Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение разнообразия и эволюции генов TAS3, кодирующих предшественники ta-siРНК у нецветковых наземных растений и особенности их экспрессии у некоторых покрытосеменных

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение разнообразия и эволюции генов TAS3, кодирующих предшественники ta-siРНК у нецветковых наземных растений и особенности их экспрессии у некоторых покрытосеменных"

На правах рукописи

005533745

Красникова Мария Сергеевна

ИЗУЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ И ЭВОЛЮЦИИ ГЕНОВ ТАБЗ, КОДИРУЮЩИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКИ 1а^РНК У НЕЦВЕТКОВЫХ НАЗЕМНЫХ РАСТЕНИЙ И ОСОБЕННОСТИ ИХ ЭКСПРЕССИИ У НЕКОТОРЫХ ПОКРЫТОСЕМЕННЫХ

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 СЕН 2013

Москва 2013

005533745

Работа выполнена в отделе эволюционной биохимии НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич

Официальные оппопепты:

Чуриков Николай Андреевич, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгсльгардга Российской академии наук, заведующий лабораторией организации генома.

Горюнова Светлана Валерьевна, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова Российской академии наук, научный сотрудник лаборатории генетики растений.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха Российской академии наук.

п , Защита диссертации состоится 18 октября 2013 года в Д часов на заседании /*ч " Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном ■ государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального / образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

по адресу: 119234, Москва, Ленинские Горы, д. 1, стр. 12, МГУ, биологический факультет, ауд.ЗлУ.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека. Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан /¿сентября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук _Крашенинников И.А.

'О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Малые некодирующие РНК эукариот участвуют во многих биологических процессах. У растений они играют важнейшую регуляторную роль в процессе роста и дифференцирования тканей, в формировании гетерохроматина, деградации мРНК, подавлении экспрессии генов, а также в ответе на разнообразные типы стрессов. Эта роль осуществляется комплементарным связыванием малых некодирующих РНК со специфическими мРНК-мишенями, ведущим к посттранскрипционному РНК-сайленсингу соответствующих генов (Baulcombe, 2004; Carrington, 2005; Voinnet, 2005; Vaucheret, 2006; Bonnet et al., 2006; Chu and Rana, 2007).

МикроРНК (miPHK) представляют собой класс малых некодирующих РНК (из 21-22 нуклеотидных остатков), транскрибируемых у всех многоклеточных организмов и некоторых вирусов (Вartel, 2004; Laporte et al., 2007; Liu et al., 2008). Некоторые микроРНК руководят расщеплением некодирующих первичных транскригггов TAS генов направляя формирование транс-действующих siPHK (ta-siPHK). Получающиеся 21-нуклеотидные ta-siPHK далее работают в качестве компонентов комплекса RISC для направления AGO зависимого расщепления собственной мишени. Особенность их действия связана с тем, что они функционально инактивируют in trans не те гены, которыми кодируются (TAS гены), а иные гены, в основном кодирующие регуляторные белки.

Для высших растений характерны ta-siPHK, кодируемые генами TAS la, TAS lb, TASlc, TAS2, TAS3 и TAS4. Большинство предшественников TAS РНК имеют только один целевой мотив микроРНК. Однако для расщепления предшественника TAS3 РНК, необходимо две miR390 мишени (на 5' и 3' концах фрагмента). Образование таких ta-siPHK зависит от специфичного взаимодействия между AG07 и miR390. Впоследствии они контролируют активность генов ауксин-регулируемых транскрипционных факторов ARF3 и ARF4, направляя специфическую деградацию их мРНК, поэтому их назвали ta-siARF РНК (Allen et al., 2005; Carraro et al., 2006; Nogueira et а., 2007).

Важнейшее значение TAS3 генов в регуляции развития растения, их широкая распространенность даже у примитивных наземных растений и слабая изученность эволюции и разнообразия miR390-3aBHCHMbix TAS генов требуют новых подходов и специальных исследований в этом направлении (Allen et al., 2005; Nogueira et а., 2007).

Цель исследования:

Изучение разнообразия и биоинформатический анализ нуклеотидных последовательностей генов транс-действующих малых интерферирующих РНК, процессинг

предшественников которых направляется микроРНК miR390, для различных, таксономически удаленных, видов наземных растений.

Задачи исследования:

1) Изучение разнообразия и дифференциальной экспрессии генов TAS3 у некоторых

двудольных растений семейства Solanaceae;

2) Изучение разнообразия и дифференциальной экспрессии генов TAS3 у некоторых

двудольных растений трибы Senecioninae (семейство Asteraceae);

3) Изучение разнообразия генов miR390 у некоторых мхов и печеночников;

4) Изучение разнообразия генов TAS3 у мхов;

Научная новизна

Для изучения TAS-генов, зависимых от miR390, исследовано их разнообразие у растений порядков Solanales, Asterales и Alismatales. Использование нового подхода, основанного на ПЦР, позволило выявить новые типы TAS3 генов. Эти гены характеризуются гораздо меньшей дистанцией между участками, комплеметарными miR390, и не обнаруживаются у Arabidopsis thaliana. Более того, эти "короткие" гены дают начало только одной копии ta-siARF РНК. Заметим, что анализ баз данных последовательностей геномов растений позволил выявить такие TAS3 гены у других покрытосеменных, а также голосеменных растений. Кроме того, получены данные об особенностях экспрессии нового типа TAS3 генов.

В работе приведены данные детального анализа разнообразия ТАБЗ-подобных генов у мхов и родственных им древнейших наземных растений. Ранее мировой науке были известны данные лишь по одному виду мхов - Physcomitrella patens. В процессе данной работы были клонированы более 40 генов, кодирующих ta-siARF РНК, используя ДНК различных таксономически удаленных видов мхов. ДНК была изолирована из целого ряда представителей классов Andreaeopsida, Polytrichopsida, Tetraphidopsida, Bryopsida (подклассы Timmiidae, Bryidae и Dicranidae) и класса Sphagnopsida. Анализ данных о структуре TAS3 генов у других представителей наземных растений, включая печеночники, хвощи и папортники, позволил автору выдвинуть гипотезу, согласно которой эти гены эволюционировали с изменением специфичности и структуры кодируемых ими ta-siPHK.

Некоторые функции TAS3 генов являются тесно связанными с онтогенезом растений и их устойчивостью к абиотическим стрессам. В этой связи часть работы посвящена изучению селективности регуляции экспрессии TAS3 генов, содержащих тандемно-дуплицированный район ta-siARF РНК, с одной стороны, и мономерный район ta-siARF, с

другой. Впервые у цветковых растений выявлено существование механизмов селективной регуляции экспрессии TAS3 генов.

Практическая значимость работы

Результаты нашего исследования расширяют представления о регуляторных механизмах функционирования защитного ответа растений на повреждающие стрессовые воздействия. Согласно литературным данным, на модели растений показана возможность получения трансгенов, имеющих признаки устойчивости к тяжелым металлам и вирусной инфекции. Эта толерантность была основана на стабильной экспрессии в растениях генов TAS. Потенциально, экспрессия в модельных трансгенных растениях наших конструкций генов TAS, введенных с помощью бинарного вектора дает возможность получения растений, несущих ценные признаки. Все полученные материалы могут быть включены в курс лекций для студентов биологических ВУЗов.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на 3 научных конференциях: Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» (Россия, Москва, 2010); Всероссийская бриологическая конференция с международным участием, посвященная 100-летию со дня рождения Романа Николаевича Шлякова (Кировск, 2012); International Conference «Molecular Mapping and Marker assisted Selection» (Vienna, Austria, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 статей в научных журналах, из которых 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, а также 3 статьи в материалах и тезисах научных конференций.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста и состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение» «Выводы» «Список литературы» и «Приложения». Материал проиллюстрирован 29 рисунками и 5 таблицами. Список цитируемой литературы включает в себя 124 наименования, из которых 121 на английском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Разнообразие генов TAS 3 и их дифференциальная экспрессия у некоторых растений рода Nicociana

Для идентификации растительных пи!1390-фланкированных предшественников ta-siPHK мы проанализировали последовательности аналогичные TAS3 генам Arabidopsis thaliana, кодируемые геномами различных наземных растений. Мы синтезировали олигодезоксирибонуклеотидные затравки, имитирующие в своей специфике miR.390, расположение на 5'- и 3'- концах TAS3 генов. С этими затравками был проведен ряд ПЦР на хромосомной ДНК представителей рода Nicotiana. ПЦР-анапиз был выполнен с двумя парами праймеров, соответствующими 5' и 3' сайтам miR390. В качестве контроля, были поставлены ПЦР на хромосомной ДНК A. thaliana с обеими парами праймеров, в результате которых был получен четкий ПЦР-фрагмент с ожидаемым размером в 260 нуклеотидных пар (рис. 1 А 3-4). Тем не менее, у Nicotiana tabacum и других видов табака мы обнаружили два фрагмента: мажорную полосу длиной около 280 н.п. и минорную - околоШ н.п. (рис. 1 А 1-2)

А В

1 2 3 4 М 1 2 З М

Рис. 1. Анализ продуктов ПЦР с праймерами, имитирующими miR390.

А. Результаты ПЦР на геномных ДНК: В. Результаты ПЦР на геномной ДНК и кДНК:

1 N. tabacum с пр. P-Tas3 и M-Tas3/caa, 1 ДНК N. tabacum с пр. P-Tas3 and M-Tas3/caa,

2 N. tabacum с пр. P-Tas3 и M-Tas3/aca, 2 кДНК N. tabacum с пр. P-Tas3 and M-Tas3/caa,

3 A. thaliana с пр. P-Tas3 и M-Tas3/caa, 3 кДНК N. tabacum с пр. P-Tas3 and M-Tas3/aca.

4 A. thaliana с пр. P-Tas3 и M-Tas3/aca.

Стрелка указывает на 170-н. ПЦР-продукт.

Яркая мажорная полоса, полученная в результате ПЦР на хромосомной ДНК N. benthamiana (FJ804742 номер GenBank) и N. tabacum cv. Samsun (FJ804751 номер GenBank), немного различалась по длине (250 н.п. и 280 н.п. соответственно). Клонирование и секвенирование этих фрагментов показали, что амплифицированные последовательности содержат ta-siARF сайт, расположенный между сайтами miR390 и состоящий из двух тандемных копий ARF-специфичных ta-siPHK. Кроме того, полученные последовательности показали очевидное сходство с ТАЗЗ-подобными генами других двудольных растений из GenBank: Arabidopsis thaliana (ВХ838290), Glycine max (BE330988), Manihot esculenta

(СК652751), Malus domestica (CN490861), Vitis vinifera (DT025007), Populus trichocarpa (DT498974), Lycopersicon esculentum (DV105041) (рис. 2). Blast-анализ выявил среди депонированных в GenBank геномов других представителей пасленовых фрагменты, близкородственные последовательностям предполагаемых TAS3 генов N. benthamiana и N. tabacum. Так, ТА53-подобные последовательности N. tabacum cv. Samsun показали почти 100% идентичности геномным последовательностям N. tabacum cv. Hicks Broadleaf, полученным в рамках Tobacco Genome Initiative (GenBank FH434354) и 78% идентичности последовательности клона хромосомы 11 ВАС Solanum lycopersicum cv. Heinz 1706 (GenBank DU917444).

ArabxJoosis linaria Glycin» max Manihot esoi lenta Malus aomastíca Vtís vinifera Populas trichocarpa Lycoporakwn esculcnturn

Ncotis^a tabaojm

Aratadopsá Ihafiana Glycine trun Manihot eecutonto Malus domastio Vítie wwfcra Populus ttichocarpa Lycoporeiccn escutenlum

TACAGXTTCTAtTC'fATC7CTttCICi4XTATAí3AATAGA"ATCTATCTC?ACO i

0<-^UUX-CTtílATC^:4-ATC«.ACT3A,fATAGA£iTrT<;*.-rO-iCC ' Ti '( ЙГГАССАШСА« AT Ai. САТАААГТСТАТАТСААААТТГГГГСЛТАТАСААТ^^ CCCyU^tSti^tCGGAAraAACttÄfA^

Сатсааст с ta^ea с CA ос ас с састоасатаслос ГС О ОС С лтс о гс т тсссестагсск

CA^=AACT5TACArCAAAAT<iTCTT3ATGTAÜASTrt TGACIААТ гтаТССССйП ....... ...................

ttetcrxTctcfCirsxßCK

rOrTTCCGlCCAACTCAXCrrCtCCrrCt IT GTCTA'

Рис. 2. Выравнивание нуклеотидных последовательностей "длинных" 1а-з1АКР локусов двудольных растений. Последовательности ШсоНапа 1аЬасит и ШсоПапа ЬеШИат1апа (подчеркнуты) были получены нами в процессе данного исследования, остальные взяты из бепВапк. Прямоугольники очерчивают сайты Ш1Я390 и

ДНК N. tabacum стабильно производит второй минорный ПЦР-продукт - около 170 нуклеотидов в длину (рис. 1 А, дорожка 1 и 2). Последовательность этих фрагментов и дальнейший анализ баз данных показал, что такие фрагменты представляют собой новый, не описанный ранее тип гшЯ390-опосредованных TAS генов, производящих потенциальных предшественников ta-siARF РНК у различных двудольных растений. В структуре этих «коротких» последовательностей был обнаружен предполагаемый ta-siARF сайт, состоящий из одной копии ARF-специфичной ta-siPHK (рис. 3). Кроме выявленных нами экспериментальным путем «коротких» последовательностей у N. tabacum (номер GenBank FJ804743), Datura stramonium (FJ804744), Solanum demissum (FJ804745) Physalis longifolia (FJ804746), в GenBank были обнаружены сходные с этими «короткими» генами последовательности других растений. В частности, 96% сходства с последовательностью N. tabacum cv. Samsun показали фрагменты N. tabacum cv. Hicks Broadleaf (GSS) полученные в рамках Tobacco Genome Initiative (GenBank номера FH734100, FH203124 и FH011695), 91%

сходства - EST последовательность N. tabacum cv. SNN (AM791738), 79% сходства -последовательность Solanum tuberosum EST (FG548921), 78% сходства - фрагмент последовательности клона хромосомы 12 S. lycopersicum LE_HBa-26C13 (АС209585) и S. lycopersicum EST последовательность (BE459870). Несколько меньшее сходство (73-74%) было выявлено с последовательностями EST S. phureja (F0647537) и S. tuberosum (BQ514736 и BI431636). Дня исследования возможности возникновения новой мономерной последовательности ta-siARF-предшественника в эволюции растений раньше, чем появление семейства пасленовых, мы изучили EST базу данных NCBI. Так, были выявлены сходные последовательности Vitis vinifera (CU775162), Beta vulgaris (CV301446), Manihot esculenta (DV447689), Gossypium hirsutum (DW502659), Helianthus exilis 1 (EE630512), Helianthus exilis 2 (EE657417), Cyamopsis tetragonoloba (EG977206), Vigna unguiculata (FG922881), Cynara scolymus (GE588140), Cichorium endivia (EL348656), Citrus aurantium (EY848024), Citrus sinensis (CK935773) и Populus trémula (DN500355) (рис. 3).

Анализ последовательностей показал, что за исключением длины, 170-нуклеотидные предшественники ta-siARF РНК отличаются от хорошо изученных 280-нуклеотидных генов структурой ta-siARF-кодирующей области. В то время как «длинные» предшественники содержат две тандемные копии ta-siARF, располагающиеся в консервативном 42-нуклеотидном сайте, у «коротких» предшественников есть только один мономерный 21-

нуклеотидный ta-siARF (рис. 2 и 3).

Рис. 3. Выравнивание нуклеотидных последовательностей "коротких" ta-siARF локусов двудольных растений. Последовательности Nicotiana tabacum, Datura stramonium, Solanum demissum и Physalis longifolia (подчеркнуты) были получены нами в процессе данного исследования, остальные взяты из GenBank. Прямоугольники очерчивают сайты miR390 и ta-siARF.

C'!!j5 ehwliSia ----------------------

»«moss -------------------------

Другой характерной особенностью всех выявленных «коротких» последовательностей ta-siARF-предшественника является то, что область между 5' сайтом miR390 и ta-siARF сайтом консервативна по длине, в то время, как область между сайтом ta-siARF и 3' сайтом miR390 по длине варьирует (рис. 3). Такая структура новых 170-нуклеотидных TAS3 локусов кардинально отличается от хорошо изученных 280-нуклеотидных TAS3 фрагментов, где наблюдается обратное - последовательность и расстояние консервативны в области между тандемом ta-siARF-последовательностей и 3' сайтом miR390, а между 5'miR390 сайтом и ta-siARF-вариабельны (рис. 2).

Для анализа особенностей экспрессии новых "коротких" TAS3 генов табака была выделена суммарная РНК из листьев растений на стадии 8 листьев. Эту РНК использовали в качестве матрицы для обратной транскрипции с олиго((Л>затравкой. Полученная таким образом смесь кДНК поли(А+) РНК послужила матрицей для ПЦР в присутствие miR390-специфичных праймеров. Этот анализ позволил выявить амплификацию только «длинных», классических TAS3 генов (Рис. 1В).

Биоинформатический анализ EST библиотек в Генбанке позволил обнаружить транскрипты, аналогичные нашим «коротким» TAS3 генам у табака (АМ791738). Однако эти клоны были получены на основе пятидневных проростков, а не более взрослых растений, где амплифицировались только «длинные» предшественники TAS3 РНК. Таким образом, можно говорить, что разные типы TAS3 генов обладают определенной специфичностью транскрипции, зависимой от стадий онтогенеза и, возможно, от специфики исследованной ткани растения.

В последние годы большое распространение получил метод массового параллельного секвенирования. С помощью этого метода было изучено разнообразие и тканеспецифичность экспрессии микроРНК и других малых интерферирующих РНК у многих растений. В частности, было показано, что ta-siPHK длиной 21 и 22 нуклеотида (и, соответственно, предшественники TAS3 РНК) у сливы (Prunus pérsica) экспрессируются, в основном, в цветках растений (Zhu et al., 2012). Мы решили использовать данные библиотек коротких РНК на публично доступном сервере SoMART (http://somart.ist.berkelev.edu). где собраны данные по ряду растений семейства Solanaceae, для сравнительного биоинформатического анализа экспрессии «коротких» и «длинных» TAS3 генов табака. Оказалось, что по количеству индивидуальных видов siPHK длиной 21-22 нт, происходящих из «длинных» TAS3 генов, цветки табака превосходят листовую ткань почти в 2 раза (цветок - 125 последовательностей, лист - 69). Однако, у «коротких» TAS3 генов эта разница доходит почти до 9 раз (цветок - 130, лист - 15). Более того, аналогичный анализ, проведенный для «короткого» TAS3 гена Solanum demissum, секвенированного нами, показал, что в случае

картофеля эта разница составляет более чем порядок (цветок - 67, лист - 5) (Подробные таблицы представлены в диссертации).

Таким образом, биоинформатический анализ подтвердил разную тканеспецифичность транскрипции «коротких» и «длинных» TAS3 генов табака.

Разнообразие генов TAS3 и их дифференциальная экспрессия у некоторых растений в подтрибе Senecioninae.

По форме, у покрытосеменных растений можно выделить бифациальные и унифациальные листья. Бифациальные листья, такие как, например, у арабидопсиса, являются более типичной формой, они отличаются наличием адаксиально-абаксиальной (верх-низ) полярности. Установление такой полярности бифациальных листьев регулируется перекрывающимися и антагонистическими генетическими взаимодействиями с участием нескольких различных транскрипционных факторов и регуляторных малых РНК (Husbands et al., 2007). Унифациальные листья, которые характеризуются абаксиальной листовой пластинкой, неоднократно выявлялись у различных видов однодольных растений (Yamaguchi et al., 2010). Транскрипционные факторы ARF3 и ARF4 необходимы для спецификации абаксиальности листа (Husbands et al., 2007).

Здесь рассматривается наличие генов ta-siARF РНК у представителей подтрибы Senecioninae. Эта группа выбрана, поскольку одни ее представители имеют унифациальные листья, а другие - четко выраженные бифациальные. Было установлено, что оба типа кодируются предшественниками РНК, принципиально схожими с их аналогами, обнаруженными у арабидопсиса.

Нами проведены ПЦР на ДНК трех видов растений: Senecio talinoides с абаксиальными унифациальными листьями, Curio repens с псевдо-унифациальными листьями и Curio articulatus с бифациальными листьями. В качестве олигонуклеотидных затравок использовались праймеры, имитирующие miR390. Электрофорез амплификатов показал синтез одной яркой полосы в 270 н.п. и минорных полос 170-190 н.п. Клонирование и секвенирование полученных фрагментов показало, что амплифицированные последовательности очень похожи между собой у рассмотренных видов (более 90% идентичности), содержат предполагаемые ta-siARF сайты, состоящие из одной или двух тандемных копий ARF-специфичных ta-siPHK и расположенные между miR390 сайтами узнавания, соответствующими праймерам для ПЦР (рис. 4А). Преобладающий TAS3-подобный ген с тандемным повтором ta-siARF был назван TAS3-Senl (GenBank JN692259). Последовательности ta-siARF в TAS3-Senl сопоставляются с фазами D7 (+) и D8 (+) определяемыми 3' miR390 сайтом в их предполагаемых предшественниках как это

наблюдается у двудольных растений. При этом последовательность С. агНсиЫиз в фазе Б8 (+) идентична 1а-51АИР арабидопсиса в фазе Б8 (+), а последовательность С. агЧсиЫиз в фазе 07 (+) имеет три несоответствия по отношению к 1а-51АЯР арабидопсиса в положении Б7 (+) (рис. 4В).

(А)

ССБСОМТАваСА-ебАСиСБАА - 5' тг.1И330

11:11IIIIIIII111111 <+Э)

П~-Т^Г"ДТГГТТ-ЬГГТГ.ЛГ-.ГТТТААТГ-,\ЛАЛТГТАТГПТТСССССТТТТТСАТТТТТТаАСТТСТТСССТТТТТТТГТТСТТГ,ТС.АТТС

Б8(+> ВЦ*) <*6) (+5)

тслттстсттелсеггетлАяйссттттстсахссттвТААвАсссАЛААЛтлестттоетзтсттттсАтттттттатеттттвтлтт

(+4) (+3) (+2) (♦!)

ТТАААТСАСТСТСАШЗТСАТААТТОТЛТТТТТАТСАТТТТТСТТССТТСССАСССААСТССТаТТСТССТТССТТетСТАТСССТТСТВЛБСТАТТ

:| I I I I I IIIНIIII 11

СС8С-бАиАбС6АаОАСиССАА - тШЭЭО

(В)

UUCUUGACCUUGUAAGACCUU-CaTAS 3 (D8+)

UUCUUGACCUUGUAAGACCUU-MtTAS 3 (D8+)

UUCUUGACCUUGUAAGACCUU—AtTAS3 (D8+)

UUCUUGACCUUGcAAGACCUU—0STAS3 (D7+)

UUCUC GAC CUUGUAAGAC С CA- С aTAS 3 (D7 + )

UUCUuGACCUUGÜAAGACCUC-MtTAS3 (D7 + )

UUCUuGACCUUGUAAGACCuc—AtTAS3 (D7+)

UUCUUGACCUUGUAAGACCUQ-0STAS3 (D6+)

Рис. 4 (А) Нуклеотидная последовательность noKycaTAS3-Senl Curio articulatus. Показаны 5' и 3' miR390 сайты-мишени. Подчеркиванием показаны предполагаемые сайты обработки Dicer. siRNAs, комплементарные ARP, указаны заливкой (D7 (+) и D8 (+)).

(В) Сравнение последовательностей TAS3-Senl Curio articulatus с TAS3 ta-siARF РНК Arabidopsis thaliana, Oryza sativa и Medicago truncatula.

Процессинг и полиаденилирование предшественников TAS3 генов растений были подробно изучены лишь на примере сплайсинга гена TAS3a A. thaliana (AT3G17185) (Alexandrov et al., 2006). Мы изучили транскрипцию генов TAS3-Senl у трех вышеупомянутых видов Senecioninae путем анализа последовательностей многочисленных клонов кДНК из вегетативных органов.

Клоны кДНК генов S. talinoides, С. repetís и С. articulatus попадают в группы с различными сайтами полиаденилирования. Два предполагаемых полноразмерных клона St. 41 и Са. 90 тоже имеют различные поли(А) сайты. В варианте Са.91, St.33 и Сг.28 для каждого гена было выявлено много клонов кДНК: 8 из 12 кДНК-кпонов C.repens и 7 из 13 клонов С. articulatus имели поли(А) «хвосты», присоединенные в этом среднем положении.

Сайты, в которых происходит полиаденилирование мРНК, разнесены на достаточно большие расстояния (рис. 5). Два сайта полиаденилирования, обнаруженные у С. articulatus находятся на расстоянии 216 нуклеотидов друг от друга, у S. talinoides они разнесены на 269 нуклеотидов, а для С. repenst были обнаружены три удаленных друг от друга сайта.

Таким образом, наблюдается высокая степень изменчивости в позиционировании поли(А) «хвостов» среди этих родственных генов у трех видов растений.

С». 90 -------------------------------------------------------------------C f ® *

Ci.il--------------------------1-----------------------------------------

it.33 - ------------------------------------------------------------------------------------------------------

CE.1I -----------------------------------------------------------------------------------"""

».!>..........................I.............................................................f-iym

Cr.31 --------------------------1---------------pell!»)

Ca.90 ■ C».91 -St.33 ' Cz.21 ■

- poly ill

- poly(A)

- poly (A)

. ид я я ггтттгпгг^пуг тгтттл"" тдгтггжтжт^тахтадтАтчгтлолаАйлалджалалвАаАвлалахоАа - poly (М --------------------------------------Ad-T---AC8ACO---TAB - poly [A)

Рис. 5. Сравнение нуклеотидных последовательностей З'-концевой области, следующей за ta-siARF тандемом, полноразмерных транскриптов и транскригтгов с преждевременной терминацией гена TAS3-Senl S. talinoides (St.), С. repens (Сг.) и С. articulatus (Са.). Область TAS3 ta-siARF затемнена Положение 3'-miR390 сайга подчеркнуто двойной линией. Делеции показаны как #.

Недавно было показано, что альтернативное полиаденилирование генерирует два транскрипта TAS3a локуса Arabidopsis (At3gl7185), из которых только один содержит оба miR390 сайта связывания фланкирующих ta-siARF регион и подвергается miR390-опосредованному процессингу (Wu et al., 2011; Hunt, 2012). Такое явление позволяет предположить более сложную регуляцию связей между miPHK и ta-siPHK. В принципе, использование альтернативных транскригтгов TAS3 генов Senecioninae в качестве мишени для деятельности miR390 может усиливать регуляцию синтеза ta-siARF РНК у разных видов Senecioninae, допуская различную степень инактивации miR390 своими собственными функциональными TAS3 генами-мишенями.

Разнообразие генов miR390 у некоторых мхов и печеночников.

Ранее гены miR390 были обнаружены у одного вида мхов - Physcomitrella. patens (Arazi Т., 2012). Для выяснения является ли наличие этих генов универсальным для бессосудистых наземных растений мы провели их поиск у других видов мохообразных -мхов и печеночников.

Хорошо известно, что микроРНК растений сильно консервативны, что позволяет исследователям предсказывать ортологи ранее известных микроРНК, используя EST и SRA базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).

В результате анализа баз данных кДНК с использованием miR390 Physcomitrella patens в качестве репера, нами были выявлены два новых гена микроРНК у мхов (Pohlia

nutans и Ceratodon purpureus). Мы использовали метод, принципиально схожий с изложенным Jones-Rhoades & Bartel (2004). В базах данных Р. nutans и С. purpureus обнаружено по одной копии предполагаемых генов-предшественников miR390, способных образовывать шпилечную структуру с минимальной свободной энергией -57,90 ккал/моль (GenBank GACA01009225) и приблизительно -64 ккал/моль (GenBank SRR074894.910234) соответственно (рис. 6). Как выяснилось, последняя последовательность предполагаемого гена miR390 имеет очевидное сходство с последовательностью miR390b Р. patens (рис. 6).

Мы попытались выявить miR390 последовательности с помощью ПЦР-подхода, разработанного нами для TAS3 генов. ПЦР-анализ проводили с помощью пары вырожденных праймеров, соответствующих последовательностям областей miR390 и miR390* шпилечных структур pre-miR390 Р.patens.

Эксперимент с использованием ДНК Brachitecium rivulare (Bryopsida) в качестве матрицы привел к эффективному синтезу одного ПЦР-фрагмента с ожидаемым размером 100 н.п., который соответствует расстоянию между miR390 и miR390* сайтами pre-miR390 P.patens. Применение строгих критериев, позволило выбрать только одну последовательность, способную образовывать типичную для микроРНК шпилечную структуру (рис. 6). Чтобы подтвердить выявленную последовательность, мы провели blast поиск сходных последовательностей в геноме В. rivulare (данные NGS секвенирования предоставлены Горюновым с сотр.). В результате была выявлена последовательность, имеющая 98% сходство с полученным нами фрагментом.

Дальнейшие эксперименты проводились с весьма филогенетически удаленными от P.patens видами мхов, а именно Timmia austríaca (класс Bryopsida, подкласс Timmiidae), Tetraphis pellucida (класс Tetraphidopsida), Polytrichum commune (класс Polytrichopsida), Andreaea rupistris (класс Andreaeopsida), Oedipodium griffitranum (класс Oedipodiopsida) и Sphagnum squarrosum (класс Sphagnopsida). ПЦР-амплификации на хромосомных ДНК всех этих видов синтезировали по одному основному фрагменту длиной около 100 н.п. Их клонирование и секвенирование показало, что треть амплифицированных фрагментов содержит предполагаемые pre-miR390 последовательности, имеющие шпилечную структуру, которая начинается с miR390/miR390* области (рис. 6). Интересно, что ни один из 9 отсеквенированных клонов продуктов ПЦР S.squarrosum не удовлетворял жестким критериям для идентификации рге-1гпМ90-подобных последовательностей. Таким образом, полученные данные подтверждают отсутствие ТА53-подобных фрагментов у этого растения (см. ниже).

Тем же методом мы выявили pre-miR390 последовательности у печеночников Marchantía polymorpha (класс Marchantiopsida) и Harpanthus Jlotovianus (класс

Jungermanniopsida) (рис. 6). С помощью web-сервера MaturePred (http://nclab.hit.edu.cn/maturepred) и построения вторичной структуры программой RNAfold (http://rnatbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi) была подтверждена принадлежность этих последовательностей к генам предшественников miR390. В базе данных NCBI SRA мы обнаружили несколько последовательностей генома Marchantía polymorpha, которые содержат полученный нами фрагмент (например, GenBank SRR072169.449069). Ранее данные о наличии генов miR390 у печеночников в литературе отсутствовали.

Р patena ppt-MIR390a (mínimum free energy о I -64.40 kcal/mol)

11II Mll.ll.llllillUMIIIIII ШИШКИН---- III II-» mi-.11» II >>■)>>■•■ .111111111.......111111.1111111111111111111111

ppt-MIR390b (MFE of -64.00 kcal/mol) _

lili III. 1(1(11. II-ШШ111Ш.ШШ11-1Ш-ШШ1М lili-И---III......III..I........I1.IIII..II11I.......-llllllllllll.il-.....1-1 И---

ppt-MIR390c (MFE of -62.30 kcal/mol )

IIIIIII... II iTTTlIllll. IIIMIIIII.il II.. III... IIIIIIIIHII.. III. II.....11111..111III.............II.IIII lililí II .11111111 -III •• -lili III

Pohlia nutans (MFE of -57.20 kcal/mol)

......... к. .......................................IIII.II.....lili......II1.IIIIIII IIIII-II--lililí III

Ceratodon purpureus (MFE of -64.00 kcal/mol)

а^ошсшшстямикиоашжосашга^

................iTÍTTtl I ((-.......(((--......................................................l.llllllllll.............III

Brachi.teci.um rivulara (MFE of -49.80 kcal/mol)

«уцяМкОкСмиипсААМстлАаышоаы^^

III- ((.((.(((((. (7777(((..-1......III. ((II. IIII.................................1I...III11111.111 II II II I»

Marchantía polvmorpha (MFE of -69.60 kcal/mol)

^ТГлгммшмгшТ!^ .....■■•(.....i.........тип...................................nuil-......... и .ni

Ti-mmia austríaca Tau-m±R390a (MFE of -50.10 kcal/mol)

.......... III. IIIIII.. IIIIIII. IIII..-. III-HIKI.....III1H..11I....11I1.1 II ll.ii. .mili -ni .11111111 ■

Tlmmla austríaca Tau-miR390b (MFE of -56.10 kcal/mol)

АасисмаАааалимсассилиоидл|сиаадАСТХд*иляиэил>огалды^^

.............■■■■.................((..(IIII........................................mil-.........

Tetraphis pellucida (MFE of -48.10 kcal/mol)

ХасйслаамоашмсЗот»ясйалм«лл|с1яиа^

...................нп..ikiiilil.(((..ni.к.. .IIni ..............ni..n.ii...пиши.шипи

Polytrichum communa (MFE of -63.80 kcal/mol)

7777(111111...................11... (((((... I.........................................................И "i

Oedipodi-um qrif f itranum (MFE of -49.50 kcal/mol)

Ш7(((((.((нни1____id к n((.. (((..((((. ((((((— iiiiii.ii)i..iii..llll.lll..ll...lllilllll-iilllllll

Andreaea ruplstrla (MFE of -49.10 kcal/mol)

........................ (¡lili-, mili..............ni. Ш.. Ш.....ni.lil.ni-.....i.mili..il.llllliilil.llliniil

Harpanthus flotovlanus (MFE of -47.10 kcal/mol)

....................................................................................mil.......niiiiii.llliiiiii

Рис. 6. Первичные и предсказанные вторичные шпилечные структуры элементов предшественников miR390 Bryophyta и Marchantiophyta. Подчеркиванием показаны последовательности высоко консервативных AGCU тетрануклеотидов miRNA или miRNA* и названия видов растений с последовательностями, ограниченными этими тетрануклеотидами.

Детекция генов TAS3 у нецветковых высших растений - мохообразных, папоротникообразных и голосеменных.

Впервые гены ta-siPHK (TAS гены) были обнаружены у покрытосеменных растений (Alien et al., 2005), позже было сообщено об их существовании у мха Physcomitrella palens (Axtall et al., 2007). ТАБЗ-локусы, определенные y P.patens, кодируют ta-siARFs, гомологичные ta-siARFs цветковых растений. Это указывает на их крайнюю эволюционную консервативность, однако, последовательности ТАБЗ-локусов до сих пор не были обнаружены у других высших споровых растений. Чтобы раскрыть своеобразную картину эволюционной истории ТАЗЗ-подобных генов у нецветковых растений, мы получили последовательности этих генов у различных мхов, хвощей, папоротников и голосеменных растений.

У мха Р. patens были найдены шесть локусов ta-siPHK, являющиеся мишенями для miR390 и названные PpTAS3a-f (Arif et al., 2012; Cho et al., 2012). Все они содержат 5' и 3' miR390 сайты узнавания. Чтобы применить подход, основанный на ПЦР-амплификации ТАЭЗ-локусов, к ранним наземным растениям, мы разработали праймеры, комплементарные сайтам узнавания miR390 PpTAS3a-f. Этим методом было исследовано 32 вида мхов (отдел Bryophyta) из 5 классов (Sphagnopsida, Andreaeopsida, Polytrichopsida, Tetraphidopsida, Bryopsida), а также, представители отдела Marchantiophyta (табл. I).

Наши данные по обнаружению miR390 у Marchantiophyta позволили нам предположить, что в этих базальных наземных растениях должны действовать miR390-зависимые молекулярные машины. Это имеет большое значение для выявления роли miR390 в эволюции ранних наземных растений. Похоже, их роль сложнее, чем просто процессинг предшественника TAS3. Особенно, если предположить потенциальное участие miR390 в прямом расщеплении белок-кодирующих мРНК. На суммарной геномной ДНК Marchantía polymorpha амплифицировался в небольшом количестве, но воспроизводимо, фрагмент ДНК из 250 н.п. Клонирование и секвенирование этого продукта ПЦР показало его сходство с ТАЗЗ-подобной последовательностью, обнаруживаемой в геноме М. polymorpha при blast-поиске в базе данных NCBI SRA (номер NCBI SRR072168.997878) (табл. 1). Поразительно, но ТАБЗ-подобный локус этого печеночника содержит только мономерный сайт ta-siAP2 и не содержит ta-siARF последовательностей (рис. 7).

Для отдела Bryophyta нами было выявлено около 40 новых последовательностей TAS3 в 4-х классах мхов (табл. I). В результате ПЦР-амплификации на хромосомных ДНК синтезировалась четкие фрагменты длиной 200-250 н.п. (рис. 8).

Marchantia polymorphs 1-Mpo

(Marcharitiopsida)

Andreaea rupestris 13-Aru

(Andreaeopsida)

Polytrichum commune 122-Pco

(Polytrichopsida)

Tetraphis pellucida 80-Tpe

(Tetraphidopsida)

Timmia austriaca 9-Tau

(Bryopsida)

5' miR390 target

-i...............L

•-{HE

--1

m _

3' miR390 target

162 182 ta-siR-AP2 la-siR-ARF

137 15? 182 202 ta-siR-AP2 ta-siR-ARF

(10 130 154 174 207 227

ta-siR-AP2 ta-siR-ARF

134 154 179 139 ta-siR-AP2 ta-siR-ARF

137 157 182 202

Рис. 7. Сравнение внутренней организации локусов ТАБЗ у ВгуорЬ^а и МагсИатюрЬ^а. Числа под прямоугольниками показывают относительную нуклеотидную позицию сайтов ппЮ90 и 1а-81РНК.

Клонирование и секвенирование полученных фрагментов ДНК показало, что амплифицированные последовательности, соответствуют общей структурной организации генов Physcomitrella - два сайта узнавания miR390 по краям и мономерная ta-siARF/ta-siAP2 последовательность между ними (рис. 7).

Наиболее консервативным фрагментом является область, включающая АР2-специфичные и ARF-специфичные блоки ta-siPHK, а также последовательность между ними. Было экспериментально показано, что эта промежуточная область тоже кодирует ta-siPHK у P. patens (Talmor-Neiman et al., 2006). Проведенный нами анализ BLAST NCBI показал, что обе последовательности, находящиеся в промежутке AP2-ARF ta-siPHK могут быть нацелены на мРНК ^охарактеризованных белков P. patens ХР_001780327 (из 186 аминокислот) и ХР_001780322 (из 382 аминокислот).

Учитывая базапьное положение Marchantiopsida среди наземных растений (Judd et al., 2008; Bowman, 2013), можно предположить, что древняя пи11390-зависимая TAS3 молекулярная машина растений сначала была направлена на АР2-подобные мРНК, а только потом стала нацелена на оба фактора: ARF- и АР2-специфичные мРНК.

А

1 2 3 4 5 6 7_8

■ ш

Рис. 8 (А) ПЦР-продукты, полученные на геномных ДНК с праймерами, комплементарными сайтам узнавания miR390 PpTAS3a-f.

Ortholrichum pumilum (1), Coscinodon humilis (2), Pylaisia polycmtha (3), Homalothecium philippeanum (5), Sphagnum girgensohnii (6), Sphagnum squarrosum (7), и Selaginella kraussiana (8).

Дорожка4 - маркер ДНК с шагом в 100 н.п. и 1500 н.п. (СибЭнзим).

(В) ПЦР-продукты, полученные на геномных ДНК с праймерами на ITS2.

Анализ деградома РНК Physcomitrella patens показал наличие новых TAS локусов мха, TAS6, которые зависят от активности двойных сайтов, комплементарных miR156/miR529 (Arif et al., 2012). Все три обнаруженных локуса TAS6 расположены вблизи генов PpTAS3 (а именно, PpTAS3a, PpTAS3d и PpTAS3f) и экспрессируются с этими видами TAS3 РНК как общие предшественники (табл. I; Arif et al., 2012; Cho et al., 2012). Кроме того, miR156 влияет на накопление ta-siPHK, специфичных для PpTAS3a, а также их мРНК-мишеней (Cho et al., 2012). Мы обнаружили, что сближенность TAS6 локусов в TAS3 генах не является уникальной для Physcomitrella patens (подкласс Funariidae) и характерна также для мхов подкласса Bryidae и Dicranidae (табл. I).

В отличие от мхов классов Andreaeopsida, Polytrichopsida, Tetraphidopsida и Bryopsida, на ДНК которых мы получили по меньшей мере один видимый фрагмент, у представителей класса Sphagnopsida (а именно, Sphagnum squarrosum и Sphagnum girgensohnii) продукт ПЦР с праймерами, имитирующими miR390, отсутствует (рис. 8А, табл. I). При этом для контроля качества препаратов ДНК, на них были поставлены реакции с праймерами на ITS2 рибосомной ДНК (Merget and Wolf, 2010) и получены ожидаемые результаты (рис. 8В).

Первые сосудистые появились примерно 420 миллионов лет назад, и главным эволюционным отличием сосудистых растений от мохопободной предковой группы стала возможность формировать поддерживающие и проводящие ткани, которые содержат клетки с одревесневшими стенками (Judd et al., 2008; Bowman, 2013).

При постановке ПЦР с праймерами, имитирующими miR390, на ДНК плауна Selaginella kraussiana мы получили отрицательный результат (рис. 8, дорожка 8). Позднее были опубликованы данные о том, что геном Selaginella moellendorffii (класс Isoetopsida) не содержит локусов DCL4, RDR6, TAS3 и miR390, которые необходимы для биогенеза

ta-siARF РНК (Banks et al., 2011). Их отсутствие показывает, что ta-siPHK-зависимые процессы регулируются по-разному в разных линиях растений и, возможно, отражают независимую эволюционную историю (сохранение или потеря TAS генов в отдельных таксонах). Таким образом, действенность нашего метода была подтверждена независимыми исследованиями.

Папоротникообразные представляют собой древнейшие линии сосудистых растений. О формировании их ta-siPHK, на основе действия miR390/TAS3, мало что известно. Также не ясно действие отбора, который повлиял на структуру TAS3 генов в различных систематических группах древних папоротникообразных (в частности, классов Isoetopsida, Equisetopsida, Marattiopsida и Polypodiopsida). Последние исследования локусов TAS3 у Physcomitrella показали, что ta-siAP2 последовательности в PpTAS3c и PpTAS3e не функционируют из-за ряда замен, препятствующих образованию Уотсон-Криковских пар с мРНК (Arif et al., 2012). Эти наблюдения позволяют предположить, что эволюция TAS3 локусов в сторону семейств с мономерными ta-siARF и не содержащими ta-siAP2, найденных у папоротникообразных, шла по пути отбора видов TAS3 мхов, которые потеряли функциональность ta-siAP2 последовательностей подобно PpTAS3c и PpTAS3e. При этом у папоротникообразных выявлен целый ряд вариантов гена TAS3.

Мы выяснили, что растения класса Polypodiopsida кодируют два варианта последовательностей TAS3 генов: подсемейства с одним и с двумя тандемными ta-siARF, аналогично тому, что мы обнаружили у покрытосеменных растений. Тем не менее, секвенирование амплификатов TAS3 локусов Equisetopsida, показало только подсемейство TAS3 с одной ta-siARF (рис. 9).

Примечательно, что у Angiopteris angustifolia (класс Marattiopsida) вьивлено третье подсемейство последовательностей TAS3. Кроме показанных ранее вариантов TAS3 локусов с одной последовательностью ta-siARF и TAS3 локусов с двумя ta-siARF, расположенными классическим тандемом в фазах D7 (+) и D8 (+), определяемых 3' miR390 сайтом, аналогично описанным в литературе локусам Arabidpopsis и других двудольных растений, был выявлен третий вариант TAS3 с двумя ta-siARF, где последовательности ta-siARF разделены и находятся в фазах D7 (+) и D10 (+) (рис. 9). Можно предположить, что представители этого подсемейства TAS3 с двумя ta-siARF и обладающие промежутком между ними, могут представлять собой промежуточную эволюционную стадию организации TAS3 локусов от подсемейства с одной ta-siARF к подсемейству с двумя ta-siARF, находящимися в тандеме.

Equisetum arvense Equ 83

(Equisetopsida)

Angiopteris angustifolia

Ang-T16

(Marattiopsida)

Angiopteris angustifolia

Ang-2/4

(Marattiopsida)

Angiopteris angustifolia

Ang-T24

(Marattiopsida)

•-1_L

-_

-Ш1

3' miR390 target

I3--

?9 <>9 135 15S

ta-siR-ARF-'

117 137

ta-siR-ARF

/5 OS 139 159

2 x ta-siR-ARF

Dicksonia fibtosia Dif-4/10

(Polypodiopsida)

Dicksonia fibrosia Drf-6/1

(Polypodiopsida)

:

2 x ta-siR-ARF

Pleridium aquilinum (Polypodiopsida)

Gnetum gnomon

one-tasi

(Gnetopsida)

-1

111 131 ta-siR-ARF

I-

Gnetum gnomon

two-tasi

(Gnetopsida)

Pinus taeda

ctg7180052440390

(Coniferophyta)

P/'nus taeda

ctg7180050584048

(Coniferophyta)

-

"I

2 X ta-siR-ARF

Рис. 9. Сравнение внутренней организации локусов TAS3 у папоротникообразных и голосеменных растений.

Последние работы по регуляции генов голосеменных растений на основе miR390, были сосредоточены главным образом на функциональном анализе микроРНК. В отличие otTAS3 цветковых растений, у хвойных расщепляется только 5' miR390 сайт узнавания TAS3-подобного предшественника РНК (Fei Q., Xia R. and Meyers B.C., 2013).

Изучение нами последовательностей TAS3, представленных в базах данных NCBI EST и SRA, показало два подсемейства генов TAS3 у Gnetophyta, имеющих те же характеристики, что и у покрытосеменных растений (рис. 9). Аналогичные данные получены для многих растений из Coniferophyta. В частности, геном Pinus taeda (http://dendrome.ucdavis.edu/resources/blasf/) содержит по меньшей мере 4 локуса TAS3

с одиночной ta-siARF и 7 локусов TAS3 со сдвоенной ta-siARF. Кроме того, проведенные нами исследования методом, основанным на ПЦР, для представителей отдела Cycadophyta (Cycas revoluta, Strangeria eriupus, Zamia pumita и Macrozamia miqnolii) выявили такие же два подсемейства TAS3.

Представляется вероятным, что основным механизмом эволюции TAS3 генов, создавшим прослеженное нами разнообразие (табл. II), является дупликация и дивергенция TAS3 локусов. После возникновения предполагаемого примитивного (АР2-специфичного) типа TAS3 локуса, этот ген, в ходе эволюции мхов, подвергался дупликации. Одна из получившихся копий могла приобрести новые функции, в результате чего, в дополнение к ta-siAP2 сайту развились ta-siARF последовательности. Наш анализ показывает, что TAS3 семейства мхов могли потерять ta-siAP2 сайт в процессе эволюции в направлении папоротников или полностью исчезнуть из геномов растений в эволюционной линии ведущей к плаунам. Наконец, эволюционный процесс создания TAS3 последовательности, характерной для семенных растений, мог бьггь связан с дублированием мономерных сайтов ta-siARF, что наблюдается у папоротников.

Значение ta-siPHK в эволюционном процессе было рассмотрено еще 2006 году [Poethig et al., 2006]. Тогда авторы предположили, что механизм регуляции генов с помощью ta-siPHK направленно развивался в ходе эволюции. Они отметили древность и эффективность данного регуляторного пути, управляющего одновременно большим количеством родственных и неродственных генов. В то время для подобной гипотезы было мало оснований, поскольку основные исследования проводились на A. thaliana, у которого регуляция генов с помощью ta-siPHK происходит нехарактерным образом. К настоящему времени показано, что другие растения используют этот путь регуляции гораздо более активно. Учитывая, что на сегодня прочитано относительно небольшое количество геномов растений, вероятно в будущем, наукой будут открыты новые семейства генов, в которых вторичные ta-siPHK играют регуляторную роль.

Таблица I. Описание последовательностей TAS3-подобных локусов мохообразных

Класс/ подкласс Порядок Вид Клон/ кластер1 Длина, HI.' Источник (ссылка и/или номер в базе NCBI)3 Структура (один- или два-ta-siARF/AP2/ TAS6)4

Bryopsida/ Dicranidae Pottiales Bryoetythrophyllum inaequalifolium 27-Вш/ TAS3b,c,e 236 КС812740 ta-siARF/AP2

Grimmiales Coscinodon humilis 20-Chu/ TAS3b.c.e 234 Krasnikova et al., 2011 НО709423 ta-siARF/AP2

C. humilis 16-Chu/ TAS3b,c,e 228 Krasnikova et al., 2011 H0709422 ta-siARF/AP2

Schistidium elegantulum 24-Sce/ TAS3b.c,e 229 Krasnikova et al., 2011 H0709424 ta-siARP/AP2

Grimmia cribrosa 43-Gcr/ TAS3b.c,e 228 Krasnikova et al., 2011 HQ709421 ta-siARF/AP2

Dicranales Fissidens laxifolius 17-Fit/ TAS3b,c,e 192 Krasnikova et al, 2011 HQ709425 ta-siARF/AP2

Ceralodon purpureus 48-Cpu/ TAS3b,c,e 231 779' SRR074890 1165977.2 ta-siARF/AP2/ TAS6

Amphidium mougeotii 56-Amo/ TAS3b,c,e 234 KC812745 ta-s¡ARP/AP2

Leucobryum glaucum 41-Lgl/ TAS3b,c,e 226 KC812750 ta-siARF/AP2

L. glaucum 42-Lgl/ TAS3b,c,e 192 KC812749 ta-siARF/AP2

Dicranum pacificum 44-Dpa/ TAS3b.c.e 232 KC812741 ta-siARF/AP2

Bryopsida/ Bryidae Orthotrlchales Orthotrichum pumilum 5-Opu/ TAS3b.c,e 199 Krasnikova et al , 2011 HO709419 ta-siARF/AP2

0. pumilum 24-Opu/ TASSa.d.f 246 Krasnikova et al., 2011 HQ709420 ta-s¡ARF/AP2

Hypnales Brachythecium latifolium 47-Br/ TAS3b,c,e 199 Krasnikova et al., 2011 FJ804748 ta-siARF/AP2

B. latifolium 50-Вг/ TAS3a,d.f 255 Krasnikova et al., 2011 F7804747 ta-siARF/AP2

B. albicans 37-Bal/ TAS3b,c,e 199 Krasnikova et al , 2011 HO709414 ta-siARF/AP2

B. rivulare 11-Вгаг/ TAS3b,c,e 199 KC812739 ta-siARF/AP2

B. rivulare 36-Вгаг/ TAS3a,d,f 255 1444' KC812738 (Illumina sequence) ta-siARF/AP2/ TAS6

Homalothecium philippeanum 7-Hp / TAS3b.c.e 199 Krasnikova et al., 2011 HQ709415 ta-siARF/AP2

Amblystegium sp 52-Ambly/ TAS3b,c,e 191 KC812762 ta-siARF/AP2

Oxyrrhytichium hians 25-Oxy/ TASSb.c.e 199 Krasnikova et al., 2011 HQ709418 ta-siARF/AP2

O. hians 32-Oxy/ TAS3a,d.f 253 KC812761 ta-siARF/AP2

Pylaisia polyantha 10-Pyp / TAS3b,c,e 199 Krasnikova et al., 2011 HQ709416 ta-siARF/AP2

P. polyantha 11-Рур/ TA.S3a.dJ 253 Krasnikova et al., 2011 HQ709417 ta-siARF/AP2

1 Эта колонка включает названия всех выявленных TAS3 клонов и кластер по Physcomitreila patens

2 В этой колонке указывается длина TAS3, включая последовательности 5 'и 3' miR390 -мишеней на границах.

3 Здесь даны ссылки и номера присоединения (если известны) для всех выявленных TAS3 локусов за исключением Physcomitreila patens. Для локуса 48-Сри и 1-Мро, полученные нами последовательности идентичны фрагментам длинных последовательностей в базе данных NCBI SRA. Для 36-Вгаг, последовательность, полученная на основе ПЦР, соответствует фрагментам NGS чтений геномной ДНК Brachythecium rivulare.

4 В этой колонке указывается внутренняя организация TAS3 локусов, которые включают ta-siARF и ta-siAP2 последовательности. TAS6 означает возникновение специфичного локуса TAS3 в непосредственной близости от локуса TAS6 (если он известен).

5 Это число показывает общую длину сложного элемента TAS6-TAS3 (от 5'miR529 в TAS6 до 3'miR390 в TAS3).

Hookeriales Hookeria lucens 49-Н/ TASib.c.e 190 Krasnikova et al., 2011 FJ804749 ta-siARF/AP2

Bryales Pohlia nutans Pnu-30698 TASla.dJ 259 920s GAC AO 1023 ISO. 1 ta-siARF/AP2/ TAS6

Plagiomnium medium 41-Рте/ TAS3a,d,f 236 KC812756 ta-siARF/AP2

Ptychostomum pseudotriquetrum 72-Pps/ TASla.d.f 246 KC812758 ta-siARF/AP2

P. pseudotriquetrum 16-Pps/ TAS3b,c,e 193 KCS12757 ta-siARF/AP2

Bryum argenteum 9-Ваг/ TAS3a,d,f 233 KC812760 ta-siARF/AP2

B. argenteum 4-Bar/ TAS3b.c,e 192 KC812759 ta-siARF/AP2

Bartramiales Bartramia halleriana 32-Bha/ TAS3b,c,e 228 KC812748 ta-siARF/AP2

B. halleriana 28-Bha/ TAS3a,d,f 272 KC812747 ta-siARF/AP2

B. halleriana 29-Bha/ TAS3a,d,f 254 KC812746 ta-siARF/AP2

Bryopsida/ Funariidae Encalyptales Encalypta rhaptocarpa 35-Erh/ TAS3a,d,f 253 KC791767 ta-siARF/AP2

/.. rhaptocarpa 16-Erh/ TAS3b,c,e 249 KC791768 ta-siARF/AP2

£ rhaptocarpa 31-Erh/ TASSadJ 253 KC791769 ta-siARF/AP2

Funariales Physcomitrella patens PpTAS3a/ TAS3a,dkf 255 895' Arifetal., 2012 ta-siARF/AP2/ TAS6

P. patens PpTAS3d/ TAS3a,d,f 256 1250' Arifetal., 2012 ta-siARF/AP2/ TAS6

P. patens PpTAS3ff TAS3a,d.f 245 1234' Arifetal., 2012 ta-siARF/AP2/ TAS6

P. patens PpTAS3c/ TAS3b,c,e 259 Arifetal., 2012 ta-siARF/AP2

P. patens PpTAS3b/ 7M.VJ4,c,e 192 Arifetal., 2012 ta-siARF/AP2

P. patens PpTAS3e/ TAS3b,c,e 192 Arifetal., 2012 ta-siARF/AP2

Bryopsida/ Timmiales Timmia austríaca 9-Tau/ TAS3a,d,f 254 KC812755 ta-siARF/AP2

Tetraphidopsida Tetraphidales Tetraphis pellucida 73-Tp ct TAS3b,c,e 275 KC812754 ta-siARF/AP2

T. pellucida 80-Tpe/ outside 251 KC812753 ta-siARF/AP2

Polytrichopsida Polytrichales Polytrichian commune 122-Pco/ outside 227 KC812751 ta-siARF/AP2

P. commune 124-Pco/ Шй,с,( 262 KC812752 ta-siARF/AP2

Andreaeopsida Andreaeales Andreaea rupestris 13-Аш/ outside 254 KC812744 ta-siARF/AP2

A. rupestris 14-Am/ outside 272 KC812743 ta-siARF/AP2

Sphagnopsida Sphagnales Sphagnum sqitarrosum He обнаружен • Krasnikova et al., 2011 -

S. girgensohnii He обнаружен - Krasnikova etal., 2011 -

Marchantiopsida Marchantiales Marchantía polymorpha 1-Мро/ outside 256 KC812742 SRR072168.997878.2 ta-siAP2

Таблица II. Краткий обзор разнообразия организации ТАБЗ-подобных локусов высших растений.

Организация ТАвЗ (Один- или два-1а-51АШг/АР2/ТА86) Класс/подкласс

Только один 1а-я1АР2 МагсЬап1юр51(1а

Один 1а-з1АР2 -один 1а-51А11Р Andreaeopsida Polytrichopsida Tetraphidopsida Bryopsida/ Т1ттМае Bryopsida/Funaгiidae Bryopsida/Bгyidae Bryopsida/Dicranidae

ТАЭб-ТАЗЗ Bryopsida/Funariidae Bryopsida/Bryidae Bryopsida/Dicгanidae

Только один 1а-51АЮ: Equisetopsida

Подсемейства с одним 1а-51А11Р и с двумя 1а-51А11Р в тандеме Marattiopsida

Два 1а-51А11Р (не тандемный повтор) Marattiopsida

Подсемейства с одним 1а-81А11Р и с двумя 1а-$1АЯР в тандеме Polypodюpsida

Подсемейства с одним 1а-51АЫг и с двумя 1а-51А11Р в тандеме 8регта1орЬ)1а6

ТАБЗ локусы не выявлены Lycopodюpsida Sphagnopsida

6 Семенные растения образуют группу, которая включает в себя несколько классов.

21

выводы

1) Предложен новый метод выявления генов TAS3 растений в составе геномной ДНК и РНК-

транскриптов растений. Этот метод основывается на использовании полимеразной цепной реакции с применением праймеров, сходных или комплементарных miR390.

2) Предложенный нами подход позволил выявить новый, не описанный ранее тип

тШ90-опосредованных TAS генов, производящих потенциальных предшественников ta-siARF РНК у различных семенных растений.

3) Впервые у цветковых растений выявлено существование механизмов селективной

регуляции экспрессии TAS3 генов.

4) Приведены данные детального анализа разнообразия ТА53-подобных генов у мхов и

родственных им древнейших наземных растений. Идентифицировано более 40 генов, кодирующих ta-siARF РНК, для различных таксономически удаленных групп мохообразных.

5) Впервые установлена первичная структура miR390 у ряда мхов и родственных им

древнейших наземных растений.

6) Анализ данных о структуре TAS генов у представителей наземных растений, позволил

выдвинуть гипотезу, согласно которой эти гены эволюционировали с изменением специфичности и структуры кодируемых ими ta-si РНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в российских журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Озерова J1.B., Тимонин А.К., Милютина И А., Красникова М.С., Боброва В.К. Новые подходы к решению проблемы фациальности листа с помощью молекулярно-генетических методов // Вестник Тверского государственного университета. Серия Биология и экология.

2008. Вып. 9. С. 181-186.

2. Морозов С.Ю., Соловьев А.Г., Красникова М.С. Новый экспериментальный подход к выявлению и секвенированию генов предшественников транс-действующих малых интерферирующих РНК в геномах растений // Вестник новых медицинских технологий.

2009. Т. XVI. № 1. С. 283-284.

3. Озерова Л.В., Красникова М.С., Троицкий А.В., Соловьев А.Г., Морозов С.Ю. Гены TAS3, кодирующие малые интерферирующие ARF РНК у растений, принадлежащих к подгрибе Senecioninae: наличие преждевременно терминируемых РНК предшественников // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2013. № 2. С. 33-36.

Публикации в международных журналах:

4. Krasnikova М. S., Milyutina I. A., Bobrova V. К., Ozerova L. V„ Troitsky А. V., Solovyev А. G., Morozov S. Y. Novel miR390-dependent transacting siRNA precursors in plants revealed by a PCR-based experimental approach and database analysis // Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009. V. 2009. ID 952304. DOI: 10.1155/2009/952304.

5. Krasnikova M. S., Milyutina I. A., Bobrova V. K., Troitsky A. V., Solovyev A. G., Morozov S. Y. Molecular diversity of miR390-guided trans-acting siRNA precursor genes in lower land plants: experimental approach and bioinformatics analysis // Sequencing. 2011. V. 2011. ID 703683. DOI: 10.1155/2011/703683.

6. Krasnikova M., Ozerova L., Troitsky A., Solovyev A., Morozov S. Peculiarities of phylogeny and expression of TAS-like small RNA precursor genes in plants belonging to family Asteraceae: experimental approach and bioinformatics analysis // Вістник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Біологія. 2012. № 62. Р. 14-19.

7. Krasnikova M.S., Goryunov D.V., Troitsky A.V., Solovyev A.G., Ozerova L.V., Morozov S.Y. Peculiar evolutionary history of miR390-guided TAS3-like genes in land plants. 2013 // Scientific World Journal. 2013. ID 924153. DOI: 10.1155/2013/924153.

Тезисы и материалы конференций:

8. Красникова М.С. Детекция и молекулярная филогения генов малых транс-действующих РНК у высших растений. // Материалы конференции Ломоносов Москва (Россия). 2010. С. 53.

9. Krasnikova M.S., Ozerova L.V., Troitsky A.V., Solovyev A.G., Morozov S.Y. Phylogenetic profiling of plant genomes mediated by PCR amplification and sequencing of trans-acting siRNA precursor genes. // Abstracts book of international conference «Molecular Mapping and Marker assisted Selection» Vienna (Austria). 2012. P. 53.

10. Троицкий A.B., Губин C.B., Боброва B.K., Игнатов М.С., Красникова М.С. Регенерация гаметофитов мхов из спор позднеплейстоценовых вечномерзлотных толщ Сибири. // Материалы всероссийской бриологической конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения Романа Николаевича Шпякова «Бриология XXI века». Кировск (Россия). 2012. С. 72.

Подписано в печать:

12.09.2013

Заказ № 8736 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Красникова, Мария Сергеевна, Москва

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета

имени М.В. Ломоносова

На правах рукописи

04201362019

КРАСНИКОВА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ И ЭВОЛЮЦИИ ГЕНОВ ТА83, КОДИРУЮЩИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКИ 1а-$1РНК У НЕЦВЕТКОВЫХ НАЗЕМНЫХ РАСТЕНИЙ И ОСОБЕННОСТИ ИХ ЭКСПРЕССИИ У НЕКОТОРЫХ

ПОКРЫТОСЕМЕННЫХ

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Сергей Юрьевич Морозов

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................3

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................8

1.1. Развитие исследований РНК-сайленсинга у растений: микроРНК и транс-действующие малые РЖ.................................8

1.2. Функции 1а-з11ША растений.................................................23

1.3. Изучение микроРНК и 1а-81РНК мхов и их функций..................24

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................... 30

2.1. Растительный материал......................................................30

2 2. Выделение ДНК...............................................................30

2.3. Агробактериальная трансформация и агроинфильтрация............31

2.4. Выделение РНК и синтез кДНК............................................ 32

2.5. Амплификация и электрофорез.............................................33

2.6. Клонированние фрагментов ДНК..........................................34

2.7. Секвенирование................................................................35

2.8. Вычислительный анализ последовательностей.........................35

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..............................37

3.1. Разнообразие генов ТА83 и их дифференциальная

экспрессия у некоторых растений рода Мсойапа............................37

3.2. Разнообразие генов ТА83 и их дифференциальная

экспрессия у некоторых растений в подтрибе Зепесюшпае...............43

3.3. Разнообразие генов 1ш11390 у некоторых мхов и печеночников.....50

3.4 Детекция генов ТА83 у нецветковых высших растений

- мохообразных, папоротникообразных и голосеменных..................57

3.5. Принципы эволюции генов ТАБЗ у наземных растений...............70

ВЫВОДЫ............................................................................ 72

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................73

БЛАГОДАРНОСТИ.............................................................. 85

ПРИЛОЖЕНИЯ............................ ......................................86

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Малые некодирующие РНК у эукариот это обычно 20-25-и нуклеотидные последовательности участвующие во многих биологических процессах. У растений они играют важнейшую регуляторную роль в процессе роста и дифференцирования тканей, в формировании гетерохроматина, деградации мРНК, подавлении экспрессии генов, а также в ответе на разнообразные типы стрессов.

Эта роль осуществляется комплементарным связыванием малых некодирующих РНК со специфическими мРНК-мишенями, ведущим к посттранскрипционному РНК-сайленсингу соответствующих генов [Baulcombe, 2004; Carrington and Ambros, 2003; Voinnet, 2005; Vaucheret, 2006; Bonnet et al., 2006; Chu and Rana, 2007].

К основным видам малых РНК относятся микроРНК (miPHK), короткие интерферирующие РНК (siPHK) и транс-действующие siPHK (ta-siPHK).

Микро РНК (miPHK) представляют собой класс малых некодирующих РНК (из 21-22 нуклеотидов), транскрибируемых из геномов всех многоклеточных организмов и некоторых вирусов [Jones-Rhoades and Bartel, 2004; Laporte et al., 2007; Liu et al., 2007].

Биогенез растительных miPHK начинается с транскрипции предшественников микроРНК РНК-полимеразой II. Эти предшественники содержат последовательность зрелой микроРНК внутри длинной несовершенной шпильки, которая обрабатывается в ядре белком DCL1 [Rogers and Chen, 2013]. В настоящее время описаны, в общей сложности, несколько десятков семейств растительных микроРНК (сотни отдельных видов микроРНК), а также, найдены их мишени - в основном белок-кодирующие мРНК. Но некоторые микроРНК руководят расщеплением некодирующих первичных транскриптов TAS генов направляя формирование трансдействующих siPHK. В этом случае, микроРНК выполняют расщепление с помощью белка Argonaute (AGO), который расщепляет одноцепочечный TAS

РНК транскрипт в области, комплементарной малой РНК. Продукты расщепления TAS преобразуются в результате совместного действия белка SGS3 и РНК-полимеразы RDR6 в двухцепочечную форму, а затем обрабатываются DCL4 для получения ta-siPHK, которые располагаются с шагом в 21 нт по отношению к исходному сайту расщепления на обеих цепях.

Получившиеся 21 -нуклеотидные ta-siPHK далее работают в качестве компонентов комплекса RISC для направления AGO-зависимого расщепления их мишени.

Особенность их действия связана с тем, что они функционально инактивируют in trans не те гены, которыми кодируются (TAS гены), а иные гены, в основном кодирующие регуляторные белки.

Для высших растений характерны ta-siPHK, которые кодируются собственными генами (TAS la, TASlb, TASlc, TAS2, TAS3 и TAS4). Большинство предшественников TAS РНК имеют только один мотив микроРНК (например, miR173), расположенный на 5'-конце ta-siPHK предшественника, и этот мотив расщепляется AGOl руководствуясь соответствующей микроРНК. Однако для расщепления предшественника TAS3 РНК, необходимо два сайта miR390 (на 5' и 3' концах фрагмента). Образование таких ta-siPHK зависит от специфичного взаимодействия между AG07 и miR390 [Montgomery et al., 2008; Endo et al., 2013]. Впоследствии они контролируют активность генов ауксин-регулируемых транскрипционных факторов ARF3 и ARF4, направляя специфическую деградацию их мРНК, поэтому их назвали ta-siARF РНК [Allen et al., 2005; Carraro et al., 2006; Nogueira et а., 2007].

Важнейшее значение TAS3 генов в регуляции развития растения, их широкая распространенность даже у примитивных наземных растений и слабая изученность эволюции и разнообразия miR390-3aBHCHMbix TAS генов требуют новых подходов и специальных исследований в этом направлении [Allen et al., 2005; Nogueira et al., 2007].

Цель исследования. Изучение разнообразия и биоинформатический анализ нуклеотидных последовательностей генов транс-действующих малых интерферирующих РНК, процессинг предшественников которых направляется микроРНК miR390 для различных, таксономически удаленных, видов наземных растений.

Задачи исследования:

1) Изучение разнообразия и дифференциальной экспрессии генов TAS3 у некоторых двудольных растений семейства Solanaceae;

2) Изучение разнообразия и дифференциальной экспрессии генов TAS3 у некоторых двудольных растений трибы Senecioninae (семейство Asteraceae);

3) Изучение разнообразия генов miR390 у некоторых мхов и печеночников;

4) Изучение разнообразия генов TAS3 у мхов.

Научная новизна. Для изучения TAS-генов, зависимых от miR390, исследовано их разнообразие у растений порядков Solanales, Asterales и Alismatales. Использование нового подхода, основанного на ПЦР, позволило выявить новые типы TAS генов. Эти гены характеризуются гораздо меньшей дистанцией между участками, комплеметарными miR390, и не обнаруживаются у Arabidopsis thaliana. Более того, эти "короткие" гены дают начало только одной копии ta-siARF РНК. Заметим, что анализ баз данных последовательностей геномов растений позволил выявить такие TAS гены у 15 семейств двудольных растений и двух семейств голосеменных растений. Кроме того, получены данные об особенностях экспрессии нового типа TAS генов.

В работе приведены данные детального анализа разнообразия TAS3-подобных генов у мхов и родственных им древнейших наземных растений. Ранее мировой науке были известны данные лишь по одному виду мхов -Physcomitrella patens. В процессе данной работы были клонированы более 40 генов, кодирующих ta-siARF РНК, используя ДНК различных таксономически удаленных видов мхов. ДНК была изолирована из целого ряда

представителей классов Andreaeopsida, Polytrichopsida, Tetraphidopsida, Bryopsida (подклассы Timmiidae, Bryidae и Dicranidae) и класса Sphagnopsida. Анализ данных о структуре TAS генов у других представителей наземных растений, включая печеночники мхи, плауны и папортники, позволил нам выдвинуть гипотезу, согласно которой эти гены эволюционировали с изменением специфичности и структуры кодируемых ими ta-siPHK.

Впервые широко исследована структура генов предшественников miR390 у печеночников и мхов. Впервые идентифицированы гены различных видов мхов и лишь несколько из них сходны по первичной структуре с известными ранее генами miR390 Physcomitrella patens.

Некоторые функции TAS3 генов являются тесно связанными с функциями онтогенеза растений и их устойчивостью к абиотическим стрессам. В этой связи часть работы посвящена изучению селективности регуляции экспрессии TAS3 генов, содержащих тандемно-дуплицированный район ta-siARF РНК, с одной стороны, и мономерный район ta-siARF, с другой. Впервые у цветковых растений выявлено существование механизмов селективной регуляции экспрессии TAS3 генов.

Практическая значимость работы. Результаты нашего исследования дают новые представления о регуляторных механизмах функционирования защитного ответа растений на повреждающие стрессовые воздействия. Согласно литературным данным, на модели растений показана возможность получения трансгенов, имеющих признаки устойчивости к тяжелым металлам и вирусной инфекции. Эта толерантность была основана на стабильной экспрессии в растениях генов TAS. Потенциально, экспрессия в модельных трансгенных растениях наших конструкций генов TAS, введенных с помощью бинарного вектора дает возможность получения растений, несущих ценные признаки. Все полученные материалы могут быть включены в курс лекций для студентов биологических ВУЗов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 3 научных конференциях: Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2010» (Россия, Москва, 2010); Всероссийская бриологическая конференция с международным участием, посвященная 100-летию со дня рождения Романа Николаевича Шлякова (Кировск, 2012); International Conference «Molecular Mapping and Marker assisted Selection» (Vienna, Austria, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей в научных журналах, из которых 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, а также 3 статьи в материалах и тезисах научных конференций.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Развитие исследований РНК-сайленсинга у растений: микроРНК и транс-действующие малые РНК

Исследования регуляции активности генов с помощью малых интерферирующих РНК в последнее время получили широкое развитие. Общий термин, охватывающий различные типы такой регуляции генной активности -«умолкание» генов или сайленсинг [Дорохов, 2007]. Понятие сайленсинга включает в себя подавление транскрипции, снижение стабильности мРНК и ингибирование ее трансляции. Осуществляться эти процессы могут разнообразными способами. Для животных был принят термин «РНК-интерференция», у грибов это явление получило название «quelling», а у растений - сайленсинг генов.

Проявления сайленсинга генов были замечены еще в первой половине 20-го века [Baulcombe, 2004] Тогда, в 1928 г. были описаны растения табака, инфицированных вирусом кольцевой пятнистости табака, у которых верхние неинокулированные листья не содержали вируса и были устойчивыми к заражению. Подобные проявления сайленсинга наблюдались неоднократно. Но систематическое изучение данного явления стало возможным лишь с появлением метода получения трансгенных растений. Тогда же исследователи обнаружили, что в клетках некоторых линий растений, в геном которых были встроены чужеродные или гомологичные гены, не удавалось обнаружить мРНК этих генов.

В 1990 году в лаборатории Йоргенсена для того, чтобы изменить окраску цветков петунии {Petunia hybrida), в растения были введены гены синтетазы розового и фиолетового пигментов [Napoli et al., 1990]. Однако, повышение экспрессии гена синтетазы пигмента не привело к проявлению более тёмной окраски околоцветника, напротив, цветки стали более светлыми и даже частично белыми. Полученные результаты свидетельствовали о том, что активность фермента не растёт, а снижается до 50 раз. Гены синтетазы

пигмента экспрессировались на более низком уровне, чем до введения трансгена.

В лаборатории Дагерти в 1993 г. показали, что введение в геном табака нетранслируемого фрагмента потивируса, приводит к антивирусной устойчивости растений и сопровождается разрушением вирусной РНК [Lindbo et al., 1993].

В 1998 году Craig С. Mello и Andrew Fire опубликовали статью в Nature, в которой описали эффект сайленсинга генов после введения двуцепочечной РНК в организм круглого червя Caenorhabditis elegans [Fire et al., 1998]. В исследованиях по регуляции синтеза мышечных белков, Мелло и Файер показали, что введение мРНК или антисмысловых РНК не влияло на синтез белка, в то время как введение двуцепочечных РНК успешно снижало экспрессию гена-мишени. В процессе этих работ появился термин РНК-интерференция.

Исследования Файера и Мелло примечательны тем, что в ходе их работы было выявлено действующее начало системы посттранскрипционного сайленсигна генов. В 1999 г. в лаборатории Болкомба также было сделано важное открытие: разрушение РНК при сайленсинге сопровождается накоплением специфических коротких 21-25 нуклеотидных двухцепочечных РНК [Hamilton and Baulcombe, 1999]. Обнаружение малых РНК изменило существующие представления о регуляции генов и функционировании клетки. Оказалось, что они выполняют множество функций с использованием неизвестных ранее механизмов. Механизм подавления экспрессии генов с помощью малых РНК обнаружен у всех крупных таксонов эукариот: позвоночных и беспозвоночных животных, растений и грибов. В 2006 году за открытие интерференции - механизма контроля генов, осуществляемого РНК Craig С. Mello и Andrew Fire получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

Методы вычислительного филогенетического анализа свидетельствуют о том, что наиболее поздний общий предок всех эукариот уже имел

способность к РНК-интерференции, отсутствие же системы РНК-интерференции у некоторых эукариот является приобретенным признаком [Cerutti and Casas-Mollano, 2006].

Наиболее древней функцией системы РНК-интерференции, как правило, называют защиту от экзогенных генетических элементов — геномов вирусов и транспозонов. Некоторые смежные функции, например, модификация гистонов, могли быть представлены и у предков современных эукариот, в то время как другие, например, регуляция развития при помощи микроРНК, по-видимому, появились позднее [Cerutti and Casas-Mollano, 2006].

Направляемая малыми РНК специфическая деградация клеточных и вирусных мРНК названа посттранскрипционным РНК-сайленсингом (ПТРС). Исследования продемонстрировали, что малые РНК растений мобильны, следовательно они могут действовать на больших расстояниях [Макарова и Крамеров, 2007; Chitwood and Timmermans, 2010; Dunoyer et al., 2010; Molnar et al., 2010; Gursanscky et al., 2011]. У растений ПТРС определяется синтезом и действием малых РНК нескольких классов, включая микроРНК (miPHK) и транс-действующие малые интерферирующие РНК (ta-siPHK) [Carrington and Ambros, 2003; Baulcombe, 2004; Voinnet, 2005; Vaucheret, 2006; Bonnet et al., 2006; Chu and Rana, 2007].

МикроРНК - это открытый на рубеже тысячелетий вид некодирующих РНК размером от 20 до 24 нуклеотидов, которые осуществляют негативный контроль экспрессии многих групп генов у эукариот, а также защиту от вирусной инфекции, направленно ингибируя трансляцию или вызывая деградацию специфических последовательностей РНК [Jones-Rhoades and Bartel, 2004; Vaucheret, 2006; Bonnet et al., 2006; Laporte et al., 2007; Chu and Rana, 2007; Liu et al., 2007].

В основе регуляции, осуществляемой микроРНК лежит подавление трансляции клеточных мРНК после комплементарного или частично комплементарного связывания с микроРНК (у животных сайты связывания miPHK находятся обычно в З'нетранслируемых областях, а у растений -

Это свидетельствует о существовании механизма обратной связи, с помощью которого miPHK определяют уровень своей собственной продукции.

У растений уже обнаружено около полусотни семейств miPHK, причем последовательности целого ряда семейств и их мишеней, названных элементы ответа на микроРНК (MRE - miRNA-responsive element), консервативны у разных таксономических групп растений от мхов до двудольных. Это указывает на законсервированность функций многих miPHK у всех наземных растений. Важно, однако, что существуют miPHK, специфичные для отдельных семейств, и даже видо-специфичные miPHK [Floyd and Bowman, 2004; Talmor-Neimann et al., 2006a; Axtell et al., 2007; Fattash et al., 2007; Barakat et al., 2007; Vazquez, 2006; Jagadeeswaran et al., 2012; Nozawa et al., 2012]. В частности, обнаруженные до сих пор miPHK водорослей являются видо-специфичными (Не et al., 2012; Tarver et al., 2012).

Ферменты, участвующие в биогенезе miPHK, тоже очень консервативны. Вероятно, наряду с РНК-интерференцией, они играли в клетке и другие роли. Масштабные исследования в области сравнительной геномики показали, что семейство белков Argonaute, общее для многих эукариот, а также архей и некоторых бактерий (например, Aquifex aeolicus), гомологично и эволюционно происходит от компонентов системы инициации трансляции [Anantharaman et al., 2002].

Классифицируют эндогенные малые РНК растений, как правило, на основании их биогенеза и функций. Например, выделяют микро miRNA, гетерохроматин-связанные hcsiRNAs, транс-действующие ta-siRNAs, ассоциированные с повторами ra-siRNAs и естественные антисмысловые nat-siRNAs [Allen and Howell, 2010; Vazquez et al., 2010].

Axtell предлагает следующую иерархическую классификацию эндоге�