Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование взаимодействия РНК- и ДНК-полимераз с матрицами и субстратами в водных и коллоидных растворах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Анарбаев, Рашид Октамович, Новосибирск

С '

Х-.У

ГУ

9/17 »-V и» <

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи

Анарбаев Рашид Октамович

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РНК- И ДНК-ПОЛИМЕРАЗ С МАТРИЦАМИ И СУБСТРАТАМИ В ВОДНЫХ И КОЛЛОИДНЫХ

РАСТВОРАХ

Специальность: 03.00.04 - биохимия Диссертация

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

д.х.н., профессор Лаврик О. И.

Новосибирск, 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ДНК-ПОЛИМЕР АЗА а-ДНК-ПРАЙМАЗА: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР).............................................................................................................................7

1.1 ДНК-ПОЛИМЕР АЗА а-ДНК-ПРАЙМАЗА IN VIVO................................'..........................................................7

1.2 Структура комплекса ДНК-полимер аза а-ДНК-праймаза...............................................................9

1.3 ДНК-праймаза..........................................................................................................................................10

1.4 ДНК-полимераза а..................................................................................................................................14

1.5 Точность ДНК-праймазы и ДНК-полимеразы а................................................................................17

ГЛАВА 2. Т7 РНК-ПОЛИМЕРАЗА (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)...........................................................20

2.1 Молекулярные свойства Т7 РНК-полимеразы..................................................................................21

2.2 Структурно-функциональные свойства т7 РНК-полимеразы.......................................................21

2.3 Кристаллическая структура Т7 РНК полимеразы............................................................................22

2.4 Взаимодействие с промотором и стадия инициации.....................................................................23

2.5 Биохимические свойства процесса элонгации транскрипта.......................................................26

2.6 Блокирование удлинения транскрипта..............................................................................................27

2.7 Необычные транскрипционные свойства т7 РНК-полимеразы.....................................................28

2.8 Модели структуры третичного комплекса и процесса элонгации транскрипта.......................29

2.9 Транскрипция РНК-матриц............................................................................................*.......................31

2.10 "Беспромоторный" синтез РНК...........................................................................................................32

2.11 Мутантные формы Т7 РНК-полимеразы...........................................................................................33

ГЛАВА 3. МИЦЕЛЛЯРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР).....................................35

3.1 Структура обращенных мицелл............................................................................................................37

3.2 Свойства воды в обращенных мицеллах...........................................................................................39

3.3 Межмицеллярный обмен.......................................................................................................................40

3.4 реакционная способность реагентов в обращенных мицеллах...................................................40

3.5 Четыре важных для энзимологии свойства систем вода-ПАВ-органический растворитель. 41

3.6 солюбилизация и свойства белков в обращенных мицеллах.......................................................42

3.7 влияние воды и растворителя на ферментативный катализ в обращенных мицеллах............43

3.8 вода, конформа1 (ионная ПОДВИЖНСЧЛЪ ферментов. И КАТАЛИЗ.......................................................45

3.9 взаимодействия и диссоциация белков в обращенных мицеллах..............................................48

3.10 Свойства нуклеиновых кислот в обращенных мицеллах............................................................50

3.11 Биологические структуры в обращенных мицеллах.....................................................................50

3.12 Ферменты в жидкокристаллических мезофазах............................................................................51

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................................................52

4.1 ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДНК-ПРАЙМАЗЫ С МАТРИЦАМИ РАЗЛИЧНОЙ ДЛИНЫ И СТРУКТУРЫ................................................................................................................................54

4.2 ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ Т7 РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ С NTP И ИХ ПРОИЗВОДНЫМИ.........................................................................................................................................57

4.3 ФРАГМЕНТ КЛЕНОВА И КОМПЛЕКС ДНК-ПОЛИМЕРАЗА а-ПРАЙМАЗА В ОБРАЩЕННЫХ

МИКРОЭМУЛЬСИЯХ РАЗЛИЧНОГО СОСТАВА.....................................................................................59

4.4 ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПТАЗА ВИЧ-1, ФРАГМЕНТ КЛЕНОВА, Т7 РНК-ПОЛИМЕРАЗА И ТТЕ

ДНК-ПОЛИМЕРАЗА В ОБРАЩЕННЫХ МИКРОЭМУЛЬСИЯХ.............................................................60

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДИК-ПРАЙМАЗЫ С МАТРИЦАМИ РАЗЛИЧНОЙ ДЛИНЫ И СТРУКТУРЫ (РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ).................................... 63

5.1 роль длины матрицы...............................................................................................................................63

5.2 Роль СТРУКТУРЫ МАТРИЦЫ........................................................................................................................68

5.3 СИНТЕЗ ПРАЙМЕРОВ НА МАТРИЦАХ POLY(DT) И POLY(DC, DT)................................................................72

5.4 кинетика синтеза РНК на матрице POLY(DT).....................................................................................72

5.5 механистическая концепция синтеза PHK-праймера....................................................................72

ГЛАВА 6. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ Т7 РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ С NIT И ИХ ПРОИЗВОДНЫМИ (РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ).........................................................................78

6.1 квазистационарный подход к описанию синтеза РНК Т7 РНК-полимеразой..........................79

6.2 взаимодействие Т7 РНК-полимеразы с NTP.....................................................................................81

6.3 взаимодействие Т7 РНК-полимеразы с DNTP...................................................................................82

6.4 взаимодействие Т7 РНК-полимеразы с аналогами СТР................................................................83

ГЛАВА 7. ФРАГМЕНТ КЛЕНОВА И КОМПЛЕКС ДНК-ПОЛИМЕРАЗА а-ПРАЙМАЗА В ОБРАЩЕННЫХ МИКРОЭМУЛЬСИЯХ (РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ)___________________________________89

7.1 активность ДНК-полимер азы в АОТ, СТАВ, SDS и bru 58 обращенных микроэмульсиях.....90

7.2 зависимость активности ДНК-полимеразы от состава микроэмульсий............у.....................90

7.3 ЗАВИСИМОСТЬ АКТИВНОСТИ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ MGAC2, ТРИС-АС И РН...............93

7.4 Зависимость активности ДНК-полймеразы и совместной активности ДНК-полимеразы а-

праймазы от wc..............................................................................................................................................98

7.5 процессивность ДНК-полимеразы в обращенных микроэмульсиях...........................................98

7.6 процессивность ДНК-полимеразы при высоких концентрациях воды.....................................101

7.7 ОСОБЕННОСТИ СОСТАВА ОБРАЩЕННЫХ МИКРОЭМУЛЬСИЙ.....................................................................101

ГЛАВА 8. ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПТАЗА ВИЧ-1, ФРАГМЕНТ КЛЕНОВА, Т7 РНК-ПОЛИМЕРАЗА И ТТЕ ДНК-ПОЛИМЕРАЗА В ОБРАЩЕННЫХ МИКРОЭМУЛЬСИЯХ (РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ)............................................................................................................103

8.1 повышение ферментативной активности с помощью щелочных агентов..............................104

8.2 фрагмент кленова в обращенных микроэмульсиях...................................................................... 107

8.3 тте днк-полимераза В обращенных микроэмульсиях..................................................................110

8.4 обратная транскриптаза ВИЧ-1 в обращенных микроэмульсиях..............................................112

8.5 Т7 РНК-полимераза в обращенных микроэмульсиях.................................................................... 115

ВЫВОДЫ..........................................................................................................................................................117

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................................................118

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Акт. ДНК - активированная ДНК;

ДТТ - дитиотреитол;

Ед. акт. - единица активности фермента;

ГТААГ - полиакриламидный гель:

ПАВ - поверхностно-активное вещество;

ПСА - персульфат аммония;

ТЕМЕД - Щ^Д^К'-тетраметилэтилендиамин;

ТХУ - трихлоруксусная кислота;

Уд. акт. - удельная активность;

ЭФ - электрофорез;

АОТ - натриевая соль ди-2-этилгексилового эфира оульфоянтарной кислоты;

В г у 30 - лаурилполи(4)-этиленгликоль;

Вгу 58 - цетилполи(20)-этиленгликоль;

ерш - количество импульсов в минуту;

СТАВ - цетилтриметиламмоний бромид;

БББ - додецилсульфат натрия;

w0 - степень гидратации ПАВ, = [Н20]/[ПАВ].

ВВЕДЕНИЕ

В основе процессов репликации, транскрипции и репарации лежит матричный биокатализ. Сущность матричного биосинтеза заключается в последовательной полимеризации нуклеозидмонофосфатов в РНК- или ДНК-продукт на основе их комплементарности к основаниям матрицы ДНК или РНК. Механизм »взаимодействия ДНК- и РНК-полимераз с матрицами, праймерами и нуклеозидтрифосфатами является ключевой проблемой матричного биокатализа. С другой стороны, сам биокатализ протекает не в разбавленных растворах, а в сложноорганизованных клеточных структурах, которые накладывают ограничения на протекание ферментативного процесса, и на базе этого возникает большое разнообразие используемых клетками механизмов регуляции матричных процессов. Попытки установить механизмы действия ДНК- и РНК-полимераз на молекулярном уровне в живых клетках сталкиваются с серьезными трудностями, связанными со сложной организацией клеточных структур, и это составляет вторую фундаментальную проблему.

Третья фундаментальная проблема связана с эволюцией живых организмов и изменением условий существования жизни, в том числе вызванных техногенной деятельностью человека. В этом случае возникают вопросы о том, как возникла жизнь, как она развивается и как будет развиваться в будущем. Здесь определяющую роль играет среда обитания, и, чтобы ответить на этот вопросы, требуется знание принципов взаимодействия живых систем с окружающей средой на молекулярном уровне, а также предпосылок и условий протекания биологического катализа. Последнее обстоятельство тесно связано с фундаментальной ролью воды в структурной организации ферментов и в ферментативном катализе.

В рамках этих фундаментальных и сложных для решения проблем и были сформулированы цель и конкретные задачи данного исследования. Цель работы -изучить механизмы взаимодействия РНК- и ДНК-полимераз с матрицами и субстратами в водных и коллоидных растворах типа "вода в масле". На первый взгляд может показаться неприемлемым использовать обращенные микроэмульсии как модели биологических систем. Но хотелось бы подчеркнуть не адекватность микроэмульсий, а скорее их полезность: что это дает в смысле биологического катализа и белково-нуклеинового взаимодействия. Сравнение поведения матричных ферментов в микроэмульсиях позволит выделить те свойства белков и нуклеиновых кислот, которые могут быть важными для ферментативного катализа.

Конкретные задачи данного исследования сводятся к следующему:

1. Исследовать взаимодействие ДНК-праймазы с матрицами различной длины и структуры, определить: а) роль длины и структуры матрицы; б) особенности синтеза РНК-праймеров на гетероматрицах; в) кинетику синтеза РНК на матрице ро1у(ёТ). На основе этих данных выработать общую концепцию синтеза РНК-праймеров ДНК-праймазой.

2. Исследовать взаимодействие Т7 РНК-полимеразы с ЖР и арилазидопроизводными СТР, вывести уравнение квазистационарной скорости синтеза РНК Т7 РНК-полимеразой и определить кинетические параметры взаимодействия РНК-полимеразы с ЫТР, сЮТР и аналогами СТР на одно- и двухцепочечных матрицах.

3. Исследовать активность фрагмент Кленова и комплекса ДНК-полимераза а-праймаза в обращенных микроэмульсиях различного состава, определить: а) зависимость активности ДНК-полимераз от состава микроэмульсий, концентрации ионов М£2+, ионной силы и рН, б) зависимость активности и процессивности ДНК-полимераз от концентрации воды.

4. Провести сравнительное исследование активности и процессивности обратной транскриптазы ВИЧ-1, фрагмента Кленова, Т7 РНК-полимеразы и 1Че ДНК-полимеразы в зависимости от структуры матрицы и концентрации воды в обращенных микроэмульсиях.

Остальные задачи и связанные с ними проблемы рассмотрены в соответствующих главах. Сама рукопись включает в себя три главы обзора литературы, где рассматриваются современные достижения в исследовании комплекса ДНК-полимераза а-праймаза, Т7 РНК-полимеразы, а также описываются основные подходы и результаты исследования ферментов в области мицеллярной энзимологии; главу "Материалы и Методы"; четыре главы посвященны результатам и их обсуждению, которые построенны на основе сформулированных выше задач и включают в себя три аспекта матричного биокатализа: узнавание матрицы ДНК-праймазой, отбор субстрата Т7 РНК-полимеразой, влияние микроокружения (особенно воды) на активность и процессивность РНК- и ДНК-полимераз; "Выводы" и "Список Литературы".

Глава 1. ДНК-ПОЛИМЕРАЗА а-ДНК-ПРАЙМАЗА: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ (Литературный обзор)

В настоящее время мы располагаем обширной информацией о молекулярных механизмах репликации ДНК, полученной в основном при изучении вирусов и бактерий. В последние годы, в связи с накоплением фактов в области энзимологии и особенностей работы репликативной вилки, увеличился интерес к репликации генома эукариот. Особый интерес представляют такие вопросы: как ДНК-праймаза и ДНК-полимераза а узнают матрицу; как инициируются новые цепи ДНК; как происходит синтез РНК ДНК-праймазой; что влияет на процессивность и точность синтеза ДНК обоими ферментами. Именно эти проблемы и рассмотрены в данном обзоре.

1.1 ДНК-полимераза а-ДНК-праймаза in vivo

В клетках эукариот синтез ДНК происходит в основном в плотных специфических структурах ("репликативных фабриках"), присоединенных к диффузному ядерному матриксу [1-3]. Предполагается, что в молекулярной организации ядерного матрикса играют некоторую роль фосфолипиды, и что ДНК связана с ядерным скелетом гидрофобными взаимодействиями [4]. "Репликативные фабрики", связанные с ядерным матриксом, включают в себя комплекс ферментов, охарактеризованный благодаря очистке ДНК-полимеразы а-праймазы. Обнаружен мультибелковый 21S комплекс [5], состоящий, как это показал анализ в денатурирующем ПААГ, не менее чем из 30 белков с молекулярными массами от 15 до 300 кДа и содержащий помимо ДНК-полимеразы а-праймазы [5-12] еще и 3-5' экзонуклеазу [10], ДНК-лигазу I, РНКазу Н, ДНК-топоизомеразу I [11], ДНК-геликазу [13], PCNA [3] и ряд других факторов. Среди них можно отметить репликативный белок A (RPA), необходимый для репликации ДНК SV40 in vitro и специфически взаимодействующий с субъединицей р48 комплекса полимераза-праймаза. RPA из тимуса теленка состоит из субъединиц 70 кДа, 53 кДа, 32 кДа и 14 кДа [14]. RPA повышает активность гомологичной ДНК-полимеразы а в 20 раз [9, 6].

Мультибелковая форма ДНК-полимеразы а содержит также белок, который связывает динуклеотиддиаденозинтетрафосфат (Ар4А) [15]. Предполагается, что Ар4А участвует в репликации ДНК и клеточном делении. Имеются данные о способности ДНК-полимеразы а использовать Ар4А в качестве праймера. При этом участие Ар4А в качестве праймера in vivo маловероятно, скорее он используется как эффектор. В этой

связи отметим также, что с ДНК-полимеразой а соочищается триптофанил-тРНК-синтетаза, которая может синтезировать этот динуклеотид [16, 17].

Известно, что прохождение клеточного цикла регулируется активацией комплексов циклинов и циклин-зависимых протеинкиназ в определенный момент времени. Показано, что Са2+ и кальмодулин регулируют экспрессию генов cdk2, cdc2, циклина В и PCNA в Т-лимфоцитах человека [18] и что в 21S репликативном - комплексе кальмодулин с молекулярной массой 68 кДа из клеток HeLa прочно связан с ДНК-полимеразой а-праймазой [19, 20]. Исследовано влияние фосфорилирования белков р180 и р68 циклин А-, В- и E-зависимыми киназами на репликацию ДНК. Это фосфорилирование влияет на сайт-специфическую инициацию репликации на ДНК SV40, но не на ДНК-полимеразную активность на активированной ДНК [21].

В клетках дрожжей ДНК-полимераза а, праймаза, 5',3'-экзонуклеазы, ДНК-

зависимая АТРаза и другие белки (от 30 до 180 кДа) образуют комплекс с общей мол.

массой 650 кДа [22]. ДНК-полимераза а обладает сродством к протеинкиназе (56-кДа)

[23] и к ДНК-геликазе из дрожжей Saccharomyces cerevisiae [24]. Показано также, что

для начала синтеза ДНК в участке начала репликации (orí) SV40 праймазно-

полимеразный комплекс человека должен включать Т-антиген и белок RPA [25]. В

t

состав такого комплекса из тимуса теленка входит, по-видимому, белок В23.1 (основной ассоциированный с РНК ядерный белок и возможный фактор ассоциации рибосом) [26]. Он увеличивает активность ДНК-полимеразы а в 3-4 раза, но при этом совершенно не стимулирует ДНК-полимеразы р и у и прайм азу. Активность ДНК-полимеразы а увеличивается в 6-60 раз в присутствии поли-(АОР-рибоза)полимеразы, которая, как это было показано иммунопреципитацией, ассоциирована с ДНК-полимеразой а в грубом экстракте клеток тимуса теленка [27]. Однако в низких концентрациях, эта же (АБР-рибоза)полимераза подавляет синтез ДНК ДНК-полимеразой а [28]. Наиболее полный репликативный комплекс описан в работе [29]. Авторы выделили, идентифицировали и изучили белки из клеток человека, необходимые для полной репликации ДНК вируса SV40. Реконструированный из индивидуальных репликативных белков этот комплекс включал в себя следующие факторы: Т-антиген SV40, репликативный белок A (RPA), ДНК-топоизомеразы I и II, ДНК-полимеразу а-праймазу, репликативный фактор С (RFC), PCNA, ДНК-полимераз