Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск эффективных мишеней РНК-интерференции в транскриптах ВИЧ-1 и разработка нового метода создания кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько siPHK

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Поиск эффективных мишеней РНК-интерференции в транскриптах ВИЧ-1 и разработка нового метода создания кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько siPHK"

На правах рукописи

Алембеков Ильдар Русланович

Поиск эффективных мишеней РНК-интерференции в транскриптах ВИЧ-1 и разработка нового метода создания кассетных генетических конструкций, экснрсссируюших

несколько «¡РНК

03.01.03 - «Молекулярная биология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

25ФВ 2015

Москва 2015

005559582

Работа выполнена в Лаборатории эпигенетических механизмов регуляции экспрессии генов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук.

Научный руководитель: заведующий Лабораторией эпигенетических

механизмов регуляции экспрессии генов, доктор биологических наук, профессор Чуриков Николай Андреевич

Официальные оппоненты: заведующая Лабораторией генетических основ

клеточных технологий Федерального

государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н. И. Вавилова Российской академии наук, доктор биологических наук Лагарькова Мария Андреевна

заведующий Лабораторией молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Федерального государственного унитарного предприятия Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов, доктор биологических наук, профессор Носиков Валерий Вячеславович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биологии развития им. Н. К. Кольцова Российской академии наук, 117808, Москва, В-334, ул. Вавилова, 26.

Защита состоится 19 марта 2015 г. в 12:30 на заседании диссертационного совета Д002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук.

Автореферат разослан « » февраля 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Анатолий Михайлович Крицын:

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является причиной неизлечимого и опасного заболевания (СПИДа), в настоящее время имеющего во многих странах мира статус эпидемии. На начало 2013 года по оценкам ВОЗ число инфицированных людей по всему миру превышало 35 миллионов человек и имеет многолетнюю устойчивую тенденцию к росту. Инфекция, вызываемая ВИЧ, неизлечима но, несмотря на это, в странах с доступом к современным лечениям пациенты имеют хорошее ожидание продолжительности и качества жизни. Ухудшающуюся эпидемиологическую ситуацию омрачают многократные безуспешные попытки создать вакцину от ВИЧ.

Для лечения СПИДа в мире зарегистрировано около пятидесяти антиретровирусных препаратов. По механизму действия и особенностям химического строения они разделяются на пять групп: нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ингибиторы протеазы, ингибиторы слияния/проникновения, ингибиторы интегразы. На сегодняшний день наиболее эффективно лечение с использованием комбинации нескольких препаратов - высокоактивная антиретровирусная терапия (ВАРТ). ВАРТ позволяет остановить прогрессию ВИЧ инфекции, уменьшить смертность, увеличить продолжительность жизни больного. К сожалению, из-за зачастую высокой стоимости, большая часть пациентов из 35,3 миллионов по всему миру (2012 год) не имеют доступ к современной антиретровирусной терапии. Кроме того, из-за возникновения резистентности ВИЧ к антиретровирусному препарату и индивидуальной непереносимости приходится выбирать новую комбинацию препаратов, способную предотвратить размножение мутировавшего вируса. Распространение резистентных вариантов ВИЧ сужает арсенал эффективных препаратов и толкает на затратные поиски и изучение новых антиретровирусных препаратов, к которым чувствительны резистентные варианты.

Благодаря успехам в изучении механизмов регуляции экспрессии генов, достигнутых в последние пятнадцать лет, появилась возможность создания нового класса лекарственных средств против ВИЧ, использующих РНК-интерференцию. Феномен РНК-интерференции заключается в избирательном подавлении экспрессии гена с помощью коротких интерферирующих РНК (siPHK), которые комплементарны транскриптам гена-мишени (Fire, 1998; Elbashir et al., 2001). В сравнении с нокаутом, РНК-интерференция быстрый и более экономичный инструмент обратной генетики (reverse genetics), ускоривший функциональное изучение секвенированных геномов, позволяющий проводить полногеномные скрининги, анализ биохимических путей и отдельных генов (Cullen and Arndt, 2005; Aagard and Rossi, 2007). Показана принципиальная возможность использовать РНК-интерфернцию в лечении вирусных, онкологических и генетических заболеваний (Aagard and Rossi, 2007; Gavrilov and Saltzman, 2012). Препараты, использующие РНК-интерференцию, уже проходят клинические исследования. Обещающие результаты в лабораторных условиях показала индукция РНК-интерференции против смертельного вируса Эбола, для которого пока не существует специфического лечения (Geisbert et al., 2010).

РНК-интерференция в качестве лечения ВИЧ-инфекции имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционной терапией. При лечении с помощью РНК-интерференции можно использовать несколько siPHK, направленных против разных мишеней (Anderson et al., 2003). При использовании высоко консервативных мишеней это замедлит возникновение резистентных форм (ter Brake, 2006). При возникновении резистентных форм вируса, имеющих мутации в мишени, последовательность siPHK к этой мишени может быть с лёгкостью изменена, что восстановит эффективность специфической РНК-интерференции. В качестве мишени может быть использована и мРНК гена человека CCR5, белковый продукт которого важен в развитии ВИЧ-инфекции, и, насколько известно, не имеет какой либо значимой физиологической функции.

Цель и задачи исследования

Цель диссертации - выявить новые мишени в транскриптах ВИЧ-1 субтипа А, которые будут поражаться биологически активными siPHK, а также создать и испытать генетические конструкции, экспрессирующие одну или несколько siPHK, эффективно поражающие эти мишени в вирусных РНК и в мРНК гена CCR5.

Для достижения цели исследования необходимо было решить следующие задачи: 1. Выбрать критерии отбора и провести отбор мишеней siPHK в транскригггах вируса и в мРНК

гена CCR5.

2. Создать генетические конструкции, экспрессирующие одиночные $1РНК, направленные на мишени в транскриптах вируса и в мРНК гена ССЯ5 человека.

3. Создать невирусную систему для количественной оценки эффективности РНК-интерференции, запускаемой генетическими конструкциями.

4. Разработать надежный метод создания кассетных генетических конструкций, которые одновременно экспрессируют три $1РНК, атакующие мишени в геноме ВИЧ-1 и в мРНК гена-рецептора ССЛ5, необходимого для внедрения вируса в клетки хозяина.

5. Выяснить зависимость эффективности РНК-интерференции от силы используемого в конструкциях промотора и от длины шпильки РНК.

6. Провести испытание эффективности РНК-интерференции, запускаемой генетическими конструкциями, и молекулярный анализ РНК, доказывающий образование молекул 51РНК при введении конструкций в клетки человека.

Научная новизна результатов исследования

Получены новые данные об искусственно вызываемой РНК-интерференции. Созданы генетические конструкции, кодирующие новые биологически активные б!РНК, направленные на мишени в вирусе и в мРНК гена ССЯ5 человека. Для количественной оценки эффективности РНК-интерференции, запускаемой генетическими конструкциями, разработана и испытана невирусная система. В ходе исследования мы столкнулись с трудностями при создании кассетных генетических конструкций, содержащих несколько палиндромов и экспрессирукмцих несколько «¡РНК. Проблема связана с образованием нескольких стабильных шпилек в исходных олигонуклеотидах. Поэтому был предложен и апробирован новый удобный и быстрый метод для создания кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько в^НК. Обнаружено, что экспрессия созданных генетических конструкций приводит к эффективной атаке выбранных мишеней. При молекулярном анализе препаратов РНК обнаружены молекулы $!РНК, имеющие длину в 21 нуклеотид. Ранее считалось, что даже небольшие количества двуспиральной РНК могут вызывать мощную РНК-интерференцию и что 27-нуклеотидные шпильки РНК усиливают РНК-интерференцию в десятки раз. Нами показано, что для эффективной РНК-интерференции в клетках человека необходимо достаточно большое количество экспрессируемой РНК, т.к. сила РНК-интерференции зависит от силы промотора, использованного при создании конструкции. Кроме того, наши данные свидетельствуют о том, что 27-нуклеотидные шпильки РНК лишь ненамного усиливают РНК-интерференцию. Обнаружено, что созданные генетические конструкции, экспрессирующие 19-27-нуклеотидные шпильки РНК, не вызывают неспецифический интерферон-подобный ответ.

Практическая ценность

Генотерапия с помощью РНК-интерференции является одной из наиболее перспективных стратегий лечения вирусных инфекций и других заболеваний. В данной работе мы выявили новые эффективные мишени РНК-интерференции в ВИЧ-1, которые могут быть важны для разработки технологии генотерапии СПИДа. Результаты данной работы могут использоваться для разработки технологии генотерапии и других вирусных инфекций, а также для других ее задач. Метод быстрого создания кассетных генетических конструкций является универсальным и может использоваться как в фундаментальных исследованиях для создания составных генетических конструкций, так и для целей генотерапии с помощью РНК-интерференции, использующей наборы 81РНК. Важными с практической точки зрения являются и полученные в данной работе результаты сравнения эффективности РНК-интерференции, которая запускается короткими и длинными шпильками РНК, а также вывод о важности выбора промотора при создании генетических конструкций.

Апробация работы

Данная работа апробирована на лабораторном семинаре в Лаборатории эпигенетических механизмов регуляции экспрессии генов ИМБ РАН им. В._А._Энгельгардта. Результаты работы были представлены: на 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2010); на трёх итоговых конференциях приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса на 2007-2012 годы" (Москва 2007,2008).

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 126 страницах, содержит 18 рисунков и 7 таблиц, состоит из разделов: вводная часть, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждения, выводы. Список литературы включает 287 литературных источников.

Результаты и обсуждение

Выбор мишеней РНК-интеоФепениии в геноме ВИЧ-1

Эффективность РНК-интерференции в отношении мишени зависит от большого количества факторов. Учет этих факторов позволяет обеспечить эффективное созревание, сборку эффекторного комплекса РНК-интерференции и продуктивное и специфичное разрушение нужных РНК-мишеней. Последовательность зрелой siPHK, находящаяся в составе эффекторного комплекса и взаимодействующая с мишенью, комплементарная ей и первоначально находится в РНК предшественнике в двуцепочечной структуре. Вторая цепь в этой структуре во время сборки эффекторного комплекса является конкурентом, способным войти в его состав вместо цепи, ведущей к мишени. Элементы последовательности, обеспечивающие преимущественную загрузку заранее выбранной цепи, накладывают ограничения на последовательность siPHK, а значить и на мишень. Таким образом, эффективная мишень РНК-интерференции обладает некоторыми признакам в последовательности сайта связывания, которые "комплементарны" требуемым для эффективного биогенеза соответствующей siPHK. Основным фактором выбора цепи из двуцепочечной siPHK является термодинамическая стабильность дуплекса на концах молекулы РНК. Именно 5' конец цепи, которая образует дуплекс с меньшей свободной энергией, войдёт в состав эффекторного комплекса (Khvorova et al., 2003; Schwatz et al., 2003; Ui-Tei et al., 2004). Данная особенность была выявлена эмпирически, в ходе исследования эффективности большого количества siPHK на культуре человеческих клеток (Reynolds et aL, 2004). Аналогичные и в значительной степени совпадающие результаты были получены также и другими исследователями (Ui-Tei et aL, 2004; Armazguioui and Prydz, 2004).

Известно, что стерическая недоступность мишени может значительно повлиять на эффективность РНК-интерференции. Так, связывание белков или образование вторичных структур может сделать участки последовательности РНК недоступными для связывания эффекторного комплекса РНК-интерференции. Вторичные структуры в РНК ВИЧ-1 могут иметь динамичную и сложную структуру (Berkhout et al., 2002), так что точно оценить их вклад в маскировку потенциальной мишени затруднительно. Предварительный учёт возможности связывания каких-либо факторов в районе мишени также затруднителен и требует экспериментальной проверки in vivo.

Поскольку ВИЧ-1 характеризуется крайне высокой частотой мутаций в геноме, под селективным давлением противовирусных средств возникают резистентные к этой терапии мутанты. При использовании РНК-интерференции в подавлении модельной ВИЧ-инфекции также происходит селекция мутаций в сайте-мишени РНК-интерференции, что приводит к снижению эффективности РНК интерференции (Boden et aL, 2003; Das et aL, 2004). Однако, консервативные участки генома менее подвержены мутациям и использование их в качестве мишеней РНК-интерференции, наряду с другими приёмами, может снизить вероятность возникновения резистентных форм вируса.

Таблица 1. Мншенн в геноме ВИЧ-1,

JV« Название (НК-тексты мишеней РНК-иигерференции Позиция в геноме (AF316544)

1 HIV-1 5AAACATCAGAAAGAACCTC3' 2435..2453

2 HIV-2 5' ATAGTGАТСТАССААТАСАЗ' 2309..2327

3 H1V-3 5GTAGTGGAATCTATGAATA3' 3905..3923

4 HIV-4 5GGACCATAGTGTATATAGA3' 5366..5384

5 HIV-5 5GGACAAGCCTTCTATACA3' 6380..6397

6 GAG-1 5GCGAGAGCGTCAATATTAA3' 3..21

В своём жизненном цикле ВИЧ-1 для развития и распространения инфекции использует множество молекулярных компонентов и механизмов хозяина. Поэтому, наряду с мишенями в геноме ВИЧ-1, также представляют интерес мишени в геноме человека. Однако, несмотря на перспективу преодоления высокой изменчивости ВИЧ-1, при использовании в качестве мишеней важных для вируса

белков хозяина, РНК-интерференция таких мишеней может привести к побочным эффектам, трудно поддающимся оценке. Тем не менее, в нашей работе произведён поиск мишеней в гене ССЛЗ, подавление экспрессии которого не имеет каких-либо отмеченных биологически значимых эффектов.

Таблица 2. Мишени в CCR5.

К. Название ДНК-тексты мишеней РНК-интерференции Позиция в мРНК CCR5 (U54994)

1 CCR5-4 5'-GTGGGACTTTGGAAATACA-3' 333..351

2 CCR 5-5 5 -GTCATCCTCATCCTGАТАА-3' 205..223

3 CCR5-6 5-GTGGAACAAGATGGATTAT-3' 45..63

4 CCR5-8 5-GGAACAAGATGGATTATCA-3' 47..Ó5

На основе эмпирических правил, полученных в вышеприведённых исследованиях, первоначально, в нашей работе были отобраны мишени из генома ВИЧ-1 и кодирующей последовательности гена CCR5 человека (Табл. 1, 2). Полученные последовательности десяти мишеней предполагается подавлять РНК-интерференцией при помощи полностью комплементарных siPHK, соответствующим как минимум 10 из 11 нижеприведённых правил (последние 3 правила обязательны без исключения):

• состав G/C 30-52%

• не менее 3 A/U в позициях 15-19 смысловой цепи

• отсутствие внутренних повторов

• А в позиции 19 смысловой цепи

• А в позиции 3 смысловой цепи

• U в позиции 10 смысловой цепи

• отсутствие G/C в позиции 19 смысловой цепи

• отсутствие G в позиции 13 смысловой цепи

• отсутствие гомополимерных трактов (А)4.5 или (Т)4.5 в смысловой цепи

• локализация мишени в консервативном районе генома

• отсутствие гомологии с известными транскриптами генома человека.

Эффективность РНК-интерференции, вызываемой генетической конструкцией. зависит от силы промотора

Для того чтобы экспериментально проверить, как выбор промотора влияет на эффективность РНК-интерференции в клетках человека, мы использовали две разные шпильки ДНК, транскрибируемые с трех разных промоторов.

Эти шпильки ДНК кодируют биологически активные siPHK и соответствуют двум мишеням РНК-интерференции в транскриптах HIV-1 (генетические конструкции anti-HIV-1-27 и anti-GAG-1). Данные шпильки клонировали в трех векторах - psiSTRIKE ("Promega"), pEGFP-Nl("Clontech") и pGeneClip ("Promega"). Первый вектор экспрессирует шпильки РНК с помощью промотора U6 РНК-полимеразы III, а два других содержат промоторы CMV и U1, транскрибируемые с помощью РНК-полимеразы II. Промотор Ш связан с синтезом малых ядерных РНК человека (Hernandez, 2002). Правильность шести созданных генетических конструкций (Рис. 1) подтверждена секвенированием.

Рисунок 1. Генетические конструкции, экспрессируюшие siPHK anti-HIV-1-27 и anti-GAG-1 с трех разных промоторов и соответствующие им домены вируса - мишени РНК-интерференции -RT и GAG.

Количественный анализ эффективности РНК-интерференции, запускаемой данными шестью конструкциями, мы проводили с использованием так называемой невирусной системы. Эта система использует котрансфекцию и включает в себя две плазмиды. Одна из них экспрессирует siPHK под одним из трех промоторов. Шесть таких плазмид схематически показаны на Рис. 1. Для экспрессии двух мишеней РНК-интерференции, соответствующих этим siPHK, мы выбрали вектор psiCHECK-2 ("Promega"), содерщий два гена люциферазы - из светлячка (Photinns pyralis) и из коралла (Renilla reniformis). В З'-некодирующую область гена Renilla мы вставляли небольшие фрагменты генома вируса, которые соответствуют мишеням РНК-интерференции. Деградация таких рекомбинантных мРНК гена Renilla при РНК-интерференции нарушает его экспрессию. При котрансфекции плазмиды psiCHECK-2 и плазмиды, экспрессирующей siPHK, наблюдается снижение экспрессии гена Renilla, тогда как экспрессия гена светлячка не изменяется и служит контролем (Рис. 1). Чем большее снижение экспрессии гена Renilla наблюдается в этой системе, тем эффективнее РНК-интерференция, запускаемая конструкцией, экспрессирующей шпильки РНК под разными промоторами. Получены две плазмиды, кодирующие мишени РНК-интерференции в составе вектора psiCHECK-2, их соответствие siPHK anti-HIV-1-27 и anti-GAG-1 подтверждено секвенированием (области RT и GAG на Рис. 1).

Рисунок 2. Эффективность РНК-интерференции, оцениваемая в невирусной системе по свечению люциферазы НепШа. а и 6 - Экспрессия гена люциферазы в присутствии б1РНК апп-1 ИV ! 27 и ашьСАС-!, соответственно (+). (-) - Результат котрансфекции соответствующей конструкции в векторе рБ1СНЕСК-2 вместе с исходным вектором «¡ЭТШКЕ, не кодирующим мРИК.

На Рисунке 2а представлены результаты анализа эффективности siPHK anti-HIV-1-27, экспрессируемой тремя конструкциями с трех разных промоторов - CMV, U1 и U6. Видно, что в наших опытах эффективность РНК-интерференции зависит от того, с какого промотора считывается данная siPHK. Наибольшая активность обнаружена при транскрипции с промотора U6, меньшую активность обеспечивал промотор CMV и самую слабую - U1 (U6 > CMV > U1), несмотря на то, что этот вектор содержит энхансер. Аналогичные результаты получены и при анализе эффективности РНК-интерференции, наблюдаемой при экспрессии siPHK anti-GAG-1 тремя конструкциями, имеющими три разных промотора (Рис. 26). Эта siPHK имеет большую биологическую активность, чем siPHK anti-HIV-1-27 (см. Рис. 2), однако промотор U6 и в этом случае обеспечивает большую эффективность РНК-интерференции. Аналогичные данные по подавлению продукции вируса этими конструкциями получены и в вирусной системе при трансфекции лимфоидных клеток МТ-4 (данные не представлены).

В наших генетических конструкциях основными элементами, обеспечивающими активность транскрипции, служат промоторы, а также энхансер в конструкции, содержащей промотор U1. Поэтому мы считаем, что полученные данные убедительно свидетельствуют о том, что в клетках человека активно работающие промоторы обеспечивают более мощную РНК-интерференцию. По всей видимости, более активная транскрипция приводит к наработке больших количеств siPHK. Ранее показали, что выбор промотора важен для эффективности РНК-интерференции, и даже разные варианты промотора РНК-полимеразы III могут существенно влиять на эффективность РНК-интерференции (Boden et al„ 2003). Наши данные свидетельствуют о том, что вектор siSTRIKE, содержащий промотор U6, более предпочтителен для эффективной искусственной РНК-интерференции в клетках данного типа, чем векторы, содержащие промоторы CMV и U1. В генной терапии выбор промотора имеет большое значение для надежной экспрессии siPHK генетическими конструкциями еще и потому, что этот выбор одновременно означает и выбор того или иного механизма регуляции экспрессии. Известно, что разные промоторы связаны с разными механизмами регуляции транскрипции, и активность одного и того же промотора в клетках разного типа значительно отличается. Например, в клетках, активно продуцирующих р53, репрессируется транскрипция, направляемая РНК-полимеразой III (Cairns and White, 1998). следовательно в таких клетках может оказаться не целесообразным использовать экспрессию под контролем промотора U6, из-за снижения транскрипции с участием РНК-полимеразы III. Более того, даже присутствие больших количеств смысловых и антисмысловых транскриптов в одних и тех же тканях и органах не всегда приводит к запуску РНК-интерференции (Чуриков и Кретова, 2003; Tchurikov and Kretova, 2007).

Несмотря на низкую эффективность запускаемой РНК-интреференции, генетические конструкции, экспрессирующие siPHK под контролем промоторов CMV и U1, могут быть также полезными. В данной работе все остальные эксперименты проведены с использованием генетических конструкций на основе psiSTRIKE, экспрессирующих siPHK под контролем промотора U6 или двух промоторов - U1 и U6.

Генетические конструкции, экспрессирующие удлинённые шпильки, запускают более эффективную РНК-интерференцию

В представленной работе приведены результаты анализа эффективности генетических конструкций при использовании невирусной тест-системы. Эти конструкции созданы на базе вектора psiSTRIKE1" и экспрессируют шпильки РНК под сильным промотором РНК полимеразы U6 человека. Экспрессия данных кассетных конструкций приводит к сайленсингу некоторых генов вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1).

В трансфецированных клетках мРНК гена люциферазы Renilla, содержащая в З'-некодирующей области испытываемую мишень, разрезается в процессе РНК-интерференции, что приводит к резкому снижению голубого свечения, катализируемого данной люциферазой (478 нм). Чем меньше наблюдаемое свечение, тем эффективнее РНК-интерференция, вызываемая исследуемой генетической конструкцией или препаратом дцРНК. Внутренним контролем для нормализации данных служит желто-зеленое свечение, катализируемое люциферазой светлячка (557 нм), которая кодируется той же самой генетической конструкцией, содержащей мишень РНК-интерференции,.

В Таблице 3 представлены тексты вставок в вектор psiSTRIKE, соответствующие самым активным siPHK. Первые шесть генетических конструкций имеют 18-23-нуклеотидные области, соответствующие смысловой цепи РНК вируса. Следующие шесть генетических конструкций (№ 7-12 в Таблице 3) соответствуют тем же шести областям в смысловой цепи РНК вируса, но имеют длины в 27 нуклеотидов. По литературным данным 27- нуклеотидные шпильки РНК, являясь природным субстратом Дайсера, могут быть в десятки раз эффективнее аналогичных 21- нуклеотидных (Kim et al„ 2006; Grimm et al., 2006). Из данных Таблицы 3 следует, что почти все генетические конструкции, кодирующие 278

нуклеотидные шпильки, могут вызывать более сильную РНК-интерференцию, чем соответствующие им 18-23-нуклеотидные конструкции. Это видно из сравнения эффекта конструкций, поражающих одну и ту же мишень: аШьН1У-1 и апй-Н1У-1-27 (№№ 1 и 7 в Таблице 3); ап«-Н1У-2 и апй-Н1У-2-27 (2 и 8); апП-Н1У-3 и апП-Н1У-3-27 (3 и 9); апП-Н1У-4 и апП-Н1У-4-27 (4 и 10); апП-Н1У-5 и атьН1У-5-27 (5 и И). Конструкция апй-САС-1, экспрессирующая 19-нуклеотидную шпильку РНК, по нашим данным является наиболее эффективной и на 99% подавляет свечение репортерного гена люциферазы ЯешНа (Таблица 3). Мишенью соответствующей б1РНК служит мРНК, кодирующая белок матрикса Р17 (МА, компонент Gag-белка). Соответствующая ей конструкция апй-САС-1-27, кодирующая 27-нуклеотидную шпильку РНК, вызывает только 60% подавление (Таблица 3). Видимо, она не является хорошим субстратом для Дайсера.

Таблица 3. Генетические конструкции, экспрессирующие шпильки РНК.

№ Название конструкции Тексты вставок шпилечных конструкции* Эффективность подавления мишени (%)** Мишень в вирусе ВИЧ-1, подтип А (AF316544)

1 anti-HIV-1 AAACATCAGAAAGAACCTCCATTcttccf gtaiAATGGAGGTTCTTTCTGATGTTT« м 80 консервативная область RT, 2435..2457

2 anti-HlV-2 ATAGTGATCTACCAATACAc/ftrfcfcaT GTATTGGTAGATCACTATm» 69 консервативная область RT, 2309..2327

3 anti-HIV-3 GTAGTGGAATCTATGAATAcffccifffcaT ATTCATAGATTCCACTACm» 87 консервативная область Int, 3905..3923

4 anti-HIV-4 GGACCATAGTGTATATAGActfcc/grcaT CTATATACACTATGGTCCm» 54 консервативная область Vpu, 5366..5384

5 anti-HIV-5 GGACAAGCCTTCTATACAcff«<?toiTG TATAGAAGGCTTGTCCnf« 78 консервативная область GP120, 6380..6397

6 anti-GAG-1 GCGAGAGCGTCAATATTAAncwtfagaT TAATATTGACGCTCTCGCm« 99 консервативная область Р17 (gag), 3..21

7 anti-HI V-l-27 AAACATCAGAAAGAACCTCCATTCCT Trrc«(ij?«j?»AAGGAATGGAGGTTCTTTC TGATGTTTflW 88 консервативная область RT, 2435..2461

8 anti-HIV-2-27 CAGAAATAGTGATCTACCAATACATG Grtcne^«J?«CCATGTATTGGTAGATCAC TATTTCTGftm 89 консервативная область RT, 2304..2330

9 anti-HIV-3-27 AGGAGTAGTGGAATCTATGAATAAA GA«m«gageTCTTTATTCATAGATTCC АСТАСТССТЯЯГ 94 консервативная область Int, 3901..3927

10 anti-HIV-4-28 AGTGTGGACCATAGTGTATATAGAA TATicw^ATATTCTATATACACTATG GTCCACACT/frtf 77 консервативная область Vpu, 5361..5388

11 anti-HIV-5-27 ACCAGGACAAGCCTTCTATACAAAC AGtfcaatfaffaCTGTTTGTATAGAAGGCT TGTCCTGGTiff» 97 консервативная область GP120, 6376..6402

12 anti-GAG-1-27 GTGCGAGAGCGTCAATATTAAGCGG GGffcrtfl^Ä^flCCCCGCTTAATATTGACG CTCTCGCACOTtf 60 консервативная область Р17, 1..27

*Текст петли, а также короткая область (dT)s на 3' конце конструкции, являющаяся терминатором для РНК полимеразы III, показаны курсивом строчными буквами. 18-27-нуклеотидные области, соответствующие смысловой цепи РНК вируса, показаны в строке слева от петли, а антисмысловой - справа. Последовательности представлены в ориентации 5'-3\ **Эффективность подавления экспрессии мишени указана в процентах от эффективности исходного вектора siSTRIKE с "рандомизированной" последовательностью вставки, для которого она колеблется от 0 до 20%.

Также, на представленной невирусной тест-системе, нами была проверена эффективность химически синтезированных дцРНК (Табл. 4). Из сравнения эффективности подавления мишеней из Таблицы 3 и Таблицы 4 видно, что генетические конструкции, экспрессирующие шпильки РНК, более

эффективны, чем соответствующие им химически синтезированные дцРНК (конструкции с номерами 9, 10 и 6 в Таблице 3 с 1, 2 и 3 в Таблице 4).

Таблица 4. Синтетические дцРНК, используемые для подавления экспрессии генов ВИЧ-1.

№ Название Тексты дцРНК4 Эффективность подавления мишени (%)

1 anti-HlV-3-27 5" AGGAGUAGUGGAAUCUAUGAAUAAAGA 3' 3' UCCUCAUCACCUTJAGAUACUUAUUUCU 5' 83

2 anti-HIV-4-27 5' GUGUGGACCAUAGUGUAUAUAGAAUAU 3' 3' CACACCUGGUAUCACAUAUAUCUUAUA 5' 68

3 anti-GAG-1-27 5' GUGCGAGAGCGUCAAUAUUAAGCGGGG 3' 3' CACGCUCUCGCAGUUAUAAUUCGCCCC 5' 92

♦Смысловая цепь дцРНК показана сверху, антисмысловая - снизу.

Генетические конструкции, экспрессирующие более эффективные 27-нуклеотидные шпильки РНК, не индуцируют неспецифический интерфероновый эффект в культуре НЕК-293Т. Тем не менее, нужно иметь в виду, что сила эффекта зависит от используемой культуры клеток. Поэтому в подразумеваемых клинических испытаниях, когда будет использоваться другой, скорее всего лентивирусный вектор (Li et a I., 2003), экспрессирующий данную шпильку РНК, и другие клетки (стволовые лимфоидные), наличие интерферонового эффекта должно быть проверено снова.

Тестирование в невирусной системе позволяет провести первый - необходимый, но недостаточный - этап отбора эффективных антивирусных siPHK. Биологически активная (по данным вышеописанной невирусной системы) siPHK может оказаться неактивной при тестировании в вирусной системе, т.к. в последнем случае ее мишень находится в другом контексте последовательностей РНК. Кроме того, из-за связывания транскриптов вируса с белками данная мишень в вирусной мРНК может быть недоступной для комплекса RISC, содержащего потенциально активную антисмысловую siPHK.

Эксперименты по тестированию в невирусной системе генетических конструкций, экспрессирующих шпильки РНК, позволили отобрать шесть эффективных мишеней в геноме ВИЧ-1, подтипа А. Эти области являются высококонсервативными, т.к. в результате скрининга нуклеотидных баз данных в этих областях найдены лишь единичные мутации. Учитывая, что ВИЧ-1 имеет высокую скорость мутирования, в целях генотерапии очень важно выявить наиболее уязвимые мишени, соответствующие высококонсервативным районам ВИЧ-1 для сайленсинга с помощью РНК-интерференции, а также создать соответствующие конструкции, экспрессирующие биологически активные siPHK.

Наши эксперименты не подтвердили опубликованные ранее данные о том, что 27-нуклеотидные шпильки РНК могут быть в десятки раз более эффективными, чем 19-23-нуклеотидные (Kim et al., 2005). По нашим данным эффективность возрастает только в 1,2-1.4 раза (см. Таблицу 3).

На базе отобранных шести эффективных генетических конструкций, экспрессирующих одиночные 27-нуклеотидные шпильки РНК, на следующем этапе работы предполагается создать кассетные конструкции, одновременно экспрессирующие несколько шпилек РНК. По литературным данным (Boden et al., 2007) такие конструкции обладают синергическим антивирусным эффектом по сравнению с конструкциями, кодирующими одиночные siPHK, и в большей степени пригодны для преодоления высокой скорости мутирования ВИЧ-1.

Новый метод создания кассетных генетических конструкций с использованием олигонуклеотидов. не образующих шпильки

Генетические конструкции, экспрессирующие несколько siPHK, вызывают более эффективную РНК-интерференцию по сравнению с конструкциями, экспрессирующими одиночные siPHK (Castanotto and Rossi, 2009).

А

Отжиг олигонуклеотдов, достройка второй цепи и рестрикция (раздельно)

2 1 4 1 6 1

Xhol BamHI В g III

Лигирование в линейную молекулу и два раунда ПЦР-амплификации 1

Клонирование в pGEM-T Easy, секвенирование и субклонирование в экспрессирующий вектор pGeneClip

S1 Loop asi s2 Lood as2 s3

U1 promoter

as3 U1 teminalion

sequence

anti-HIV-1-27

anti-HIV-2-27

anti-CCR5-8

anti-HIV-1-27

5' baqcttjt AAACATCAGAAAGAACCTCCATTCCTTCTTCCTGTCA 3'

3'GAAGGACAGTTTCCTTACCTCCAAGAAAGACTACAAAt.baqctct::. 5'

anti-HIV-2-27

5' tctcqaqt ,:CAGAAATAGIGAICTACCAAIACATGGACTGTCCITC 3' _

--S'TGACbEGAAGGGTACATAACCATCIAGTSATAMGAC- fc-taGot- . 5'

anti-CCR5-8

5' .fegatcd: ."GGAACAAGATGGATTATCATTCAAGAGA 3'

"--3' AAGTTCTCTACTATTAGGTAGAACAAGGt' ^ctagaj 5'

Рисунок 3. Создание кассетных генетических конструкций, экспрессирующих $|РНК. (А) Дизайн трех пар олигонуклеотидов (1-6) перекрывающихся только в последовательности петли, расположенной между двумя частями палиндрома, "в" и "ая", соответственно, указывают смысловые и антисмысловые последовательности в трех шпильках разделённых петлями. (Б) Последовательности перекрывающихся олигонуклеотидов, использованных для создании кассеты. Смысловые и антисмысловые цепи показаны красным и синим цветами, соответственно. Последовательности петель указаны чёрным жирным шрифтом. Сайты рестрикции обведены рамкой.

Такой подход, - комбинированная РНК-интерференция, особенно эффективен, если в качестве мишени выступает вирус ВИЧ-1, склонный к ускользанию от "обычной" РНК-интерференции из-за высокой частоты мутаций (Boden et a I., 2007). Можно выделить три основных стратегии применения комбинированной РНК-интерференции для генной терапии:

1) использование нескольких промоторов и нескольких shPHK в конструкции:

2) использование длинных shPHK, кодирующих несколько siPHK под одним промотором;

3) использование генов микроРНК, содержащих вставки для экспрессии нескольких siPHK

(Lamberth et al„ 2010; Liu et al„ 2009; Liu et aL, 2008).

Нами разработан новый метод создания кассеты, экспрессирующих несколько siPHK под контролем одного промотора в культуре клеток человека. В отличие от других протоколов создания генетических конструкций для РНК-интерференции (Xu et al., 2009), в нашем методе не используется пошаговое клонирование каждой шпильки. Вместо этого кассета с несколькими шпильками клонируется в один этап, что позволяет значительно сократить время получения генетической конструкции.

Использование длинной ДНК-вставки содержащей палиндромы (шпильки) из смеси нескольких "перекрывающихся" олигонуклеотидов приводит к образованию вторичных структур, препятствующих достраиванию второй цепи фрагментом Клёнова (большой фрагмент ДНК-полимеразы I Escherichia coli) или другой полимеразой. Снижение эффективности на этапе достраивания приводит к чрезвычайно низкой частоте успешных клонирований "завершенных" ДНК-вставок. Использование только двух длинных (более 100 н.) олигонуклеотидов с перекрывающимися последовательностями позволяет отчасти преодолеть эти трудности, но сопряжено с нуклеотидными более частыми ошибками при синтезе таких длинных олигонуклеотидов и их дороговизной. Наш протокол позволяет ограничиться менее дорогими олигонуклеотидами меньшей длины. Мы использовали пары олигонуклеотидов, не содержащие внутри себя палиндромов и перекрывающиеся только в области петли, что позволяет избежать образования шпилек внутри олигонуклеотидов. Последовательности для отжига олигонуклеотидов в области петли уникальны для каждой пары. Подобранные сайты рестрикции на концах каждой пары олигонуклеотидов обеспечивают предопределённую сборку элементов в кассету.

Нами созданы 3 генетические конструкции, экспрессирующие одну shPHK против мишени в CCR5 и две против ВИЧ-1, которые процессируются в 3 различные siPHK (Рис. 3). При этом указанные одноцепочечные области не содержат комплементарных участков. Таким образом, три пары олигонуклеотидов, перекрывающихся только в последовательности их петель, порознь отжигаются и достраиваются фрагментом Клйнова полимеразы I Escherichia coli.

После рестрикции соответствующими ферментами ДНК-фрагменты с выступающими 5' концами лигировали вместе в кассету в заранее определённой последовательности. Последовательность собранной ДНК-кассеты обогащалась с помощью ПЦР-амплификации, после этого ДНК очищали в 2% агарозном геле и, после элюции, вновь проводили ПЦР с теми же праймерами. Ампликон ДНК-кассеты клонировали в pGEM-T Easy для секвенирования, затем субклонировали в экспрессирующий вектор pGeneClip (Рис. За).

Технически наш протокол состоит из следующих этапов: 1) дизайн и синтез олигонуклеотидов; 2) отжиг пар олигонуклеотидов; 3) достройка одноцепочечных участков отожжённых пар олигонуклеотидов фрагментом Клёнова ДНК полимеразы I Escherichia coli; 4) преципитация в этаноле фрагментов кассеты и создание липких концов при помощи подходящих рестриктаз; 5) лигирование ДНК-фрагментов в линейную ДНК-кассету; 6) два раунда ПЦР-амплификации, с фракционированием в 2% агарозном геле и элюцией после каждого; 7) клонирование в pGEM-T Easy с обнаружением позитивного клона методом гибридизации колоний; 8) секвенирование; 9) субклонирование в вектор экспрессии pGeneClip.

Этапы 2-4 этого протокола занимают 2-4 дня; этапы 5 и 6 занимают 1-2 дня; этапы 7-8 - 3-4 дня. Таким образом, за 5-7 дней можно создать несколько конструкций в промежуточном векторе pGEM-T Easy. Субклонирование в экспрессирующий вектор обычно занимает 3-4 дня. В итоге, за неделю можно получить несколько кассетных конструкций. Секвенировав пять случайных позитивных колоний, отобранных методом гибридизации колоний, мы обнаружили только одну мутацию внутри петли в одном из клонов, что говорит о низкой частоте мутаций, вызванной двумя раундами ПЦР.

Наши результаты указывают на возможность создания по нашему протоколу работающих кассетных генетических конструкций. Кассета под контролем одного промотора эффективно экспрессирует три разных shPHK, а генерируемые в результате siPHK имеют необходимую специфичность и биологическую активность. Приведённый протокол позволяет использовать синтетические олигонуклеотиды длиной менее 50 н. и получать готовую кассету в один приём (в отличие от методов пошагового создания кассет). Таким образом, преимущество нашего протокола заключается в скорости и экономии.

По изложенному выше протоколу было создано несколько кассет экспрессирующих три siPHK, которые были испытаны на невирусной системе. Видно, что каждая мишень к siPHK по отдельности эффективно подавляется, что говорит о хорошей экспрессии каждой siPHK в кассете (Рис. 4а). Мишенями выступали последовательности (домены) клонированные в 3' нетранслируемой области гена Renilla люциферазы в составе psiCHECK-2 (Promega, США). Подавление каждой отдельной мишени РНК-интерференцией siPHK, экспрессируемой кассетой 1 было достаточно сильным. Наблюдали 75% ингибирование с помощью siPHK anti-HIV-1-27, 77% с помощью anti-HIV-2-27 siPHK и 53% с помощью

апи-СС115-8 й|'РНК. Похожие результаты были получены при РНК-интерференции генетическими конструкциями экспрессирующими единичные 51РНК под контролем промотора Ш (см. Табл. 3 и 4).

р—0.67 р=0.12

Рисунок 4 Эффективность РНК-ннтерференции в экспериментах по котрансфекции в невирусной системе в пяти параллелях. (А) Плазмда р$1СНЕСК-2, содержащая мишень РНК-интерференции Н1У-1-27 или Н1У-2-27, или ССЯ5-8 в репортерном гене люциферазы КспШа, была трансфецирована вместе с экспрессирующей плазмидой, содержащей (+) или не содержащей (-) кассету, генерирующую апи-Н1У-1-27, апп-Н1У-2-27 и ап11-ССЯ5-8 81РНК. (Б) Аналогично (А), но использованы другие кассеты, полученные нашим методом. Они кодируют по три 81Р! 1К, не комплементарные котрансфецированной мишени. Под графиком указано наличие (+) или отсутствие (-) обозначенных з1РНК в экспрессирующей кассете.

Изображённые на Рис. 4а и 46 величины р показывают уровень статистической значимости t-теста нокдауна, вызываемого указанной siPHK. При этом нами не обнаружена статистически значимая РНК-интерференция в аналогичных экспериментах по котрансфекции кассетных генетических конструкций, экспрессирующих те же siPHK, и не соответствующих им мишеней (см. Рис. 46).

Испытание кассетных генетических конструкиий. экспрессируюших несколько siPHK. в невирусной системе

С использованием нового метода на основе плазмиды pGeneClip нами созданы три генетических конструкции. Кассетные генетические конструкции представляют собой экспрессирующие генетические конструкции (Promega), содержащие кассетную вставку, кодирующую три siPHK: anti-HIV-1-27, anti-HIV-2-27 и anti-CCR5-8-27 (Кассета 1); anti-HIV-1-27, anti-HIV-3-27 и anti-CCR5-8-27 (Кассета 2); anti-HIV-1-27, anti-HIV-5-27 и anti-CCR5-8-27 (Кассета 3). При этом, Кассета 1 экспрессируется под контролем промотора UI, а Кассета 2 - под контролем двух смежных промоторов U1 и U6. Кассета 3 была создана в двух вариантах, под контролем промотора U1, и под контролем промоторов U1-U6. Кассетные генетические конструкции с UI-U6 промоторами имеют необходимые терминаторные последовательности для обоих промоторов.

Для проверки, действительно ли РНК, транскрибируемая с кассетной конструкции, процессируется в siPHK, мы использовали метод защиты от РНКазы (RNAse protection assay). В итоге оказалось, что исходный транскрипт образует siPHK длиной около 21 н. (Рис. 5). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что РНК, синтезируемая с кассетных генетических конструкций, успешно включается в систему РНК-интерференции (Tchurikov and Kretova, 2011).

- 21

Рисунок 5. Кассетные генетические конструкции, кодирующие несколько siPHK в составе удлинённых шпилек, экспрессируют эти siPHK при трансфекции.

Анализ тотальной РНК из трансфецированных клеток методом протекции от РНКаз (RNAse protection assay). М - РНК маркер; 1, 2, 3 - трансфекции исходным вектором экспрессии pGeneClip; 4 и 5 - отдельные трансфекции полученных нами кассетных генетических конструкций. Длины РНК молекул в нуклеотидах указаны.

Для дальнейшего изучения созданных кассетных конструкций нами была измерена вызываемая ими РНК интерференция мишеней. Испытание кассетных конструкций проводилось на невирусной системе (Рис. 6) Для этого полученные кассетные конструкции котрансфецировали в клетки НЕК293Т вместе с репортерной конструкцией на основе р§1СНЕСК-2, содержащей одну из мишеней, специфичную для кодируемой в;РНК. Измерение уровня экспрессии проводили через 72 часа после трансфекции.

Firefly

Рисунок 6. Схема невирусной тест-системы, используемой для проверки кассетных генетических конструкций.

Для определения эффективности РНК-интерференции, уровень экспрессии репортерного гена люциферазы Renilla при котрансфекции с генетической конструкцией, сравнивали с базовым уровнем экспрессии репортерного гена, в отсутствие siPHK. Эффективность РНК-интерференции кассетной конструкции равна выраженной в процентах величине, обратной отношению базового уровня экспрессии репортерного гена к уровню экспрессии репортерного гена при котрансфекции с кассетной конструкцией. При этом данные экспрессии репортерного гена нормализовали по уровню экспрессии контрольного гена люциферазы Firefly. Измерения уровня экспрессии для каждой точки проводились в трех параллелях, а в случае Кассеты 1 под контролем промотора U1 в пяти параллелях. Эффективность РНК интерференции, вызываемой кассетными генетическими конструкциями, измерялась отдельно в отношении каждой мишени.

Н1У-1

Кассета 1 - +

Эффективность 75%

Рисунок 7. Испытание Кассеты 1 (апН-НIV-1-27, апИ-Н1У-2-27, ап«-ССК5-8-27) экспрессируемой под контролем промотора 1Л (рвепеСНр, Promega).

Активность измерена через 72 часа после трансфекции. Эксперимент выполнен в пяти параллелях (п=5). При применении критерия Стьюдента отмечено снижение экспрессии для всех мишеней специфичных Кассете 1 при уровне значимости р<0,05.

В итоге, при испытании Кассеты 1 под контролем промотора Ш было обнаружено достоверное снижение уровня экспрессии для всех мишеней (р<0.05). Так, эффективность РНК интерференции составила для мишени Н1У1 - 75%, для мишени Н1У-2 - 77%, а для мишени ССЯ5-8 - 62% (Рис. 7).

При испытании Кассеты 2 под контролем промоторов Ш-иб также было обнаружено достоверное снижение уровня экспрессии для всех мишеней (р<0.05). Эффективность РНК интерференции составила для мишени Н1У1 - 42%, для мишени Н1У-3 - 86%, а для мишени ССК5-8 - 47% (Рис. 8).

Для определения эффективности РНК-интерференции в случае Кассеты 3 нами были использованы два варианта данной кассетной конструкции под контролем промотора 111 и под контролем промоторов

ш-иб.

При испытании Кассеты 3 как под контролем промотора Ш, так и под контролем промоторов Ш-Ш было обнаружено достоверное снижение уровня экспрессии для всех мишеней (р<0.05). Так, эффективность РНК интерференции в Кассете 3 под контролем промотора и 1 составила для мишени НГУ1 - 38%, для мишени НГУ-5 - 83%, а для мишени ССЯ5-8 - 55%, а под контролем промоторов 111-116 для мишени Н1У1 - 64%, для мишени Н1У-5 - 88%, а для мишени ССИ5-8 - 64% (Рис. 9).

500000

О" I

400000

0 ш

1 300000

с; 2ооооо

Н1У-1

р-0 025

I

нм-з

р=0.0016

СС135-8

Р=0.00'9

11

Кассета 2 - + Эффекжекосгь 42%

Рисунок 8. Испытание Кассеты 2 (апйН1У-1-27, ап«Н1У-3-27, апйСС1*5-8-27) под контролем промоторов 1Л-116 Активность измерена через 72 часа после трансфекции. Эксперименты выполнены в трех параллелях (п=3). При применении критерия Стьюдента отмечено значимое снижение экспрессии для всех мишеней специфичных Кассете 2 при уровне значимости р<0,05.

86% 47%

Таким образом, РНК интерференция, вызываемая кассетными конструкциями, приводит к значительному подавлению экспрессии мишени, при этом для некоторых мишеней эффективность подавления особенно высока (не менее 75%) (Рис. 7-9).

При сравнении эффективности кассет и отдельных составляющих их шпилек (Таб. 3, №7-12), видно, что наиболее эффективные удлинённые шпильки в составе кассет также оказываются наиболее эффективными (см. Табл. 3, №7, 8, 9, 11). Однако при этом шпильки в составе кассеты несколько менее эффективны, чем при "самостоятельной" экспрессии. Вероятно, это связано с конкуренцией между разнотипными шпильками во время процессинга в я!РНК, а также эндогенными клеточными микроРНК. Тем не менее, некоторое снижение эффективности шпилек в составе кассеты компенсируется другим важным свойством кассет в предполагаемой терапии ВИЧ: - возможностью подавлять несколько мишеней

и сохранять действие даже в случае мутации одной из вирусных мишеней. Так известно, что продолжительная РНК интерференция в вирусной системе приводит к появлению устойчивых к РНК интерференции вариантов вируса (Boden et al., 2003, Das et al., 2004), что отражает способность ВИЧ к высокой частоте мутаций. РНК интерференция одновременного нескольких

А

Кассета 3 - +

Эффективность 38%

Кассета 3 - + Эффективность 64%

HIV-5 CCR5-8

Р-5.67Е-М _P-OQ1

Рисунок 9. Испытание Кассеты 3 (ап«Н1У-1-27, апНН1У-5-27, ап«СС1»5-8-27) в составе вектора рвепеСПр (Рготейа, США) (А) Кассета 3 под контролем промотора Ш. (Б) Кассета 3 под контролем промоторов и 1-116. Активность измерена через 72 часа после трансфекции. Все эксперименты выполнены в трех паралелях (п=3). При применении критерия Стьюдента отмечено снижение экспрессии для всех мишеней специфичных Кассете 3 при уровне значимости р<0,05.

мишеней позволяет в значительной степени снизить вероятность возникновения резистентного варианта и отложить его появление (ter Brake et al., 2006).

Также, при анализе уровня РНК интерференции в двух вариантах Кассеты 3 выявлено увеличение уровня РНК-интерференции Кассеты 3 под контролем промоторов U1-U6 по сравнению с той же конструкцией под контролем U1. Так, шпильки в составе Кассеты 3 под контролем U1-U6 промоторов имеют несколько большую эффективность по сравнению с шпильками под контролем U1 (Рис. 9).

Такое увеличение эффективности можно объяснить совместной экспрессией двумя системами РНК полимераз: РНК полимеразой 11 (промотор U1) и РНК полимеразой III (промотор U6). Как показано на примере экспрессии одиночных шпилечных конструкций (см. Рис. 4) siPHK под контролем U6 промотора обладают большей активностью. Добавление его к менее эффективному U1 промотору увеличит общую экспрессию, даже если будет конкуренция между двумя системами транскрипции за кодирующую последовательность. Низкая эффективность РНК-интерференции под контролем промотора UI может быть связана с неэффективным биогенезом siPHK из транскрипта, имеющего структуру не характерную для предшественников siPHK. Так, известные siPHK происходят либо из транскриптов РНК полимеразы III (нет m7G-K3na, нет ро1у(А)-хвоста), либо из мРНК (есть m7G-K3n и ро1у(А)-хвост). Первичный же транскрипт гена UI (UI pre-snRNA) несмотря на синтез РНК полимеразой II, имеет только один признак мРНК - m7G-K3n, и не имеет полиаденилатного «хвоста» (I'guen and Murphy, 2003), из-за чего синтезируемые с кассетных конструкций транскрипты могут процессироваться в siPHK менее эффективно.

Рисунок 10. Измерение активности РНК интерференции, вызываемой кассетными конструкциями, против мишеней с некомплементарными последовательностями.

Экспрессия гена люциферазы, содержащего одну из мишеней (HIV-1, HIV-2 или CCR5-8) котрансфецированной с одной из трех кассетных конструкций, экспрессирующих siPHK (anti-). При использовании критерия Стьюдента не обнаружено значимого подавления мишеней кассетными конструкциями, экспрессирующими siPHK некомплементарные мишеням (р=0,05). Эксперименты выполнены в пяти параллелях

(п=5).

Для проверки специфичности используемых кассетных конструкций мы провели их котрансфекцию с неспецифическими мишенями. В итоге было обнаружено отсутствие значимого подавления мишеней, не имеющих сродства к генерируемым siPHK (Рис. 10).

Таким образом, созданные по нашему методу кассетные генетические конструкции генерируют siPHK к нескольким мишеням и вызывают их эффективное и специфичное подавление посредством РНК-интерференции. Объединение последовательности трёх шпилек в составе единого кассетного транскрипта уменьшает длину вставки, что при сохранении способности эффективно генерировать siPHK, облегчает её приготовление из олигонуклеотидов и снижает стоимость. При этом экспрессия кассетной генетической конструкцией транскрипта с несколькими шпильками делает его более похожим на природные аналоги и, как мы полагаем, позволяет улучшить эффективность созревания siPHK.

Испытание генетических конструкций, экспрессирующих siPHK. в псевдолентивирус-клеточной системе

Следующим этапом нашей работы была оценка эффективности созданных нами генетических конструкций, экспрессирующих siPHK, в псевдолентивирус-клеточной системе.

Псевдолентивирусы представляют собой лентивирусный капсид со всеми ферментами ВИЧ, но без некоторых регуляторных и дополнительных белков вируса; билипидная оболочка псевдовируса может включать гомологичные или гетерологичные (псевдотипирующие) вирусные поверхностные белки слияния, в том числе поверхностные белки вирусов везикулярного стоматита (Quinonez and Sutton, 2002), гриппа (Guo et al., 2009), Эбола (Kobinger et al., 2001), бешенства (Mochizuki et al., 1998), гепатита С (Hsu et al., 2003) и др. Псевдовирусные частицы физиологически почти неотличимы от истинного вируса ВИЧ-1 и воспроизводят репликационный цикл вируса во всех стадиях, вплоть до интеграции провируса, но без образования потомства в зараженных клетках. Отсюда их второе название - вирусы одного цикла инфекции (single cycle infection virus): вероятность возникновения в экспериментах с ними репликационно компетентного вируса исчезающе мала, в связи с чем безопасность их использования для изучения антивирусных препаратов гораздо выше, а стоимость работ многократно ниже, чем при использовании инфекционных изолятов ВИЧ-1 (Adelson et al., 2003).

Ранее описано применение псевдовирус-клеточной системы, позволяющей оценивать ингибирующую активность антиретровирусных соединений различных классов: ингибиторов входа-слияния (Platt et al., 2005), вирусной обратной транскриптазы (Nikolenko et al., 2005; Чересиз и др., 2010), протеазы (Parry et al., 2009), сборки/созревания вирусной частицы (Zhou et al., 2009), а также препаратов на основе siPHK (Jacque et al., 2002), без использования инфекционных изолятов ВИЧ-1.

Успешное применение РНК-интерференции для подавления экспрессии генов ВИЧ-1 в клеточных линиях продемонстрировано в целом ряде работ, в которых мишенями для siPHK служили транскрипты всех основных, регуляторных и вспомогательных генов ВИЧ-1 (tat, rev, gag, pol, nef, vif, env и vpr) (Coburn et al., 2002; Lee et al., 2002; Jacque et al., 2002). Несмотря на эти первоначальные успехи, ученые при проведении экспериментов по подавлению репликации ВИЧ-1 в клеточных системах сталкиваются с серьезными проблемами, такими как появление мутантных escape-вариантов вируса, уходящих от подавления интерферирующими РНК (Das et al., 2004), а также отсутствие превентивного эффекта РНК-интерференции против первичного заражения клеток вирусом (Westerhout et al., 2006). Для борьбы с мутантными вариантами вируса предлагается несколько эффективных подходов: выбор сайтов-мишеней в

консервативных областях лентивирусного генома, использование нескольких siPHK к различным сайтами-мишенями, что снижает вероятность появления мутантных escape-вариантов (Rossi, 2006).

Расположение и структура сайтов-мишеней для анти-ВИЧ siPHK в последовательностях транскоиптов системы лентивирусной экспрессии in vitro

Экспрессия лентивирусного генома in vitro с помощью мультиплазмидной системы, разработанной для генотерапии, несет в себе важнейшие элементы транскриптома инфекционного провируса, но при этом отличается от последнего рядом целенаправленных модификаций (Chang and Gay, 2001).

Поскольку сайты-мишени для анти-ВИЧ siPHK подбирались на основании последовательности инфекционного изолята ВИЧ-1 субтипа А, для подтверждения их присутствия в структуре псевдолентивирусных транскриптов проводилось сравнение последовательностей последних с последовательностью инфекционного вирусного изолята. В ходе анализа были обнаружены совершенные или частично вырожденные сайты-мишени для восьми siPHK в областях генов gag и pol, несплайсированного gag-pol транскрипта упаковочной плазмиды psPAX2, служащего матрицей для трансляции структурных белков и ферментов репликации псевдолентивирусной частицы (см. Табл. 5). Наличие сайта-мишени в области gag в структуре векторного транскрипта плазмиды pWPI, который упаковывается в лентивирусный капсид в качестве переносимого РНК-генома, делает его мишенью для двух из восьми описанных выше интерферирующих РНК (anti-Gag-1 и anti-Gag-1-27).

Мишени для siPHK в гене поверхностного вирусного гликопротеина env (anti-HIV-5 и anti-HIV-5-27) не обнаруживаются в структуре псевдолентивирусных транскриптов. Таким образом, последние две мишени можно использовать в качестве отрицательного контроля - эффекта siPHK, не нацеленными на транскрипты псевдолентивирусной системы, на упаковку псевдовирусов in vitro.

Подавление продукции псевдолентивиоусов в клетках линии НЕК-293Т путем коэкспрессии siPHK. направленных против разных мишеней в лентивирусном геноме

Примененная нами псевдовирус-клеточная система состоит из двух модулей: экспрессия лентивирусного генома в составе трансфецируемых плазмид (в клетках-продуцентах) моделирует экспрессию генома интегрированного провируса ВИЧ в инфицированных клетках, а полученные в клетках-продуцентах псевдолентивирусные препараты могут использоваться для инфекции клеток-мишеней и моделирования ранних, прединтеграционных стадий инфекции. В данном исследовании ингибирующее действие siPHK наблюдалось в клетках-продуцентах линии НЕК-293Т, где подавлялась экспрессия вирусных транскриптов, комплементарных последовательностям конкретных siPHK, что отражалось на инфекционном титре образующегося вирусного препарата. Клетки-мишени той же модельной линии НЕК-293Т использовались для точного количественного определения инфекционного титра препаратов, полученных в клетках-продуцентах под действием РНК-интерференции и без нее.

Снижение титра образующегося в клетках-продуцентах псевдолентивирусного препарата происходит вследствие РНК-интерференции, вызванной коэкспрессией анти-ВИЧ siPHK, направленных против мишеней, присутствующих в транскриптах мультиплазмидной системы лентивирусной экспрессии in vitro.

Так, котрансфекция плазмид экспрессирующих siPHK, специфичных к мишенями в областях gag и pol (см. Табл. 5) с плазмидами лентивирусной экспрессии может вести к посттрансляционнному сайленсингу и/или деградации несплайсированного gag-pol транскрипта упаковочной плазмиды psPAX2. В результате снижения уровня синтеза структурного вирусного белка Gag и вирусных ферментов, кодируемых единой рамкой считывания Pol (в которую входят вирусные протеаза, обратная транскриптаза и интеграза), количество появляющихся полноценных псевдолентивирусных частиц также будет снижаться. В то же время ни одна из указанных siPHK не будет влиять на экспрессию двух полностью сплайсированных транскриптов упаковочной плазмиды, трансляция которых приводит к образованию важнейших регуляторных лентивирусных белков. Rev и Tat.

Таблица 5. Последовательности, соответствующие в геноме ВИЧ-1, нуклеотвдные несовпадения с гранскрипгами-мишенями в псевдолентивирусной системе и эффективность РНК-интерференцни.____

Генетическая конструкция и ее мишень в геноме геноме ВИЧ-1 (AF316544) Мишень в псевдолентивирусной системе Последовательность siPHK и количество нуклеотидных несоответствий с транскриптом-мишенью в псевдолентивирусной системе* Процент подавления

anti-HlV-l (2435-2457 п.н.) /23 п.н. anti-HIV-1-27 (2435-2461 п.н.) /27 п.н. (pol) обратная транскриптаза psPAX2 (gag-pol транскрипт) AAACAUCAGAAAGAACCUCCAUU (0) AAACAUCAGAAAGAACCUCCAUUCCUU (0) 83 87

anti-HIV-2 (2309-2327 п.н.) /19 п.н. anti-HIV -2-27 (2304-2330 п.н.) /27 п.н. (pol) обратная транскриптаза psPAX2 (gag-pol транскрипт) AUAGU(G/C)AUCUA(C/U)CAAUACA (2) CAGA(A/C)AUAGU(G/C)AUCUA(C/U)CAAUACAUGG (3) 10 25

anti-HIV -3 (3905-3923 п.н.) /19 п.н. anti-HIV 3-27 (3901-3927 п.н.) /27 п.н. (pol) интеграза psPAX2 (gag-pol транскрипт) GUA(G/A)U(G/A)GAAUCUAUGAAUA (2) AGGAGUA(G/A)U(G/A)GAAUCUAUGAAUAAAGA (2) 48 40

anti-GAG 1 (3-21) /19 п.н. anti-GAG 1-27 (1-27) /27 п.н. (gag) белок вирусного капсида р17 5' район gag в транскрипте pWPl и в gag-pol траскрипте psPAX2 GCGAGAGCGUCA(A/G)UAUU AA (1) GUGCGAGAGCGUCA(A/G)UAUUAAGCGGGG (1) 90 60

anti-HIV -5 (6380-6397 п.н.) /18 п.н. anti-HIV -5-27 (6376-6402 п.н.) /28 п.н. (env) поверхностный гликопротеин gp!20 Отсутствует GGACAAGCCUUCUAUACA (18) ACCAGGACAAGCCUUCUAUACAAACAG (28) 30 30

Примечание. * - В нуклеотидных последовательностях в скобках и через знак «/» указаны нуклеотвдные несоответствия в последовательностях $]РНК/транскрипта-мишени, после последовательностей в скобках приводится общее количество неспаренных нуклеотидов.

Деградация транскрипта плазмиды pWPI, который должен упаковываться в псевдолентивирусные частицы и переносить при инфицировании репортерный трансген eGFP, вследствие котрансфекции плазмид anti-Gag-1 или anti-Gag-1-27, может приводить к сборке псевдовирусов без векторного трансгена, что также будет отражаться как снижение титра псевдолентивирусного препарата, определяемого методом проточной цитометрии (см. Рис. 11).

Как видно из приведенных данных (см. Табл. 5; Рис. 10), высокая эффективность анти-ВИЧ siPHK (от 60 до 90% снижения титра образующегося псевдовируса) ассоциируется со слабо вырожденными сайтами-мишеням (не более одного несоответствия между последовательностями интерферирующей РНК и транскрипта-мишени), в то время как 2 или 3 нуклеотидных замены в области мишени характеризовали siPHK с низкой эффективностью (10-30%).

Рисунок 11. Эффективность подавления репликации псевдолентивирусов в клетках-продуцентах с помощью анти-ВИЧ siPHK:

а - снижение титра образующегося лентивируса под действием индивидуальных интерферирующих РНК. Эффективность подавления для каждой индивидуальной РНК определялась как снижение титра образующегося лентивируса по отношению к контрольному препарату, получаемому в отсутствии интерферирующих РНК. Anti-HIV-5 и Anti-HlV-5-27 служили в качестве отрицательного контроля, поскольку не имели гомологичного сайта-мишени в последовательностях транскриптов векторной и упаковочной плазмид;

б - анализ эффективности подавления образования псевдолентивирусов под действием Anti-HIV-1 siPHK методом проточной цитометрии. Гистограмма распределения флуоресценции зеленого флуоресцентного белка в клетках, инфицированных лентивирусным препаратом, полученным в отсутствие siPHK (левый график), и препаратом, полученным с подавлением лентивирусной экспрессии с помощью Anti-HIV-1 siPHK (правый график).

Котрансфекция плазмид экспрессирующих siPHK anti-HIV-J и anti-HIV-5-27 с лентивирусными плазмидами в принципе не должна направленно подавлять экспрессию лентивирусных генов, потому что в псевдовирусной системе нет участка генома вируса. Тем не менее, обнаружено снижение титра образующегося в результате такой трансфекции лентивируса до 30% от контрольного, что, возможно, объясняется общей активацией клеточного механизма ответа на появление двуцепочечных РНК и ее влиянием на упаковку псевдолентивируса в клетках-продуцентах. Характерно, что такой же уровень эффективности ингибирования выявляется и для siPHK с сильно вырожденными мишенями (2 или 3 нуклеотидных замены), что позволяет считать характер их воздействия также, в большей степени, ненаправленным (неспецифическим).

Ранее показано, что наиболее эффективным критерием для определения сайтов-мишеней для анти-ВИЧ siPHK является выбор эволюционно консервативных последовательностей в вирусном геноме (ter Brake et al., 2006), но и в этом случае оказывается необходимым тестирование десятков или сотен вариантов шпилечных РНК для выбора нескольких, обладающих высокими ингибирующей активностью и надежностью против селекции escape-вариантов вируса (ter Brake et al., 2006; Eije et al., 2009). Схема отбора таких «терапевтических» интерферирующих анти-ВИЧ siPHK, обладающих двумя вышеуказанными свойствами, предполагает первичный массовый прескрининг shPHK для отбора высокоэффективных ингибиторов и их дальнейшей проверке в вирус-клеточных системах с многократным репликационным циклом вируса. Последние позволяют подтвердить низкую вероятность появления вирусных escape-вариантов, уходящих от подавления интерферирующими анти-ВИЧ siPHK, и требуют использования препаратов инфекционных изолятов ВИЧ-1, лимфоидных клеток-мишеней и длительного времени селекции потенциальных беглецов (от 14 до 100 дней) (Eije et al., 2009). В то же время массовый скрининг анти-ВИЧ shPHK возможно проводить в модельных клеточных линиях,

20

II

У У J У У У У У у s у у у у у s у

например, НЕК-293Т (Eije et al., 2009), e использованием нескольких различающихся подходов. Последние основаны на котрансфекции анти-ВИЧ siPHK и лентивирусных последовательностей-мишеней, но, в зависимости от использованной в них модели, разделяются на безвирусные и вирус-клеточные (Табл. 6) (Westerhout et al., 2006; Чуриков и др., 2008; ter Brake et al., 2006; Eije et al., 2009; Gao et al., 2008).

Данная псевдолентивирус-клеточная система представляет собой удобную платформу для массового скрининга эффективных анти-ВИЧ siPHK, обладающую рядом преимуществ как перед безвирусной системой, так и перед вирус-клеточной системой с использованием инфекционного провируса (см. Табл. 6). Вирусная геномная РНК в клетках, продуцирующих ретровирусные белки и частицы, оказывается доступной для РНК-интерференции только в короткое временное окно с момента ядерного экспорта до упаковки в капсид на внутренней мембране, а не постоянно, как в безвирусной системе (Gao et al., 2008). Соответственно и оценки активности siPHK в вирус-клеточных системах с большей точностью отражают величину прогнозируемой терапевтической эффективности таких препаратов. Кроме того, использование псевдовируса всегда предпочтительнее инфекционного, так как требует соблюдения более низкого уровня биологической защиты и позволяет удобное клонирование дополнительных ВИЧ-1-мишеней в составе лентивирусного вектора.

Таблица 6. Вирус-клеточные и безвирусные методы скрининга эффективных анти-ВИЧ siPHK

Котрансфекции Метод Мера эффективности подавления и метод измерения Клетки-мишени Ссылки

Анти-ВИЧ эЬР! 1К + плазмида с репликационно-компетентным провирусом ВИЧ-1 (например, рЬА!) Вирус-клетка Продукция вирусных частиц (ВИЧ-1 р24 ИФА) 293Т (Westerhout et aL, 2006)

Анти-ВИЧ вЬРНК + экспрессионная кассета репортерного гена, слитого с лентивирусной мишенью Безвирусный Экспрессия репортерного гена 293Т (Чуриков и др., 2008)

Анти-ВИЧ эЬРНК + набор плазм ид лентивирусной экспрессии (например, р\УР1 + рвРАхг+рмог.о) Вирус-клетка Продукция псевдовирусных частиц (инфекционный титр, детекция вирусного трансгена в клетках-м ишенях) 293Т (ter Brake et al., 2006; Eije et al., 2009; Gao et al., 2008)

Сравнение активностей изученных нами анти-ВИЧ siPHK с наличием нуклеотидных замен между последовательностями интерферирующей РНК и транскрипта-мишени показывает, что только эффекторные молекулы с не более чем одним неспаренным нуклеотидом в сайте связывания мишени проявляют высокую эффективность ингибирования. Это согласуется и с данными о появлении вирусных вариантов-беглецов, уходящих из-под контроля интерферирующих РНК за счет единственной нуклеотидной замены в сайте-мишени (Eije et a I., 2009). Впрочем, даже эффективные анти-ВИЧ siPHK с одним и тем же сайтом связывания мишени могут существенно отличаться друг от друга по активности (anti-Gag-1 и anti-Gag-1-27, 90 и 60% активности, соответственно). Схожие результаты по эффективности и надежности подавления инфекционного варианта вируса в транзиторной трансфекции и в вирус-клеточной системе с многократной репликацией получены для последовательной серии перекрывающихся siPHK, имеющих в качестве мишени консервативную последовательность, включающую в себя кодон инициации Gag и демонстрирующих разброс эффективности и надежности подавления от 50 до 90% (Eije et al., 2009).

Таким образом, в настоящее время поиск терапевтически пригодных анти-ВИЧ siPHK видится как массовый скрининг серий таких молекул к консервативным или репликационно важным последовательностям генома ВИЧ-1 и отбор эффективных для дальнейшей проверки их надежности

(подавление escape-вариантов). Псевдолентивирус-клеточная система представляется идеально предназначенной для безопасного скрининга эффективности антиретровирусных интерферирующих РНК.

Генетические конструкции, экспрессируюшие siPHK. не вызывают активации неспеиифического интерферон-зависимого ответа

У высших многоклеточных имеется врожденная иммунная система, направленная на предотвращение развития инфекции. Принцип функционирования врождённого иммунитета основан на обнаружении присутствия компонентов вирусов или бактерий, и последующем изменении экспрессии генов способных противодействовать инфекции. Основной реакцией врожденного иммунитета на инфекцию является интерферон-опосредованный ответ, приводящий к активации т. н. интерферон-стимулируемых генов (ИСГ). Многие из этих генов участвуют в стрессовой реакции при антивирусном ответе (Haque and Willians, 1998; Stark et al., 1998). Одним из индукторов интерферона является двуцепочечная РНК, присутствие которой в том или ином виде характерно почти для всех вирусных инфекций (Обзор в Kumar and Carmichael, 1998). Длинная дцРНК сама по себе вызывает активацию некоторых интерферон-стимулируемых генов (Bandyopadhyay et al., 1995) и неспецифическое уменьшение экспрессии генов (Caplen et al., 2001; Elbashir et al., 2001b).

Использование siPHK также в некоторых случаях приводит к не связанной с РНК-интерференцией активации ИСГ (Bridge et al., 2003; Persengiev et al., 2004; Scacheri et al., 2004; Sledz et al., 2003; Pebernard and Iggo, 2004). Тот факт, что siPHK могут вызвать активацию неспецифического ответа, вызывает законные сомнения в специфичности эффекта той или иной siPHK, и требует осторожной интерпретации результатов РНК-интерференции. Для подтверждения специфичности эффекта конструкций, экспрессирующих siPHK, необходимо показать отсутствие активации неспецифического ответа в клетках.

Молекулы дцРНК длиной около 30 н., введенные в клетки млекопитающих, обладают потенциальной возможностью индуцировать неспецифический интерфероновый эффект (Manche et al., 1992). Поэтому отобранные нами шпилечные конструкции, экспрессирующие 27-нуклеотидные РНК-шпильки, были дополнительно тестированы на возможность такой индукции.

Для обнаружения активации интерферонового пути нами был использован набор реактивов Interferon Detection Kit (SBI). Принцип обнаружения основан на измерении относительных уровней экспресии пяти генов, интерфероновый ответа при помощи ПЦР-амплификации после реакции обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Использование этих пяти генов позволяет надёжно детектировать интерферон-опосредованую стрессовую реакцию в различных типах клеток и при различных условиях. Различные типы клеток могут показывать различное усиление экспресси изучаемых пяти генов. Интенсивность обнаруживаемой активации интерферон-опосредованой стрессой реакции также зависит от концентрации дцРНК-индуктора и типа клеток (данные производителя набора, использованного для анализа).

Таблица 7. Результаты проверки 27-нуклеотвдных шпилечных конструкций на индукцию

неспецнфического интерферонового эффекта

№ Обозначе ннегена Экспрессия в условиях индукции / Экспрессия при отсутствии индукции Экспрессия при введепии шпилечной конструкции / Экспрессия при введении контрольного вектора

1 ß-актин 250/350 = 0,7 160 /180 = 0,89

2 OAS1 225 / 5 = 45 5/5 =1

3 OAS2 25/5 =5 4/3 = 1,3

4 ISGF3y 250 / 75 = 3,3 178/183 = 0,97

5 IFITM1 325 / 220 = 1,48 68/90 = 0,76

6 МХ1 170/5 = 34 6/5 =1,2

Примечание. Экспрессия [З-актина использована в качестве контроля. В третьем столбце показаны соотношения уровней экспрессии маркерных генов при индукции и отсутствии интерферонового эффекта, полученные на контрольной кДНК из Набора. В четвертом столбце показаны данные соотношения для экспериментов с введением шпилечной конструкции и контрольного вектора (исходного вектора без вставки).

Различные линии клеток в развитии неспецифического интерферонового ответа имеют различную чувствительность к дцРНК. Биохимические пути могут также иметь существенные отличия. Тип клетки, условия роста и число сделанных пассажей могут оказать влияние на чувствительность, уровень и интенсивность активации интерферонового ответа. Интерфероновый ответ неизменно возникает при введении дцРНК, и приводит к активации биохимических путей ответа на стресс. Активация ответа,

22

например в НЕК 293 и MRC-5, может быть ясно засвидетельствована увеличением уровня экспрессии OAS1, OAS2, МХ1, ISGF3gamma и IFITMI, после обработки длинной poly(I)-poly(C) дцРНК в низких концентрациях, как 250 нг/мл. Более высокие концентрации, как 2,5 мкг/мл могут вызвать быстрый апоптоз и цитотоксичность в течении 24-48 часов после обработки (данные производителя набора).

Из Таблицы 7 следует, что отобранные нами генетические конструкции, экспрессирующие более эффективные 27-нуклеотидные шпильки РНК, не индуцируют неспецифический интерфероновый эффект в культуре НЕК293Т. Тем не менее, нужно иметь в виду, что само проявление, а также сила эффекта зависит от используемой культуры клеток, силы промотора и прочих условий. Поэтому в возникновение активации неспецифических реакций необходимо проверять снова, в случае значительного изменения какого-либо параметра (например, концентрации плазмиды).

Выводы

1. Определены новые мишени РНК-интерфереиции в транскриптах ВИЧ-1 и в мРНК гена CCR5 человека, которые атакуются биологически активными siPHK.

2. На основе плазмиды psiCHECK-2 создана и испытана система для невирусной количественной оценки эффективности РНК-интерференции, направленной на транскрипты ВИЧ-1 и на мРНК гена CCR5 человека.

3. Обнаружено, что эффективность искусственной РНК-интерференции, которая вызывается генетическими конструкциями, экспрессирующими шпильки РНК, зависит от силы промотора. Наибольшая активность наблюдается при транскрипции под промотором U6, меньшую активность обеспечивал промотор CMV и еще меньшую - промотор U1.

4. Обнаружено, что 27-нуклеотидные шпильки РНК запускают более эффективную РНК-интерференцию, но не в десятки раз более активную, как предполагалось ранее.

5. Экспрессия созданных генетических конструкций в клетках человека не вызывает неспецифический интерферон-подобный ответ.

6. Разработан новый метод для создания кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько siPHK, основанный на использовании олигонуклеотидов, не содержащих внутренних палиндромов, и двух последовательных ПЦР.

7. При молекулярном анализе препаратов РНК, выделенных из клеток человека, трансфецированных кассетными генетическими конструкциями, обнаружены 21-нуклеотидные биологически активные siPHK. Эти данные свидетельствуют о том, что кассетные конструкции в клетках человека активно экспрессируют шпильки РНК, которые процессируются в биологически активные молекулы siPHK.

Список работ опубликованных по теме диссертации.

Статьи:

1. Алембеков И. Р., Кретова О. В., Гашникова Н. М., Покровский А. Г., Чуриков Н. А. 2009. Эффективность РНК-интерференции, вызываемой введением генетических конструкций, экспрессирующих siPHK, зависит от силы промотора. Молекулярная биология, 43(2), 374-377.

2. Алембеков И. Р., Кретова О. В., Чуриков Н. А. 2001. Анализ генетических конструкций, экспрессирующих антивирусные siPHK, в невирусной тест-системе. Вопросы вирусологии, 56(2), 32-35.

3. Чересиз И. С., Григорьев И. В., Чересиз Е. А., Алембеков И. Р., Кретова О. В., Чуриков Н. А., Покровский А. Г. 2011 Изучение антиретровирусных препаратов на основе интерферирующих РНК в псевдовирус-клеточной системе. Вестник ИГУ. Биология, клиническая медицина. 9(1), 5-14.

4. Kretova О. V., Alembekov 1. R., Tchurikov N. А. 2012. Generation of genetic constructs that simultaneously express several shRNAs. Biotechniques, 52(6), 389-391.

Тезисы конференций:

1. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», Москва, 2007 (Чуриков Н. А., Кретова О. В., Моисеева Е. Д., Сосин Д. В., Алембеков И. Р., Торопчина Ю. Н„ Покровский А. Г., Гашникова Н. М. "Создание высокоэффективных шпилечных генетических конструкций, предназначенных для сайленсинга генов HIV-1 в клетках человека". Сборник тезисов, с. 86).

2. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», Москва, 2008 (Чуриков Н. А., Кретова О. В., Моисеева Е. Д., Сосин Д. В., Алембеков И. Р., Торопчина Ю. Н.; Покровский А. Г., Гашникова Н. М. "Создание генетических конструкций и препаратов siPHK, предназначенных для генотерапии СПИДа с помощью РНК-интерференции и способных преодолевать высокую скорость мутирования вируса". Сборник тезисов, с. 151).

3. 14-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2010 (Алембеков И. Р., Кретова О. В., Чуриков Н. А. "Создание высокоэффективных генетических конструкций, предназначенных для генной терапии СПИДа с помощью РНК интерференции". Сборник тезисов, том 2, с. 105).

Работа выполнена при поддержке:

1. Госконтракт Минобрнауки 02.512.11.2066 от 19 февраля 2007 г. "Создание высокоэффективных шпилечных генетических конструкций, предназначенных для сайленсинга генов HIV-1 в клетках человека".

2. Госконтракт Минобрнауки 02.512.11.2259 от 7 июля 2008 г. "Создание генетических конструкций и препаратов siPHK, предназначенных для генотерапии СПИДа с помощью РНК-интерференции и способных преодолевать высокую скорость мутирования вируса".

3. Грант CRDF RUB2-2960-M0-09. "Design of chimerical expression cassettes producing biological active siRNAs targeting both the conserved regions in HIV-1 transcripts and regions in CCR5 mRNA".

Алембеков Ильдар Русланович Формат 60x90/16 Тираж 100 экз. Подписано в печать 5.02.2015 Заказ № 242 Типография ООО «Генезис» 8 (495) 434-83-55 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86