Ядерная РНК полимераза - IV, альтернативная форма митохондриальной РНК полимеразы

Кравченко, Юлия Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ядерная РНК полимераза - IV, альтернативная форма митохондриальной РНК полимеразы
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ядерная РНК полимераза - IV, альтернативная форма митохондриальной РНК полимеразы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

КРАВЧЕНКО Юлия Евгеньевна

ЯДЕРНАЯ РНК ПОЛИМЕРАМ - IV, АЛЬТЕРНАТИВНАЯ ФОРМА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ РНК ПОЛ ИМ КРАЗЫ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2004

Работа выполнена в лаборатории пролиферации клеток Инс1И1ута молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Научный руководитель

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор П. М. Чумаков.

доктор химических наук, профессор, чл -корр РАН С. Н. Кочетков

доктор биологических наук, профессор А. В. Иткес

Ведущая организация

ГНИИ Генетики и Селекции промышленных микроор! анизмов

Защита диссертации состоится Диссертационного совета Д 002 235 01

Молекулярной биоло! ии им В А Энгелыардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, д 32

У Институте

на заседании

С диссертацией можно ошакомиться в библиотеке Инстшута Молекулярной биолог ии им В А Энгелы ардта РАН

Ав гореферат разослан

ан « ' ^ »

2004 года

Ученый секретарь Диссер! анионного сове, кандидат химических наук

ziSoizX

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Общеизвестно, что транскрипция эукаржмического генома происходит с участием трех ядерных РНК поли мераз, которые разделяют свои функции следующим образом РНК иолимераза I ответственна за синтез 28S и 18S рибосомальиых РНК [Paule, White, 2000J, РНК полимераза II транскрибирует все 1ипы мафичной РНК, то есть участвует в транскрипции всех белок-кодирующих генов, а тюке некоторых нскодирующих РНК [Howe, 2002] РНК полимераза III транскрибирует 5S рибосомальную РНК, фанснортную РНК, 7SL РНК и U6 РНК, а также ряд стабильных малых РНК, участвующих в сплайсинге [Paule, White. 2000] В дополнение к перечисленным ядерным полимеразам, в клетках эукариот присутствует митохондриальная РНК полимераза, представленная одной субъединицей, которая родственна полимеразам бактерий и бактериофагов, ее функция oí раничинае1ся транскрипцией всего 37 генов, находящихся на кольцевой ДНК митохондриального генома [Tiranti, 1997] Митохондриальная РНК полимераза появилась в клетках параллельно с возникновением митохондрий, клеточных органелл, обнаруживающих сходство с архебактериями Как и большинство митохондриальных генов, ген митохондриальной РНК полимеразы находится в ядерном (еноме, на 19 хромосоме, и разделен на 22 экзона Он транскрибируется РНК полимеразой II, и ею белковый продукт далее фанслоцируется в митохондрии, благодаря сигнальному пептиду, расположенному в 41 аминокислотных остатках naN-конце молекулы [Iiranti, 1997]

Обнаружение еще одной ядерной полимеразы эукаротических клеток, способной синтезировагь мРНК и родственной РНК полимеразе митохондрий и прокариот, весьма актуально, поскольку, после недавней расшифровки полной структуры 1енома человека, мыши и других организмов, это открывает новые широкие юризонты для изучения механизмов экспрессии эукариотического генома, а также регуляции работы генов в норме и патологиях

ЦЕЛЬ И ЧАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью работы было изучение открытой нами новой ядерной РНК полимеразы эукариот (РНК полимеразы IV), образующейся в результате альтернативного сплайсинга митохондриальной РНК полимеразы и способной транскрибировать некоторые белок-кодирующие гены В ходе исследования были поставлены следующие задачи

1. Доказать существование новой РНК полимеразы (РНК полимеразы IV)

2. Изучить характер альтернативного сплайсинга гена митохондриальной PIIK полимеразы, приводящий к образованию второю белкового продукта

3. Определить внутриклеточную локализацию РНК полимеразы IV

4. Определить специфические функции исследуемой РНК полимеразы

5. Идентифицировать и охарактеризовать гены, транскрибируемые новой РНК полимеразой

6. Идеи i ифицировать и охарактеризовать промоторы 1енов, iранскрибируемых РНК полимеразой IV

РОС н V "'ПИЛЬНАЯ 1 1 г КА ' '.<>рг

7. Показать способность РНК полимеразы IV к прямому связыванию с промоторами регулируемых ею генов

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

В настоящей работе было впервые доказано существование второй ядерной РНК полимеразы зукариог, способной транскрибировать некоторые белок-кодирующие гены РНК полимераза IV обнаруживает структурную и эволюционную тмологшо с читохондриальной РНК нолимеразой, так как, обе они кодируются одним геном и образуются в результат альтернативного сплайсиша При этом, белок митохондриалыюй РНК полимеразы размером 135кД кодируется основным транскрип юм гена РОБЯМТ, и имеет строю митохондриальную локализацию Второй транскрипт кодирует белковый продует размером 110кД, который транслируется, начиная с 6-го АТО кодона альтерна!ивной рамки счи!ывания расположенного в третьем жзоне В результате образующийся белок не содержит сигнала транспорта в митохондрии и локализуется в ядре Эта форма белка была определена нами как РНК полимераза IV

Нами было показано, что транскрипция генов РНК полимеразой IV, устойчива к специфическому ингибитору РНК полимеразы II а-аманитииу, а также демонстрирует ¡начи тельную активацию в ответ на окислительный стресс

В процессе работы была идентифицирована группа генов, транскрибируемых данной полимеразой, к их числу относятся такие гены, как РЮЗ (р53-индуцируемый ген 3), Д1ПН12 (альдетид дегидрогеназа 12), МОС3265 (предшественник пренилцистеин оксида >,ы), 7ВТВ1 (белок, содержащий Хп-Агщег и ВТВ домен 1)

Было установлено, что промоторы указанных 1енов кардинальным образом отличаются по своим свойствам от промоторов, контролируемых РНК полимеразой II, в гом числе, было обнаружено, что на их активность не оказывают влияния транскрипционные эцхансеры, которые стимулируют активность промоюров, контролируемых РНК полимеразой II

Была тюке выявлена способность РНК полимеразы IV к прямому связыванию с промоторами транскрибируемых ею генов

Гибридизацией с упорядоченным набором клеточных РНК (микроарреи фирмы АйутеШх) была произведена приблизительная количественная оценка генов, транскрибируемых РНК полимеразой IV, по предварительным оценкам РНК полимераза IV может участвовать в транскрипции до 3-5% всех генов

Полученные ре)ульгаты обеспечивают широкий спектр направлений для дальнейших научных исследований, а также для их практического применения В частности, благодаря независимости активности промоторов, транскрибируемых РНК полимеразой IV, от находящихся в их окружении транскрипционных энхансеров данные промоторы мо1ут найти применение в экспрессионных векторных системах, комбинирующих конститутивные и регулируемые промоторы Более того, устойчивость РНК полимеразы IV к а-аманитину и ее активация в ответ на окислительный стресс может быть использована для регулируемой жспрессии генов, помещенных под промоторы, узнаваемые РНК полимеразой IV Очищенная РНК полимераза IV может использоваться для

транскрипции т vitro Отдельные функциональные элементы белка данной полимеразы могу i быть использованы в качестве мишеней для модификации ее функций, а также, для создания диагностических проб и селекции специфических препаратов

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы диссертационной работы были доложены на международном симпозиуме "р53 & beyond", Москва, май 2004, на семинаре департамента молекулярной биологии I-erner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation, Кливленд, США, апрель, 2004, на коллоквиуме лаборатории пролиферации клеток, Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта, Москва, май, 2004

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.

Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков и 9 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка лигературы (всего 162 ссылки)

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обнаружение аномального поведения транскрипта гена PIG3 в ответ на обработку клеток а-аманитином, не характерного для генов, транскрибируемых PIIK нолимеразой II.

При изучении новых биологических активностей мутантных р53 (Pugacheva, Ivanov, Kravchenko, Chumakov, 2002) мы использовали различные обработки, позволяющие установить последова!ельность событий при жспрессии генов, регулируемых р53 Для этою, в частности, применялась обработка клеток ингибиторами транскрипции, такими как а-аманигин (подавляет РНК полимеразу II) При анализе экспрессии р53-индуцируемого гена 3 (PIG3), было получено неожиданное наблюдение в клетках человека различного р53 статуса имеется два транскрипта гена PIG3, размером 1,9 и 2,3 kb, которые обнаруживают различия в регуляции после обработки а -аманитином (Рис 1) Транскрипт размером 1,9 kb, который был описан ранее как р53 регулируемый, исчезал после 14 часовой обработки 15 цг/мл а-аманитином, что согласуется с тем, что он транскрибируется РНК полимеразой II При этом транскрипт размером 2 3 kb не только не снижался после обработки а-аманитином, но и значительно увеличивался, что не имело рационального объяснения, поскольку подавление РНК полимеразы не мо(ло сопровождаться увеличением интенсивности транскрипции

-2300 Ьр -1900 Ьр САРРН

Рис.1 Ноэерн-блот анализ тотальной РНК полученной из контрольных клеток Не1_а (К) и клеток, инкубированных в течение 14 часов с 15 цг/мл «-аманитина (ММ) и гибридизованной с пробами к генам РЮЗ и 6АР0Н

2. Дополнительный фанскршп, размером 2,3 кЬ, являсюя специфичным и кодируется геном РЮЗ.

Для дальнейшего и ¡учения необычной реакции транскрип к>в гена РЮЗ на обработку а -аманитином следовало подтвердить, что дополнительный транскрипт размером 2,3 кЬ не является гибридизационным артефактом и кодируется геном РЮЗ Для этого транскрипты гена РЮЗ подавляли используя феномен РНК-интерференции Это достигалось экспрессией в клетках НеЬа с помощью лентивирусного вектора р1,81,(1 малой шпилечной РНК, содержащей двуцепочечный участок 19-21 пар оснований, комплементарный участкам экзонов гена РЮЗ Такие шпилечные РНК процессируется клеточными ферментами до образования двуцеиочечньгх 81РНК, которые в цитоплазме взаимодействуют с мРНК, выбранной в качестве мишени, и вызывают ее ускоренное разрушение Через 48 часов после введения конструкта из клеток была выделена тотальная РНК и проанализирована с помощью Нозсрн-1 ибридизации с пробой, соответствующей гену РЮЗ Количество как 1,9. так и 2,3 кЬ транскриптов гена РЮЗ существенно уменьшалось после введение 41РНК. что указывает на ю, что обе формы РНК транскрибируются с 1 ена РЮЗ (Рис 2)

^ л-^ *

Рис.2 Нозерн-блот анализ тотальной РНК из клеток Не1а, через 48ч после введения аРНК специфичного м гену РЮЗ и гибридизованной с пробами к генам РЮЗ о и в АРОН (К) - контроль, (рЦэЦЗ)- клетки с введенным 5! пустым вектором (аРКЗЗ) - клетки с введенным аРНК специфичным гену РЮЗ

-2300 Ьр -1900 Ьр вАРОН

ШИШк

3. Идентификация и а на. ни транскриптов, которые, подобно второму транскрип гу I ена РЮЗ, акт ивируюгея в ответ на обработку а -аманитином.

Мы задались целью выявить дру!ие гены, обладающие аналогичной реакцией на а-аманигин Для згою гибриди¡ацией с упорядоченными наборами

последова1ельностсй мРПК человека (микроарреи кДНК человека фирмы АРГуте1пх) были установтены транскрипты, количество которых увеличивается в 2 и более раз в препаратах готальной РНК клеток НеЬа, обрабо1анных а -аманитином Как и ожидалось, основная часть транскриптов оказалась чувствительной к а-аманитину, чго соглас>ется с поведением мРПК, транскрибируемых РНК полимеразой II Тем не менее, было выявлено несколько десятков транскриптов, количество которых заметно увеличивалось в ответ на обработку а-аманитином Естественно было предположить, что в клетках чаегь транскриптов обладает повышенной стабильностью, в результате чего их относительное количество может повышаться на фоне более коро1Коживущих РНК, такие транскрипты также могут оказаться в списке а-аманитин устойчивых мРНК, наряду с истинно а-аманитин устойчивыми транскриптами Для выявления истинных а-аманитин устойчивых транскриптов нами было отобрано 15 генов из общего списка и подвергнуто количественному анализу с помощью ПЦР после обратной транскрипции матриц (метод ОТ-ПЦР) Для этою использовали специфические олигонуклеотидные праймеры, соответствующие экзонам каждою из 15 генов Сравнению были подвергнуты препараты РНК клеток ПеТ.а, инкубированных с а-аманиганом и без (Рис 3) Из пятнадцати протестированных транскриптов одиннадцать обнаружили чувствительность к а-аманитину, что характерно для РНК, транскрибируемой РНК полимеразой II Однако, четыре транскрипта (генов МОСЧ265, АШН12, ХВТВ1, К1АА0810) обнаружили устойчивость/увеличение в ответ на обработку а-аманитином

МвС3265\ А1.РН гвТВ1 К1АА0810\51.С25А10 К А К [К Л К А К А

РЫ12442 эюомз ивхй1 РЕСН

... К А.......... К_А_ Ж_А— _К__ ____К_А_

РОХЯ 2 АТР51 ЫОиРВ7 йСХЙ АКЯ72

К А К А К А К А К А

Рис.3 Результаты ОТ-ПЦР на РНК выделенной из контрольных Не1_а клеток (К) и клеток обработанных а-аманитином (А) с использованием специфических праймеров на гены отобранные после анализа микрофреев

4. Характеристика транскрипции генов РЮЗ, МОС3265 и АЫ)Н12.

Мы сосредоточились на анализе транскрипции генов МОС3265 и /\LDII12, которые продемонстрировали наиболее выраженную устойчивость к а -аманитину

С помощью Позер!1-1ибрити5ации бьпо показано зависимое ог дозы а -аманитипа увеличение уровня транскрипции данных генов (Рис 4)

HeLa

А AM (мкг /мл) К 5 - ° £ К

А431

ААМ (мкг/мл)

О Ш и

т* т- Л

MRC5

ААМ (мкг /мл)

^ от

в «о ч-

Ж^вв^ яиШ *

РЮЗ

MGC3265

ALDH12 р21 GAPDH

Рис.4 Нозерн гибридизация тотальной РНК полученной из контрольных клеток HeLa А431 MRC5 (К) и клеток инкубированных в течение 12 часов с разными дозами а-аманитина (ААМ) (от 0 5 до 15 мкг/мл ) Гибридизация с мечеными пробами для генов РЮЗ MGC3265 ALDH12 p21 Wa" и GAPDH

В качестве положительного контроля был использован ген РЮЗ (верхний транскриит размером 2,3kb) а в качестве отрицательного - р53 регулируемый ген p21 Wafl Результат был воспроизведен независимо на трех линиях клеток (HeLa, Д431 и MRC5) При этом гены p21 Wafl и GAPDH демонстрировали зависимое oi дозы а -амани тина снижение транскрипции, в то время как транскрипция генов РЮЗ, MGC3265 и ALDII12 демонстрировала обратную зависимость, усиливаясь по мере увеличения концентрации ингибитора, что совершенно нехарактерно для Iенов, транскрибируемых PIIK полимеразой II

Пьпаясь найти объяснение обнаруженному зффекту, в результате которого уровень транскрипции исслечуемых ichob значи[ельно увеличивался после обработки интибиюром РНК полимеразы II а -аманигином мы решили протестировать действие некоторых других обработок на транскрипцию выбранных генов В частности, клетки Hei а обрабатывали перекисью водорода (Н2О2), ингибиторами различных кина!, а также облучали t'V Уровень "жсгтрессии iенов РЮЗ, MGC3265 и AIDHI2 определяли с помощью Нснерн-тибриди!апии PIIK полученной из обработанных клеток (Рис 5) В peiv.ibiaTe было обнаружено что инкубация с 0,5 мМ Н2О2 в несколько раз увеличивала уровень депрессии РЮЗ, MGC3265 и МХ)Ш2, что свидетельствует об активации данных генов пот тействием окислительного стресса Кроме того было обнаружено, что танные 1ены активир\ются татгже после обработки ингибитором широкою спектра серии- феониновых киназ Н7 (100 иМ чл) Интересно, чга 117 также является ингибитором РНК почимеразы II подавляя активацию этого фермента и поэтому полученный результат хорошо согласуется с )ффекюм а-

ачанитина Таким образом, нами было установлено, что транскрипция генов РЮЗ, МОС3265 и А1Л)Ш2 повышается в ответ на обработку ингибиторами РНК полимеразм И, кроме тою, транскрипция данных 1енов активируется при окислительном стрессе

PIG3

MGC3265

ALDH12 GAPDH

Рис.5 Нозерн-гибридизация

тотальной РНК полученной из контрольных клеток Не1_а (К), а также клеток после обработки Н2О2 11\/ имитатором гипоксии диффероксамином (ИРО),

ингибиторами Р13 киназ ЦМоПтапт), серин-треониновых киназ (Н7), МЕК I и II киназ (Р098039) ЕвРЯ (АС1478) тирозиновых киназ (Септет) а также а-аманитином (ААМ) Блот гибридизовался с мечеными пробами для генов РЮЗ МвС326б АиЗН12 и вАРОН

5. Экспрессия генов, устойчивых к а -аманитину, возрастает после подавления РНК полимераз I или II.

Чтобы установить имеет ли РНК полимераза II или I отношение к транскрипции 1енов РЮЗ, MGC3265 и А1ШИ2 в клетках Hela с помощью лентивирусного вектора pLSI.G были прозкспрессировапы siPIIK, специфичные, соответственно, генам больших субъсдиниц РНК полимераз I или II Клетки собирались в течение четырех дней после введения siPIIK; на выделенной из них тотальной РНК был поставлен Нозерн, после чего бло1 гибридизовался с меченными кДИК пробами, специфичными для больших субъединиц РНК полимеразы I и И, соответственно, а также для генов РЮЗ, MGC3265, ALDH12 и GAPDII В качестве контролей была использована РНК, полученная из контрольных клеток, клеток обработанных а -аманитином, и клеток зараженных пустым вектором pLSLG (Рис 6) Было обнаружено, что в ответ на подавление РНК полимера! I или II уровень транскрипции генов РЮЗ, MGC3265 и ALDH12 не только не снижался, но, напротив, значительно активировался, усиливаясь в течение нескольких дней после заражения В то же время, транскрипты тена GAPDH, а также самих РНК полимера! I и II после введения siPIIK существенно снижались

IIa основании полученных выше результатов, нами был сделан вывод, что РНК полимераза II, ответственная за транскрипцию всех белок-кодиругощих генов, так же как и РНК полимераза I, скорее всего, не участвуют в транскрипции генов РЮЗ, MGC3265 и AI,DIU 2 К сожалению, с помощью siPIIK не представлялось возможным подавить РНК полимеразу III, поскольку эта полимераза контролирует транскрипцию siPHK на промоторе гена H1RNA в составе лентивирусного вектора

Однако, мы исключи ти во(можное участие РНК полимераш III с помощью другого подхода основанною на измерении чувствительности к обработке доксорубшшном в концентрациях, способных преимущественно подав тять РНК полимеразу III Клетки Hela обрабатывали разными концентрациями доксорубиншта, после чего Нозернчибри щзацией было установлено, что подавление РНК полимеразы III не влияет на уровень транскрипции генов РКП, MGC3 265 и АI .DI 112 (Рис 7)

О (Л

дни после инфекции

й -

К а < 1 2 3 4

РЮЗ MGC3265 ALDH12

12 3 4

^ ш

Г» A DHU ^

чЭНгиП ъ

u__НЕЙ.

Рис. 6 Нозерн-гибридизация тотальной РНК полученной из контрольных клеток Не1_а (К) клеток обработанных <;-аманитином (ММ) либо после четырех дней экспрессии этРНК к генам РНК полимераз I (ЯЫАР1) или II (РЫАРН) а также клеток в которые в качестве контроля был введен пустой вектор (рЦ^б) Блот гибридизовался с мечеными пробами для генов РЮЗ МСС3265 АШН12 вАРЭН а также для РНК полимераз I (ЯЫАР!) и II (РМАРП)

доксорубицин (нг/мп)

_ о о

к 2 2 о «

РЮЗ MGC3265 ALDH12

Р21 GAPDH

'ШФ1- тт щшл "шш-РР

Рис. 7 Нозерн-гибридиззция тотальной РНК полученной из контрольной линии Не1_а (К) и НеЬа обработанных разными дозами доксорубицина (от 10 до 150 нг/мл) гибридизованный с мечеными пробами к генам РЮЗ МСС3265 АШН12 р21 №М,САР0Н

6. Экспрессия а-а мл и huí и усюйчивых генов снижается после специфическо! о подавления митохоидриальной РНК полимеразы.

Так как, мы установили, что в фанскрипции генов PIG3, MGC3265 и A.LDII12 РНК полимеразы I. II и III, по-видимому, не участвуют, мы решили проверить, не может ли митохондриальная РНК полимераза каким-то образом участвовать в транскрипции тгих генов Нами были подобраны siPIIK, специфичные для жзонов гена митохоидриальной PIIK полимераш После их экспрессии в клетках HeLa в составе вектора pLSLG, клетки собирались в течение четырех дней, выделяли тотальную РНК и анали ¡ировали Нокгрн-гибридизацией с меченными кДНК пробами, специфичными для тенов PIG3, MGC3265, ALDH12 и GAPDH, а также для гена самой митохоидриальной PIIK полимеразы (Рис 8)

Ьыло обнаружено, что, несмотря на существенное снижение уровня самою транскрипта митохоидриальной РНК полимеразы, с первого по третий день экспрессии siPHK, обнаруживалось значительное увеличение транскрииции анализируемых генов, и только на четвертый день экспрессии siPHK наблюдалось некоторое снижение При этом на экспрессию юна GAPDH введение мРНК к миюхондриальной РНК полимеразе влияния не оказывало

¡jj дни после инфекции К а 1 2 3 4

Рис. 8 Нозерн-гибридизация тотальной РНК полученной из контрольных клеток HeLa (К), клеток экспрессирующих а течение четырех дней аРНК к гену метохондриальной РНК полимеразы (si-mtRNAP) а также клеток в которые для контроля был введен пустой вектор ( plSLG) Блот гибридизовался с мечеными пробами к генам PIG3 MGC3265 ALDH12 GAPDH, а также митохоидриальной РНК полимеразы (mtRNAP)

Мы предположили, что наблюдаемое повышение транскрипции исследуемых генов объясняется их индукцией под действием окислительного стресса, развивающегося за счет повреждения митохондрий после подавления синтеза митохоидриальной РНК полимеразы Это предположение было основано на вышеприведенных наблюдениях, указывающих на активацию транскрипции тех же генов после обработки Н2О2 (Рис 5)

Действительно, развитие окислительною стресса обнаруживалось FACS анализом путем измерения внутриклеточной) уровня ROS в контрольных клетках HeLa и в клетках с митохоидриальной РНК полимеразой, подавленной экспрессией siPHK (Рис 9).

PIG3 MGC3265 ALDH12 GAPDH

ШШЯЯВЯШШтшаеш

si-mtRNAP

mtRNAP

■г

Рис. 9 Результаты FACS анализа на контрольной линии Hela (control) и на клетках HeLa экспреосирующих в течение двух дней siPHK к гену митохондриальной РНК полимераэы (si-mrtRNApol) Внутриклеточный уровень ROS был измерен инкубацией клеток с флуоресцентным препаратом дихлордигидрофлюоресцеином (DCF)

Чтобы исключить влияние эффекта, вызванного окислительным cipeccoM, нами была получена линия клеток (рО), не содержащая активных митохондрий, и, следовательно, не продуцирующая миюхондриальныч ROS Для этого клетки Hola в течение четырех недель пассировали в прису1ствии 50 hi 'мт брочисюго этидия на специальной среде Отсутствие активных митохондрий было детектировано с помощью реагента MitoTracker Red (Рис ]0)

контроль рО

Рис. 10 Окраска клеток на активные митохондрии реагентом MitoTracker Red контрольная линия Hela и рО Hela не содержащая митохондриальной ДНК

После этою, в клетках рО Пе1а экснрессировали slPПK к митохондриальной РНК по тимеразе, и ставили Нозерн гибридизацию с РНК, полученной на чет вер гай день экспрессии Ьло! отжигался с меченной кДПК для тенов РЮЗ МОС3265, А1 ПН12 и ОАРОИ (Рис 11) При лом было обнаружено значительное снижение \ровня

экспрессии исследуемых генов

Рис. 11 Ноэерн-гибридизация тотальной РНК полученной из контрольных (К) клеток рО Не1а из клеток на четвертый день экспрессии 51РНК к гену митохондриальной РНК полимераэы (эь-п^РМАР) а также клеток в которые в качестве контроля был введен пустой вектор (рЬЭиЗ) блот гибридизовался с мечеными пробами к генам РЮЗ МЧС3265 АШН12 вАРОН а также к гену митохондриальной РНК полимераэы (тНШР)

О -i И

о.

Cl <

Oí «ri

*3>

PIG3 MGC3265 ALDH12 GAPDH mtRNAP

Подавление митохондриальной РНК полимерам в клетках рО HeLa не приводило к какому-либо увеличению уровня ROS, что определялось ГЛСЯ анализом (Рис 12)

Рис. 12 Результаты FACS анализа на контрольной линии рО HeLa (control) и на клетках рО HeLa экспрессирующих в течение двух дней siPHK к гену митохондриальной РНК лолимеразы (si-mit RNApol) Внутриклеточный уровень ROS измеряли после инкубации клеток с флуоресцентным препаратом дихлордигидрофлюоресцеином (DCF)

Таким обраюм, митохондриальная РНК полимераза, действительно, имеет отношение к транскрипции генов РЮЗ, MGC3265 и ALDII12, обнаруживающих устойчивость к а -аманитину, что подтверждается факт ом снижения уровня транскрипции исследуемой группы генов после специфического подавления митохондриальной РНК полимеразы siPHK

7. Белок, узнаваемый антителами к митохондриальной РНК полнмеразе обнаруживается как в читоховдрнях, так и п ядре.

Как и большинство митохондриальных генов, ген митохондриальной РНК полимеразы находится в ядре и, соответственно, митохондриальная РНК полимераза поступает в митохондрии уже после синтеза на полирибосомах цитоплазмы Транслокация в митохондрии осуществляется !а счет специфической последовательности в N-концевой части белка Однако, если митохондриальная РНК полимераза как-то участвует в транскрипции немитохондриальных (ядерных) генов, она должна обладать способностью проникать в ядро и там осуществлять свою функцию Для определения местонахождения митохондриальной РНК полимеразы мы использовали метод иммунофлуоресцентното анализа препаратов клеток HeLa после окраски антителами, реагирующими с пептидом, расположенным в С-концевом сегменте митохондриальной РНК полимеразы

Далее, мы решили определить распределение митохондриальной РНК полимеразы после стимутяции экспрессии изучаемых нами генов, для чего в течение 14 часов клетки Не1л инкубировали либо с а -ачанитином либо в присутствии 5мМ Н202 (Рис 14) Было обнаружено, чю наблюдается перераспределение ядерного белка с образованием отдельных центров Поскольку перераспределение совпадает со значитетьной стимуляцией транскрипции генов РЮЗ, МОС3265 и ЛЫ)Н12, мы предполагаем, что именно в этих центрах может сосредотачиваться процесс синтеза соответствующих тенов Однако, данный вопрос требует дополнительного изучения

(Рис 13)

Рис. 13 Внутриклеточная локализация митохондриальной РНК полимеразы определенная методом иммунофлуоресценции с антителами специфичными к пелтоду митохондриальной РНК полимеразы Конфокальная микроскопия

Рис. 14 Внутриклеточная локализация белка митохондриальной РНК полимеразы в контрольных клетках после обработки преиммунной сывороткой (1) контрольных клетках НеЬа покрашенных антителами к митохондриальной РНК полимеразе (2) а также после обработки клеток и-аманитином (3) и Н2О2 (4) Иммунофлуоресцентный анализ

8. Существование двух форм белка, детектируемых антителами к митохондриальной РНК полимера ¡е.

Нам представлялось важным определение электрофоретической подвижности ядерной и миюхопдриальной форм белков, реагирующих с антителами к митохондриальной полимеразе Для -этою с помощью Вестерн-анализа мы сравнили белковые экстракты из митохондриальных и ядерных фракций, кроме )Того, для сравнения использовали тотальные белковые экстракты клеток Не1,а и рО НсЬа В тотальном жстракте обнаруживалось две формы белка (Рис 15), одна - размером И5кД, извеиная как митохондриальная РНК полимераза и дополнительная, размером ПОкД При этом митохондриальная фракция со (ержала то 1Ько длиннмо форму бстка ратмером Н5кД, а ядерная фракция только короткую, ратмером 110кД Более тою, в тотальном 'жстрактс белка, полученном из рО клеток, не со (ержащих митохондриальной ДНК (Рис 10) ко1ичес1во верхней (митохондрия плюй) формы быто значительно снижено в то время как количество нижней (ядерной) формы, размером 110 кД, оставалось неизменным

Чтобы подтвердить специфичность обеих форм белка и их отношение к гену митохондриальной полимера!Ы в клетках рО ПеЬа с помощью лентивирусного вектора р[. ЯЬО жспрессировали slPHK, специфичные для экзонов Ч и 17 гена

митохондриальной РНК полимсразы (РОЫШТ), тотальный белковый лизат и! них клеток также был нанесен на Вестсри-б.км Ьыло обнаружено практически по шос исчезновение обеих форм бетка, детектируемых антителами к митохондриальной РНК полимеразе, что укашвает на ю, что обе формы содержат последовательности •жюнов гена РОЬИМТ

' I

| ^^ШР ^ ' I

110К

)

Ней Не!_а (рО)

Рис. 15 Вестерн-анализ экстрактов белка полученных из клеток Не1.а и рО Не1а с использованием антител специфичных экзонам гена Р01ДМТ (К) - тотальный белковый экстракт (М) - митохондриальная фракция (Я) - ядерная фракция ф-РЫА) - белковый экстракт из клеток экспрессирующих8|РНКкгенуР01КМТ

Одним из объяснений происхождения второй укороченной (ядерной) формы белка может быгь поеттранстяционный гтроцессин| поттгора!мсрного продукта трансляции Чтобы проверить такую возможность в клетки рО НеЬа с помощью леншвирусного вектора рЬУ была введена полноразмерная кДНК гена митохондриальной РНК полимсразы По истечении двух дней белковые продукты определялись с помощью Вес I ерн-анали ¡а с использованием антител к митохондриальной РНК полимеразе, результаты которого показали значительное увеличение количества длинной формы белка, размером П5кД, и неизмененное количество короткой формы 110 кД Ьолее тою, в ядерной фракции, изолированной из этих клеток, даже после гиперэкспрессии митохондриальной РНК полимеразы, белок размером 135кД не появлялся, а количество 110 кД формы белка также оставалось неизменным (Рис 16)

о. о.

§ I

к ОС

Рис. 16 Вестерн-анализ тотальных экстрактов белка (Т) а также ядерной фракции (Я), полученных из рО Не1.а клеток с использованием антител специфичных к митохондриальной РНК полимеразе (К) - контроль (гтйИМАР) - белок, полученный из клеток экспрессирующих полноразмерную митохондриальную РНК попимепаз«

135К 110К

Таким образом, 110 кД форма белка не является продуктом посттрансляционного процессии! а миюхондриальной РНК полимераш, а сингешруется как не5ависичая форма Полненный резутыаг предполагает существование альтернативной формы мРНК, служащей специфической матрицей для синтеза ядерной 110 кД формы белка

9. Дока ¡а 1 ельство существования альтернативного сплайсинга в гене миюхондриальной РНК полимеразы.

Предполагая, что обе формы белка кодируются одним геном, мы реши 1И проанализировав доступные базы данных FST на предмет возможных алыернативных структур мРНК, соответствующих гену POI RMT Особенно нас интересовали ES'I, картирующиеся в 5'-концевой части гена, поскольку эта область кодирует N-копцсвой пептид, отвечающий за миiохондриальнуго локализацию белка Мы допускали варианты сплайсинга при которых эта область белковой молекулы будет отсутствовать При анализе FST мы обнаружили, что 19 FST соответствующих 5'-концевой части тена, поддерживают структуру основною транскрипта, кодирующего митохондриальную РНК полимеразу Однако три HST соответствовали альтернативному транскрипгу, который содержал проксимальные 224 нуклеотида интрона 1 Такой транскрипт содержит зри стоп кодона, происходящие из интрона 1, которые прерывают рамку считывания, используемую для трансляции митохондриальиой РНК полимеразы, в результате чет о следующим вероятным стартом трансляции оказывается начало третьею экзона (Рис 17) Чтобы проверить существование подобного транскрипта в клетках HeLa нами были использованы праймеры, специфичные 5'-участку митохондриальиой РНК полимеразы, на границе между первым экзоноч и интроном (Рис 17)

Рис. 17 Схема альтернативного сплайсинга гена митохондриальиой РНК полимеразы человека (рг 1 рг 2 рг 3) - специфические праймеры для обнаружения альтернативного транскрипта миюхондриальной РНК полимеразы

С помощью ОТ-ПЦР было подтверждено существование двух вариантов алыернативното сплайсинга, один из которых соответствует основной форме, а другой - включает в себя часть первого интрона ого доля составляет 20-25% транскриптов гена POI RMT (Рис 18)

Рис.18 ОТ-ПЦР на тотальной РНК с использованием специфических праймеров на альтернативный транскрипт гена митохондриальиой РНК полимеразы (1)-продукт альтернативного сплайсинга, (2)-полноразмерный транскрипт РНК полимеразы митохондрий

Аналогичные данные, подтверждающие существование альтернативного транскрипга, были получены методом ОТ-ПЦР на РНК, выделенной из мышиных

ATG.,

ATG

ех.1

ех.2

фибробластов ЗТЗ, а 1акжо из фибробластов крысы Rati, что свидетельствует о том, что данный механизм прис>щ и другим органишам (данные не представтены) Прод>кты, полученные в pe3vTbiaie O'I-ПЦР были сиквснированы и было показано, что они мочностью соответствую! формам представленным в 6aie данных bST Таким обраюм, мы установили существование альтернативною сплайсинга гена POLRMT, в результате которого у человека образуется гранскрипт включающий часть им фона между первым и вторым экзонами, а у мыши и крысы транскриш, который полностью включает интрон между первым и вюрым экзонами, что 1акже приводи! к образованию укороченной формы белка Белковый продукт, образующийся при трансляции ачьтернативного транскринта, не содержит сигнала транспорта в митохончрии, однако, содержит сигнал ядерной локализации, что позволяет ему локализоваться в ядре, что и было показано нами ранее в эксперименте (Рис 13, 15, 16) Укороченный белок, образующийся в результате альтернативного сплайсинга первичного транскрипта гена POLRMT который л о кал и туется в ядре и возможно, имеет отношение к транскрипции генов РКП, MGC3265 и ALDH12 был обозначен нами как ядерная РНК полимерата IV

10. PIIK полимераза IV кодируется альтернативной формой мРНК.

В клетках рО Hela с помощью лентивир>сного вектора pLSI G были про жспрессированы siI'HK, специфичные последовательностям ингрона 1, присутствующим в альтернативном транскрипте гена POLRMT Очевидно, что такие ыРНК не должны влиять на экспрессию основного транскрипта По истечении двух дней из клеток был получен тотальный жстракг белка, который

был подвергнут Вестерн-анализу (Рис 19)

Рис.19 Вестерн-анализ тотальных экстрактов белка полученных из контрольных рО Не1_а клеток (К) а также из клеток экспрессирующих эРНК к интрону 1 гена РОИЧМТ (аГО^А)

а ■

135К

110К

Наблюдатось полное исчезновение нижней формы белка размером 1 ЮкД после экспрессии чтРНК, специфичных интрону 1 гена POLRMT Полученные данные свидетельствуют о том, что короткая форма белка детектируемая антителами к митохончриалыюй РНК полимеразе, кодируется альтернативным транскриптом гена Р01.КМТ, содержащим нитрон 1

'Этот же вывод был подтвержден при использовании метода иммунофлуоресценции на клетках рО НеТ.а (Рис 20) В этих клетках с помощью лентивируспых векторов были экспрессированы а)-полнораз черный белок митохондриальной РНК полимеразы, который, как показано, не усиливает ядерную окраску, а локализуется в митохондриях, бМтРНК, специфичные как для митохондриальной РНК полимеразы, так и для РНК полимеразы IV (экзоны 3 и 17 гена POLRMT), в результате введения которых значительно снижается

интенсивность ядерной окраски, с,)^1РНК, специфичные только для РНК полимеразы IV (интрон 1 гена РОЬИМ!), введение которого также приводит к существенному снижению интенсивности ядерной окраски, при >том не влияя на окраску митохондрий

Таким образом, РНК полимераза IV, образующаяся в результате альтернативного сплайсинга гена РОЬКМТ, локализуется в ядре Ее количество специфически снижается после введения соответствующих «РНК

Рис.20 Иммунофпуоресценция на клетках рО HeLa с использованием антител специфичных к РНК полимеразе митохондрий (1) - контроль (2) - клетки экспрессирующие митохондриэльную РНК полимеразу (3) - клетки экспрессирующие siPHK к митохондриальной и IV РНК полимеразе (экзоны 3 и 17) (4)-клетки экспрессирующие siPHK к РНК полимфазе IV (интрон 1)

11. Алысрнативнаи форма РНК действи i сльно способна кодировать ядерную форму белка 110 кД.

Мы сконструировали лентивирусные векторы, содержащие как иолноразмерную кДНК митохондриальной РНК полимеразы, гак и укороченную с N-конца кДНК, в которой первый ATO кодон располагался на третьем экюне, как это имеет место в альтернативном транскрише Для удобства обнаружения обе формы белка были помечены на С-концс за счет введения пептидного Flag эпитопа Конструкты были прозкспрессированы в клетках рО НеЬа, после чет методом иммунофлуоресценции с использованием антител, специфичных к Flag, была установлена их внутриклеточная локализация (Рис 21).

Как видно из результатов иммунофлуоресценции, белок, кодирующийся полноразмерной мРНК, обладает исключительно митохондриальной локализацией и не обнаруживается в ядре, в то время как укороченный с N-конца белок локализуется только в ядре

mtRNAP (Flag)

RNAP-IV(Rag)

Рис.21 Иммунофлуоресценция на клетках рО HeLa с использованием антител специфичных к Flag (mtRNAP) клетки экспрессирующие полноразмфную кДНК митохондриальной РНК полимеразы с Flag пептидом на С коннце (RNAP IV) - клетки экспрессирующие укороченную форму кДНК с Flag-пептидом на С коннце

Дспее и) клеток рО Hola , жспрессируюших оба пи констр'кта были но |\чепы ioia тьный белковый же i ракт а также я терная фракция коюрьь бы ш но (вергн\ты Иесгерн-ана тиз\ с ашите ими к. flag-шитпп* (Ри^.22) Как слс г-ет из опыта беюк. нол\ченныи на по шора ¡черной кДНК имеет размер 145 кД чю но шостью совпа тает с растром чито\он триальной РНК полимеразы fio тее того, на форма ни обнаруживается и ядерной фракции кии порученный на укороченной форме кДНК, соответствует размеру 1 ЮкД и присутствует в ядерном экстракте Анализируя данные иммунофлуоресцеции и Востерн-блот анализа, мы пришли к выводу, что, митохондриалытая РНК поличераза и РНК полимераза IV, образующаяся в результате альтернативного сплаиситна, кодируются разными формами мРПК, чем и определяются различия в их локализации и функции

лш.

110К

Рис.22 Вестерн анализ с использованием анти Flag антител на тотальных экстрактах белка (Т) и ядерной фракции (Я) полученных из клеток рО HeLa (К) -контроль (mtRNAP) -клетки экспрессирующие попноразмерную кДНК митохондриальной РНК полимеразы с Flag на С конце (RNAP IV)- клетки экспрессирующие укороченную форму кДНК с Flag на С конце

12. Для трансляции белка РНК поличеразы IV используется шестой стартовый ATG кодон.

Анализируя предсказанный и фактический размеры белка, кодируемою альтернативным транскриптом, мы обнаружили явное несоответствие. Белок, укороченный с N-конца и транслирующийся с укороченной мРНК должен иметь размер 1060 аминокислот, что составляет примерно 130кД В то же время мы наблюдали белковый продукт размером всего 1 ЮкД В связи с этим было сделано предположение, что для инициации трансляции РНК полимеразы IV используется не первый ATG кодон третьего экзона Для проверки ■»того в клетках рО HeLa был экспрессирован лентивирусный конструкт, содержащий укороченную форму кДНК, и имеющий Flag эпигон либо на С, либо на N-конце молекулы Белковые лизаты, полученные из этих клеток были подвергнуты Вестерн-анализу с испольюванисм антител, узнающих Flag эпитоп, в качестве контроля были использованы антитела, специфичные к митохондриальной PIIK полимеразе (Рис 23)

RNAP-IV RNAP-IV

Рис.23 Вестерн - анализ с использованием антител специфичных для митохондриальной РНК полимеразы (mtRNAPAb) и энти-Flag антител (Flag Ab) (К) - контроль, (N—Flag)

- белок полученный из клеток экспрессирующих РНК полимеразу IV с N-концевым Flag (С - Flag)

- белок полученный из клеток экспрессирующих РНК полимеразу IV с С-концевым Flag

mtRNAPAb | Flag Ab

Таким образом, РНК полимераза IV меченная у ATG номер 1 N-концевым Flag эпитопом, не детектируется антителами, специфичными к Flag эпитоп}, в то время как узнается антителами к митохондриальной РНК полимеразе, в то же время обе формы белка, меченные на С-конце, узнаются Flag антителами в равной мере Из этого следует, что транстяция белка РНК полимеразы IV, действительно происходит не с первого ATG кодона

Анализируя последовательность кДНК РНК полимеразы IV человека, мыши и крысы было обнаружено, что консервативным для них оказывается 6-й ATG кодон и, возможно, именно с него начинается считывание белка к процессе трансляции Более того, по теоретическим предсказаниям, белок, образующийся в ре ¡ультате этого, имеет размер 11 ОкД, что точно соответствует экспериментальным данным Для проверки данного предположения мы получили лентивирусные конструкты, содержащие последовательность кДНК, которая начиналась с 6-ю ATG кодона В качестве контроля была использована кДНК, начинающаяся с 9-го А ГО кодона (поскольку, белки образующиеся в результате трансляции с 7-ю и 8-го ATG кодонов. должны лишь незначительно отличаться по размеру, что затрудняет сравнение их размеров) В клетках рО HeLa были экспрессированы лентивирусные конструкты, содержащие кДНК РНК полимераш IV, а также кДНК, начинающуюся с 6-то и 9-го ATG кодонов, содержащие Flag

последовательность на С-конце Тотальные белковые экстракты из этих клеток

были подвер! нуты Вестерн-анализ-s с amn-Flag антителами (Рис 24)

2 «о о»

Рис.24 Вестерн-анализ с использованием энти-Flag % j¡5

антител (RNAP-IV) - белок полученный из клеток к < <

экспрессирующих кДНК РНК полимеразы IV, (ATG 6) : —— ~—"~¡ -белок полученный из клеток экспрессирующих кДНК !

с 6-м стартовым ATG кодоном (ATG9)-белок полученный из клеток, экспрессирующих кДНК с 9-м стартовым ATG кодоном

Суммируя полученные данные, мы сделали вывод чга PIIK полимераза IV образуется в результате альтернативного сплайсиша первичного транскриша гена POLRMT, в процессе которого теряется сигнал транспорта в митохондрии, локализованный в первом экзоне, и белок приобретает способность к локализации в ядре В качестве инициаторного кодона выс|упает 6-ой ATG колон, локализованный в фетъем экзоне, который оказывается универсальным для человека, мыши и крысы, в результате трансляции с которого образуется белок, размером 1 ЮкД. что соответствует размеру РНК полимера ш IV

13. Характеристика промоюров Iснов ALDH12 и ZBTB1, демонстрирующих усюйчивость к о -аманитину и транскрибируемых PIIK по.гимеразой IV.

Следующей целью нашей работы была идентификация и характеристика промоторов генов, транскрибируемых РНК полимеразой IV Для этого мы идентифицировали промоториые участки генов ALDII12 и ZBTB1, отобранных после анализа микроарреев (Рис 3), фанскрипция которых демонстрировала устойчивость к а -аманигину и чувс i вительность к рифампицину Данные промоторы были клонированы в вектор pGL3, содержащий репортер люпиферазу так, что ген чюциферазы регулировался исследуемыми промоторами Эти конструкции вводили прямой грансфекцией в клетки рО НеЬа В качестве отрицательного контроля был использован пустой вектор, а в качестве положительного - pGI 3, содержащий контрольный промотор SV40 Активность исследуемых промоторов была измерена через 48 часов с помощью люциферазной реакции в конфольных клетках рО Не1 а, а также в клетках, обработанных в течение 12 часов а -аманитином ПОмкг'мл) (Рис 25) Было обнаружено значительное усиление активности AI DH12 и ZBTB1 промоторов в результате обработки а -аманитином, a SV40 промотор обнаруживал обратную регуляцию

Чтобы проверить специфичность этой реакции, промоторы SV40 и ALDH12 в составе вектора pGL3 были введены в клетки рО HeLa, а также в клетки экспрессирующие пустой вектор pLSI G или siPHK в октаве этого вектора специфичные как митокоидриальной, так и IV РНК полимеразам Их активность была измерена с помощью люциферазной реакции (Рис 26)

pGL3

pGL3-SV40

pGL3-ALDH12

pGL3-ZBTB1

Рис.25 Люциферазная активность, измеренная в контрольных клетках (control) и в клетках обработанных а -аманитином (ММ) через 48 часов после введения в них пустого вектора pGL3 (pGL3) SV40 промотора (pGL3-SV40), промотора ALDH12 (pGL3-ALDH12) и ZBTB1 промотфа (pGL3-ZBTB1)

control

pLSLG si-mtRNAP

Рис.2б Люциферазная активность измеренная в контрольных клетках (control) в клетках экспрессирующих пустой вектор (pLSLG) или st-RNA, специфичный как митохондриальной так и РНК полимеразе IV (si-mtRNAP) Активность была измерена через 48 часов после введения пустого вектора pGL3, содержащего люциферазный репортер (pGL3) SV40 промотор (pGL3-SV40) и промотор ALDH12 (pGL3-ALDH12)

Полученные данные, демонстрирующие существенное снижение уровня активнос!и АЬОН12 иромоюра в ответ на экспрессию Ч1-РНК к митохондриальной и IV РНК полимеразам, свидетельствую! о спсцифичноыи наблюдаемого эффекта и о зависимости активности Л1Л)Н12 промотора от экспрессии РНК полимеразы IV

14. Промоюры генов Л10Н12, гВТВ1 и МСГ3265, регулируемых РНК полимера »ой IV, содержат общий С1руктурно-функциональный мотив.

В сотрудничеове с Д-ром Е Куниным (КСВ1 N111, США) мы провели сравнительный компьютерный анализ последовательное гей промоторов генов А1Л}Н12, /ВТВ1 и МОС3265 и выявили общий мотив, характерный для промоторов генов, регулируемых РНК полимеразой IV Данный мотив был 1акже обнаружен в составе промоторов других генов-кандидатов, транскрипция которых,

возможно, осуществляется РНК полимераюй IV При этом данный мотив оказывается консервативным у всех видов млекопи1ающих и но обнаруживает гомологии с последовательностями типичными для промоторов РНК попимеразы II, а 7акже РНК полимера) I и III Ботее гого, он не обнаруживает сходства ни с одним из известных сайтов свя!ывания транскрипционных факторов

Далее нами бы ю показано что обнаруженный участок последовательности является функциональным элементом промоторов РНК полимеразы IV Для этою в вектор pGL3 были клонированы исходные промоторы генов ALDH12, ZBTB1 и MGC3265, а также промоторы lex же генов, не содержащие выявленного общего мотива (PI Е) Активность промоторов была ишерсна с помощью люциферашой реакции Было показано существенное снижение активности промоторов, не содержащих общего мотива, по сравнению с активностью исходных промоторов (Рис 27).

Рис. 27 Люцифераэная активность измеренная через

48 часов после введения пустого вектора pGL3, содержащего репортер к люцифераэе (pGL3) SV40 промотора (pGL3-SV40), а также промоторов ALDH12 (pGL3-ALDH12) ZBTB1 (pGL3-ZBTB1) и MGC3265 (pGL3-MGC3265 Complete promoter -исходные промоторы PFE deleted - промоторы не содержащие общего мотива

pGL3 pGL3-SV40 pGL3-ALDH12 pGL3 ZBTB1 pGL3-MGC3265

15. Промоторы генов, регулируемых РНК полимеразой IV, не активируются энханссрами, стимулирующими транскрипцию РНК полимеразы II.

Мы предположили, что промоторы, инициируемые РНК полимеразой IV, должны принципиально отличаться от промоюров РНК полимеразы II Если это так, то они не должны активироваться энхансерами стимулирующими промоторы >у кариотической РНК полимеразы II Для проверки данного предположения были созданы конструкты, где в векторе pGI 3 перед промоторами ALDH12 и SV40 был помещен сильный искусственный энхштсар, состоящий из шести копий тетрациклин-реснонсивного эдемен-та (TRF) В Hei а клетки были введены конструкты, содержащие ALDH12 и SV40 промоторы, а также конструкты, в которых перед указанными промоторами находится энхансер Через 48 часов в клетках была измерена люциферазная активность (Рис 28)

Было показано, что TRE энхансер активировал SV40 промотор более чем в 10 раз, при этом люциферазная активность снижалась в ответ на а -аманитин Bio же время, ALDII12 промотор не реагировал на присутствие энхансера и оставался нечувствительным к а -аманитину Сходные результаты были получены при

введении конструкта, содержащего перед указанными промоторами сильным энхансер цитомегаловируса (данные не представлены), из чего нами был еде тан вывод, что промоторы, инициируемые РНК полимеразой IV не реагируют на транскрипционные энхансеры РНК полимеразы II

Рис.28 Люциферазная активность измеренная в контрольных клетках (control) и в клетках обработанных а -аманитином (a-amanitin) Активность была измерена через 48 часов после введения пустого вектора pGL3 SV40 промотора (pGL3-SV40) и промотора ALDH12 (PGI3-ALDH12) в отсутствии (w/o enh) и в присутствии (TRE-enh) энхансера

16. РНК полимераза IV обладает способностью связываться с промотором гена ALDHI2.

Мы решили проверить способность РНК полимеразы IV связываться с промотором гена ALDH12 Для этого был использован метод хроматиновой иммунопреципитации в разработанной нами модификации С помощью прямой трансфекции в HeLa клетки в составе вектора pGL3 были введены промоторы SV40 и AIDH12, в качестве контроля был использован пустой векюр pGI 3 После фиксации формалином клеточные экстракты были параллельно прецицитированы анштелами, специфичными к митохондоиальной РНК нолимеразе, а также антителами к РНК полимеразе II Полученные преципитаты были "расшиты" для освобождения ДНК из комплекса с белками, депротсинищрованы и, очищенная ДНК быта трансфецирована в кле1ки Е coli Число выросших колоний указывало на эффективность иммунопреципитации (Рис 29)

а 40

от

|30

I 20

s 10

Е <

I mtRNAP Ab IRNAPII Ab

I ,

pGL3 pGL3-SV40 pGL3-ALDH12

Рис.29 Хроматиновая

иммунопреципитация с

использованием антител к митохондриальной РНК

полимеразе (тИ^АР АЬ) и РНК полимеразе II ^АР II АЬ) на клетках с введенным пустым вектором (рС1_3) промотором 5У40(р61_3-5У40) и промотором гена АШН12 (рО-3-АШН12)

В экстрактах, содержащих вектор с SV40 промотором, уветичение количества гтреципитируечых плашид наблюдатось после препипи1ации антителами к РНК полимеразс II. в то время как в случае AI DH12 промотора обогащение наблюдалось после преципи|адии антителами к митохондриальной и IV РНК нолимеразам Эти данные свидетельствуют о способности РНК полимеразы IV физически свя!ыва!ься с промотором гена ALDH12 внутри клетки

17. Количественная оценка числа генов человека, транскрипция которых происходит с участием РНК полямеразы IV.

Для приблизительной оценки количества 1енов человека, транскрибируемых РНК полимеразой IV, проба тотальной РНК, полученной из клеток рО IleLa, экспрессирующих siPHK д,иоонов iena POLRMT, бы ia гибрилитована с наборами проб, соответствующих мРНК человека (микроарреи фирмы Affymetrix. 1433 2 0 Plus, соответствующие 47 тыс транскриптам и ESI) В качестве контроля использовалась РНК из неинфицированных клеток рО IleLa Ьыло обнаружено что около 1300 транскригпов подавлялись в два и более ра! Нами бьио отобрано 17 генов, которые был и проверены с помощью ОТ-ПЦР на РНК, полученной из контрольных клеюк, а также из клеток, обработанных а-аманитином или рифамттицином с использованием соответствующих о тигопуклеотидных праймеров Девять из семнадцати генов обнаруживали устойчивость к а-аманитину и чувствительность к рифампицину, то есть, вели себя как гены, транскрибируемые PIIK полимеразой IV С учетом этих данных, нами было определено приблизительное количество генов, транскрипция которых, возможно, осуществляется с помощью исследуемой нами ноличеразы По приблизительным оценкам, оно составляют до 3-5% от общего количества генов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Идентификация РНК полимеразы IV, как второй потимеразы, способной транскрибировать бслок-кодирутощие гены, открывает широкий спектр вопросов требующих дальнейшего изучения В настоящей работе на примере РНК полимеразы IV была продемонстрирована глубокая hhtoi рация функций берущих начало от прокариотического предшественника эндосимбионта митохондрии, что, очевидно, обеспечивает клетке лучшую способность к адаптации и ведет к расширению функциональных возможностей эукариотических органишов Во!можно перемещение прокариотической РНК полимеразы в ядро создало предпосылки для горизонтальною переноса бактериальных генов в эукариотический геном Транслокация в ядро митохондриальньтх генов на ранних стадиях могла cían, возможной бтатоцаря способности их транскрипции присутствующей в ядре РНК полимеразой IV, узнающей прокариотическис промоторы Особенности активации РНК полимеразы IV имеющей митохондриальное родство может быть использовано на ботее поздних стадиях эволюционного развития некоторыми зукариотическими генами не имеющими отношения к митохондрии или к прокариотам мнотие из которых безусловно, участвуют в фундаментальных процессах жи шедеятельности органи ша

ВЫВОДЫ:

1 Доказано существование еще одной ядерной РНК полимеразы эукариот, способной транскрибировать некоторые белок-кодирующие 1ены Эта полимераза обнаруживает структурную и эволюционную гомоло1ию с митохондриальной РНК полимеразой, так как обе они кодируются одним теном и образуются в процессе альтернативного сплайсинга

2 Трансляция альтернативно!о транскрипта начинается с 6-го ATG кодона открытой рамки считывания, расположенного в третьем экзоне; Образующийся белок, размером 110 кД, не имеет сигнала транспорта в митохондрии и локализуется в ядре Эта альтернативная форма белка была названа нами РНК полимеразой IV

3 Установлено, что транскрипты, синтезируемые PIIK полимеразой IV устойчивы к га-аманитину, прямому ингибитору РНК полимеразы И, а также демонстрируют значительную активацию в ответ на окислительный стресс

4 Идентифицирована ipynna 1енов, транскрибируемых РНК полимеразой IV, среди которых PIG3, ALDH12, MGC3265 и ZBTB1

5 Идентифицированы и охарактеризованы промоторы РНК-полимераза IV-регулируемых генов, они кардинальным образом отличаются по своим свойствам от промоторов РНК полимеразы II Обнаружено наличие общего функционального мотива, присущего таким промоторам, который не обнаруживает гомологии с последовательностями, типичными для промоторов РНК полимеразы II, а также РНК полимераз I и III, и не обнаруживает сходства ни с одним из известных сайтов связывания транскрипционных факторов Показано, что активность исследуемых промоторов не усиливается под влиянием транскрипционных энхансеров РНК полимеразы II

6 Разработана новая модификация метода хроматинной имунопреципитации, с использованием которой установлена способность РНК полимеразы IV к прямому связыванию с промоторами транскрибируемых ею генов

7 Произведена приблизительная количественная оценка числа генов человека, траггекрибируемьгх РНК полимеразой IV РНК полимераза IV участвует в транскрипции до 3-5% всех г енов

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1 Elena N Pugacheva Alexcy V Ivanov, Julia E. Kravchenko. Bons P Kopmn. Arnold J Levine and Peter M Chumakov "Novel gam of function activity of p53 mutants activation of the dUTPase gene expression leading to resistance to 5-fluorouracil". (2002), Oncogene, 21, с 4595-4600

2. Ю.Е.Кравченко и П M Чумаков " Альтернативные гранскрипгы гена POLRMT, ответственные за синтез ядерной РНК полимеразы IV", (2005), Молекулярная Биология, том 39, №1 с 1-5

3 Elena N Pugacheva, Alexey V Ivanov, Julia E. Kravchenko, Bons P Kopnin, Arnold J Levine and Peter M Chumakov "Novel gain of function activity of p53 mutants activation of the dUTPase gene expression loading to resistance to 5-fluorouracil", конференция Норвежского Фонда, Москва, (2000), с 78-79

4 Julia Е. Kravchenko, Peter М Chumakov "Nuclear RNA polymerase IV" International Symposium "p53 & beyond", Moscow, (2004), с 41

Отпечатано в ООО "РЕГЛАНТ" Подписано в печать 28 10.04 Уел печ. л 1,68 Тираж 100 экз. Заказ №340 115230 г Москва, Электролитный проезд, ЗБ Тел. 317-70-09

РНБ Русский фонд

2006-4 7412

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кравченко, Юлия Евгеньевна

Содержание

Список принятых сокращений

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 РНК полимераза II

1.1.1 Строение РНК полимеразы II

1.1.2 Особенности транскрипции РНК полимеразой II

1.1.3 Строение промотора РНК полимеразы II

1.1.4 Транскрипционный комплекс РНК полимеразы II

1.2 РНК полимераза I

1.2.1 Строение РНК полимеразы

1.2.2 Строение промотора РНК полимеразы I

1.2.3 Транскрипционный комплекс РНК полимеразы I

1.2.4 Терминация транскрипции РНК полимеразы I

1.3 РНК полимераза III

1.3.1 Строение промотора РНК полимеразы III

1.3.2 Транскрипционный комплекс РНК полимеразы III

1.3.3. Терминация транскрипции РНК полимеразы III

1.4 Митохондриальная РНК полимераза

1.4.1 Характеристика генома митохондрий

1.4.2 Строение митохондриальной РНК полимеразы

1.4.3 Промоторы митохондриальной РНК полимеразы и особенности ее транскрипции

1.4.4 Транскрипционный комплекс митохондриальной РНК полимеразы и терминация транскрипции

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

0 2.1. Используемые клеточные линии, их культивирование и обработка

2.2. Лизис клеток и приготовление ядерных экстрактов

2.3. Измерение концентрации белка по методу Бредфорд

2.4. Фракционирование белков в полиакриламидном геле

2.5. Перенос белков из гелей на фильтры и имму но детекция

2.6. Норзерн блот анализ

2.7. Приготовление проб для гибридизации на кДНК микроаррее

2.8. ОТ-ПЦР анализ

2.9. Выделение геномной ДНК из клеток эукариот

2.10. Получение компетентных клеток Е.соИ и трансформация

2.11. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК 48 ^ 2.12. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами

2.13. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей

2.14. Реакция лигирования

2.15. Получение конструктов и сиквенирование фрагментов к ДНК митохондриальной РНК полимеразы

2.16. Получение экспрессионных лентивирусных конструктов

2.17. Трансфекция лентивирусных и плазмидных конструктов и получение клеточных линий

2.18. Идентификация промоторов А1£)Н12 и 2ВТВ1, получение конструктов, содержащих изучаемые промоторы

2.19. Измерение активности люциферазы

2.20. Хроматиновая иммунопреципитация р- 2.21. Иммунофлуоресценция

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Обнаружение аномального поведения транскрипта гена РЮЗ в ответ на обработку клеток а-аманитином, не характерного для генов, транскрибируемых РНК полимеразой II

3.2. Дополнительный транскрипт, размером 2.3 кЬ, является специфичным и кодируется геном РЮЗ

3.3. Идентификация и анализ транскриптов, которые подобно второму транскрипту гена РЮЗ, активируются в ответ на обработку ос -аманитином

3.4. Характеристика транскрипции генов РЮЗ, МОС3265 и А1Л)Н

3.5. Экспрессия генов, устойчивых к а -аманитину, возрастает после подавления РНК полимераз I или II

3.6. Экспрессия а-аманитин устойчивых генов снижается после специфического подавления митохондриальной РНК полимеразы

3.7. Белок, узнаваемый антителами к митохондриальной РНК полимеразе обнаруживается как в митохондриях, так и в ядре

3.8. Существование двух форм белка, детектируемых антителами к митохондриальной РНК полимеразе

3.9. Доказательство существования альтернативного сплайсинга в гене митохондриальной РНК полимеразы

3.10. РНК полимераза IV кодируется альтернативной формой мРНК

3.11. Альтернативная форма РНК действительно способна кодировать ядерную форму белка 110 кД

Р' 3.12. Для трансляции белка РНК полимеразы IV используется шестой стартовый АТС кодон

3.13. Идентификация промоторов генов А1Я)Н12, 2ВТВ и МОС

3.14. Характеристика промоторов генов А1ЛЭН12 и ZBTB1, демонстрирующих устойчивость к а -аманитину и транскрибируемых РНК полимеразой IV

3.15. Промоторы генов А1ЛЗН12, ZBTB1 и МОС3265, регулируемых РНК полимеразой IV, содержат общий структурно-функциональный мотив

3.16. Промоторы генов, регулируемых РНК полимеразой IV, не активируются энхансерами, стимулирующими транскрипцию РНК полимеразы II

3.17. РНК полимераза IV обладает способностью связываться с промотором гена АЫ)Н

3.18. Количественная оценка числа генов человека, транскрипция которых происходит с участием РНК полимеразы IV

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ядерная РНК полимераза - IV, альтернативная форма митохондриальной РНК полимеразы"

Общеизвестно, что транскрипцию генома эукариот осуществляют трех ядерных ДНК зависимых РНК полимеразы. РНК полимераза I (РНКП I) ответственна за синтез 28S и 18S рибосомальных РНК, РНК полимераза II (РНКП II) транскрибирует матричные РНК, то есть участвует в транскрипции всех белок-кодирующих генов, а также некоторых некодирующих РНК. РНК полимераза III (РНКП III) вовлечена в транскрипцию 5S рибосомальной РНК, транспортных РНК, 7SL РНК и U6 РНК, а также некоторых стабильных малых РНК, участвующих в процессинге/сплайсинге РНК. В дополнение к этим полимеразам, в клетках имеется также митохондриальная РНК полимераза (мтРНКП), представленная одной субъединицей, и близкородственная полимеразе бактерий и бактериофагов, которая специализируется на транскрипции кольцевого генома митохондний. [1].

Транскрипция представляет собой циклический процесс, включающий несколько строго регулируемых стадий [2]. Для ранних стадий транскрипции характерно образование преинициаторного комплекса полимеразы (PIC), который связывается со специфической последовательностью на ДНК, называемой промотором. Следующая стадия инициации транскрипции заключается в освобождении промотора и начале синтеза РНК [3]. Далее следует стадия элонгации, во время которой происходит синтез основной массы транскрипта, и завершает раунд транскрипции стадия терминации, во время которой происходит диссоциация полимеразы и ДНК. В результате высвобождается новый транскрипт, после чего полимераза готова вступать в новый цикл транскрипции.

1.1. РНК полимераза IIТранскрипция белок-кодирующих генов является одним из главных процессов жизнедеятельности организмов, а также основным механизмом ее регуляции. В основеэтого процесса лежит формирование комплекса на промоторном участке, основным действующим компонентом которого является РНКП II, которая в клетках эукариот до сих пор считалась единственной РНК полимеразой, ответственной за синтез матричной РНК, подлежащей трансляции, то есть, кодирующей белки.

1.1.1. Строение РНК полимеразы IIЯдерные РНК полимеразы являются сложными мультикомпонентными ферментами, в состав каждого из которых может входить 12 и более субъединиц [4], причем пять субъединиц (АВСЮа, АВСЮр, АВС14.5, АВС23 и АВС27) являются общими для всех трех полимераз. Наиболее крупная («большая») субъединица обнаруживает высокую степень гомологии у всех трех типов полимераз; однако характерным только для второй полимеразы является присутствие на С-конце консервативного С-концевого домена (CTD) [5], который содержит множественные повторы гептапептида типа YSPTSPS [6]. Количество таких повторов у разных видов может варьировать от 25 до 50 [7]. Удаление половины консенсусных повторов оказывается летальным для организма, что указывает на его важную функцию [8]. Установлено, что CTD участвует во всех стадиях транскрипции: активации, инициации, элонгации и терминации [9]. Каждый из гептаповторов содержит несколько потенциальных сайтов фосфорилирования, в результате чего РНКП II может существовать как в гипофосфорилированной (РНКП II-А), так и в гиперфосфорилированной (РНКП 11-0) формах. Изменения в степени фосфорилирования обеспечивают переключение с одной стадии транскрипции на другую, и определяет разные точки транскрипционного цикла [10]. Была также показана способность CTD к активации процессига пре-мРНК непосредственно на транскрипте, синтезируемом РНКП II [11].

1.1.2. Особенности транскрипции РНК полимеразой II.

Характерным для транскрипции РНКП II является «кэпирование» 5' -конца образующейся мРНК, в результате которого к нему присоединяется 7-метилгуанозин- 3-фосфат (m7Gppp), или «кэп». Наличие 5'-концевого кэпа предохраняет пре-мРНК от действия 5'-3' экзонуклеаз, способствует инициации сплайсинга, созреванию (процессингу) 3'-конца образующейся РНК, помогает транспорту мРНК в цитоплазму и способствует процессу трансляции [12]. Процесс формирования кэпа представляет собой три последовательные ферментативные реакции, первая из которых осуществляется 5'-фосфатазой, удаляющей у-фосфат с первого нуклеотида. Далее гуанизилтрансфераза (ГТаза) присоединяет гуанозин к 5'-5'-трифосфату, а 7-метилтрансфераза осуществляет метилирование терминального гуанина [13]. Трифосфатазная и гуанилтрансферазная активности принадлежат, так называемому, кепирующему ферменту. После образования m7Gppp на 5'-конце, два консервативных белка СВР20 и СВР80, образующих вместе кэпсвязывающий комплекс образуют связь с m7Gppp и сохраняют ее в течение всего процесса транскрипции, процессинга и транспорта в цитоплазму [14]. Наличие m7Gppp на 5'-конце является характерной чертой транскриптов РНКП II, и не обнаружено у РНК, образующихся за счет транскрипции РНКП I или РНКП III.

Другой особенностью транскрипции РНКП II является последующее полиаденилирование 3'-конца РНК. Процессинг 3'-концевого участка новосинтезированной РНК представляет собой многоступенчатый процесс, требующий участия нескольких факторов. На начальных стадиях с помощью эндонуклеаз происходит расщепление новосинтезированной цепи РНК и добавление полиаденилатного "хвоста" с помощью поли(А)-полимеразы. Белковые факторы, участвующие в этом процессе обнаруживают высокую консервативность в эволюции. Фактор специфичности расщепления и полиаденилирования CSPF узнает консервативный сигнал (AAUAAA),после чего три дополнительных фактора - фактор, стимулирующий расщепление CstF, низлежащий элемент DSE и фактор расщепления CFIm непосредственно разрезают РНК[15]. Наличие поли(А) на 3'-конце увеличивает устойчивость новосинтезированной РНК к 3'-5' экзонуклеазной активности и способствует транспорту и трансляции мРНК. Образование поли(А) хвоста на 3'-конце мРНК характерно именно для транскриптов синтезируемых РНКП II, хотя известны случаи, когда РНК, образующаяся в результате транскрипции РНК II (например, гистоновая мРНК) не имеет полиаденилатного хвоста[16].

1.1.3. Строение промотора РНК полимеразы IIИзвестно, что очищенная от транскрипционных факторов РНКП II сохраняет способность к элонгации, но не может инициировать транскрипцию. Следовательно, транскрипционный аппарат, участвующий в синтезе белок-кодирующих генов зависит от транскрипционных факторов, которые требуются для образования преинициаторного комплекса. Для эукариот характерен достаточно консервативный набор транскрипционных факторов [17].

Коровый или центральный промотор РНКП II представляет собой минимально необходимый участок ДНК, с которым связывается РНКП II для инициации транскрипции и на котором происходит сборка комплекса основных транскрипционных факторов. В последовательностях корового промотора не обнаружено заметной гомологии, однако, первым основанием новосинтезированной цепи мРНК всегда является аденин, окруженный с обеих сторон пиримидинами, и эта тенденция сохраняется для большинства видов. Данный участок называется инициаторным (InR); он находится на точке старта с координатами -3 +5, и может быть описан общей формулой Ру САРу [18].

Для большинства промоторов характерно наличие ТАТА-подобной последовательности, представленной в виде ТАТАА и обычно располагающейся на 25 оснований выше от точки старта транскрипции. Обычно, ТАТА-мотив оказывается окруженным ГЦ-богатыми участками. Структура ТАТА-мотива абсолютно консервативна и единичные замены в его составе приводят к нарушению его функций. Таким образом ТАТА-мотив представляет собой элемент транскрипционного комплекса, аналогичный бактериальному промотору: короткий, имеющий весьма определенную структуру в области выше от точки страта и необходимый для транскрипции [19].

Известны, однако, также промоторы, не содержащие TATA мотива и на их долю приходится около половины всех известных промоторов. Обычно промоторы такого типа вместо TATA мотива включают в себя низлежащий промоторный элемент DPE который расположен ниже от точки старта на расстоянии 28-32 оснований. Таким образом, существует два основных типа корового промотора РНКП П. первый из которых включает в себя инициаторный элемент и ТАТА-мотив, а второй - инициаторный элемент и DPE [20] (Рис.1).

А.-30 гточка старта1-10■3I YYCAYYYYY"+5TATA мотивинициаторный участок (InR)Б.точка старта-3] YYCAYYYYY"+5инициаторный участок (InR)+28 |AGAC+32низлежащии промоторный элемент(DPE)Рнс.1. Схема организации минимального промотора РНК полимеразы И. Где (А) - коровый промотор, содержащий TATA последовательность (ТАТА-мотив) и инициаторный элемент (InR), (Б) -промотор, содержащий инициаторный элемент (InR) и DPE элемент {низлежащий элемент).

Эффективность и специфичность узнавания промотора зависит от коротких последовательностей, расположенных выше от точки старта транскрипции и с которыми связываются специальные белки-активаторы. К числу таких последовательностей относится СААТ-мотив, расположенный на 80 нуклеотидов выше, который способен работать в обеих ориентациях значительно, усиливая эффективность связывания с промотором. Другим элементом является ГС-богатый мотив, расположенный выше от точки старта и представленный множественными повторами типа GGGCGG [21].

Таким образом, промотором можно считать изолированный участок последовательности, способный связывать РНК полимеразу. Однако в большинстве случаев существуют и другие участки последовательности, способные координировать и значительно усиливать промоторную активность. К числу таких последовательностей относятся энхансеры, которые могут располагаться на различных расстояниях как выше, так и ниже от промотора, и существенно усиливать его активность. При этом энхансеры быть расположены как в непосредственной близости от промотора, так и на достаточно большом удалении от него (до 10 тысяч оснований) и работать в обеих ориентациях [22].

Вслед за доказательством существования энхансера были описаны его некоторые свойства:Энхансеры способны изменять общую структуру матрицы, в том числе влияя на плотность суперскручивания ДНК. Они определяют локализацию матрицы в клетке, например, её прикрепленность к ядерному матриксу. Энхансеры обеспечивают «место контакта», через которое РНК полимераза или другие факторы взаимодействуют с хроматином [23].

Энхансеры взаимодействуют со связывающимися с ними факторами. Комплекс, образующийся на энхансере, называется энхансомой. Её компоненты образуют активную структуру на энхансере, не взаимодействуя при этом непосредственно с РНК полимеразой,но, создавая активную поверхность для связывания с коактиваторным комплексом, который, в свою очередь, способствует сборке инициаторного комплекса на промоторе и привлечения РНК полимеразы [24]. Если белки связываются с энхансером, расположенным на расстояниях в несколько сотен оснований от промотора, то при этом образуется своего рода «белковый мост», который позволяет им непосредственно взаимодействовать с факторами, связывающими промотор. Для осуществления подобного механизма необходима достаточная гибкость молекулы ДНК, которая обеспечивает сближение энхансера и промотора, что достигается с помощью образования петель на молекуле ДНК. Существование подобного cw-механизма впервые было показано на бактериальном энхансере [25]. Однако, существует исключение из описанного выше процесса, когда энхансер способен проявлять также /гага-активность. Например, в паре соматических хромосом энхансер на одной хромосоме способен активировать промотор на парной ей хромосоме [26], впрочем, механизм такой активации не совсем понятен.

Существуют и факторы, ограничивающие работу энхансера. Обычно энхансер активирует близлежащий промотор, однако, если энхансер локализован между двумя промоторами, то активироваться, способен только один из них - за счет белок-белковых взаимодействий, соединяющих комплексы на промоторе и энхансере. Активность энхансера также может быть ограничена за счет действия инсуляторов, элементов последовательности ДНК, которые предотвращают взаимодействие с промотором [27].

Следует отметить, что механизм работы энхансеров во многих случаях остается неизученным. До сих пор неизвестно, каким из промоторов требуется наличие энхансера для нормального уровня экспрессии и почему некоторые энхансеры избирательно активируются только в определенных тканях, а другие способны работать в любых типах клеток.

1.1.4. Транскрипционный комплекс РНК полимеразы II.

Первая стадия формирования транскрипционного комплекса заключается в связывании участка ДНК, расположенного выше от промотора в районе ТАТА-последовательности с фактором TFIID [28]. Транскрипционный фактор TFIID включает в себя два компонента: TATA связывающий белок ТВР (ТАТА-связывающий белок), имеющий размер около 30 кД и TAFs (ТВР-связывающие факторы) [29]. При этом, основная часть TAF факторов находятся в стехиометрическом соотношении с количеством ТВР в клетке и, в большинстве своем, являются тканеспецифичными. TFIID комплекс может содержать до 11 различных TAF компонентов, узнающих разные типы промоторов. Их масса вариьрует от 30 до 250 килодальтон, а общая масса TFIID фактора составляет около 800 килодальтон [30]. ТВР является ключевым и универсальным компонентом данного комплекса и обладает способностью связываться с разными типами промоторов [31].

Несмотря на универсальность TFIID фактора, он не является уникальным. У многоклеточных эукариот обнаружено существование альтернативного комплекса, в состав которого вместо ТВР фактора входит ТВР-подобный компонент TLF, который на 60% идентичен ТВР, но не способен связываться с ТАТА-мотивом. Механизм его действия до сих пор остается неясным [32].

Интересной особенностью ТВР фактора является его способность связываться с малой бороздкой ДНК, в то время как все остальные известные ДНК-связывающие факторы взаимодействуют с большой бороздкой ДНК [33]. ДНК-связывающий домен ТВР, который располагается на его С-конце, консервативен у разных видов, в то время как N-концевая часть белка, экспонированная на поверхности для связывания с другими факторами, обнаруживает достаточную вариабельность [34].

Процесс инициации транскрипции РНК полимеразой II включает в себя несколько стадий, в течение которых происходит последовательное присоединение транскрипционных факторов и сборка инициаторного комплекса на промоторе [35]. На ранних этапах происходит узнавание TATA последовательности TFIID фактором (TFIID способен также узнавать InR на стартовой точке промотора). Следующим этапом является присоединение TFIIA фактора, который активирует ТВР, связывающий участок ДНК непосредственно перед TATA последовательностью, при этом, давая возможность третьему компоненту - TFIIB связаться с участком ДНК, расположенным непосредственно за TATA последовательностью. TFIIB отвечает за связывание РНК полимеразы II с данным комплексом [36, 37]. На следующей стадии происходит присоединение фактора TFIIF, состоящего из двух субъединиц. Его большая субъединица - RAP74 является АТФ-зависимой хеликазой, осуществляющей "подплавление" ДНК, необходимое для инициации. Малая субъединица - RAP38, обнаруживающая гомологию с бактериальным сигма-фактором, осуществляет непосредственное привлечение и связывание РНК полимеразы II [38]. Таким образом, в отличие от бактериальной РНК полимеразы, для узнавания и связывания РНК-полимеразы II с ДНК необходимо наличие комплекса вспомогательных транскрипционных факторов. Большинство транскрипционных факторов необходимы исключительно для связывания РНКП II с промотором. Однако некоторые транскрипционные факторы включаются на более поздних стадиях. К их числу относятся факторы TFIIE и TFIIH [39]. TFIIH является единственным, обладающим собственными ферментативными активностями - АТФазной, хеликазной активности, а также киназной. За счет последней происходит фосфорилирование РНК полимеразы II, что необходимо для начала собственно транскрипции. Более того, связываясь с ДНК уже ниже от области промотора, TFIIH, позволяет РНК полимеразе освободиться от инициаторного комплекса и освободить промотор, обеспечивая предпосылки для началаэлонгации. Таким образом, основной функцией факторов TFIIE и TFIIH является освобождение РНК полимеразы и "плавление" ДНК, необходимое для начала движения полимеразы [40].

1.2. РНК полимераза I.

Функцией РНКП I является синтез рибосомальной РНК (18S и 28S). Рибосомальная РНК представляет основной продукт транскрипции в клетке, на долю которого приходится около 80-90% от общей массы РНК.

РНКП I расположена в клетке преимущественно в ядрышках. При микроскопии ядрышки имеют характерную структуру, и состоят из волокнистой сердцевины, окруженной зернистым ободком. Волокнистая сердцевина является местом транскрипции рибосомальной РНКП I. Зернистый ободок представлен рибонуклеопротеидными частицами, основной составляющей которого является рибосомальная РНК [41]. В процессе транскрипции образуется единый предшественник рибосомальной РНК (45 S), в результате последующего расщепления которого образуются отдельные молекулы 28 S и 18S РНК. По-видимому, существует несколько независимых участков транскрипции, разделенных внутренними нетранскрибируемыми спейсерами (IGS), которые составляют кластер. Благодаря этому, несколько молекул РНКП I могут одновременно вести транскрипцию на одной матрице.

1.2.1. Строение РНК полимеразы I.

Ядерные РНК полимеразы являются сложными мультикомпонентными ферментами, в состав каждого из которых может входить 12 и более субъединиц [42], причем пять субъединиц (АВСЮа, АВСЮр, АВС14.5, АВС23 и АВС27) являются общими для всех трех полимераз. Кроме этого, полимераза I и полимераза III делят междусобой еще две субьеденицы (АС 19 и АС40) [43],которые не обнаружены в составе комплекса полимеразы II, но которые по функции соответствуют субъединицам В 12,5 и В44 РНКП II [44, 45]. Существование общих субъединиц закладывает возможность координированной регуляции транскрипции разными полимеразами. [46].

1.2.2. Строение промотора РНК полимеразы I.

Промотор РНКП I состоит из двух функциональных участков, разделенных нетранскрибируемым спейсерами. Центральный, (коровый) участок промотора (CP), окружающий точку старта транскрипции, необходим и достаточен для инициации. Он представлен преимущественно ГЦ-богатой последовательностью [47], а также короткой консервативной ТАТА-подобной последовательностью вокруг точки старта, рибосомального инициатора InR [48]. Впрочем, несмотря на сходство с ТАТА-мотивом,, InR не является сайтом взаимодействия с TATA связывающем белком ТВР.

Существуют и другие элементы, способствующие сборке и стабилизации комплекса на коровом участке промотора. Одну из ключевых ролей в этом процессе играет вышележащий промоторный элемент, UPE, который значительно усиливает интенсивность транскрипцию, но не является обязательным для ее инициации. Он представлен ГЦ-богатыми участками, гомологичными последовательностям в коровой зоне промотора [49, 50] UPE связывает фактор, который является посредником при сборкетранскрипционного комплекса.

Еще один многофункциональный компонент промотора, проксимальный терминатор РТ, располагается выше UPE и выполняет ряд функций, таких как: защита промотора от "блуждания" полимеразы [51, 52], участвует в перестройке хроматина [53] и укладке рибосомальной РНК [54] (Рис. 2). Проксимальный терминатор вносит вклад в координацию процесса транскрипции. Известны организмы, например, S. cerevisia, укоторых проксимальным терминатор представлен в неправильно» ориентации, но, тем не менее, сохраняет способность связываться с фактором терм и наци и и координировать транскрипцию.

Описанный принцип организации промотора РНКП I универсален для большинства видов, хотя сама последовательность промотора имеет строгую [55], но не абсолютную видовую специфичность [56]. Сходство в последовательности промотора между разными видами минимальное, в то время как, основа функционального элемента промотора высоко консервативна у всех видов [57]. В виду разнообразия промоторной последовательности у разных видов, РНКП I некоторых организмов приобретает потенциальную возможностьвыполнять нехарактерные для нее функции. Так, известно, что у Trypanosoma cruzi РНКП I способна транскрибировать не только рибосомальную РНК, но и два белок-кодирующих гена, однако, не с характерного для нее промотора [58].

1.2.3. Транскрипционный комплекс полимеразы I.

По аналогии с РНКП И, для работы полимеразы I требуются дополнительные факторы. Для большинства систем необходимым и достаточным является транскрипционный фактор, который связывается с коровой частью промотора. У разных видов он известен под разным названием (TIF-IB - у мыши и A. castellanii, SL1 - у человека и крысы, Ribl - у Xenopus, CF - у дрожжей), хотя выполняемая им функция аналогична. Это основной фактор инициации транскрипции рибосомальной РНК. Он включает в себя TATA связывающий белок ТВР, а также три или четыре (в зависимости от вида) дополнительные субъединицы, известные как группа факторов, ассоциированных с ТВР (TAFls) [59, 60]. Эти факторы способны взаимодействовать как между собой, так и с ТВР. В присутствии ТВР они выполняют функцию, аналогичную факторам TFIID и TFIIIB в транскрипционной системе РНКП II и РНКП III, соответственно. Основная функция TAF-IB заключается в установке полимеразы на промоторе перед началом транскрипции.

Помимо TAF-IB, для повышения эффективности транскрипции требуется фактор UBF, взаимодействующий с элементом, расположенным выше от промотора, который, связываясь с ГЦ- богатыми участками, помогает TAF-IB в сборке и укреплении на промоторе [61]. UBF представляет собой димер полипептида размером 90-100 кД, N-конец которого представлен димеризационным доменом, за которым, в центральной части белка, располагаются от четырех до шести ДНК-связывающих доменов, а С-конец представлен кислым серин-богатым участком [62]. Димер UBF способен покрывать своими ДНК связывающими доменами участок ДНК размером около 135-160 оснований и образовыватьдостаточно устойчивую структуру, названную энхансомой [63]. Было также обнаружено, что коровый и UBF элементы промотора РНКП I могут экспонироваться на поверхности двух смежных энхансом. Это облегчает процесс связывания ядерных факторов с промотором за счет одновременного взаимодействия как с коровым, так и с UBF элементами [64]. Кроме того, UBF способен напрямую контактировать с ядерными факторами, помогая последним связываться с промотором [65]. У человека такой контакт осуществляется за счет взаимодействия фактора TAF1-48 (48 кД белок, ассоциированный с ТВР) с С-концевым участком фосфорилированного UBF [66].

В зоне нетранскрибируемого спейсера, между активными точками транскрипции, могут содержаться элементы, выполняющие функцию энхансеров. Энхансеры представляют собой цис-активные элементы, располагающиеся как выше, так и ниже от промотора, которые способны значительно усиливать активность промотора [67, 68]. Механизм их действия не совсем ясен. Так, было показано, что у Xenopus энхансер может стимулировать транскрипцию даже не будучи в цис-ориентации по отношению к промотору. Если в ооциты Xenopus ввести ДНК, содержащую промотор, сцепленный с энхансером, после инъекции связь промотора с энхансером мгновенно терялась, но активационная функция энхансера продолжала сохраняться [69]. Возможно, энхансеры работают как некие загрузочные агенты промотора, обеспечивая его лимитирующими факторами. У позвоночных кандидатом на роль такого фактора является UBF, который, как было показано, может связывается с энхансерными элементами [70]. Однако, энхансеры, преобладающие в транс-ориентации и достаточно удаленные от промотора не могут полноценно активировать транскрипцию за счет конкуренции с промотором за UBF фактор [71], но способны связывать его форму, которая не работает непосредственно на промоторе [72].

Формирование комплекса РНКП I осуществляется за счет белок-белковых взаимодействий с транскрипционными факторами. Однако, и в отсутствии ядерных факторов, РНК полимераза I обладает способностью связываться с последовательностью ДНК; в таком случае, инициация осуществляется случайным образом. В присутствии факторов, полимераза специфически связывается с промотором, таким образом, исключая неспецифическую инициацию [73].

1.2.4. Терминация транскрипции.

Для терминации транскрипции необходимо связывание белка-терминатора со специфической последовательностью ДНК, расположенной в пределах 1000 оснований ниже от транскрипционной единицы. Функцию терминатора РНКП I выполняет ДНК связывающий белок TTF1 (у человека и мыши), или его аналог Reblp, у дрожжей [74]. Функциональность TTF1 определяется специфичностью ориентации, и процесс терминации также зависит от ориентации и контекста последовательности [75, 76]. Последовательности для связывания терминаторов РНК полимераз I и III идентичны [77]. На мышиной системе было показано, что терминация осуществляется только в том случае, если РНК полимераза I встречается с TTF1, который, уже связан с ДНК [78]. Далее, TTF1 привлекает фактор диссоциации, который катализирует образование 3'-конца, после чего, за счет активности эндонуклеазы отщепляется остаток 3'-конца, что является заключительным сигналом для диссоциации полимеразы с матрицы.

1.3. РНК полимераза III.

РНКП III эукариот осуществляет транскрипцию ограниченного количества коротких РНК, таких как, рибосомальная 5S РНК, транспортная РНК, 7SL РНК, U6 snPHK, а также некоторых стабильных малых РНК, большинство из которых участвует всплайсинге. Несмотря на ограниченное количество транскрибируемых генов, на долю РНКП III приходится значительная часть транскрипционной активности в клетке. Известно, что РНКП III функционирует в дискретных точках, и имеет локализацию, отличную от локализации других РНК полимераз. С использованием конфокальной микроскопии на HeLa клетках было показано, что для транскрипции, осуществляемой РНКП III, внутри нуклеоплазмы существует как минимум 2000 сайтов [79]. Каждый сайт имеет приблизительный радиус 20нм и содержит около пяти молекул РНКП III. Присутствие других полимераз в этих сайтах не обнаружено. Как упоминалось ранее, РНК полимераза эукариот представляет собой комплексный фермент, в состав которого может входить до 12 субъединиц, большинство из которых делят между собой все три ядерные РНК полимеразы.

1.3.1. Строение промотора РНК полимеразы III.

Промоторы, используемые РНКП III, делятся на три группы по принципу организации и требуемым транскрипционным факторам. Для промоторов первой группы, используемых РНКП III характерна уникальная особенность: основная часть элементов последовательности, узнаваемой полимеразой расположена ниже точки старта транскрипции. Эти внутренние элементы промотора, как правило, представляют собой структуру, в состав которой входят основные функциональные блоки, разделенные нефункциональными участками. В качестве классического примера строения промотора первого типа приводится ген 5S РНК Xenopus laevis, которому для эффективной транскрипции требуется три внутренних элемента. В их число входит, так называемый, блок А, расположенный на расстоянии 50-64 оснований от старта, промежуточный блок (элемент) (67-72 основания) IE и блок С, находящийся на расстоянии 80-97 оснований от точки старта; при этом структура блоков является абсолютно консервативной, а также недопускает изменений на участках последовательности, соединяющей эти блоки [80]. Такого типа блоки были обнаружены в промоторах 5S рибосомальных генов и у более низших организмов, таких как Drosophila melanogaster и S. Cerevisiae [81]. Подобное строение промотора является уникальным для гена 5S рибосомальной РНК и называется промотором первого типа (Рис.3).

Более стандартный промотор, используемый РНКП III, определенный как промотор второго типа, включает в себя два высоко консервативных блока А и В внутри транскрибируемого участка и обнаружен у генов транспортной РНК. Блок А промоторов первого и второго типа имеет высокую гомологию и часто является взаимозаменяемым [82], но у более сложных организмов он локализуется ближе к точке старта транскрипции. Расположение блока В может быть весьма неоднозначным, отчасти потому, что некоторые гены транспортной РНК внутри кодирующей области имеют короткие интроны. Расстояние между блоками в 30-60 оснований является наиболее оптимальным для эффективной транскрипции, однако, может достигать размера до 365 оснований [83]. Такая вариабельность достигается за счет способности блоков А и В одновременно связываться с одним фактором TFIIIC [84] (Рис.3).

У позвоночных существует еще один класс промоторов РНКН III. Промоторы данного типа не нуждаются во внутренних элементах и все их компоненты расположены выше от точки старта. Промоторы данного класса принадлежат к третьему типу. Например, для промотора гена U6 у человека и мыши было показано, что он способен сохранять свою первоначальную активность даже после делеции участков, расположенных ниже. Аналогичная ситуация наблюдается у человеческих генов 7SK и MRP/7-2 [85]. Наиболее характеризованный промотор третьего типа принадлежит U6 гену человека. Он включает в себя три элемента: ТАТА-мотив, локализованный на расстоянии 30-25 оснований выше точки старта, далее, проксимальный элемент PSE с координатами -66 -47и дистальный элемент DSE - в положении -244 -214 [86, 87] (Рис. 3). Известно, что РЕ и DSE элементы имеют гомологию и взаимозаменяемы с подобными элементами промотора гена U2 snPHK, который, как известно, транскрибируется РНКП D [88]. Однако, в составе промотора U2 нет 'Г AT А-мотива, хотя TATA- элемент как раз более характерен для генов, транскрибируемых РНКП 11, нежели для генов РНКП III. Интересно, что добавление TATA-элемента к промотору U2 гена превращает его в промотор, транскрибируемый РНКП III, в то время, как промотор U6 с удаленным ТАТА-элементом начинает транскрибироваться РНКП II [89].

А.'точка стартапромежуточный элементучасток терминации+1БЛОК-А+50[.1ы IE 1 1 11 1 1БЛОК-С+64 +70+80+97V+ 120Б.точка старта+1БЛОК-А+3участок терминацииБЛОК-Б |I+ 19 +52+62+73В.-244-214-68-47 -30-25+ 1Рис. 3 Схема организации промоторов РНК полимеразы III. Где, (А) - схема промотора первого типа, (Б) - схема промотора второго типа, (В) - схема промотора третьего типа.

Известно, что существует группа генов, транскрибируемых РНКП III, но не обладающих ни одним из трех типов промоторов. Так, например, промотор гена EBER2 вируса Эпштейна-Барра содержит блоки А и В, типичные для промоторов РНКГ1 III второго типа,наличие которых является обязательным для эффективной транскрипции, однако, удаление участка последовательности выше от точки старта, на порядок снижает эффективность транскрипции, в то время как, на активацию промотора второго типа вышележащая область не влияет [90]. Ответственными за этот механизм являются Spl и ATF связывающие сайты в вышележащей промоторной области. Помимо этого, промотор EBER2 содержит ТАТА-элемент, который увеличивает активность промотора в 5 раз. В качестве других примеров комбинированного промотора РНКП III, нуждающегося как в вышележащей промоторной области, так и во внутренних элементах, можно привести ген тРНК тутового шелкопряда [91], ген тРНК Xenopus [92] и 7SL ген человека [93]1.3.2. Транскрипционный комплекс РНК полимеразы III.

1.3.2.1. Транскрипционный комплекс РНК полимеразы III, характерный для промоторов первого и второго типа.

Блоки А и В, входящие в состав большинства промоторов РНКП III узнаются мультисубъединичным комплексом, названным TFIIIC, который является одним из основных и самых крупных известных транскрипционных факторов. У S. cerevisiae TFIIIC состоит из двух доменов, каждый из которых диаметром 20 нм и размером около ЗООкД, включает в себя шесть субъединиц, каждая из которых сама по себе не способна к специфическому связыванию с ДНК [94]. При этом два блока промотора одновременно узнаются одним фактором, не смотря на то, что расстояние между ними у некоторых видов весьма значительное. В случае, если расстояние между элементами промотора превышает возможность транскрипционного фактора, избыточный сегмент ДНК способен образовывать петли, тем самым сближая блоки и позволяя TFIIIC связаться с ними.

Строение TFIIIC человека отличается от дрожжевого. Методом ионообменной хроматографии TFIIIC человека был разделен на два компонента, TFIIIC 1 и TFIIIC2 [95].

При этом, группе генов, включающих 5S РНК, VAI и гены тРНК для транскрипции РНКП III требуется присутствие обоих компонентов TFIIIC, а таким генам, как U6 и 7SK необходимым и достаточным является наличие только TFIIIC 1 компонента, но не TFIIIC2 [96].

Первая стадия узнавания промотора второго типа заключается в связывании TFIIIC2 с блоком В и является предпосылкой для последующего привлечения TFIIIC 1 и TFIIIB факторов [97]. И хотя, функция TFIIIC 1 остается до конца неясной, известно, что он служит для усиления и расширения зоны действия TFIIIC2, т.е. является для него вспомогательным компонентом. Результаты седиментационного анализа показали, что TFIIIC1 имеет массу до 200кД и характерную глобулярную структуру [98], для TFIIIC2 было показано, что он состоит из пяти полипептидов и имеет общую массу около 600 кД [99].

Известно, что для нормального узнавания TFIIIC промотора гена 5S рибосомальной РНК требуется присутствие еще одного вспомогательного фактора TFIIIA. Впервые TFIIIA был выделен из Xenopus laevis [100]. Он относится к семейству цинксодержащих транскрипционных факторов, так как основная его часть представлена девятью тандемно-расположенными цинк содержащими ДНК, связывающими доменами [101]. Эти данные подтверждены рентгеноструктурным анализом, который показал существование девяти "цинковых пальцев", связывающих ДНК [102]. Таким образом, TFIIIA выполняет роль адаптера, обеспечивая платформу и позволяя TFIIIC связываться с блоком В промотора 5S рибосомальной РНК [103].

Независимо от типа промотора было установлено, что основной функцией TFIIIC является привлечение главного элемента транскрипционного комплекса TFIIIB [104]. Наиболее охарактеризован TFIIIB у дрожжей где он представляет собой комплекс полипептидов, одним из которых является TATA связывающий белок ТВР [105], другим фактор "В", размером около 90кД [106]. Фактор "В" играет роль, подобную той, которую играет сигма-фактор для бактериальной РНК полимеразы. Эта субъединица устойчива к укорачиванию и продолжает функционировать даже после делетирования двух третей ее длины [107]. Третьим компонентом TFIIIB является субъединица размером 70кД, которая на N-концевом участке обнаруживает высокую гомологию (до 40 %) с TFIIB фактором РНКП II [108], и, в связи с этим, называется TFIIB-подобным фактором BRF. Мутагенезом было установлено, что BRF содержит два различных ТВР-связывающих домена [109]; при этом, для привлечения полимеразы необходимыми являются все три субъединицы TFIIIB, в то время как, к прямому взаимодействию с ней способна лишь одна BRF.

В отличие от TFIIIC, фактор TFIIIB человека менее охарактеризован, однако, показано, что TFIIIB человека, по аналогии с другими организмами, также содержит ТВР [110] и некий гомолог BRF [111]. Поскольку, комплекс TFIIIB содержит ТВР, следовательно, он может независимо связываться с ТАТА-элементом [112]; при этом, эффективность связывания возрастает за счет взаимодействия между ТВР и BRF [113]. Тем не менее, большинство промоторов первого и второго типов не могут напрямую узнаваться TFIIIB [114] и взаимодействуют с ним посредством TFIIIC.

Комплекс TFIIIB в системе транскрипции РНКП III обнаруживает сходство с комплексом TIF-IB при транскрипции РНКП I. В каждом из этих случаев ТВР располагается непосредственно перед точкой старта транскрипции. Этот комплекс является достаточным для привлечения полимеразы и ее установки на инициаторном сайте. Комплекс является достаточно устойчивым и сохраняется в течение многих раундов инициации. В некоторых случаях транскрипция становится возможна в отсутствии факторов сборки, в присутствии только TIF-IB или TFIIIB.

1.3.2.2. Транскрипционный комплекс РНК полимеразы III, характерный для промоторов третьего типа.

Для промоторов третьего типа генов 7SK и U6 характерен строго определенный набор факторов. Например, необходимым для них является присутствие TFIIIC1, но не TFIIIC2 [115]. Более того, TFIIIB, необходимый промоторам третьего типа отличается от TFIIIB используемого промоторами первого и второго типа [116]. Также известно, что BRF не требуется для транскрипции с промоторов этого типа, хотя он и ко-преципитирует вместе с фактором PTF, необходимым гену U6 для узнавания проксимального элемента PSE [117]. PTF представляет собой комплекс, состоящий из пяти субъединиц. При этом гены U1 и U2, транскрибируемые РНКП II и содержащие последовательность РЕ могут также активироваться за счет PTF. Это позволяет предположить, что для полимеразы II и III он является общим РЕ-связывающим фактором [118]. Более того, PTF может взаимодействовать с ТВР или TFIIIB, которые в свою очередь связаны с TATA последовательностью ДНК. [119]. Таким образом, самым важным этапом для сборки комплекса и активации транскрипции на промоторе третьего типа является связывание РЕ, a PTF и ТВР, за счет взаимодействия друг с другом, способны значительно усиливать этот процесс [120].

1.3.3. Терминации транскрипции РНК полимеразы III.

Процесс терминации транскрипции в системе РНКП III аналогичен процессу терминации у полимеразы I и осуществляется по аналогичному принципу, а последовательность для связывания терминаторов РНК полимераз I и III является абсолютно идентичной.

Но, если для терминации транскрипции полимеразы I необходимо связывание белка-терминатора со специфической последовательностью ДНК, расположенной нижеобласти транскрипции, то РНКП III способна сама узнавать терминаторные последовательности на ДНК [121]. Однако, на дрожжах было показано, что белок Reblp, который является фактором терминации РНКП I, связываясь с определенным контекстом последовательности, может терминировать РНКП III. Но, в отличие от РНК полимераз I и II, полимераза III может безошибочно и эффективно узнавать сайты терминации и в отсутствии дополнительных факторов терминации [122]. В большинстве случаев сигналами терминации могут служить простые кластеры из четырех и более Т-остатков [123]. Существуют также данные от том, что Ьа-антиген каким-то образом участвует в терминации транскрипции РНКП III, что показано на клетках HeLa, однако, у дрожжей, при делеции гена, кодирующего Ьа-антиген, активность РНКП III не менялась [124]. Попытки продемонстрировать роль Ьа-антигена в транскрипции РНК полимеразы III на Xenopus также оказалась неудачной [125, 126].

1.4. Митохондриальнная РНК полимераза.

1.4.1. Характеристика генома митохондрий.

Митохондрия - уникальная органелла эукариотической клетки, принимающая участие в различных процессах метаболизма. Однако основной ее функцией является производство АТФ с помощью системы окислительного фосфорилирования [127]. Митохондрия является единственной органеллой клетки, требующей сотрудничества двух физически разделенных геномов - ядерного и ее собственного, митохондриального. Большинство митохондриальных белков закодированы в ядре и синтезируются в цитоплазме, после чего транспортируются в митохондрии. Митохондриальный геном включает небольшой набор белков, необходимых для функционирования системы окислительного фосфорилирования.

В настоящее время широко распространенной и общепринятой является гипотеза происхождения митохондрий из а-протеобактерий. Считается, что а-протеобактерии внедрились в эукариотическую клетку в виде эндосимбионта две тысячи миллионов лет назад [128], после чего, в процессе эволюции, большинство генов эндосимбионта были транслоцированы в ядро. Набор генов, оставшихся в митохондриальном геноме является весьма консервативным у разных видов.

Геном митохондрий обладает рядом отличительных особенностей, большинство из которых не характерны для ядерного генома эукариот.

1. Эукариотическая клетка является полиплоидной в отношении митохондриальной ДНК: большинство клеток млекопитающих содержат до нескольких сотен митохондрий, а они, в свою очередь, могут содержать от двух до десяти копий митохондриальной ДНК [129].

2. Геном митохондрий наследуется по материнской линии. Митохондрии сперматозоидов, попадающие в ооцит во время оплодотворения, мгновенно элиминируются за счет убиквитин-зависимой системы деградации [130]. Во время оогенеза митохондриальная ДНК претерпевает, так называемый, феномен "узкого места", в результате которого только небольшая ее часть амплифицируется и передается следующему поколению. Этот феномен обеспечивает быструю смену мутаций в течение нескольких поколений, передающихся потомкам.

3. Скорость эволюции митохондриального генома значительно выше, чем ядерного. Этот факт объясняется рядом причин. Во-первых, митохондриальная ДНК, в отличие от ядерной, гораздо меньше защищена белками и ассоциирована с внутренней мембраной митохондрий, где образуются повреждающие активные формы кислорода (ROS) [131]. Во-вторых, эффективность механизма репарации митохондриальной ДНК значительно ниже, чем ядерной [132]. Накопление мутаций митохондриальной ДНК за счет высокойскорости их образования могут вести к серьезным нарушениям функций и различным заболеваниям у человека, в том числе играть роль в процессах старения [133].

4. При трансляции митохондриальных генов используется генетический код, отличный от универсального. Так, например, у млекопитающих УГА определяет триптофан вместо стоп-кодона, а АУА, АУЦ и АУУ используются в качестве инициаторных кодонов, АГА и АГГ вместо кодирования аргинина являются терминирующими. Такая упрощенная система кодон-антикодоновых взаимодействий позволяет получить в результате трансляции только 22 транспортных РНК [127].

5. Структура, состав и организация митохондриальной ДНК строго консервативна у разных видов. Геном митохондрий человека представляет собой кольцевую двухцепочечную ДНК, размером 16,6 тысяч пар оснований, на долю которой приходится лишь 0.5 -1% от общего количества ДНК в клетке. Две цепи ДНК за счет разницы в ГЦ-составе могут быть разделены в градиенте плотности в виде тяжелой Н-цепи и легкой L-цепи. Митохондриальная ДНК в норме представляет собой суперскрученную кольцевую структуру, в отличие от ядерной, не "одетую" в хроматин а, как упоминалось выше, в небольшой степени покрытую белками и ассоциированную с внутренней мембраной митохондрий [134]. Большая часть молекул митохондриальной ДНК содержит трехцепочечный участок, представляющий собой вытесненную D-петлю в которой сегмент ДНК новосинтезированной тяжелой Н-цепи размером 500-700 пар оснований сохраняет комплиментарную связь с участком материнской легкой L-цепи. D-петля может достигать размера до 1000 пар оснований и является основным некодирующим сегментом, содержащим регуляторные элементы для транскрипции и репликации митохондриальной ДНК. Этот участок является наиболее вариабельным по размеру и составу последовательности у разных видов, однако, содержит консервативные участки, играющие роль регуляторов [127].

6. Митохондриальный геном млекопитающих содержит 37 генов, кодирующих различные компоненты митохондриального трансляционного аппарата (две рибосомальные РНК 12S и 16S), 22 гена трансферных РНК и 13 матричных РНК белков, являющихся компонентами комплекса дыхательной цепи[135]. При этом большая часть информации кодируется в тяжелой цепи митохондриальной ДНК. Одной из отличительных особенностей строения ДНК митохондрий является компактная организация генов, кодирующие последовательности которых непосредственно примыкают друг к другу или разделены несколькими основаниями. Характерной чертой является отсутствие интронов [136].

Геном митохондрий содержит только две некодирующие зоны. Одной из них является упомянутая выше D-петля, которая включает в себя стартовую точку репликацииITдля тяжелой цепи (О ), промоторы для транскрипции тяжелой и легкой цепей, а также, консервативные блоки последовательности CSB и последовательности, связывающиеся с терминаторами TAS [127] (Рис.4). Следующий некодирующий участок размером около 30 нуклеотидов включает в себя стартовую точку репликации легкой цепи (Ol) и располагается от Он на расстоянии двух третей длины ДНК (Рис.4).

Как большинство генов митохондриальных белков, ген мтРНКП, транскрибируются в ядре с помощью РНКП II, после чего мРНК транслируется на рибосомах цитоплазмы, после чего готовый белок транслоцируется в митохондрии за счет N-концевого лидерного пептида, являющегося сигналом транспорта в митохондрии. Импорт в митохондрии осуществляется АТФ-зависимой транспортной системой [137].

1.4.2. Строение митохондриальной РНК полимеразы.

Ген мтРНКП локализуется на 19 хромосоме и включает в себя 22, экзона, её полноразмерная кДНК имеет размер 3831 пар оснований. Ген мтРНКП транскрибируетсяРНКП II и, соответственно, требует наличия специфичной последовательности, при узнавании которой белок, образующийся в результате трансляции в цитоплазме, может транслоцироваться в митохондрии. Сигнал транспорта в митохондрии представлен 41 аминокислотным остатком HaN-коицевой части последовательности [138].

МтРНКП представлена одной субъединицей и имеет высокую структурную гомологию и идентичность выполняемых функций у разных организмов.

Впервые каталитический компонент митохондриальной транскрипции был выделен и характеризован у дрожжей и представлял собой единичный полипептид размером 145 кД [139]. Далее, в 1997 был идентифицирован и характеризован ген мтРНКП человека, который обнаруживал высокое сходство с митохондриальной полимеразой дрожжей, особенно, своей С-концевой частью. Более того, была обнаружена высокая гомология гена митохондриальной полимеразы с РНКП бактерий [140], РНКП бактериофагов ТЗ [141] и Т7 [142], а также Sp6 бактериофага [143]. С-концевой участок бактериальной РНКП, аналогично полимеразе митохондрий, несет функцию узнавания промотора и способен к каталитической активности.

Известно, что мтРНКП, в отличие от РНКП II, проявляет чувствительность к рифампицину, который также является ингибитором РНК полимеразы бактерий [144].

1.4.3. Промоторы митохондриальной РНК полимеразы и особенности еетранскрипции.

Синтез РНК в митохондриях человека начинается сразу в трех точках,1 2локализованных на D-петле: одна для легкой цепи (L) и две для тяжелой цепи (Н и Н ) [145] (Рис.4). Тяжелая цепь транскрибируется путем образования двух перекрывающихся точек транскрипции, одна из которых начинается на инициаторном сайте Н1, локализуется на рассотянии 19 нуклеотидов выше от точки старта транскрипции гена тРНКр,1е изаканчивается на 3'-конце гена 16S рибосомальной РНК. Данная транскрипционная точка работает более интенсивно, чем вторая, и ответственна за транскрипцию рибосомальных РНК, а также тРНКРЬе и тРНКУа1. Сайт терминации для нее располагается в низлежащей области reHal6S рибосомальной РНК, внутри гена TPHKLeu [146].

Вторая транскрипционная точка работает с частотой в 20 раз меньшей, чем первая, начинается с инициаторного сайта Н2, расположенного вблизи 5'-конца гена 12S рибосомальной РНК, и продуцирует полицистронную молекулу. Покрывающую всю тяжелую цепь ДНК. Легкая цепь ДНК дает начало единичному полицистрону, берущему начало на 5'-конце гена 7S рибосомальной РНК [147].

Два основных промотора мтРНКП, содержащие Н1 и L точки инициации, называются HSP и LSP, соответственно, функционируют независимо и имеют структуру, состоящую из двух частей (Рис.4). Первый промоторный элемент представлен консенсусным мотивом размером 15 пар оснований, который окружает точку старта и достаточен для инициации транскрипции. Второй элемент располагается непосредственно выше от точки старта. Он необходим для оптимизации процесса транскрипции и может работать как энхансер. Данный регуляторный элемент включает сайт связывания для одного из двух транскрипционных факторов мтРНКП [148].

Вторая точка инициации транскрипции тяжелой цепи Н2 имеет промотор размером всего 15 пар оснований и не содержит сайтов связывания для транскрипционных факторов.

Процессы репликации и транскрипции в митохондрии происходят скоординировано и одновременно. Инициация транскрипции и репликации в кольцевом геноме митохондрий происходит на регуляторном участке, образующим D-петлю, который, как упоминалось выше, включает в себя точку начала репликации (Он) и транскрипционный промотор LSP [149]. Но восинтезиро ванная РНК, образующаяся в результате транскрипции образует гибрид с кольцевой ДНК митохондрий в районе точки стартарепликации, так называемую, R-петлю, тем самым формируя затравку для митохондриальной ДНК полимеразы и способствуя началу репликации. Матричная РНК митохондрий является пол иди строи ной, то есть, включает в себя более, чем один ген, и, соответственно, требует нескольких стадий сплайсинга для своего созревания. Более того, процесс трансляции, также, оказывается необходим для инициации репликации. Таким образом, транскрипционный аппарат митохондрий несет на себе двойную функцию, участвуя в экспрессии генов и репликации митохондриальной ДНК [150].

1.4.4. Транскрипционный комплекс митохондриальной РНК полимеразы.

Известно, что для инициации транскрипции митохондрий у человека необходимым является наличие четырех компонентов: мтРНКП и трех вспомогательныхтранскрипционных факторов mtTFA [151],mtTFBlM и mtTFB2M [152]. Транскрипционный фактор mtTFA человека обладает ДНК связывающей способностью, может активировать транскрипцию за счет связывания с участком ДНК вышестоящей области промотора, и является основным регулятором митохондриальной транскрипции. mtTFA представляет собой белок размером 25 килодальтон и относится к HMG (high mobility group) типу белков [151]. Сайты связывания для mtTFA локализованы в вышестоящей области двух наиболее активных точек D-петли (Н1 и L), при этом и связывающая и транскрипционная активность проявляется сильнее в промоторе легкой цепи (LSP), чем в промоторе HSP1. Предполагается, что mtTFA формирует комплекс с ДНК за счет двух своих HMG доменов, обеспечивая тем самым структурные изменения в промоторной области, что позволяет мтРНКП связаться с ней [149]. Более того, mtTFA способен регулировать количество митохондриальной ДНК в клетке, а также коррелирует с транскрипционной активностью митохондрий и репликацией.

Мутации в гене Tfam, кодирующем фактор mtTFA у мышей, приводят к летальному исходу еще в эмбриональном развитии [153].mtTFA является широкораспространненым ДНК-связывающим белком в митохондриях. Например, у дрожжей он присутствует в таком количестве, что способен связывать каждые 15 нуклеотидных оснований [154]. У Xenopus, также было показано значительное увеличение его уровня во время ооцитарного развития [155]. Более того, mtTFA способен функционировать в митохондрии как ДНК упаковывающий белок, при этом его уровень в клетке оптимизируется, коррелируя с необходимостью активации того или иного процесса. Например, во время инициации транскрипции уровень mtTFA достаточно низкий, в то время как при упаковке ДНК, он значительно повышается [156]. Транскрипционный фактор mtTFA у человека и дрожжей имеет высокую степень гомологии и является консервативным у многих организмов.

Транскрипционные факторы mtTFBIM и mtTFB2M, были обнаружены совсем недавно и до сих пор остаются недостаточно охарактеризованными. Однако, было доказано их функциональное и структурное сходство с адаптерным сигма-фактором бактерий, необходимым для связывания РНК полимеразы. Оба фактора обладают способностью к прямому взаимодействию с мтРНКП, формируя при этом гетеродимер и являются взаимозаменяемыми. Они являются необходимыми для инициации транскрипции, но не для элонгации [157].

Терминация транскрипции в митохондриях осуществляется при участии фактора терминации mTERF, который представляет собой белок размером 34 килодальтона и его присутствие обнаружено только у высших позвоночных. mTERF имеет в своей структуре три потенциальные "лейциновые застежки", но связывается с ДНК в виде мономера. mTERF способен связывать независимый сайт терминации, тем самым способствуя остановке транскрипции [158].

Таким образом, в результате исследования митохондриальных процессов, было выявлено несколько отличительных особенностей транскрипции и репликации в митохондриях, таких как:1. Наличие митохондриального генома, представленного в виде двухцепочечной кольцевой ДНК, не имеющей хроматина.

2. Наличие РНК полимеразы, состоящей из одной субъединицы, кодируемой в ядре, транслирующейся в цитоплазме и транслоцирующейся в митохондрии.

3. Высокая структурная и функциональная гомология РНК полимеразы и транскрипционных факторов mtTFA и mtTFB с бактериальными аналогами.

4. Образование характерных структур, таких как D-петля и R-петля, способствующих скоординированному процессу транскрипции и репликации.

5. Участие всех компонентов транскрипционного аппарата как в процессе транскрипции, так и в процессе репликации.

6. Наличие собственного трансляционного аппарата7. Наличие минимального набора рибосомальных и транспортных РНК, необходимых для сплайсинга.

МтРНКП возникла в течение эволюции параллельно с возникновением митохондрий, клеточных органелл, обнаруживающих сходство с бактериями, а высокая гомология между бактериальной и митохондриальной РНК полимеразами свидетельствует в пользу теории эндосимбиотического происхождения митохондрий [159].

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Используемые клеточные линии, их культивирование и обработка.

Таблица 1. Характеристика использованных клеточных линийКлеточная линия ПроисхождениеHeLa рак шейки матки человекаHI 299 лёгочная карцинома человекаMRC5 нормальные легочные фибробласты человекаНСТ116 карцинома толстой кишки человекаА431 эпидермальная карцинома человека293Т упаковывающие клетки, модифицированная линия PhoenixЗТЗ иммортализованные мышиные фибробластыRati иммортализованные крысиные фибробластыПроизводная клеточная линия HeLa(pO), не содержащая митохондрий инкубировалась с добавлением в среду 50нг/мл бромистого этидия, 100мкг/мл пирувата и 50мкг/мл уридина. Перед обработкой различными препаратами клетки рассаживались за 24 часа. В процессе работы клетки подвергались обработкам следующими препаратами:а-аманитин (15мкг/мл) в течение 12-14 часов, Н202 (0.5мМ/мл) в течение 10 минут, после чего клетки отмывались и велись еще в течение 24 часов, Н7 (100мкМ/мл) в течение 14 часов, доксорубицином (200нг/мл) в течение 14 часов. Клетки также были подвергнутыоблучению ультрафиолетом (3-UV трансиллюминатор, UVP, Apland, СА, 302 нм, 2500 мкВт/см2 за 23 секунды)2.2. Лизис клеток и приготовление ядерных экстрактов.

2.3. Измерение концентрации белка по методу Бредфорд.

К 1-2 мкл лизата добавляли 2 мл краски (Bio-Rad Protein assay kit), и проводили измерение оптической плотности при 595 нм.

2.4. Фракционирование белков в полиакриламидном геле.

Электрофорез белков проводили по стандартной методике (Маниатис, 1984) используя 4% концентрирующий и 12% градиентный разделяющий гель. При электрофорезе выставляли постоянный ток 35-40 мА. В качестве маркерных белков использовали Rainbow markers (Amersham).

2.5. Перенос белков из гелей на фильтры и иммунодетекция.

Белки из геля переносили на PVDF мембрану Hybond-P (Amersham) в буфере (39 мМ глицин, 48 мМ трис-HCl рН 8.3, 0,037 мМ SDS, 20% метанол), с помощью прибора Trans-Blot Cell (Bio-Rad) при токе 300 мА в течение двух часов. Полноту переноса контролировали по маркерным белкам и окрашиванием геля 0,25% Кумасси G-250 в 7% уксусной кислоте.

Для иммунодетекции фильтр инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в PBS-Tween буфере (10 мМ трис-HCl рН 7.4, 0.9% NaCl, 0.1% Tween-20), содержащем 2% обезжиренного сухого молока, затем добавляли специфические моноклональные антитела (100 мкг/мл) в разведении 1:1000-1:5000 и инкубировали еще 1 час. Фильтр 3 раза по 10-15 мин отмывали PBS-Tween буфером и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с вторичными анти-видовыми поликлональными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Amersham). Фильтр 3 раза по 10-20 минут отмывали в буфере PBS, содержащем 0.1% Tween-20. Проявление специфических белковых полос проводили согласно инструкции к ECL-набору фирмы Amersham.

Использованные антитела: к митохондоиальной РНК полимеразе - кроличьи ^ поликлональные антитела (любезно предоставлены лабораторией Gerald S. Shadel); к РНКполимеразе II - кроличьи поликлональные антитела (SantaCruz #899,N-20), Flag М2 мышиные моноклональные антитела (Sigma).

2.6. Норзерн - блот анализ.

2.7. Приготовление проб для гибридизации на кДНК микроаррее.

В качестве проб для микроарреев была использована тотальная РНК, экстрагированная из клеток HeLa реагентом Тризол (Gibco-BRL) в соответствии с рекомендациями производителя и подвергнутая дополнительной очистке на колонках "RNeasy Mini Kit" (Qiagen) руководствуясь рекомендациями производителя.

2.8. ОТ-ПЦР анализ.

Выделение тотальной РНК производилось стандартным методом с помощью экстракции Тризолом. Для получения кДНК обратную транскрипцию проводили с использованием кита "SuperScript First-Strand Synthesis System" (Invitrogen) на 3 мкг тотальной РНК в 20 мкл реакционной смеси в соответствии с рекомендациями производителя. После этого аликвоты по 2 мкл переносили в 50 мкл реакционной смеси для ПЦР, содержащей по 100 нг специфических праймеров. ПЦР амплификацию проводили с использованием "Hi-Fi supermix" Тац-полимеразы (Invitrogen). Программа ПЦР подбиралась с учетом параметров специфических праймеров, по окончании амплификации смесь подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле,.

Таблица 2. Праймеры, использованные при ПЦР анализе генов, отобранных в результате микроарреев на тотальной РНК из клеток, обработанных D-аманитином:Название гена Состав праймеров1. MGC3256 5' праймер: 5' -cgttcctattactcagtgcag З'праймер: 5'-ggatgatccatcttcagtgg2. ALDH12 5' праймер: 5' -ccaaggactcttacgacttc З'праймер: 5'- agcctgacaactggcatcat3. KIAA0810 5' праймер: 5' -caaggacttcgccgtctatg 3' праймер: 5' -ttgaaggagtgtggcactgt4.ZBTB1 5'праймер: 5'- gtctagctgcttagatcaagat 3' праймер: 5' -tggtgccacttcagatctga5. H2AFJ 5' праймер: 5' - cgtgacaacaagaagaccag 3' праймер: 5' -agcagctactaggctaggaa6. FLJ12442 5' праймер: 5' -gctggctgcctggatgaaag 3' праймер: 5' -cctgtcccagacaataaagg7. S100A13 5'праймер: 5'- cttcttcacctttgcaaggc 3' праймер: 5' -tttgggaagagtgcggttct8. UBXD1 5'праймер: 5'- caagtacaactacacgctgc 3' праймер: 5' -tcacaagagcttctcgatgg9. FECH 5'праймер: 5'- caatccaaggttggtccgat 3' праймер: 5' -cctgcagacaggattgacac10. SLC25A10 5' праймер: 5' -cctctctgacaacatcttcac 3' праймер: 5' -gaagaacctagcgtgtctgg11.FDXR2 5'праймер: 5'- cctccgctttttccgaagc З'праймер: 5'-gaagctgtcagtcatggttg12. ATP5I 5' праймер: 5' -atcctgctccgtctgcagg 3' праймер: 5' -cacaggaagctttattcatccg13. NDUFB7 5' праймер: 5' -gctcaagtgcaagcgtgaca 3' праймер: 5' -gaaggcttttatttgactggtcc14. DCXR 5' праймер: 5' -atccaggtgtcgcagattgt З'праймер: 5'-agaaagaggatggcgttcac5'праймер: 5' -acaggaatcgcttctggaag15. AKR7A2 З'праймер: 5' -gaggtgacagaaaagccttgТаблица.З Праймеры, используемые при ПЦР анализе генов, отобранных в результате микроарреев на тотальной РНК из клеток, экспрессирующих siPHK к РНК полимеразе IV.

Название гена Состав праймеров1. FLJ41489 (W05495) 5'праймер: 5'-gacatgaggaaaggctgg З'праймер: 5'-gtcaccactgcgaagtg2. D-631 5' праймер: 5' -gtaatcgtagaccatgcctg 3' праймер: 5' -ctacctaagaaggcatctgg3. ULK1 5' праймер: 5' -ccgtgacttcttcctcatc 3' праймер: 5' -cgcaaagggcaggaaatc4. ARGBP2 5'праймер: 5'-cctggaagccaggtatg 3' праймер: 5' -ctactgactgatgacaaggg5. FLJ14867 5'праймер: 5'-cgcccttgagataggaaac 3'праймер: 5'-gcctcctgctattaatgcaatc6. р57К1Р 5'праймер: 5'-ggtgagccaatttagagcc 3' праймер: 5' -ctttacactttgggaccagtg7. шрр9 5'праймер: 5'-ctaagcaggatgccttctc З'праймер: 5'-gagtgcctgtagtgcaag8. NPIP 5' праймер: 5' -cacctcctccaactcaac 3'праймер: 5'-gattatcatccgctgaggg9. EGR1 5' праймер: 5' -gaggctttgggagcaaaataag 3' праймер: 5' -ggaaggatatacaccacatatcc10. EHHADH 5' праймер: 5' -ggagtacaggattcatctaatgg 3' праймер: 5' -gtgctctgtagaattcaaggc11. INSIG1 5' праймер: 5' -cattctgaactttggaatgaccc 3'праймер: 5'-gaatgtgaacctcactagatgttc12. Е-527 5'праймер: 5'-ggcagtaatagtaatacatccatg 3' праймер: 5' -gtggaaataagaacatccctac13. CLCN3 5' праймер: 5' -gggtcaaaatggacaggtc 3' праймер: 5' -gctgctgctttgacagtaaag14. LHX2 5' праймер: 5'-cttttctaatgactcgcaaccc 3' праймер: 5' -cagtattcctaaggcacgtg15. DSG2 5' праймер: 5' -gcagtaggacagaatgtgac 3' праймер: 5' -ctgtgtgtctgtaaggctc16. S100A11 5' праймер: 5' -ctgggattagaagcagaagg 3' праймер: 5' -gagtagcatttcccagattcttaag17. SOST 5 'праймер: 5 '-ggatacatcagtgatggtttgtaatg 3' праймер: 5' -ggagatggtgagaagccПраймеры, используемые при ПЦР анализе для детекции альтернативного сплайсинга в гене митохондриальной РНК полимеразы человека, в результате которого детектировалось два продукта размером 217 п.н. (митохондриальная РНК полимераза) и 338 п.н. (РНК полимераза IV): 5' праймер( 1): 5' -gtggtttcttatgcagcctc 5 'праймер(2): 5' -gtaatgtcggcactttgctg 3' праймер: 5' -atccttctccagtatctttgcч2.9. Выделение геномной ДНК из клеток эукариот.

2.10. Получение компетентных клеток E.coli и трансформация [161].

2.11. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК.

Аналитическое выделение плазмидной ДНК проводили также как и препаративное до стадии обработки с РНКазой. Бактериальные колонии засевали в 1-5 мл среды LB сампициллином. Для выделения использовали количество растворов I, II и III: 200 мкл, 400 мкл и 300 мкл, соответственно. После осаждения с изопропанолом и промывки 70% этанолом осадок ДНК растворяли в 20-50 мкл воды с РНКазой (10 мкг/мл) и рестрицировали.

2.12. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

Обработку препаратов ДНК рестриктазами проводили в соответствующих буферах, поставляемых фирмой производителем при рекомендуемых условиях. По окончании реакции ДНК фракционировали в агарозном геле.

2.13. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей.

Электрофорез ДНК проводили в 0.8-2% агарозных гелях в трис-ацетатном буфере (40 мМ трис-ацетат, рН 7.5; 2 мМ ЭДТА). Бромистый этидий добавляли непосредственно в раствор агарозы в концентрации 10 мкг/мл. Гели фотографировали на пленку Polaroid-665, используя светофильтр ОС-12.

Фрагменты ДНК выделяли из агарозных гелей с помощью кита QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) согласно указаниям производителя.

2.14. Реакция лигирования.

2.15. Получение конструктов и сиквенирование фрагментов к ДНК митохондриальной РНК полимеразы.

Нами было использовано три линии клеток: рак шейки матки человека (HeLa), мышиные иммортализованные фибробласты (ЗТЗ) и крысиные фибробласты (Rati). Клетки выращивали до достижения субконфлюэнтного монослоя на 10-см чашках Петри, затем отмывали буфером PBS и лизировали на льду реагентом Trizol (GibcoBRL). Выделение тотальной РНК проводили согласно рекомендациям производителя. Далее, с помощью обратной транскрипции была получена кДНК и поставлен ПЦР с использованием "Hi-Fi supermix" Taq-полимеразы (Invitrogen) и специфических праймеров, содержащих на концах рестриктные сайты. Праймеры были подобраны специальным образом, позволяющим детектировать продукт альтернативного сплайсинга гена митохондриальной РНК полимеразы.

1. Праймеры на альтернативный транскрипт гена митохондриальной РНК полимеразы человека:5'-праймер (Xbal): 5'-gagatctagaaggtaacacaaagggag З'-праймер (BamHI): 5'-agagaggatcccatctggaccttcctg2. Праймеры на альтернативный транскрипт гена митохондриальной РНК полимеразы для мыши и крысы:5'-праймер (EcoRI): 5'-gagagaattcggaaggtaaaggagtgtc З'-праймер (Bglll): 5'-agagagatcttcaccctcatctcagАмплификационную смесь подвергали электрофорезу в 1 % агарозном геле, полосы ДНК очищали с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN), далее подвергали обработке соответствующими рестрикционными эндонуклеазами и клонировали в вектор pUST. Полученные продукты были отсиквенированы в составе вектора pUST на автоматическом сиквенаторе с использованием следующих праймеров:(М13) 5'-праймер: 5'-gtaaaacgacggccagt (М13) З'-праймер: 5'-agcggataacaatttcacacagga2.16. Получение экспрессионных лентивирусных конструктов.

Получение конструктов, экспрессирующих siPHK, специфичные к различным генам. Для получения данных конструктов был использован лентивирусный вектор pLSLG, содержащий GFP, что позволяло отследить эффективность заражения. На основе этого вектора нами были созданы следующие конструкты, экспрессирующие siPHK к различным генам: pLSLG-siPIG3, pLSLG-siRNAPI, pLSLG-siRNAPII, pLSLG-si mtRNAP, pLSLG-siRNAPIV. Для этого на каждый ген были смоделированы оптимальные siPHK (Таблица 4).

Таблица.4 Структура siPHK, использованных при создании конструктов.

Создание конструкта pL V-mtRNAP.

Полноразмерная кДНК митохондриальной РНК полимеразы была любезно предоставлена Валерией Тирранти (Италия). Фрагмент кДНК, полученный методом ПЦР с помощью специфических праймеров, содержащих сайты рестрикционных эндонуклеаз, был подвергнут электрофорезу в 1% агарозном геле, очищен с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN), обработан соответствующими рестрикционными эндонуклеазами и заклонирован в экспрессионный лентивирусный вектор pLV.

Праймеры, использованные при клонировании: MtRNAP (EcoRI) 5'-праймер: 5'- agaggaattccgcaggcgcgggc MtRNAP (Xhol) 3'-праймер: 5'-agagcctcgagttttggtggcaaСоздание лентивирусных конструктов, содержащих Flag.

На основе конструкта с полноразмерной кДНК митохондриальной РНК полимеразы, с использованием специфических праймеров, содержащих последовательность Flag, а также сайты рестрикционных эндонуклеаз (Таблица 5) были получены следующие конструкты: pLV - mtRNAP (C-Flag), pLV-RNAP-IV (C-Flag), pLV-(6ATG) RNAP-IV (C-Flag), pLV-(9ATG) RNAP-IV (C-Flag), pLV-RNAP-IV (N-Flag).

Таблица 5. Праймеры, использованные при создании конструктов.Название конструкта Структура праймеровpLV-mtRNAP (C-Flag) 5'-праймер (Xbal): 5'- agagtctagaagcttaccatgtcggcactttgctgg 3'-праймер Flag (Hindlll): 5'-agagaagcttaccatggattacaaggacgacgacgataagatgtcggcactttgctggpLV-RNAP-IV (C-Flag) 5' -праймер (Xbal): 5' -ctagaagcttaccatgggggccaaggatgccaccccg 3'-праймер Flag (Hindlll): 5' -gatccggggtggcatccttggcccccatcttatcgtcgtcgtccttgtaatccatggtapLV-(6ATG) RNAP-IV (C-Flag) 5'-праймер (Xbal): 5' -agagtctagacatgtacaacgccgtg 3'-праймер Flae (Hindlll): 5' -gatccggggtggcatccttggcccccatcttatcgtcgtcgtccttgtaatccatggtapLV-(9ATG) RNAP-IV (C-Flag) 5'-праймер (Xbal): 5' -agagtctagacagatgagccaggagg 3'-праймер Flag (Hindlll): 5' -gatccggggtggcatccttggcccccatcttatcgtcgtcgtccttgtaatccatggtapLV-RNAP-IV (N-Flag) 5'-праймер Flag (Xbal) 5' -gagatctagaccatggattacaaggacgacgacgataagatgggggccaaggatgcc 3'-праймер (BamHI): 5' -agagaggatcctacacctggttcatgacggagacat*2.17. Трансфекция лентивирусных и плазмидных конструктов и получениеклеточных линий.

Для трансфекции эукариотических клеток лентивирусными и плазмидными конструктами был использован метод с применением LipofectAMINE PLUS реагента (GibcoBRL). За 24 часа до трансфекции клетки высевали на чашки Петри так, чтобы к моменту трансфекции они составляли 40-60% от монослоя. Всю процедуру проводили с учетом рекомендаций производителей.

Смесь для трансфекции составляли последовательно добавляя в 1.5-мл пробирку и пипетируя: ДНК плазмиды, ростовую среду DMEM, не содержащую сыворотку и антибиотики и PLUS реагент, в количествах, рекомендуемых производителем в зависимости от объема и количества клеток. После этого смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее LipofectAMINE реагент разводился таким же количеством DMEM и добавлялся в смесь, после чего трансфекционную смесь инкубировали еще в течение 15 минут, а затем аккуратно наливали на предварительно отмытые от сыворотки и антибиотика клетки и залитые необходимым объемом чистой среды DMEM. По истечении трех часов клетки отмывались от трансфекционной смеси и заливались нормальной средой.

При трансфекции лентивирусных векторов использовались две вспомогательные плазмиды VSVG и SR8.2, способствующие лучшей упаковке и проникновению вируса в клетку.

Если используемый вектор не содержал GFP, то для определения эффективности трансфекции параллельно трансфецировали клетки плазмидой pEGFP-Nl (Cloritech). Через 24-48 часов анализировали количество клеток под микроскопом в ультрафиолетовом свете. Трансфецированныс клетки при этом приобретают характерное зеленое свечение.

2.18. Идентификация промоторов ALDH12 и /I! ГШ, получение конструктов, содержащих изучаемые промоторы.

Конструкты pGL3-ALDH12. Нами была идентифицирована предполагаемая промоторная область гена ALDH12 (Рис.5). Чтобы дискриминировать минимальный активный промотор была подобрана серия праймеров. на разные участки промоторной области, содержащих на концах рестриктные сайты.

Таблица 6. Комбинации праймеров, специфичных промоторной области гена ALDH12, используемых при создании конструктов.

Рис. 6 Промоторная область гена ZBTB1gggcaggggtctgacatctggacggagtgggaaagcagcctcgcatcctgccctggggagtcgggaggagcccagttccatccagctg tgc a a acaggaggaggaggaggtcccaagcct acccttgagaggggcaagaggggtggtcaa gccgccgc cgccgcgacggcccc cgcggtgcgggttgc gccagcctcctc ggagctcgacgca ga aacttgttgcaacaaacaggcgacc gcgggtgcccctagcagccag cggcagagtgggtgggcgggcgagagggaggggaaggctggcggacgccgcagcgaactgglgggcagaccL-ggiigU-gvfgcglТаблица 7. Комбинации праймероа, специфичных промоторной области гена ZBTB1, используемых при создании конструктов.

Варианты промотора Комбинация праймеровPromoter 1-1 5'- праймер-] (Xba I): 5' -agagatctagagtctgacatctggacgg 3'- праймер-1 {Hind III): 5' -agagaagctt ac gc ggc ga с t с сPromoter 2-1 5'- праймер-2 (Xba I): 5' -agagatctagacagctgtgcaaacaggag 3'- праймер-l (Hind HI): 5' - agagaagctt gc 11 ae gc g gc gac tccPromoter 3-1 5*- праймер-3 (Xba I): 5' -agagatctagaggtggtcaagccgccg 3'- праймер-l (Hind Ш): 5*-agagaagct®tacgcggcgactccPromoter 4-1 5"- праймер-4 (Xba I): 5' -agagatctagagagctcgacgcagaaacttg 3'- праймер-l (Hind III): 5'-agagaagctt j^cttacgcggcgactccjКонструкты pGL3(TRE)-ALDH12. pGL3(TRE)-ZBTBl и pGL3(CMV)-ALDH12, ^ pGL3(CMV)-ZBTBI. Данные конструкты были получены следующим образом: из вектораpSIPT, содержащего энхансерную последовательность TRE, представленную шестью копиями тетрациклин респонсивного элемента (TRE), с помощью ПЦР, с использованием специфических праймеров, с заложенными на концах рестриктыми сайтами Mlul и Асс651, была получена энхансерная последовательность TRE. Далее, продукт ПЦР обрабатывался аналогичным образом и был заклонирован в уже существующие конструкты pGL3-ALDH12 и pGL3-ZBTBl перед соответствующей промоторной областью. Аналогичным образом, с использованием специфичных праймеров, были получены конструкты pGL3(CMV)-ALDH12 и pGL3(CMV)-ZBTBl, содержащие перед исследуемыми промоторами последовательность CMV энхансера.

Праймеры, использованные для получения данных конструктов: TRE энхансер:^ 5'-праймер (Mlul): 5'-gagagacgcgtcgcttttcccctcgagЗ'-праймер (Acc65I): 5'-tactcgacccgggtacc CMV энхансер:5'-праймер (Mlul): 5'- gagagacgcgtactagtgcccagtacatgac З'-праймер (Acc65I): 5'-agagaggtaccatagacctcccaccgtac2.19. Измерение активности люциферазы.

В клетки HeLa с помощью прямой трансфекции был введен вектор pGL3, экспрессирующий ген люциферазы под минимальным SV40 промотором (pGL3-SV40), а так же полученные ранее конструкты pGL3-ALDH12, pGL3-ZBTBl, pGL3(TRE)-ALDH12 и pGL3(TRE)-ZBTBl. В качестве контроля был использован пустой вектор pGL3. В каждом Щ случае с люциферазной плазмидой котрансфецировалась плазмида, экспрессирующая генР-галактозидазы, для проверки эффективности трансфекции. Через 48 часов клетки промывали 3 раза 1 xPBS, лизировали с помощью лизируещего буфера (Reporter Lysis Buffer, Promega), для лучшего лизиса клетки инкубировались в течение часа при -70С, после чего им давали оттаять и измеряли активность люциферазы с помощью Luciferase Assay System (Promega) в соответствии с рекомендациями производителя.

2.20. Хроматиновая иммунопреципитация.

2.21. Иммунофлуоресценция.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Обнаружение аномального поведения транскрипта гена PIG3 в ответ па обработку клеток а-аманнтином, не характерного для генов, транскрибируемых РНК полимеразой 11.

При изучении новых биологических активностей мугантных р53 (Pugacheva, Ivanov, Kravchenko, Chumakov, 2002) мы использовали различные обработки, позволяющие установить последовательность событий при экспресии генов, регулируемых р53. Для этого, в частности, применялась обработка клеток ингибиторами транскрипции, такими как а-аманитин (подавляет РНК полимеразу II). 11ри анализе экспрессии р53-индуцируемого гена 3 (PIG3), было получено неожиданное наблюдение: в клетках человека различного р53 статуса имеется два транскрипта гена РГСЗ, размером 1,9 и 2,3 kb, которые обнаруживают различия в регуляции после обработки а -аманитином (Рис.7).

Рис.7 Нозерн-блот анализ тотальной РНК, полученной из контрольных клеток HeLa (К) и клеток, инкубированных в течение 14 часов с 15 цг/мл а-аманитина (ААМ) и гибридизованной с пробами к генам PIG3 и GAPDH.

Транскрипт размером 1,9 kb, который был описан ранее как р53 регулируемый, исчезал после 14 часовой обработки !5 цг/мл а-аманитином, что согласуется с тем, что он транскрибируется РНК полимеразой II. При этом транскрипт размером 2.3 kb не только не-2300 bp соО0 -1900 bp GAPDHснижался после обработки а-аманитином, но и значительно увеличивался, что не имело рационального объяснения, поскольку подавление РНК полимеразы не могло сопровождаться увеличением интенсивности транскрипции.

3.2. Дополнительный транскрипт, размером 2,3 kb, является специфичным и кодируется геном PIG3.

Для дальнейшего изучения необычной реакции транскриптов гена PIG3 на обработку а -аманитином следовало подтвердить, что дополнительный транскрипт размером 2,3 kb не является гибридизационным артефактом и кодируется геном PIG3. Для этого транскрипты гена PIG3 подавляли используя феномен РНК-интерференции. Это достигалось экспрессией в клетках HeLa с помощью лентивирусного вектора pLSLG малой шпилечной РНК, содержащей двуцепочечный участок 19-21 пар оснований, комплементарный участкам экзонов гена PIG3. Такие шпилечные РНК процессируется клеточными ферментами до образования двуцепочечных siPHK, которые в цитоплазме взаимодействуют с мРНК, выбранной в качестве мишени, и вызывают ее ускоренное разрушение. Через 48 часов после введения конструкта из клеток была выделена тотальная РНК и проанализирована с помощью Нозерн-гибридизации с пробой, соответствующей гену PIG3. Количество как 1,9, так и 2,3 кЬ транскриптов гена PIG3 существенно уменьшалось после введение siPHK, что указывает на то, что обе формы РНК транскрибируются с гена PIG3 (Рис.8).-2300 bpго<DО. -1900 bp «отGAPDHРис.8 Нозерн - блот анализ тотальной РНК из клеток HeLa, через 48ч. после введения siPHK, специфичного гену PIG3 и гибридизованной с пробами к генам PIG3 и GAPDH. (К) - контроль, (pLSLGJ- клетки с введенным пустым вектором, (siPIG3) - клетки с введенным siPHK, специфичным гену PIG3.

3.3. Идентификация и анализ транскрнптов, которые, подобно второму транскрнпту гена PIC3, активируются в ответ иа обработку а -аманитином.

Мы задались целью выявить другие гены, обладающие аналогичной реакцией на а-аманитин. Для этого гибридизацией с упорядоченными наборами последовательностей мРНК человека (микроарреи кДНК человека фирмы Asymetrix) были установлены транскрипты, количество которых увеличивается в 2 и более раз в препаратах тотальной РНК клеток HeLa. обработанных а -аманитином. Как и ожидалось, основная часть транскриптов оказалась чувствительной к а-аманитину, что согласуется с поведением мРНК, транскрибируемых РНК полимеразой II. Тем не менее, было выявлено несколько десятков транскриптов, количество которых заметно увеличивалось в ответ на обработку а-аманитином. Естественно было предположить, что в клетках часть транскриптов обладает повышенной стабильностью, в результате чего их относительное количество может повышаться на фоне более короткоживущих РНК; такие транскрипты также могугоказаться в списке а-аманитин устойчивых мРНК, наряду с истинно а-аманитин устойчивыми транскриптами Для выявления истинных а-аманитин устойчивых транскриптов нами было отобрано 15 генов из общего списка, количество транскриптов которых после обработки ингибитором обнаруживали разную степень превышения относительно контроля (Таблица 8).increase factor name of авпе address12.1 ALDH12 'gb:NM022568.1 /DEF=Homo sapiens aldehyde dehydrogenase 12(ALDH12)2.8 KIAA0810 Consensus includes gb:BE615699 CLONE=IMAGE:3621960 / KIAA0810 protein2.5 ZBTB1 'gb:NM014950.1 /DEF=Homo sapiens KIAA0997 protein (KIAA0997)2.5 H2AFJ 'gb:NM018267.1 /DEF=Homo sapiens hypothetical protein FLJ10903 (FLJ10903)2.3 MGC3266 'gb:NM024028.1 /DEF=Homo sapiens hypothetical protein MGC3265 JVIGC3265)2.3 F LJ12442 gb:NM022908.1 /DEF=Homo sapiens hypothetical protein FLJ12442 (FLJ12442)2.3 S100A13 'gb:NM005979.1 /DEF=Homo sapiens S100 calcium binding protein A13 (S100A13)2.3 UBXD1 'gb:NM025241.1 /DEF=Homo sapiens UBX domain containing gene 1 (UBXD1)2.1 FECH Consensus includes gb:AU152635=Hs.26ferrochelatase protoporphyria) /FL=gb:NM000140.12.1 SLC25A10 gb:NM012140.1 /DEF=Homo sapiens solute carrier family 25 ( chondrialcarrier; dicarboxylatetransporterSLC25A10)2.1 FDXR gb:NM004110.2 /DEF=Homo sapiens ferredoxin reductase (FDXR), nuclear gene encoding mitochondrial protein2 ATPSI gb.NM007100.1 /DEF=Homo sapiens ATPsynthase, H+ transporting, mitochondrial FO complex, subunit e (ATP5I)2 NDUFB7 gb:NM004146.2 /DEF=Homo sapiens NADH dehydrogenase ubiquinone) 1 beta subcomplex, (NDUFB7)2 DCXR gb:NM016286.1 /DEF=Homo sapiens carbonyl reductase (LOC51181)2 AKR7A2 gb:NM003689.1 /DEF=Homo sapiens aldo reductase family 7, member A2,(aflatoxin aldehyde reductase AKR7A2]Таблица.8 Гены, отобранные в результате анализа микроарреевДалее эти гены были подвергнуты количественному анализу с помощью ПЦР после обратной транскрипции матриц (метод ОТ-ПЦР). Для этого использовали специфические олигонуклеотидные праймеры, соответствующие экзонам каждого из 15 генов. Сравнению были подвергнуты препараты РНК клеток HeLa, инкубированных с а-аманитином и без; вкачестве дополнительного контроля использовали РНК после обработки рифампицином, ингибитором прокариотических РНК иолимераз, а также митохондриальной РНК полимеразы клеток (Рис.9).MGC3265 ALDH ZBTB1 KIAA0810 SLC25A10К ККккFLJ12442 S100A13 UBXD1 FECH H2AFJК А К А К А К А К А штт шят МНЯрFDXR2 АТР51 NDUFB7 DCXR AKR72К А К А К А К А К Аmm шт—mmm* mm Рис.9 Результаты ОТ-ЛЦР на РНК, выделенной из контрольных Hela клеток {К] и клеток, обработанных а-аманитином (А) с использованием специфических праймеров на гены, отобранные после анализа микроарреее.

Из пятнадцати протестированных транскриптов одиннадцать обнаружили чувствительность к а-аманитину, что характерно для РНК, транскрибируемой РНК полимеразой И. Однако, четыре транскрипта (генов MGC3265, ALDHI2, ZBTB1, KLAA0810) обнаружили устойчивость/увеличение в ответ на обработку а-аманитином,3.4. Характеристика транскрипции генов P1G3, MGC3265 н ALDH12.

Мы сосредоточились на анализе транскрипции генов MGC3265 и ALDH12, которые продемонстрировали наиболее выраженную устойчивость к а -аманитину. С помощьюНозерн-гибридизации было показано зависимое от дозы а -аманитина увеличение уровнятранскрипции данных генов (Рис.10).HeLaААМ (мкг/мл)А431ААМ (мкг/мл)MRC5ААМ (мкг /мл)к d ^ о И J1 г- и И> о to К О т- LO т- т- и Ч о ю г\ О ч- Ю тPIG3 —ZZZ --ттШШMGC3265 •и* «М М> ттт ALDH12 р21 пг яш вш ШШ GAPDH Рис.10 Ноэерн-гибридизация тотальной РНК, полученной из контрольных клеток HeLa, А431, MRC5 (К) и клеток, инкубированных в течение 12 часов с разными дозами а-аманитина (ААМ) (от 0.5 до 15 мкг/мл). Гибридизация с мечеными пробами для генов PIG3, MGC3265, ALDH12, р21 Wan и GAPDH.

В качестве положительного контроля был использован ген PIG3 (верхний транскрипт размером 2,3kb)f а в качестве отрицательного - р53 регулируемый ген p21Waf1. Результат был воспроизведен независимо на трех линиях клеток (HeLa, А431 и MRC5), При этом гены р21 Wafi и GAPDH демонстрировали зависимое от дозы а -аманитина снижение транскрипции, в то время как транскрипция генов PIG3, MGC3265 и ALDH12 демонстрировала обратную зависимость, усиливаясь по мере увеличения концентарции ингибитора, что совершенно нехарактерно для генов, транскрибируемых РНК полимеразойПытаясь найти обьяснение обнаруженному эффекту, в результате которого уровень транскрипции исследуемых генов значительно увеличивался в после обработки ингибитором РНК полимеразы II а -амапитином, мы решили протестировать действиенекоторых других обработок на транскрипцию выбранных генов. В частности, клетки HeLa обрабатывали перекисью водорода (Н2О2), ингибиторами различных киназ, а также облучали UV. Уровень экспрессии генов PIG3, MGC3265 и ALDH12 определяли с помощью Нозерн-гибридизации РНК, полученной из обработанных клеток (Рис. 11).PIG3 MGC3265 ALDH12 GAPDHРис.11 Нозерн-гибридизация тотальной РНК, полученной из контрольных клеток HeLa (К), а также клеток после обработки: Н2О2, UV, имитатором гипоксии диффероксамином (DFO); ингибитороми: PI3 киназ (Wortmanin), серин-треониновых киназ (Н7), МЕК I и II киназ (PD98039), EGFR (AG 1478), тирозиновых киназ (Genistein), а также а-аманитином (ААМ). Блот гибридизовался с мечеными пробами для генов PIG3, MGC3265, ALDH12 и GAPDH.

В результате было обнаружено, что инкубация с 0,5 мМ Н2О2 в несколько раз увеличивала уровень экспресии PIG3, MGC3265 и ALDH12, что свидетельствует об активации данных генов под действием окислительного стресса. Кроме того, было обнаружено, что данные гены активируются также после обработки ингибитором широкого спектра серин-греониновых киназ Н7 (100 (iM/мл). Интересно, что Н7 также является ингибитором РНК полимеразы II, подавляя активацию этого фермента, и поэтомуСП СО соо г-«ООCD чQ ОCL <полученный результат хорошо согласуется с эффектом а-аманитина. Таким образом, нами было установлено, что транскрипция генов PIG3, MGC3265 и ALDH12 повышается в ответ на обработку ингибиторами РНК полимеразы II, кроме того, транскрипция данных генов активируется при окислительном стрессе.

3.5. Экспрессия генов, устойчивых к а -аманитнну, возрастает после подавления РНК полимераз I или II.

Чтобы установить, имеет ли РНК полимераза II или I отношение к транскрипции генов PIG3, MGC3265 и ALDH12 в клетках HeLa с помощью лентивирусного вектора pLSLG были проэкспрессированы siPHK, специфичные, соответственно, генам больших субъединиц РНК полимераз I или II. Клетки собирались в течение четырех дней после введения siPHK; на выделенной из них тотальной РНК был поставлен Нозерн, после чего блот гибридизовался с меченными кДНК пробами, специфичными для больших субьединиц РНК полимеразы I и II, соответственно, а также для генов PIG3, MGC3265, ALDH12 и GAPDH. В качестве контролей была использована РНК, полученная из контрольных клеток, клеток обработанных а -аманитином, и клеток зараженных пустым вектором pLSLG (Рис.12).

Было обнаружено, что в ответ на подавление РНК полимераз I или II уровень транскрипции генов PIG3, MGC3265 и ALDH12 не только не снижался, но, напротив, значительно активировался, усиливаясь в течение нескольких дней после заражения. В то же время, транскрипты гена GAPDH, а также самих РНК полимераз I и II после введения siPHK существенно снижались.PIG3 MGC3265ALDH12 GAPDHГнс.12 Нозерн-гибридизация тотальной РНК, полученной из контрольных клеток HeLa (К), клеток, обработанных а-аманитином (ААМ), либо после четырех дней экспрессии siPHK к генам РНК полимераз I (RNAP1) или II (RNAPII), а также клеток, в которые в качестве контроля был введен пустой вектор (pLSLG). Бпот гибридизовался с мечеными пробами для генов PIG3, MGC3265, ALDH12, GAPDH, а также для РНК полимераз I (RNAPI) и II (RNAPII).

3.6. Экспрессия а-аманитни устойчивых геион снижается после специфического подавления митохондриальной РНК полимеразы.

Так как, мы установили, что в транскрипции генов PIG3, MGC3265 и ALDH12 РНК полимеразы I, ff и III, по-видимому, не участвуют, а также принимая во внимание тот факт, что уровень экспресии этих генов значительно снижается после обработки клеток ингибитором митохондриальной РНК полимеразы рифампицином,, мы решили проверить, не может ли митохондриальная РНК полимераза каким-то образом участовать в транскрипции этих генов. Нами были подобраны siPHK, специфичные для экзонов генамитохондриальной РНК полимеразы. После их экспрессии в клетках HeLa в составе вектора pLSLG, клетки собирались в течение четырех дней, выделяли тотальную РНК и анализировали Нозерн-гибридизацией с меченными кДНК пробами, специфичными для генов PIG3, MGC3265, ALDHI2 и GAPDH, а также для гена самой митохондриальной РНК полимеразы (Рис.14).

Было обнаружено, что несмотря на существенное снижение уровня самого гранскрипта митохондриальной РНК полимеразы, с первого по третий день экспрессии siPHK обнаруживалось значительное увеличение транскрипции анализируемых генов, и только на четвертый день экспрессии siPHK наблюдалось некоторое снижение. При этом на экспрессию гена GAPDH введение siPHK к митохондриальной РНК полимеразе влияния не оказывало.О^ дни после инфекцииК о- 1 2 3 4PIG3 MGC3265 ALDH12GAPDH mtRNAPРис.14 Нозерн-гибридизация тотальной РНК, полученной из контрольных клеток HeLa (К), клеток, экспрессирующих в течение четырех дней siPHK к гену митохондриальной РНК полимеразы (si-mtRNAP), а также клеток, в которые для контроля был введен пустой вектор (pLSLG). Блот гибридиэовался с мечеными пробами к генам PIG3, MGC3265, ALDH12, GAPDH, а также митохондриальной РНК полимеразы (mtRNAP).

Мы предположили, что наблюдаемое повышение транскрипции исследуемых генов объясняется их индукцией под действием окислительного стресса, развивающегося за счет повреждения митохондрий после подавления синтеза митохондриальной РНК полимеразы. Это предположение было основано на вышеприведенных наблюдениях, указывающих на активацию транскрипции тех же генов после обработки Н2Ог (Рис.11).

Действительно, развитие окислительного стресса обнаруживалось FACS анализом путем измерения внутриклеточного уровня ROS в контрольных клетках HeLa и в клетках с митохондриальной РНК полимеразой, подавленной экспрессией siPHK (Рис.15).

Рис. 15 Результаты FACS анализа на контрольной линии HeLa (control) и на клетках HeLa, экслрессирующих в течение двух дней siPHK к гену митохондриальной РНК полимеразы (si-mitRNApol). Внутриклеточный уровень ROS был измерен инкубацией клеток с флуоресцентным препаратом дихлордигидрофлюоресцеином (DCF).

Чтобы исключить влияние эффекта, вызванного окислительным стрессом, нами была получена линия клеток (рО), не содержащая активных митохондрий, и следовательно, не продуцирующая митохондриальных ROS. Для этого клетки HeLa в течение четырех недель пассировали в присутствии 50 нг/мл бромистого этидия на специальной среде. Отсутствие активных митохондрий было детектировано с помощью реагента MitoTracker Red (Рис.16).контроль рОРис.16 Окраска клеток на активные митохондрии реагентом MitoTracker Red: контрольная линия HeLa и рО HeLa, не содержащая митохондриальной ДНК.

После этого, в клетках рО HeLa экспрессировали siPHK к митохондриальной РНК полимеразе, и ставили Нозерн гибридизацию с РНК, полученной на четверый день экспрессии. Блот отжигался с меченной кДНК для генов PIG3, MGC3265, ALDH12 и GAPDH (Рис.17). При этом было обнаружено значительное снижение уровня экспрессии исследуемых генов.

Подавление митохондриальной РНК полимеразы в клетках рО HeLa не приводило к какому-либо увеличению уровня ROS, что определялось FACS анализом (Рис.18).

Таким образом, митохондриальная РНК полимераза действительно имеет отношение к транскрипции генов РЮЗ, MGC3265 и ALDH12, обнаруживающих устойчивость к а -амцнитину и чувствительность к рифампицину, что подтверждается фактом снижения уровня транскрипции исследуемой группы генов после специфического подавления митохондриальной РНК полимеразы siPHK.КPIG3 шMGC3265 mmALDH12 шGAPDH mtRNAP о—IсоJ CL<СИ1=I(ЛРнс. 17 Нозерн-гибридизация тотальной РНК, полученной из контрольных (К) клеток рО HeLa, из клеток на четвертый день экспрессии siPHK к гену митохондриальной РНК полимеразы (si-mtRNAP), а также клеток, в которые в качестве контроля был введен пустой вектор (pLSLG). Блот гибридизовался с мечеными пробами к генам PIG3, MGC3265, ALDH12, GAPDH, а также к гену митохондриальной РНК полимеразы (mtRNAP).оЕСЧ) О • £<0о О1 ^о ■control si-mit RNApol*f ™ I I -f^WHf*—i—i—1010'1?10"10'l*nc. 18 Результаты FACS анализа на контрольной линии рО HeLa (control) и на клетках р0 HeLa, экспрессирующих в течение двух дней siPHK к гену митохондриальной РНК полимеразы (si-mit RNApol). Внутриклеточный уровень ROS измеряли после инкубации клеток с флуоресцентным препаратом дихлордигидрофлуоресцеином (DCF).

3.7. Белок, узнаваемый антителам» к митохондриальной РНК полимеразе обнаруживается как в митохондриях, так и в ядре.

Как и большинство митохондриальных генов, ген митохондриальной РНК полимеразы находится в ядре и, соответственно, митохондриальная РНК полимераза поступает в ми тохондрии уже после синтеза на полирибосомах цитоплазмы. Транслокация в митохондрии осуществляется за счет специфической последовательности в N-концевой части белка. Однако, если митохондриальная РНК полимераза как-то участвует в транскрипции немитохондриальных (ядерных) генов, она должна обладать способностью проникать в ядро и там осуществлять свою функцию. Для определения местонахождения митохондриальной РНК полимеразы мы использовали метод иммунофлуорссцентного анализа препаратов клеток HeLa после окраски антителами, реагирующими с пептидом, расположенным в С-концевом сегменте митохондриальной PIIK полимеразы (Рис.19).

Рис.19 Внутриклеточная локализация митохондриальной РНК полимеразы, определенная методом иммунофлуоресценции с антителами, специфичными к пептиду митохондриальной РНК полимеразы. Конфокальная микроскопия.

Далее, мы решили определить распределение митохондриальной РНК полимеразы после стимуляции экспрессии изучаемых нами генов, для чего в течение 14 часов клетки HeLaинкубировали либо с а -аманитином, либо в присутствии 5мМ Н2О2 (Рис.20). Было обнаружено, что наблюдается перераспределение ядерного белка с образованием отдельных центров. Поскольку перераспределение совпадает со значительной стимуляцией транскрипции генов РЮЗ, MGC3265 и ALDH12, мы предполагаем, что именно в этих центрах может сосредотачиваться процесс синтеза соответствующих, генов. Однако, данный вопрос требует дополнительного изучения.

1 з л 4 * * 4Рис.20 Внутриклеточная локализация белка митохондриальной РНК полимеразы в контрольных клетках после обработки преиммунной сывороткой (1), контрольных клетках HeLa, покрашенных антителами к митохондриальной РНК полимеразе (2), а также после обработки клеток а-аманитином (3) и Н2О2 (4). Иммунофлуоресцентный анализ.

3.8. Существование двух форм белка, детектируемых антителами к митохондриальной РНК полимеразе.

Нам представлялось важным определение электрофоретической подвижности ядерной и митохондриальной форм белков, реагирующих с антителами к митохондриальной полимеразе. Для этого с помощью Вестерн-анализа мы сравнилибелковые экстракты из митохондриальных и ядерных фракций; кроме этого, для сравнения использовали тотальные белковые экстракты клеток HeLa и рО HeLa. В тотальном экстракте обнаруживалось две формы белка (Рис.21), одна - размером 135кД, известная как митохондриальная РНК полимераза и дополнительная, размером ИОкД. При этом, митохондриальная фракция содержала только длинную форму белка, размером 135кД, а ядерная фракция - только короткую, размером 1 ЮкД. Более того, в тотальном экстракте белка, полученном из рО клеток, не содержащих митохондриальной ДНК (Рис. 16), количество верхней (митохондриальной) формы было значительно снижено, в то время как количество нижней (ядерной) формы, размером 110 кД, оставалось неизменным.

Чтобы подтвердить специфичность обеих форм белка и их отношение к гену митохондриальной полимеразы, в клетках рО HeLa с помощью лентивирусного вектора pLSLG экспрессировали siPHK, специфичные для экзонов 3 и 17 гена митохондриальной РНК полимеразы (POLRMT); тотальный белковый лизат из этих клеток также был нанесен на Вестерн-блот. Было обнаружено практически полное исчезновение обеих форм белка, детектируемых антителами к митохондриальной РНК полимеразе, что указывает на то, что обе формы содержат последовательности экзонов гена POLRMT (Рис. 21).

135К 110КРис.21 Вестерн-анализ экстрактов белка, полученных из клеток HeLa и рО HeLa с использованием антител, специфичных экзонам гена POLRMT. (К) - тотальный белковый экстракт, (М) -митохондриальная фракция, (Я)-ядерная фракция, (si-RNA) - белковый экстракт, из клеток, экслрессирующих siPHK к гену POLRMT.

К si-RN/HeLaHeLa (рО)Одним из объяснений происхождения второй укороченной (ядерной) формы белка может быть посттрансляционный процессинг полноразмерного продукта трансляции. Чтобы проверить такую возможность в клетки рО HeLa с помощью лентивирусного вектора pLV была введена полноразмерная кДНК гена митохондриальной РНК полимеразы. По истечении двух дней белковые продукты определялись с помощью Вестерн-анализа с использованием антител к митохондриальной РНК полимеразе, результаты которого показали значительное увеличение количества длинной формы белка, размером 135кД, и неизмененное количество короткой формы 110 кД. Более того, в ядерной фракции, изолированной из этих клеток, даже после гиперэкспрессии митохондриальной РНК полимеразы, белок размером 135кД не появлялся, а количество 110 кД формы белка также оставалось неизменным (Рис.22).

135К 110КРис. 22 Вестерн-анализ тотальных экстрактов белка (Т), а также ядерной фракции (Я), полученных из рО HeLa клеток, с использованием антител, специфичных к митохондриальной РНК полимеразе. (К) - контроль; (mtRNAP) - белок, полученный из клеток, экспрессирующих полноразмерную митохондриальную РНК полимеразуТаким образом, 110 кД форма белка не является продуктом посттрансляционного процессинга митохондриальной РНК полимеразы, а синтезируется как независимая форма.

Полученный результат предполагает существование альтернативной формы мРНК, служащей специфической матрицей для синтеза ядерной 110 кД формы белка3.9. Доказательство существования альтернативного сплайсинга в гене митохондриальной РНК полимеразы.

Предполагая, что обе формы белка кодируются одним геном, мы решили проанализировать доступные базы данных EST на предмет возможных альтернативных структур мРНК, соответствующих гену POLRMT. Особенно нас интересовали EST, картирующиеся в 5'-концевой части гена, поскольку эта область кодирует N-концевой пептид, отвечающий за митохондриальную локализацию белка. Мы допускали варианты сплайсинга, при которых эта область белковой молекулы будет отсутствовать. При анализе EST мы обнаружили, что 19 EST, соответствующих 5'-концевой части гена, поддерживают структуру основного транскрипта, кодирующего митохондриальную РНК полимеразу. Однако три EST соответствовали альтернативному транскрипту, который содержал проксимальные 224 нуклеотида интрона 1. Такой транскрипт содержит три стоп ко дона, происходящие из интрона 1, которые прерывают рамку считывания, используемую для трансляции митохондриальной РНК полимеразы, в результате чего следующим вероятным стартом трансляции оказывается начало третьего экзона (Рис.23). Чтобы проверить существование подобного транскрипта в клетках HeLa нами были использованы праймеры, специфичные 5'-участку митохондриальной РНК полимеразы, на границе между первым экзоном и интроном (Рис.23).

ДТПex.1ex.2Рис.23 Схема альтернативного сплайсинга гена митохондриальной РНК полимеразы человека. (рг.1, рг.2, рг.З) - специфические праймеры для обнаружения альтернативного транскрипта митохондриальной РНК полимеразы.

С помощью ОТ-ПЦР было подтверждено существование двух вариантов альтернативного сплайсинга, один из которых соответствует основной форме, а другой -включает в себя часть первого интрона; его доля составляет 20-25% транскриптов гена POLRMT (Рис.24).

Рис.24 ОТ-ПЦР на тотальной РНК с использованием специфических праймеров на альтернативный транскрипт гена митохондриальной РНК полимеразы. (1) - продукт альтернативного сплайсинга, (2) -полноразмерный транскрипт РНК полимеразы митохондрий.

Аналогичные данные, подтверждающие существование альтернативного транскрипта, были получены методом ОТ-ПЦР на РНК, выделенной из мышиных фибробластов ЗТЗ, а также из фибробластов крысы Rati, что свидетельствует о том, что данный механизм присущ и другим организмам (данные не представлены). Продукты, полученные в результате ОТ-ПЦР были сиквенированы и было показано, что они полностью соответствуют формам, представленным в базе данных EST. Таким образом, мы установили существование альтернативного сплайсинга гена POLRMT, в результате1 2которого у человека образуется транскрипт, включающий часть интрона между первым и вторым экзонами, а у мыши и крысы транскрипт, который полностью включает интрон между первым и вторым экзонами, что также приводит к образованию укороченной формы белка. Белковый продукт, образующийся при трансляции альтернативного транскрипта, не содержит сигнала транспорта в митохондрии, однако, содержит сигнал ядерной локализации, что позволяет ему локализоваться в ядре, что и было показано нами ранее в эксперименте (Рис.19, 21, 22). Укороченный белок, образующийся в результате альтернативного сплайсинга первичного транскрипта гена POLRMT, который локализуется в ядре и, возможно, имеет отношение к транскрипции генов РЮЗ, MGC3265 и ALDH12 был обозначен нами как ядерная РНК полимераза IV.

3.10. РНК полимераза IV кодируется альтернативной формой мРНК.

В клетках рО HeLa с помощью лентивирусного вектора pLSLG были проэкспрессированы siPHK, специфичные последовательностям интрона 1, присутствующим в альтернативном транскрипте гена POLRMT. Очевидно, что такие siPHK не должны влиять на экспрессию основного транскрипта. По истечении двух дней из клеток был получен тотальный экстракт белка, который был подвергнут Вестерн-анализу (Рис.25).

Наблюдалось полное исчезновение нижней формы белка размером ИОкД после экспрессии siPHK, специфичных интрону 1 гена POLRMT. Полученные данные свидетельствуют о том, что короткая форма белка, детектируемая антителами к митохондриальной РНК полимеразе, кодируется альтернативным транскриптом гена POLRMT, содержащим интрон 1.

135К11 OKРис.25 Вестерн-анализ тотальных экстрактов белка, полученных из контрольных рО HeLa клеток (К), а также из клеток, экспрессирующих siPHK к интрону 1 гена POLRMT (siRNA).

Этот же вывод был подтвержден при использовании метода иммунофлуоресценции на клетках рО HeLa (Рис.26). В этих клетках с помощью лентивирусных векторов были экспрессированы: я^-полноразмерный белок митохондриальной РНК полимеразы, который, как показано, не усиливает ядерную окраску, а локализуется в митохондриях., б)-siPHK. специфичные как для митохондриальной РНК полимеразы, так и для РНК полимеразы IV (экзоны 3 и 17 гена POLRMT), в результате введения которых значительно снижается интенсивность ядерной окраски, е)-siPHK, специфичные только для РНК полимеразы IV (интрон 1 гена POLRMT), введение которого также приводит к существенному снижению интенсивности ядерной окраски, при этом не влияя на окраску митохондрий.

Таким образом, РНК полимераза IV, образующаяся в результате альтернативного сплайсинга гена POLRMT, локализуется в ядре. Её количество специфически снижается после введения соответствующих siPHK.

Рис.26 Иммунофлуоресценция на клетках рО HeLa, с использованием антител, специфичных к РНК полимеразе митохондрий. (1) - контроль, (2) - клетки, экспрессирующие митохондриальную РНК полимеразу, (3) - клетки, экспрессирующие siPHK к митохондриальной и IV РНК полимеразе (экзоны 3 и 17), {4)-клетки, экспрессирующие siPHK к РНК полимеразе IV (интрон 1).

3.11. Альтернативная форма РНК действительно способна кодировать ядерную форму белка 110 кД.

Мы сконструировали лентивирусные векторы, содержащие как полно размерную кДНК митохондриальной РНК полимеразы, так и укороченную с N-конца кДНК. в которой первый ATG ко дон располагался на третьем экзоне, как это имеет место в альтернативном транскринте. Для удобства обнаружения обе формы белка были помечены на С-конце за счет введения пептидного Flag эгштопа. Конструкты были проэкспрессированы в клегках рО HeLa, после чего методом иммунофлуоресценции с использованием антител, специфичных к Flag, была установлена их внутриклеточная локализация (Рис.27).mtRNAP (Flag)RNAP-IV (Flag)jfefc- шfr»Рис.27 Иммунофлуоресценция на клетках рО HeLa с использованием антител, специфичных к Flag, (mtRNAP) - клетки, экслрессирующие полноразмерную кДНК митохондриальной РНК полимеразы с Flag-пептидом на С-коннце, (RNAP-IV) - клетки, экспрессирующие укороченную форму кДНКс Flag-пептидом на С-коннце.

Как видно из результатов иммунофлуоресценции, белок, кодирующийся полно размерной мРМК обладает исключительно митохондриальной локализацией и не обнаруживается в ядре, в то время как укороченный с N-конца белок локализуется только в ядре.

Далее, из клеток рО HeLa экспресеирующих оба эти конструкта были получены тотальный белковый экстракт, а также ядерная фракция, которые были подвергнуты Вестерн-анализу с антителами к Flag-эпитопу (Рис.28). Как следует из опыта, белок, полученный на полноразмерной кДНК, имеет размер 135 кД, что полностью совпадает с размером митохондриальной РНК полимеразы; более того, эта форма не обнаруживается в ядерной фракции. Белок, полученный на укороченной форме кДНК, соответствует размеру ПОкД и присутствует в ядерном экстракте. Анализируя данные иммунофлуоресцеции и Вестерн-блот анализа, мы пришли к выводу, что, митохондриальная РНК полимераза и РНК полимераза IV, образующаяся в результате альтернативного сплайсинга, кодируются разными формами мРНК. чем и определяются различия в их локализации и функции.

135К11QKРис.28 Вестерн-анализ с использованием энти-Flag антител, на тотальных экстрактах белка (Т) и ядерной фракции (Я), полученных из клеток рО HeLa. (К ) -контроль, (mtRNAP) - клетки, экспрессирующие полноразмерную кДНК митохондриальной РНК полимеразы с Flag на С-конце, (RNAP-IV)- клетки, экспрессирующие укороченную форму кДНК с Flag на С-конце.

3.12. Для трансляции белка РНК полимеразы IV используется шестой стартовый V ATG колон.

Анализируя предсказанный и фактический размеры белка, кодируемого альтернативным транскриптом, мы обнаружили явное несоответствие. Белок, укороченный с N-конца и транслирующийся с укороченной мРИК должен иметь размер 1060 аминокислот, что составляет примерно 130кД. В то же время мы наблюдали белковый продукт размером всего ПОкД. В связи с этим было сделано предположение, что для инициации трансляции РНК полимеразы IV используется не первый ATG кодон третьего экзона. Для проверки этого в клетках рО HeLa был экспресс ирован лентивирусный конструкт, содержащий укороченную форму кДНК, и имеющий Flag эпитоп либо на С, либо на N-конце молекулы. Белковые лизаты, полученные из этих клеток были подвергнуты Вестерн-анализу с использованием антител, узнающих Flagэпитоп; в качестве контроля были использованы антитела, специфичные к митохондриальной РНК полимеразе (Рис.29).RNAP-IV HNAP-IV* N-Flag C-Flag 7 N-Flag C-FlagЩmtRNAP Ab Flag AbРис.29 Вестерн-анализ с использованием антител, специфичных для митохондриальной РНК полимеразы (mtRNAP Ab), и энти-Flag антител (Flag Ab). (К) - контроль, (N-Flag) - белок, полученный из клеток, экспрессирующих РНК полимеразу IV с N-концевым Flag, (С - Flag) - белок, полученный из клеток, экспрессирующих РНК полимеразу IV с С-концевым Fiag.

Таким образом, РНК полимераза IV, меченная у ATG номер 1 N-концевым Flag эпитопом, не детектируется антителами, специфичными к Flag эпитопу, в то время как узнается антителами к митохондриальной РНК полимеразе, в то же время обе формы белка, меченные на С-конце, узнаются Flag антителами в равной мере. Из этого следует, что трансляция белка РНК полимеразы IV, действительно, происходит не с первого ATG ко до на.

Анализируя последовательность кДПК РНК полимеразы IV человека, мыши и крысы было обнаружено, что консервативным для них оказывается 6-й ATG кодон и, возможно, именно с него начинается считывание белка в процессе трансляции. Более того, по теоретическим предсказаниям, белок, образующийся в результате этого, имеет размер ПОкД, что точно соответствует экспериментальным данным. Для проверки данного предположения мы получили лентивирусные конструкты, содержащие последовательностькДНК, которая начиналась с 6-го ATG ко до на. В качестве контроля была использована кДНК. начинающаяся с 9-го ATG кодона (поскольку, белки, образующиеся в результате трансляции с 7-го и 8-го ATG кодонов, должны лишь незначительно отличаться по размеру, что затрудняет сравнение их размеров). В клетках рО HeLa были экс премированы лентивирусные конструкты, содержащие кДНК РНК полимеразы IV, а также кДНК, начинающуюся с 6-го и 9-го ATG кодонов, содержащие Flag последовательность на С-конце. Тотальные белковые экстракты из этих клеток были подвергнуты Вестерн-анализу с анти-Flag антителами (Рис.30).

Суммируя полученные данные мы сделали вывод, что РНК полимераза IV образуется в результате альтернативного сплайсинга первичного транскрипта гена POLRMT, в процессе которого теряется сигнал транспорта в митохондрии, локализованный в первом экзоне, и белок приобретает способность к локализации в ядре. В качестве инициаторного кодона выступает 6-ой ATG ко дон, локализованный в третьем экзоне, который оказывается универсальным для человека, мыши и крысы, в результате трансляции с которого образуется белок, размером 110кД, что соответствует размеру РНК полимеразы IV.>CL (О О»< О ОZ f— J—ОС < <юкРис.30 Вестерн-анализ с использованием энти-Flag антител. (RNAP-IV) -белок, полученный из клеток, экспрессирующих кДНК РНК полимеразы IV, (ATG 6) -белок, полученный из клеток, экспрессирующих кДНК с 6-м стартовым ATG кодоном, (ATG 9) - белок, полученный из клеток, экспрессирующих кДНК с 9-м стартовым ATG кодоном.

3.13. Идентификация промоторов генов ALDH12, ZBTB и MGC3265.

Следующей целью нашей работы была идентификация промоторов генов, транскрибируемых РНК полимеразой IV. Для этого нами была опередлена предполагаемая промоторная область гена ALDH12 (см. Материалы и методы), отобранного после анализа микроарреев (Рис.9). Чтобы дискриминировать минимальный активный промотор была подобрана серия праймеров, на разные участки промоторной области (см. Материалы и методы). Методом ПЦР анализа на геномной ДНК, благодаря различным комбинациям специфических праймеров, было получено 13 различных вариантов ALDH12 промотора (Рис.31). Данные варианты промотора были заклонированы в вектор pGL3, содержащий репортер к люциферазе. Таким образом, было получено 13 конструктов, где ген люциферазы находился под разными вариантами ALDH12 промотора (см. Материалы и методы). После этого, с помощью прямой трансфекции были введены в HeLa(pO) клетки в качестве отрицательного контроля был использован пустой вектор, а в качетсве положительного - SV40 промотор в составе вектора pGL3. Активность исследуемых вариантов промотора была измерена через 48 часов с помощью люциферазной реакции (Рис. 31).

В результате данного эксперимента было показано, что промотор гена ALDH12 обладает достаточно высокой активностью, сравнимой с активностью раннего SV40 промотора. Также был дискриминирован и отобран минимальный промотор (Р5-1), сохраняющий достаточную активность, который был использован нами во всех последующих экспериментах.-400 -300 1 1 -200 -100 1 1 mRNA start dGL3 SV40 early P 1-2 P 2-2 P 7-2 PB-2 - 10000 20000 ЭОООО 10000 50000 soooo luciferase activityРис.31 Варианты промотора гена ALDH12 (слева), А также их активность, измеренная с помощью люциферазной реакции а клетках HeLa(pO), через 48 часов после введения контрольного вектора pGL3, вектора pGL3-SV40, а также конструктов, содержащих разные варианты промотора ALDH12 (Р1-1-Р9-1) (справа).

Аналогичный эксперимент по идентификации промотора (см. Материалы и методы) был поставлен с промоторами генов MGC3265 и ZBTB1 (результаты не представлены). Однако, активность промотора MGC3265, оказалась весьма низкой, практически сравнимой с кон тролем, в связи с этим работы по характеристике данного промотора были прекращены. Что касается промотора гена ZBTBI (см. Материалы и методы), то в результате исследования нами был отобран вариант промотора, демонстрирующий приемлемую активность, которая была в 2.5 раза ниже активности раннего SV40 промотора.

3.14. Характеристика промоторов генов ALDH12 и ZBTB1, демонстрирующих устойчивость к а -аманнтину и транскрибируемых РНК полимеразой IV.

После того, как были идентифицированы промоторные области генов ALDH12 и 7.ВТВ1, а также отобраны оптимальные по активности промоторы. Нашей следующей задачей стала их характеристика и определение их свойств. Данные промоторы были клонированы в вектор pGL3, содержащий репортер люциферазу, так, что ген люциферазы регулировался исследуемыми промоторами. Эти конструкции вводили прямой трансфекцией в клетки рО HeLa. В качестве отрицательного контроля был использован пустой вектор, а в качестве положительного — pGL3, содержащий контрольный промотор SV40. Активность исследуемых промоторов была измерена через 48 часов с помощью люциферазной реакции в контрольных клетках рО HeLa, а также в клетках, обработанных в течение 12 часов а -аманитином (10мкг/мл) (Рис.32).

70«О 60 X>1 50301 <0о «О2 20ёи 10■ control □ ААМСpGL3pGL3-SV40pGL3-ALDH12pG L3-ZBTB1Рис.32 Люциферазная активность, измеренная в контрольных клетках (control), а клетках, обработанных а -аманитином (ААМ) через 48 часов после введения в них пустого вектора pGL3 (pGL3), SV40 промотора (pGL3-SV40), промотора ALDH12 (pGL3-ALDH 12) и ZBTB1 промотора (pGL3-ZBTB1J,Было обнаружено значительное усиление активности ALDH12 и ZBTB1 промоторов в результате обработки а -аманитином, a SV40 промотор обнаруживал обратную регуляцию.

Чтобы проверить специфичность этой реакции, промоторы SV40 и ALDH12 в составе вектора pGL3 были введены в клетки рО HeLa, а также в клетки, экспрессирующие пустой вектор pLSLG или siPHK в составе этого вектора, специфичные как митохондриальной, так и IV РНК полимеразам. Их активность была измерена с помощью люциферазной реакции (Рис.33).controlpLSLGsi-mtRNAPРис.33 Люциферазная активность, измеренная в контрольных клетках (control), в клетках, экспрессирующих пустой вектор (pLSLG) или si-RNA, специфичный как митохондриальной, так и РНК полимеразе IV (si-mtRNAP). Активность была измерена через 48 часов после введения пустого вектора pGL3, содержащего люциферазный репортер (pGL3), SV40 промотор (pGL3-SV40) и промотор ALDH12 (pGL3-ALDH12).

Полученные данные, демонстрирующие существенное снижение уровня активности ALDH12 промотора в ответ на экспрессию si-PHK к митохондриальной и IV РНК полимеразам, свидетельствуют о специфичности наблюдаемого эффекта и о зависиомсти активности ALDH12 промотора от экспрессии РНК полимеразы IV.

3.15. Промоторы генов ALDH12, ZBTB1 и MGC3265, регулируемых РНК полимеразой TV, содержат общий структурно-функциональный мотив.

В сотрудничестве с Д-ром Е. Куниным (NCBI NIH, США) мы провели сравнительный компьютерный анализ последовательностей промоторов генов ALDH12, ZBTB1 и MGC3265 и выявили общий мотив, характерный для промоторов генов, регулируемых РНК полимеразой IV. Данный мотив был также обнаружен в составе промоторов других генов-кандидатов, транскрипция которых, возможно, осуществляется РНК полимеразой IV. При этом, данный мотив оказывается консервативным у всех видов млекопитающих и не обнаруживает гомологии с последовательностями, типичными для промоторов РНК полимеразы II, а также РНК полимераз I и III. Более того, он не обнаруживает сходства ни с одним из известных сайтов связывания транскрипционных фактров.

Далее, нами было показано, что обнаруженный участок последовательности является функциональным элементом промоторов РНК полимеразы IV. Для этого в вектор pGL3 были клонированы исходные промоторы генов ALDH12, ZBTB1 и MGC3265, а также промоторы тех же генов, не содержащие выявленного общего мотива PFE. Активность промоторов была измерена с помощью люциферазной реакции. Было показано существенное снижение активности промоторов, не содержащих общего мотива, по сравнению с активностью исходных промоторов (Рис. 34).■ complete promoter

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кравченко, Юлия Евгеньевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Идентификация РНК полимеразы IV, как второй полимеразы, способной транскрибировать белок-кодирующие гены открывает широкий спектр вопросов, требующих дальнейшего изучения. В настоящей работе на примере РНК полимеразы IV была продемонстрирована глубокая интеграция функций, берущих начало от прокариотического предшественника эндосимбионта митохондрии, что, очевидно, обеспечивает клетке лучшую способность к адаптации и ведет к расширению функциональных возможностей эукариотических организмов. Возможно, перемещение прокариотической РНК полимеразы в ядро создало предпосылки для горизонтального переноса бактериальных генов в эукариотический геном. Транслокация в ядро митохондриальных генов на ранних стадиях могла стать возможной благодаря способности их транскрипции присутствующей в ядре РНК полимеразой IV, узнающей прокариотические промоторы. Особенности активации РЖ полимеразы IV, имеющей митохондриальное родство может быть использовано на более поздних стадиях эволюционного развития некоторыми эукариотическими генами, не имеющими отношения к митохондрии или к прокариотам, многие из которых, безусловно, участвуют в фундаментальных процессах жизнедеятельности организма.

Информация о работе

Кравченко, Юлия Евгеньевна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Ядерная РНК полимераза - IV, альтернативная форма митохондриальной РНК полимеразы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы