Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Консервативность и вариабельность ДНК ядрышковых организаторов человека

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Консервативность и вариабельность ДНК ядрышковых организаторов человека"

н

005013343

ШИБАЛЁВ ДМИТРИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

КОНСЕРВАТИВНОСТЬ И ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ДНК ЯДРЫШКОВЫХ ОРГАНИЗАТОРОВ ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.01.03 -молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

2 2 МАР 2012

Москва-2012 г.

005013343

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук, лаборатории организации генома.

Научные руководители: кандидат биологических наук

Куприянова Наталья Сергеевна

Официальные оппоненты: Носиков Валерий Вячеславович

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией, Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Машкова Тамара Дмитриевна

кандидат химических наук, старший научный сотрудник ИМБ РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Защита состоится « 16 »аррелЯ 2012 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при ИБГ РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте молекулярной биологии им. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, В-334, ул. Вавилова 32.

Автореферат разослан « »4рта 2012 года.

Учёный секретарь Диссертационного совета

кан. фарм. наук ЛС-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Рибосома является одной из самых древних и важных органелл клетки, сохранившей общие черты организации у всех ныне живущих организмов. Гены, ответственные за синтез нуклеиновых кислот и белков, формирующих рибосому, а также гены, обслуживающие процесс работы этих генов, созревание продуктов транскрипции и переход зрелых продуктов в активное состояние, образуют крупнейший полигенный комплекс, от согласованной работы которого зависит жизнеспособность отдельных клеток и всего организма в целом. Центральную роль в этом комплексе занимают гены рибосомной ДНК (рДНК), организованные в кластеры тандемных повторов. 'Мономер состоит из консервативной транскрибируемой области и нетранскрибируемого межгенного спейсера (рМГС), строение которого имеет видоспецифический характер.

Тот факт, что : определенные количества рибосомной РНК (рРНК) необходимы практически во всех клетках организма, делает актуальным изучение механизмов транскрипции рибосомных генов и выявление особенностей организации тех участков рДНК, которые отвечают за регуляцию этого процесса. О получении черновой версии полноразмерной нуклеотидной последовательности генома человека было заявлено в 2000, а завершенной - в 2003 году. Однако неисследованными остались гетерохроматиновые области (около 8% всего генома), к которым относятся центромеры, теломеры и кластеры рибосомных ДНК человека. Это объясняется сложной организацией данных областей и высокой концентрацией повторов в них. По всей вероятности, центромеры, теломеры и кластеры рибосомных ДНК человека будут просеквенированы не раньше разработки новых технологий для изучения первичной структуры ДНК.

Синтез рРНК является этапом, лимитирующим скорость биогенеза рибосом. Скорость работы Pol I подвергается интенсивной регуляции на несколких уровнях. Известно, что эффективность экспрессии генов рРНК у эукариот непосредственно определяется взаимодействием ряда цис- и транс- факторов в предпромоторной области. Скорость пролиферации раковых клеток в опухолях прямо пропорциональна размеру ядрышка и активности Pol I. Сверхэкспрессия пре-рРНК коррелирует с неблагоприятным прогнозом при раке [White, 2008; Montarano et al., 2008].

За последние годы обнаружен ряд эпигенетических факторов, участвующих в регуляции активности рибосомных генов. Обнаружен комплекс, ремоделирующий структуру хроматина в области промотора рРНК (NORC), который не только участвует в формировании гетерохроматина и подавлении транскрипционной активности, но и связывает эти процессы с модификацией гистонов и метилированием de novo [Santoro and

Grummt, 2005; Bernstein and Allis, 2005]. Большую роль в процессе регуляции играют также некодирующие РНК, считывающиеся с рибосомного межгенного спейсера (рМГС) [Mayer et al., 2008; Shiao et al., 2009].

Хотя регуляция транскрипции рРНК представляет собой весьма сложную систему, последние достижения позволяют подойти к пониманию множественных связей между биогенезом рРНК и развитием серьезных заболеваний. Отсюда следует, что изучение организации и полиморфизма рДНК является важной задачей, так как даже небольшие изменения в первичной структуре могут подавлять гены супрессоры, а также активировать онкогены и протеинкиназы, стимулирующие Pol I, и ускоряющие клеточную пролиферацию. Все выше изложенное показывает актуальность изучения структурно-функциональной организации и полиморфизма генов рРНК, играющих важную роль в регуляции их экспрессии.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является поиск и изучение вариаций в первичной структуре рМГС человека и прилежащих к кластеру рДНК областей генома. Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• С помощью ПЦР-амплификации провести анализ участков предпромоторной рДНК, содержащих повторы различных типов.

• Определить уровень и изучить молекулярную природу вариабельности участка LR2 рибосомного межгенного спейсера.

• Из космидной клонотеки хромосомы 13 человека выделить клоны, содержащие рДНК и определить первичную структуру участков, предшествующих кластеру РДНК.

• Определить вероятные «горячие точки рекомбинации» фрагментов области LR1-LR2, с наибольшей вероятностью реализующиеся при рекомбинации в рДНК человека.

Научная новизна и практическая ценность работы.

При изучении полиморфизма предпромоторной области рМГС выявлен феномен образования укороченных рекомбинантных (химерных) молекул ДНК, как следствие преждевременной терминации полимеразной цепной реакции в сложно организованных локусах рМГС человека, содержащих однонаправленные Alu повторы, а также тандемные повторы между ними. Установлены сайты терминации Taq полимеразы на Alu повторах в рМГС человека.

Впервые показан высокий уровень полиморфизма участка 1Л2Уаг в рМГС человека; определена природа изменчивости этих участков, которая связанна с дупликациями, делециями и конверсионными переносами блоков повторов между аллелями.

Показано, что область, предшествующая кластеру рДНК в хромосоме 13 (не менее 7 т.п.н.), гомологична на 84% ранее определенному ортологичному участку из хромосомы 21. Обнаружение высокой консервативности последовательностей, прилежащих к кластеру рДНК со стороны теломеры, в различных ЯОР+ хромосомах указывает на важное значение этих последовательностей для согласованной эволюции генов рРНК и их принадлежность к ядрышковому организатору в совокупности с кластерами рДНК.

Обнаружен новый случай сегментных дупликаций в геноме человека. Показана высокая гомология прителомерного участка (5 т.п.н.) хромосомы 13 с прицентромерным участком хромосомы 19.

Картированы ш бШсо сегменты, высоко гомологичные ЬЮ-1Л2 участкам рДНК, на ЯОР ~ хромосомах, путем их сравнения с полноразмерной последовательностью ДНК генома человека; данные предполагают существование горячих точек рекомбинации в повторах рДНК.

Результаты работы имеют ценность для понимания структурно-функциональной организации генов рРНК человека, природы внутри геномного полиморфизма рДНК и регуляции работы мультигенного семейства рДНК. Полученные рекомбинантные клоны могут быть использованы для решения научных и практических задач по геномике человека, в том числе, при определении роли рДНК в различных патологиях человека. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Москва 3-4 декабря 2007года),

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Структура и объём работы. Диссертация изложена на 96 страницах, включает 18 рисунков, 2 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 224 источников, благодарности, а также приложения.

Результаты и их обсуждение 1. Феномен образования рекомбинантных (химерных) молекул ДНК, как следствие преждевременной терминации полимеразной цепной реакции в локусах содержащих однонаправленные Alu элементы и микросателлитные последовательности.

Рибосомная ДНК содержит практически все типы последовательностей генома, как эволюционно консервативные, кодирующие, так и вариабельные, некодирующие спейсерные области с высоким содержанием повторов различного типа. При рестриктно-гибридизационном анализе повторов рДНК, клонированных в составе космидной клонотеки хромосомы 13 человека, стандартные характеристики получены лишь для части мономеров, значительная же часть клонов рДНК содержала большое число нуклеотидных замен, дополнительные микросателлитные кластеры и делеции различной протяженности [Рысков и др.,1993; Куприянова и др., 1996].

Полученные результаты указывали на то, что геномная рДНК также может обладать значительно большей вариабельностью, чем это представлялось ранее. Структурная организация рДНК человека представлена на (рис.1).

г2 гЗ г1 г4

Рис. 1 Схема строения мономера рДНК. Точками обозначены высоко-консервативные области г1-г4.

Известно, что наиболее вариабельные участки рДНК находятся в районах рМГС, связанных с инициацией и терминацией транскрипции. Описанный полиморфизм обычно проявляется в вариациях числа повторяющихся звеньев в микросателлитных кластерах и в точковых заменах оснований, которые могут приводить к инактивации рестриктных сайтов, ведущей к полиморфизму длин рестриктных фрагментов (ПДРФ).

Для поиска внутригеномного полиморфизма в области, предшествующей точке инициации транскрипции, сначала нами была избрана область между £coRI и ВатШ сайтами, содержащая четыре Alu элемента в различных ориентациях (рис.2). Проводили ПЦР - амплификацию участка, размером около 1,8 т.п.н., ограниченного праймерами РЗ (5'-aatgaaaatgaaaatgaacgca-3') и Р4 (5'-aaagcgaaatgagtcaacag-3'), содержащего однонаправленные повторы А1иЗ и Л1и4. Эти повторы разделены блоком 90 п.н. повторов, которые образованы микросателлитными кластерами (ТССС)„ и (TTGC)„ (рис. 3).

Рис.2. Развернутое схематичное изображение изучаемой области рМГС. Вынесен ВатШ-ЕсоШ фрагмент размером -4,5 т.п.н. Стрелками обозначено расположение и направление А1и- повторов.

г

—>-

Рис. 3 Схема строения и ПЦР-анализа области рДНК, содержащей А1иЗ и А1и4. Положение олигонуклеотидной пробы ОР обозначено треугольником, микросателлитных мотивов звездочкой.

ПЦР-амплификация данной области, проведенная на тотальной ДНК из крови нескольких неродственных индивидов, выявила помимо ожидаемого фрагмента (~ 1,8 т.п.н.) также дополнительный укороченный фрагмент, размером ~ 800 п.н. (рис.4а).

а

б

в

Рис 4. Саузерн-блот анализ ПЦР-продуктов, а-негативное изображение 1,5 % агарозного геля в УФ-свете, б-гибридизация с пробой ОР и в - с пробой (ttgc)4.

Для выяснения природы укороченного фрагмента был проведен блот-гибридизационный анализ полученного ПЦР продукта. Оказалось, что оба фрагмента гибридизуются с олигонуклеотидной пробой OP (5'-ctaggaaatcgccactttga-3'), соответствующей уникальному участку, вблизи праймера PI (рис.4 б).

Однако только фрагмент размером 1,8 т.п.н. гибридизуется со специфической пробой, содержащей микросателлитный мотив (ttgc)4, кластер которого разделяет А1иЗ и А1и4 (рис. 4в). Эти результаты позволяют предположить, что фрагмент, размером 0,8 т.п.н. представляет собой делегированный вариант фрагмента размером 1,8 т.п.н., утерявшего участок между двумя Alu элементами. Вариация условий ПЦР-амплификации (вариация концентрации Mg2+ от 1,5 до 4 мМ и использование разных препаратов Taq-полимеразы) приводила к изменению относительного содержания этих продуктов, но не устраняло полностью укороченный вариант (данные не приведены). Блот-гибридизационный анализ геномной ДНК, гидролизованной £coRI, с олигонуклеотидными пробами, использованными для идентификации этих ПЦР продуктов, не выявил укороченных рестриктных вариантов рДНК. Было высказано предположение, что укороченные ПЦР-продукты образуются in vitro в результате преждевременной терминации полимеразной реакции.

Для проверки этого предположения, были проведены контрольные эксперименты, в которых в качестве матрицы использовали ДНК космидного клона 84АЗ, содержащего рДНК человека и ранее выделенного из клонотеки хромосомы 13 человека (LA13NC01, Los Alamos). Оказалось, что и в этом случае амплифицируются два фрагмента ДНК -1,8 т.п.н. и 0,8 т.п.н. Это означает, что укороченный фрагмент ДНК действительно образуется как побочный продукт ПЦР-амплификации, и причиной этого может быть преждевременная терминация реакции полимеризации.

Для определения структуры укороченного фрагмента проводили его клонирование в pGEM T-Easy вектор, отбирали клоны, дающие положительные сигналы со специфической олигонуклеотидной пробой ОР, и секвенировали вставки рекомбинантных клонов. Оказалось, что в укороченном амплификанте отсутствует один Alu элемент и последовательность в 700 п.н., разделяющая АШЗ отА1и4.

Известно, что степень отличия А1иЗ и А1и4 из рМГС человека составляет 25% [Gonzalez et al., 1989]. Наличие в А1иЗ и А1и4 специфических нуклеотидных вариаций позволила нам выявить химерную (рекомбинантную) структуру Alu-повтора в 0,8 т.п.н. фрагменте, (рис 5)

TGTAATCCCAGCACTTTGGGAGG 1) GGACGAGGCTGGGCGCGGTTGCACGCCTGTCATCCCAGCACTTTGGGAGGCTAAGGCAGGCGGAC-65

2 ) GGCCGGGCACGGGCGC------ACGCCCGTCATCCCAGCACTTCGAGAGGCTAAGGCAGGCGGÄC

3) GGCCGGGCACGGTÇGT—

1) CACCTGAGGTTGGGAGTGGGAGACCAGCCTGACCAACATGGAAAAACACC—GTCTCTACTAAAA-12 8 2 ) CACCTGAGGTTGGGAGTGGGAGACCAGCCTGAACAACATGGAAAAACACC—GTCTCTACTAAAA 3) CACÄGGAGGTCG^CÄGTTGGAGACCAGCCTGAGCAACATGGAGAGACACGGCGTGCCTACTAA

1 ) GTACAAACATCAGCCA-----GCACGGTGGCCCATGCCT----GT-AATCCCAGCTAATCAGGAG-183

2 ) GTACAAACATCAGCCAAGCCAGCACGGTGGCCCATGCCT----GT-AATCCCAGCTAATCAGGAG

3) ACACAAACATCAGÇÇ^GCÇM^

1) GCT-GAGGCAGGAGÄÄTCGCTTGAACCTGGGAGGCGGÄGGGTGCGGTGAGCCGÄGATCGCGCCAT-247

2) GCT-GAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCTGGGAGGCGGAGGGTGCGGTGAGCCGAGATCGCACCAT

3 ) GCTGGAGGCAGGAGÄAGCGCTCGAACCCGGGAGGCGGÄAGGTGCGGTGAGCCAAGATCGCGCCAT

1) TGCCCTCTAGCCTGGGCAACAAGAGTGAAACTCTGTCTCAAAAAAAAG -295

2) TGCCCTCTAGCCTGGGCAACAAGAGTGÄAACTCTGTCTCAAAAAAAA , 3 ) TGCACTCTAGCCGTGGAAACAAGAGTGAAACTCTGTCTCAAAA

Рис.5 Сравнение рекомбинантного Alu 0,8 т.п.н. фрагмента с известными вариантами А1иЗ и А1и4 из рМГС человека. Строки 1-3: АШЗ, химерный Alu, Alu4. Номера справа возле 1 строки соответствует позициям нуклеотидов в А1иЗ. Жирным шрифтом выделены нуклеотиды характерные для A lui и А1и4, черточками - делеции. Светло-серым цветом отмечен АШЗ темно-серым А1и4. Положение последовательности Alu - "соге" показано над верхней строкой.

Анализ нуклеотидной последовательности рекомбинантного Alu-повтора показывает ее идентичность с А1и4 от 5'-конца до нуклеотида С52, и последующее ее совпадение с А1иЗ, начиная от нуклеотида Т53 (рис. 5). Это означает, что Alu в составе укороченного ПЦР фрагмента состоит из половинок АШЗ и А1и4. По-видимому, досрочная терминация происходит на матрице АШЗ, и синтез останавливается на нуклеотиде 47-52 при элонгации праймера Pl. С уверенностью можно сказать, что с нуклеотида С53 наблюдается гомология между рекомбинантным (химерным) продуктом и АШЗ, более точно сказать сложно так как от нуклеотида G47 до нуклеотида С52 АШЗ и

Alu4 не отличаются по первичной структуре. В случае отжига любого из вариантов преждевременно терминировавших последовательностей с гомологичными участками А1иЗ при последующей достройке может образовываться наблюдаемый нами рекомбинантный (химерный) продукт. Это может происходить по схеме на (рис.6).

Оставалось неясным, является ли обнаруженный феномен спецификой для данного участка рМГС. Поэтому эксперимент, аналогичный выше описанному, был проведен нами на соседней области рМГС, ограниченной праймерами PI (5'-gttactctgaaaacggaggc -3'), Р2 (5'-gttgcgtttcattttcattttca -3'), содержащей однонаправленные повторы Alul и А1и2 эти повторы разделены 93 п.н., которые образованы AT обогащенными последовательностями и микросателлитным кластером (ТАСА)П. Повторы Alul и А1и2 в этом участке рМГС имеют направление, противоположное направлению повторов А1иЗ и А1и4 (рис.3). При ПЦР-амплификации этой области также было получено два продукта 1 и 0,6 т.п.н. Секвенирование этих продуктов показало химерную природу укороченного варианта (данные не преведены).

Таким образом, феномен преждевременной терминации ПЦР, в определенных участках Alu, с образованием делегированного (укороченного) продукта показан для двух зон рМГС, содержащих как однонаправленные Alu, так и микросателлитные повторы между ними.

Полученные данные находятся в соответствии с литературными, в которых отмечалось, что амплифицированный продукт не всегда может точно отражать структуру нативной ДНК. В частности, при амплификации сегментов, образованных мультигенными семействами, авторы наблюдали появление, кроме ожидаемых, дополнительных продуктов амплификации [Bradley and Hillis, 1997], [Scharf et al., 1987], [Bradley et al., 1993] Эти авторы сделали предположение, что подобные продукты могут возникать за счет того, что укороченные копии амплифицируемой ДНК гибридизуются с альтернативной гомологичной матрицей и выступают в качестве праймеров в последующих циклах амплификации. Однако природа укороченных продуктов ими не была определена.

Праймер

Alu 1(3)

Alu 2(4)

ШШШШШШШШШЙ!

Праймер Alu 1(3) / Alu 2(4)

Рис 6. Предполагаемая схема образования укороченного ПЦР-продукта.

В наших экспериментах было впервые показано, преждевременная терминация происходит в определенной точке Alu элементов. Этот феномен был показан при ПЦР-амплификации двух независимых участков рМГС, имеющих сходную структурную организацию и был также воспроизведен при амплификации аналогичного участка рМГС в составе космидного клона.

Остается неясной причина преждевременной терминации ПЦР внутри Alu повторов, ведущей к появлению рекомбинантных продуктов. Вполне вероятно, что наиболее консервативный участок Alu (Alu - "core"), будучи частью Poüll промотора, может иметь повышенное сродство к Taq полимеразе, тормозить ее движение вдоль цепи ДНК и тем самым вызывать явление преждевременной терминации in vitro, которое ведет к появлению неполноразмерных амплифицированных продуктов.

Очевидно, что описанное нами явление необходимо учитывать в исследованиях по сравнительной геномике, когда используется ПЦР-амплификация участков, содержащих сложно организованные повторяющиеся элементы генома, и требуются дополнительные доказательства существования аллельных вариантов при образовании более одного амплификанта.

2. Природа гетерогенности сегмента 1Л<2уаг рМГС человека.

рМГС человека содержит в своей центральной части два крупных повтора (~2 т.п.н.) ЬМ и гомологичных между собой на 90% (рис. 7), каждый из которых включает большого числа микросателлитов.

праймер2

Рис.7 Расположение LR1 и LR2 в повторе рДНК. Вынесено подробное строение LR2.

Нами изучался внутригеномный полиморфизм участка LR2, обогащенного поли (G)n- и (AG)m- кластерами, обозначенного нами как LR2var. В первой серии экспериментов проводили ПЦР-амплификацию этого участка с праймерами П1 (5'-ttctgtcagtctgtcagacac-3') 22764-22786 и П2 (5'- gaaacccccctgactcaggtcaag -3') 23523-23500 на суммарной клеточной ДНК одного индивида. Продукт амплификации, размером ~ 750 п.н., клонировали в векторе pGEM-T Easy. В результате получили 35 рекомбинантных клонов. Секвенирование этих клонов показало высокую гетерогенность клонированных участков LR2var.

В последующих экспериментах проводили амплификацию LR2var, используя ДНК 10 неродственных индивидов. Всего было клонировано и секвенировано 689 копий сегмента LR2var, с координатами 22763-23523, полученных из геномов десяти индивидов. Сравнение последовательностей также выявило их высокую гетерогенность и специфические особенности строения.

Центральную часть LR2var занимают протяженные кластеры (G) „ (AG) m. Значения 'п' и 'несущественно варьируют между копиями LR2var в интервале 'п'- от 5 до 12 и 'т'от 13 до 27, соответственно, при случайных комбинациях 'п' и 'т'. Варианты (G) 8-ци (AG) 18.20 наиболее часто встречаются в тотальной выборке (таблица 1).

Таблица 1. Представленность вариантов 1Л2уаг по группам. Цветом выделены участки характерные для групп: светло-серый- вариант А, серый -вариант В и темно-серый -участки гомологии с ЬШ. Часть минорных вариантов в группах «А» и «В» не представлены.

варианты группы «А»

(G)7 AGAAGAGñGG (G)7 AGAAGAGAGG (G)7 AGAAGAGAGG (G)7 AGAAGAGAGG (G)7 AGAAGAGAGG (G)7 AGAAGAGAGG (G)7 AGAAGAGAGG (G)7 AGAAGAGAGG (G)7 AGAAGAGAGG (G)7 AGAAGAGAGG CG)7 AGAAGAGAGG (G)7 AGAAGAGAGG (G)7 AGAAGAGAGG 567 (82,3%)

(AG)7 AC (AG)7 AC (AG)7 AC (AG)7 AC (AG) 6 AC (AG) 6 AC (AG)6 AC (AG)7 AC (AG)7 AC (AG) 7 AC (AG)7 AC (AG)5 AC (AG) 7 AC

(G) 4 (G)4 (G) 4 <G)4 (G) 4 (G) 4 (G)4 (G) 4 (G) 4 (G) 4 (G) 4 (G) 4 (G)4

AGAGA(G)6 AGAGA(G) 6 AGAGA(G)6 AGAGA(G)6 AGAGA(G)6 AGAGA(G)6 AGAGA(G)6 AGAGA(G)6 AGAGA(G)6 AGAGA(G)6 AGAGA(G)6 AGAGA(G)6 AGAGA(G)6

AGA (G)n (AG) Ш

AGA (G)n (AG) Ш

AGG (G)n (AG) rrt

AGG (G)n (AG)rn

AGA (G)n (AG)m

AGA (G)n (AG)m

AGG (G)n (AG)m AGAGA(G)n(AG)m

AGA (G)n (AG)Ш

AGA ¡G)n (AG)rc

AGA (G)n (AG)m

AGA (G)n (AG) m

AGA (G) П (AG)m

AAAGAGAAGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC - 3 3 4 AAAGAGATGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-114 AAAGAGAAGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-4 6 AAAGAGATGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-21 AAAGAGAAGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-12 AAAGAGATGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-9 AAAGAGAAGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-6 AAAGAGAAGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-4 GAGAGAGATGTAAAACCAAACACCACCTCCTTGACC-2 AAAAGAGATGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-2 AAAAGAGAAGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC- 2 AAAGAGATGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-2 AAAGAGATGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGATC-2

варианты группы «В»

¡G)6 AGAAGAGAGG (AG) 7 AT (G) 4 AGG------------------(G) n

(G) 6 AGAAGAGAGG (AG) 8 AT (G) 4 AGG------------------(G) XI

(G) 6 AGAAGAGAGG (AG) 8 AT (G) 4 AGA--------------(G>n

ÍG)6 AGAAGAGAGG (AG) 8 AT <G¡ 4 AGG------------------(G) n

(G) 6 AGAAGAGAGG (AG) 9 AT (G) 4 AGG------------------(G) n

(G)6 AGAAGAGAGG (AG) 9 AT (G) 4 AGA------------------(G) n!

(G)6 AGAAGAGAGG (AG) 9 AT (G) 4 AGG------------------(G) n

(G) 6 AGAAGAGAGG (AG) 9 AT (G) 4 AGA-----1--------(G) n

(G) 6 AGAAGAGAGG (AG) 9 AT (G) 4 AGG------------------(G)n

(G)6 AGAAGAGAGG (AG) 9 AT (G) 4 AGA.------------------(G)n

(G) 6 AGAAGAGAGG (AG) 9 AT (G) 4 AGG------------------(G)n

(Si 6 AGAAGAGAGG (AG) 9 AT (G) 4 AGA------------------(Gí n

(G) 6 AGAAGAGAGG (AG) 10AT (G) 4 AGG—------------(G) n

(G) 6 AGAAGAGAGG(AG) 10AT (G) 4 AGG------------------(G) n

85 (12,3%)

(AG)m ------AAGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-3

(AG)m ------ATGTAAAACCAAACACCACCTCCITGACC-2

(AG) в -------TGTAAAACCAAACACCA.CCTCCTTGACC-2

(AG)SI ---AAGTAAAACCAACCACCACCTCCTCCTTGACC-2

(AG) m ------AAGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC - 9

(AG) m ------AAGTAAAACCAAACACCACCTCCTTGACC-5

(AG) m ------AAGTAAAACCAAACACCACCTCCTTGACC-3

(AG)m ------AAGTAAAACCAAACACCACCT CCTTGACC- 5

{AG) Ю — —AAGTAAAACCAAACACCACCtCCTTGACC-15

(AG) m -------TGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC- 3

(AG)» . -------TGTAAAACCAAACACCACCTCCTTGACC-2

(AG) m -------TGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-2

варианты группы «А»+«В»

(G)7 AGAAGAGAGG(AG)7 AC (G) 4 AGAGA(G)6 AGA ÍG) (AG) m ------AAGTAAAACCAACCÁCCACCICCITGACC- ■5

(G) 7 AGAAGAGAGG(AG)7 AC (G) 4 AGAGA(G)6 AGA (Gj ri." (AG) m ----—ATGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGÁCC - ■2

(G) 7 AGAAGAGAGG(AG) 7 AC (G) 4 AGAGA(G)6 AGG (G) n (AG) m ------ - AGTAAAACCAAACACCACCTCCTTGACC - ■1

(G)7 AGAAGAGAGG(AG)7 AC ÍG) 4 AGAGA(G)6 AGG (G) r. (AG) m ------AAGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC - ■1

(G)7 AGAAGAGAGG(AG)7 AC (G) 4 AGAGA(G)6 AGA (G) n (AG) irt ------AAGTAAAACCAAA.CACCACCTCC'rTQACC'- ■1

(G) 7 AGAAGAGAGG(AG)7 AC (G) 4 AGAGA---— -- (G) n (AG) m AAAGAGAAGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC- ■1

(G)7 AGAAGAGAGG(AG)7 AC (G)4 (G) n (AG) m r~'--- -ATGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGÁCC - -1

(G) 7 AGAAGAGAGG(AG)7 AC (G) 4 SGG------- -- ' ÍG) n. (AG) ra ------AAGXAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC- 1

(G)7 AGAAGAGAGG(AG)7 AC (G) 4 AGA------- (G) a (AG)IR AAAGAGATGTAAAACCAAÜCACCACCTCCTTGACC- ■1

(G) 6 AGAAGAGAGG (AG) 7 AT (G)7 AGG------— (G) n (AG) m AAAGAGATGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-1

ÍG) 6 AGAAGAGAGG (ÁG) 9 AT (G) 4 AGA-------— (G) n (AG; m AAAGAGATGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-1

(G) 6 AGAAGAGAGG (AG) 10AT (G) 4 AGAGA (G) 6AGA (G) n (AG)m -----;-ATGTAAAACCAAACACCACCTCCTTGACC-l

(G)6 AGAAGAGAGG(AG)IOAT (G)4 AGAGA(G)6AGG (G)n (AG)m ATGTAAAACCMACACCACCTCCTTGACC-1

\(G) 7. AGAAGAGAGG (AG) 8 AT (G) 4 AGAGA (G) 6AGA (G) n (AG) ffl AAAGAGAAGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-2

(G) 7 AGAAGAGAGG (AG) 9 AT (G) 4 AGA-~—----1 (G) n (AG)jn AAAGAGAAGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-1

(G)7 AGAAGAGAGG (AG) 9 AT (G) 4 AGG------------------(G)n (AG)m AAAGAGAAGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-1

(G) 7 AGAAGAGAGG (AG) 9 AT (G) 4 AGAGA (G) 6AGA (G) n (AG! m --------GTAAAACCASACACCACCTCCTTGACC-l

(G)7 AGAAGAGAGG(AG)10AT (G)4 AGG------------------(G) П (AG)m AAAGAGAAGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-1

(G)8 AGAAGAGAGG(AG)6 AT (G)4 AGAGA(G)6AGA (G)n (AG)m AAAGAGATGTAAAACCAACCACCACCTCCTTGACC-1 25 12,75%)

варианты группы «С»

(G)7 AGAAGAGAGG(AG)25-(G) 7 AGAAGAGAGC (AG) б

(G)7 AGAAGAGAGG(AG)25 -----------------------------------

(G)б AGAAGAGAGG(AG)32* ---------------------

(G16 ---AGAGAGG(AG)12

(G)б AGAAGAGAGG(AG)9 AC

(G) 6 AGAAGAGAGG (AG) 7 ATAGATAGAGAGA (G) 6----------(AG) 31

(G) 6 AGAAGAGAGG (AG) 7 ATAGATAGAGAGA (G) 6----------(AG) 31

(G)7 AGAAGAGAGG(AG) 7 AC(G)4AGAGA(G)6AGA (G)10(AG)13-(G) 7 AGAAGAGAGG (AG) 7 ACGG (AG) 4AT (G) 4AGG (G) 9(AG>25

(G) 6 AGAAGAGAGG (AG) 10 ------------------------------------------

(G) 7 AGAAGAGAGG (AG) 7 AC (G) 4 AGAGA (G) 6 AGA (G)n (AG) m

12 (1,75%)%

- — AAGTAAAACCAACCACCACCTCCTÍGACC-1

- — AAGTAAAACCAAACACCACCTCCTTGGCC-1 -----------------— --CCTCCTTGACC-i

Рис. 8 Схема строения ЬК2таг. Цифрами обозначены точковые замены на основании которых происходило деление на группы.

Для систематизации последовательностей, фланкирующих центральный кластер, их сравнивали без учета варьирующих значений 'п' и 'т' , в результате чего сегменты были подразделены на 4 группы на основании нуклеотидной замены в положении - 17, где возможны С или Т (Рис.8). Группа А наиболее многочисленна, представлена 13 вариантами и включает 567 из 689 проанализированных последовательностей, что составляет 82,29%. Наиболее представлен вариант 1 включающий 334 последовательности. В группу В попали 14 вариантов последовательности 1Л2таг (12,33%). Наиболее распространенный вариант представлен 15-ю копиями. Также следует отметить, что группа В отличается от группы А, в большинстве случаев делециями во фланкирующих областях кластера (й) „ (АО) ш в положении от -12 и до +7-9.

К группе А+В были отнесены последовательности, содержащие в своем составе участки, характерные как для А, так и для В (в таблице 1 выделены различной окраской). Следует отметить, что их число невелико. Наиболее представленный вариант состоит из 5'-части последовательности А и З'-от В, и встречается 5 раз.

Группа С наименьшая - 12 вариантов (1,75%). В нее попали варианты в большинстве своем содержащие участки гомологии с ЬЦ.1 см. диаграмму 1.

Диаграмма 1 Представленность вариантов групп А, В, А+В и С в выборке из 689 последовательностей.

Как видно из диаграммы, наиболее представлены нуклеотидные последовательности группы А, которые практически идентичны (без учета варьирующих

значений 'п' и 'т' в центральном кластере) ортологичному участку из последовательности ОепеВапк Ш3369.

В группе В (12,3%, от всех обнаруживается гетерогенность до и после

центрального кластера (0)„ (АО)т (Табл.1). Фланкирующие участки с 5'-конца у последовательностей группы В включают вариабельные кластеры (в) 6-8 и (АС) 6-ю, одну замену С->Т в фиксированном положении -17 и короткие делеции перед кластером (0)„ (АО) т. Для 3'- фланкирующей области характерны делеции, примыкающие к центральному кластеру (О) п (АО) ш и замещения оснований в фиксированных позициях +8, +19 и+34.

Последовательности группы С (1,75% от всех 1.1^.2сильно отличаются от таковых из групп А и В. Три варианта не содержат центрального кластера (О) „ (АО) т . Вместо этого, первый кластер (АО) 6-ю, характерный для аллелей В, расширен до значений (Ав) 18-32 и часто содержит замены О С. (обозначены звездочкой в таблице 1). Четыре последовательности в своем составе имеют группу нуклеотидов отличающихся от канонического состава 1Л2. 3'- фланкирующая последовательность содержит замещения оснований, делеции и инсерции. Сравнение последовательностей ЬК2уаг с ортологами из ЬШуаг (ОепеВапк, Ш3369) часто обнаруживает идентичные замещения оснований. Это с высокой вероятностью позволяет предположить фрагментный обмен 1Л11 с Ы12 и/или вставку сегментов ЬЮ в 1Л2.

Различия между нуклеотидными последовательностями, фланкирующими центральный блок микросателлитов (й) „ (АО) т в группах А-С могли возникнуть в результате кроссинговера и мозаичных межаллельных переносов. В группах А и В, были выделены варианты 1Ж2пх объединяющие в себе характерные особенности обеих групп. Их число невелико, что позволяет предположить, что рекомбинации в центральной части ЬЯ2уаг являются весьма редким событием.

Мини-группа С ЬЯ2Уаг лишена центрального (О) „ (Ай) ш кластера, тогда как предшествующий кластер (АО) 6-ю расширен до значений (АО) 18-зг- В 3'- части последовательностей С-группы содержатся замены, характерные для ЬЮ. Соответствующее выравнивание позволяет предположить, что варианты С возникли в результате генной конверсии между Ы11 уаг и Ь112уаг. В кластере (Ай)7 могли возникнуть двуцепочечные разрывы, аналогичные тем, которые описаны для минисателлитов [Виап! Д., е1 а1.„ 2000; 1е£1геу8 АЛ., Мау С., 2004], с последующей достройкой выступающих однонитчатых концов, приводящей к внедрению ЬШ подобных участков. Предполагаемое внедрение участка ЬЮ в аллели С2 и С5 начинается с нуклеотида -17. Конечную точку внедрения определить сложно в виду идентичности двенадцати 3'-

концевых нуклеотидов в LR.Uk и ЬК2%аг(таблица 1). Таким образом, можно предположить, что выраженная гетерогенность 1Л2 может возникать по нескольким механизмам, включающим дупликации, делеции и конверсионный перенос блоков повторов между аллелями.

Интересно отметить, что вся область ЬК2уаг вплоть до позиции +11 на Рис. 8 состоит из пуринов, за исключением С/Т в позиции -17. Поскольку во всех случаях за С/Т следует в, есть основания полагать, что «Т» возникают в результате деметилирования 5-МеС в Срв.

Таким образом, нами обнаружен высокий уровень внутри- и межгеномного полиморфизма участка в составе рМГС человека. Его вариации связаны с

микросателлитной изменчивостью, инсерциями/ делениями, с точковыми мутациями (нуклеотидными заменами) и фрагментными обменами между 1Л1 и 1.112.

3. Анализ т $Шсо горячих точек рекомбинации, связанных с рДНК.

Описанная выше высокая гетерогенность ЬЯ2таг может быть связана с повышенной частотой рекомбинационных событий в области ЬШ-1Л*2 рМГС. В этом случае фрагменты данной области можно было бы обнаружить в различных ЯОР хромосомах. Мы провели поиск наличия 1ЛИ-1Л2 фрагментов рДНК ¡п вШсо в различных хромосомах человека. Такие фрагменты различного размера со средней степенью гомологии ~80% были обнаружены на нескольких хромосомах. Распределение концевых участков фрагментов рДНК может соответствовать положению горячих точек рекомбинации в рДНК.

Было обнаружено, что участки, гомологичные области 1Ли-ЬК2, наиболее часто встречаются на ЯОР- хромосомах 2-10 раз, на хромосоме 12-5 раз, а также на хромосомах 3, 6, 19 и на половых хромосомах среди гипотетических транскрипционных факторов.

При изучении последовательностей, окружающих горячие точки рекомбинации, оказалось, что наиболее часто они представлены микросателлитами типа (ТС)П , (ТС)П , поли АТ - последовательностями, а также вблизи них часто встречаются последовательности, потенциально способные образовывать квадруплексы согласно формуле Ох№Ох>1ЬОхМсОх, где х - число в оснований в каждом й-тракте, из четырех, формирующих тетраду.

4. Сегментная дупликация прилегающих к рДНК участков генома человека.

Следующей задачей нашей работы являлась характеристика ранее не изученных

участков, дистальных по отношению к кластеру рДНК (рДО) хромосомы 13 человека. Для экспериментов использовали клонотеку рекомбинантных космид LA13NC01, полученную из хромосомы 13 человека, очищенной на хромосомном сортере. Клонотека состояла из 16896 отдельных клонов, что соответствует четырем эквивалентам ДНК хромосомы 13 человека. Использовали фильтры с упорядоченной панелью клонов, ранее изготовленные в лаборатории Н.К. Янковского (ИОГен) и любезно предоставленные нам для работы. Отбор соответствующих клонов проводился с помощью гибридизации с пробой DJU-R [Gonzalez and Sylvester, 1997], специфичной для рДО акроцентрических хромосом человека и высших приматов. Из 1500 клонов семь дали положительный сигнал, причем у двух (92Е7 и 82F6) ярко выраженный, и значительно слабее у клонов 84АЗ, 91D10, 86G5, 76G2 и 123С5. Блот-гибридизационный анализ ДНК этих клонов с пробой DJU-R подтвердил специфичность гибридизации колоний для 92Е7 и 82F6 (рис.9).

Последовательная гибридизация EcoRI-фрагментов ДНК с пробами, специфичными для значащих областей рДНК, показала, что 3'- конец вставки клона 82F6 локализован в 18S рДНК, а З'-конец вставки клона 92Е7 находится в области 28S рДНК (рис.10). Это позволило предположить, что протяженность фрагмента рДО в клоне 82F6 больше, чем в 92Е7. Таким образом, клон 82F6 оказался наиболее перспективным для изучения прителомерной зоны, соседствующей с кластером рДНК.

Отобранные клоны были охарактеризованы также с помощью FISH на метафазных хромосомах. Работа производилась О.В. Муравенко из Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

ДНК клонов 82F6 и 92Е7, как и следовало ожидать, хорошо гибридизовалась с рДНК в прителомерных областях всех акроцентрических хромосом (данные не преведены).

Поскольку размер космидной вставки 82F6 составляет ~30 т.п.н., а один из ее концов картирован нами в зоне 18S рДНК, можно было ожидать, что эта вставка простирается вглубь прителомерной зоны. Секвенирование ДНК клона 82F6 проводили, используя в качестве праймеров DJU-R и произвольно выбранные олигонуклеотиды по ходу секвенирования. Ранее был секвенирован участкок 8.3 т.п.н., дистальный относительно кластера рДНК в хромосоме 21 (acc.no.U67616) [Gonzalez and Sylvester, 1997]. Нами была показана высокая гомология (98 %) между участком клона 82F6 из хромосомы 13 и 1700 п.н. 5'- концевого участка 8.3 т.п.н. хромосомы 21 человека и выйти за пределы этого участка в направлении теломеры. Было просеквенировано еще 3500 п.н. (Асс. Nu.AF478540) в ранее не изученной прителомерной зоне.

urn 1 2 3 4 5 6 7 8

1.6— « «

Рис. 9 Блот-гибридизационный анализ ДНК клонов с пробой DJU-R. 1-92Е7, 2-82F6, 3-84A3, 4- маркер, 5-91D10, 6-86G5, 7-76G2 и 8-123С5.

1 2 3

хан 3.JL ш. TILH ——

12— 12=

Ф «

6 — 5 — тф 6 — 5 — 5 —

4 — 4 — 4 —

3 — 3 — 3 —

2 — 2 — 2 —

1.6 — 1.6 — 1.6 —

1 — I — 1 —

Рис.10 Картирование концов вставок клонов 82F6 и 92Е7, гидролизованных эндонуклеазой EcoRI. 1-гибридизация с пробой г2, 2-е пробой гЗ и 3- с пробой rl (см. рис.1).

Поиск в базе данных показал, что определенная нами нуклеотидная последовательность обладает значительной гомологией (83-84%) с ВАС-клоном из хромосомы 19 (Acc.nu. АС006504), расположенным наиболее близко к центромере из всех секвенированных на сегодня клонов.

Кластеры рДНК образуют мультигенные семейства и при этом располагаются на ЯОР+ хромосомах человека перед теломерами. Полноразмерный повтор рДНК человека был секвенирован сравнительно давно [Gonzalez and Sylvester, 1995]. Нами выявлена высокая гомология (98%) рДО хромосом 13 и 21 на протяжении более 1700 п.н. и определена последовательность еще ~ 3300 п.н. в направлении теломеры. Обнаружена протяженная область гомологии (81-84%) между прителомерными областями хромосом 13 и прицентромерным участком хромосомы 19, а также «перемежающаяся» гомология между прителомерным и прицентромерным участками хромосомы 13.

Проведенное нами сравнение последовательности рДНК человека с полноразмерной последовательностью генома человека выявляет на ЯОР~ хромосомах большое число участков с высокой (в среднем, 80% гомологией) средней длины 1-1,5 т.п.н. Особенно часто на ЯОР~ хромосомах присутствуют фрагменты последовательностей, гомологичные тем, которые предшествуют кластерам рДНК как это показано на (рис.11). Возможно, это говорит о частых перестройках генома, в которых участвуют области ЯОР+ хромосом, дистапьных по отношению к кластерам рДНК.

12 3

в 3 12 П 12 13

Лш

•Г I

К 111

I Г

-1™ :§ • I I I

X ^ МТ по*р1асеа

Рис. 11. Фрагменты, предшествующие рДНК человека, повторяющиеся на ЯОР хромосомах. Штрихи, перпендикулярные «телу» хромосомы, обозначают участки, гомологичные тем, которые встречаются перед кластерами рДНК на хромосоме 13 Цвет штрихов отражает размер сегментов. Светло серый - от 50 до 80 н., серый- от 80 до 200 н., и темно-серый - больше 200 н. Чрезвычайно высокая плотность фрагментов с высокой степенью гомологии на большинстве хромосом свидетельствует в пользу ранее сделанного заключения о том, что участки, предшествующие кластерам рДНК, часто вступают в рекомбинации с различными хромосомами.

Можно было ожидать, что рДО, представляющие собой уникальные нуклеотидные последовательности на акроцентрических хромосомах, эволюционируют независимо друг от друга. Вместо этого обнаружена высокая межхромосомная гомогенность в районе рДО, а небольшие вариации свойственны в равной степени как гомологичным, так и негомологичным хромосомам, что напоминает ситуацию, характерную для наиболее консервативных значащих областей рДНК, в эволюции которых преобладают частые внутри- и межхромосомные рекомбинации. По всей видимости, истинной причиной консервативного характера рДО акроцентрических хромосом является активная независимая их гомогенизация, аналогичная процессу для значащей и рег^ляторной областей генов рРНК.

В настоящее время намечается тенденция к пересмотру основных концепций эволюции геномной ДНК. Общепринятый взгляд на эволюцию генома до сих пор базировался на постулатах о неизменности его общего строения, на фоне которого происходило лишь не более одной крупной реорганизации за 10 млн. лет [Bailey J.A., et al„ 2002], [Melford H.C., Trask B.J. 2002 ].

Теперь же в результате реализации программы "Геном человека" появились свидетельства беспрецендентно высокой частоты сегментных дупликаций в ходе эволюции приматов, т.е. за последние 35 млн. лет [Bailey J.A., et al., 2002]. Сегментные дупликации представляют собой дупликативную транспозицию геномной ДНК, размером от одной до сотен т.п.н. при среднем значении гомологии 95.5%. Дупликации могут существовать в виде тандемов, [van Geel Mat., et al., 2002] но чаще они рассеяны по геному и бывают как внутри-, так и межхромосомными. Межхромосомные дупликации предпочтительно локализуются в прицентромерных и прителомерных областях хромосом. Анализ черновой версии генома показал, что прицентромерные области обогащены межхромосомными дупликациями не менее чем в 4.5 раза, а прителомерные - не менее чем в 2.7 раза [Murphy W.J., et al., 2001]. Структура и эволюция наиболее значительных по размеру (>1 т.п.н ) и степени гомологии ( >90%) сегментных дупликаций хромосомы 22 подробно рассмотрены в [Bailey J.A., et al., 2002]. Один из самых интересных результатов этой работы - обнаружение на хромосоме 22 человека участка, для которого не найдено дупликонов на хромосомах высших приматов, и именно этим участком заканчивается расшифрованная на сегодняшний день нуклеотидная последовательность в прицентромерной области хромосомы 22. Это позволяет думать, что самые молодые дупликоны расположены наиболее близко к центромерам.

Наши данные о гомологии между рДО хромосомы 13 и областью 19ql2 и возрастанию этой гомологии в хромосоме 13 в направлении теломеры вносят вклад в изучение дупликативной транспозиции ДНК и, тем самым, в развитие общей картины эволюции генома. Представляет интерес то, что протяженный участок гомологии (~2 т.п.н.) обнаружен именно между прителомерным и прицентромерным участками негомологичных хромосом (рис. 12)

Хромосома 13 (13р13)

Рис.12 Схематическое сравнение фрагмента рДО хромосомы 13 человека с гомологичным участком ВАС- клона, содержащего прицентромерную область хромосомы 19 человека.

Таких случаев описано немного. Наиболее известный из них - участки, специфичные для хромосомы 22 и других акроцентрических хромосом, в локусе 2рИ [Horvath J., et al., 2000]. Общепризнано, что эта гомология обусловлена слиянием концов двух предковых форм (синтенных хромосомам 12 и 13 шимпанзе) около 5 млн. лет назад, что и привело к возникновению хромосомы 2 человека [Ijdo J., et al., 1991], [Luke S., Verma R.S. 1992]. Высокоповторяющиеся и паралогичные участки 4q24 и 4q35 в виде мозаичных вкраплений присутствуют на коротких плечах акроцентриков и в прицентромерных и прителомерных областях различных хромосом [Piccini I., at al. 2001]. Недавно при изучении прителомерных дупликаций у гоминоидов обнаружено, что копия, филогенетически ортологичная прителомерному участку хромосомы 1 человека (HSAlq42.3), у бабуина локализована в прицентромерном пространстве (PHA lq) [van Geel Mat et al., 2002]. Можно предположить, что снижение порога степени сходства до 80-90% при поиске гомологичных нуклеотидных последовательностей расширит число выявленных дупликаций за счет более древних.

Степень гомологии между рДО хромосом 13 и 21 и прителомерной областью хромосомы 19 относительно невысока (от 81 до 84%), что, по-видимому, указывает на древний ("доприматный") возраст дупликации. Обе нуклеотидные последовательности гомологичны последовательности Alu ретропозона, что говорит о его присутствии в данной области еще до дупликации. Интересно, что пока участок прицснтромерной области хромосомы 19 подвергался независимой дивергенции, гомологичные участки в рДО почти всех акроцентрических хромосом эволюционировали согласованно, что

предполагает эволюционное давление, а, следовательно, и важное функциональное значение поддержания консервативности рДО.

За последние несколько лет получено чрезвычайно много новых данных не только о механизмах регуляции экспрессии рРНК, но и о строении как ядрышка в целом, так и его многочисленных субструктур. Полученные результаты позволили назвать ядрышко клеточным сенсором, т.к. многие реакции в ответ на внутренние и внешние стрессы затрагивают его в первую очередь. Поскольку модуляция синтеза рРНК является ведущим фактором в скорости образования зрелых рибосом, любой, даже незначительные вариации в структуре рДНК (например, БИР) могут оказывать серьезное влияние на активность рибосомного синтеза и, следовательно, нуждаются в специальном изучении.

выводы

1. Показана консервативность двух сложно-организованных локусов рМГС человека вблизи промотора генов рРНК, содержащих однонаправленные Л/и-повторы и тандемные повторы между ними. Обнаружен феномен образования укороченных рекомбинантных (химерных) молекул ДНК при ПЦР-амплификации этих локусов в результате преждевременной терминации Taq-пoлимepaзы в определенных участках Л/к-повторов.

2. Обнаружен гипервариабельный участок Ы121аг в центральной части рМГС человека. Установлено, что гетерогенность 1Л^2Уаг определяется микросателлитнои изменчивостью, как следствие репликативных ошибок, однонуклеотидными заменами, инсерциями/делециями небольших участков и конверсионными обменами между 1Л2 и ЬШ.

3. Показана высокая гомология прителомерного участка (5 т.п.н.) хромосомы 13 с прицентромерным участком хромосомы 19.

4. С помощью анализа ш вШсо установлены возможные «горячие точки» рекомбинации в рДНК и оценена представленность фрагментов области 1Л11-1Л12 на различных хромосомах человека.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

[1] ОБНАРУЖЕНИЕ РЕКОМБИНАНАТНЫХ ПРОДУКТОВ ПРИ ПЦР-АМПЛИФИКАЦИИ ДНК, СОДЕРЖАЩЕЙ ОДНОНАПРАВЛЕННЫЕ Л/и-ПОВТОРЫ.

ShibalevD.V., Voronov A.S., Bashkirov V.N., KupriyanovaN.S., RyskovA.P. Доклады Академии Наук. 2003. Т. 388. № 1-6. С. 55-59.

[2] СЕГМЕНТНЫЕ ДУПЛИКАЦИИ ПРИТЕЛОМЕРНЫХ УЧАСТКОВ ХРОМОСОМЫ 13 ЧЕЛОВЕКА.

Купршнова Н.С., Шибалев Д.В., Воронов A.C., Муравенко О.В., Зеленин A.B., Рысков А.П. Молекулярная биология. 2003. Т. 37. С. 221-227

[3] PCR-GENERATED ARTIFICIAL RIBOSOMAL DNAs FROM PREMATURE TERMINATION AT ALU SEQUENCES

KupriyanovaN.S., ShibalevD.V., VoronovA.S., RyskovA.P. Biomolecular Engineering. 2004. T.21. C. 21-25.

[4] ОБНАРУЖЕНИЕ ВНУТРИГЕНОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА УЧАСТКА LR2 МЕЖГЕННОГО РИБОСОМНОГО СПЕЙСЕРА ЧЕЛОВЕКА

Шибалев Д.В., Воронов A.C., Фирсов С.Ю., Рысков А.П., Куприянова Н.С. Молекулярная биология. 2004. Т. 38. С. 835-838

[5] ENHANCED HETEROGENEITY OF THE LR2 SEGMENT IN THE HUMAN RIBOSOMAL INTERGENIC SPACER

KupriyanovaN.S., ShibalevD.V., VoronovA.S., RyskovA.P. GENE. 2008. T. 425. C. 44-47

[1] ИЗУЧЕНИЕ ВНУТРИ И МЕЖГЕНОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК В ОБЛАСТИ ЯДРЫШКОВОГО ОРГАНИЗАТОРА У ЧЕЛОВЕКА И ВЫСШИХ ОБЕЗЬЯН

А.П. Рысков, Д.В. Шибалев, К.К. Нечволодов, Н.С. Куприянова. Институт биологии гена РАН, Москва 2007год.

[2] СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ПОЛИМОРФИЗМ РИБОСОМНОГО МЕЖГЕННОГО СПЕЙСЕРА У ЧЕЛОВЕКА и ВЫСШИХ ОБЕЗЬЯН

А.П. Рысков, Д.В. Ш ' ............Н.С. Куприянова, ^ъ/схгэ/с^ц^

Тезисы:

Российской

биологии гена РАН, Москва 2008год.

Заказ № 109-а /02/2012 Подписано в печать 21.02.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:гак@с/г. ги

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шибалёв, Дмитрий Валерьевич, Москва

61 12-3/853

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук

На правах рукописи

Шибалев Дмитрий Валерьевич Консервативность и вариабельность ДНК ядрышковых

организаторов человека

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Куприянова Н.С.

Москва 2012

ВВЕДЕНИЕ 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1.1 Организация, локализация и количественная оценка содержания рибосомной ДНК (рДНК) в геноме человека. 7

1.2 Строение мономерных единиц рДНК. Орфоны. 9

1.3 Alu повторы в геноме и в рДНК человека и их предполагаемые функции 14

1.4 Экспрессия и процессинг рибосомной РНК. 17

1.5 Прителомерные и прицентромерные пространства, соседствующие с ядрышковым организатором в акроцентрических хромосомах. 20

1.6 Специфические особенности и возможные механизмы эволюции рДНК. 21

1.7 Сложная структура и динамическая эволюция субтеломер человека. 25

1.8 Картирование фрагментов рибосомной РНК в хромосомах человека, лишенных ядрышковых организаторов. 28

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 30

2.1 Выделение ДНК из крови. 30

2.2 Выделение ДНК из тканей. 30

2.3 Блот-гибридизационный анализ ДНК. 31

2.3.1 Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами. 32

2.3.2 Электрофоретическое фракционирование фрагментов геномной ДНК. 32

2.3.3 Перенос ДНК на нейлоновый фильтр (по Саузерну). 32

2.3.4 Обработка нейлоновых фильтров перед гибридизацией. 32

2.3.5 Синтез меченых олигонуклеотидных зондов с помощью киназной реакции. 32

2.3.6 Гибридизация ДНК на фильтрах с мечеными олигонуклеотидными зондами 33

2.3.7 Получение радиоавтографов 33

2.3.8 Щелочная отмывка фильтра 34

2.4 ПЦР-амплификация 34

2.5 Получение рекомбинантных ДНК с помощью лигазной реакции 34

2.6 Трансформация компетентных клеток рекомбинантной ДНК 34

2.7 Отбор рекомбинантных колоний методом ПЦР-амплификации 35

2.8 Выделение плазмидной ДНК 35

2.9 Обработка рекомбинантных плазмид рестрикционными эндонуклеазами 36

2.10 Электрофоретическое фракционирование фрагментов плазмидной ДНК 36

2.11 Секвенирование рекомбинантной плазмидной ДНК методом амплификации с терминаторами 36

2.12 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 38

3. РЕЗУЛЬТАТЫ 39

3.1 Феномен образования рекомбинантных (химерных) молекул ДНК, как следствие преждевременной терминации полимеразной цепной реакции в локусах содержащих однонаправленные Alu элементы и микросателлитные последовательности. 39

3.2 Природа гетерогенности сегмента LR2var рМГС человека. 45

3.3 Анализ in silico горячих точек рекомбинации, связанных с рДНК. 52

3.4 Сегментная дупликация прилегающих к рДНК участков генома человека 55

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 60

4.1 Феномен образования рекомбинантных (химерных) молекул ДНК, как следствие преждевременной терминации полимеразной цепной реакции в локусах содержащих однонаправленные Alu элементы. 60

4.2 Природа гетерогенности сегмента LR2 var рМГС человека. 63

4.3 Сегментные дупликации прилегающих к рДНК участков генома человека. 66

выводы 71

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 72

БЛАГОДАРНОСТИ 90

ПРИЛОЖЕНИЕ 91

ВВЕДЕНИЕ

Биогенез рибосом - координированный многостадийный процесс, происходящий в ядрышке, где синтезируется, созревает и подвергается модификациям рибосомная РНК (рРНК) которая затем входит в состав зрелых рибосомных субъединиц. Этот процесс забирает огромное количество клеточной энергии и тесно связан с ростом и делением клеток. Скорость синтеза белка строго коррелирует с содержанием в клетке рРНК и транспортной РНК (тРНК). Синтез рРНК является первым событием в синтезе рибосом, и он активно регулируется внешними сигналами, такими как тип питания, ростовые факторы и клеточные стрессы. Таким образом, транскрипция генов рРНК и созревание пре-рРНК играют центральную роль в сложной системе контроля клеточного роста и пролиферации. Клетки растут и делятся. Некоторые типы клеток растут без деления, например, нейроны и ооциты. Развивающиеся зиготы, напротив, делятся без роста. Однако для подавляющего большинства клеток процессы роста и деления тесно сопряжены, что приводит к поддержанию размера клеток в узких пределах. Для роста клеток необходим синтез белков, а для синтеза белков необходимы рибосомы. Таким образом, контроль синтеза рибосом является неотъемлемым атрибутом контроля клеточного роста [Dipayan and Warner, 2004]. Гены, которые кодируют нуклеиновые кислоты и белки, формирующие рибосомы, а также гены, обслуживающие созревание транскриптов, активацию зрелых продуктов и функционирование рибосом, образуют массивный полигенный комплекс, и их координированная работа жизненно необходима для поддержания жизни отдельных клеток и всего организма в целом. Механизмы репликации и транскрипции рДНК, а также механизмы поддержания ее константности или вариабельности, поняты далеко не в полной мере. Они изучаются в ряде лабораторий во всем мире в совокупности с сопутствующими проблемами [Jacob, 1995; Gonzalez and Sylvester, 1995, 1997, 2001; Gonzalez et al., 1989; Grummt, 2003; Grummt, 1999; Langst et al., 1997; Mayer et al., 2005; Nosikov and Braga, 1982; Kupriyanova, 2000].

Давно известно, что количественные и качественные изменения в синтезе рРНК могут быть важными молекулярными показателями состояния организма. Это касается, в частности, возрастных изменений числа генов рРНК и характера метилирования рДНК. В ряде работ показано возрастное снижение количества рДНК в тканях мозга и сердца человека и в тканях мыши методом Саузерн гибридизации [Johnson and Strehler, 1972; Gaubatz and Cutler, 1978].

Исследование связи между метилированием рДНК и экспрессией рРНК при старении на культурах клеток, полученных от больных с синдромом Вернера, показало, что эти

клетки росли медленнее и погибали, пройдя несколько делений, в отличие от контроля. [Indig et al., 2004].

Недавно показано, что при обработке культуры клеток фибробластов от больных ревматоидным артритом окисляющим агентом практически не наблюдается активации синтеза рРНК, тогда как в контрольных клетках синтез активируется на 50-80%. Для фибробластов таких больных характерен также ранний апоптоз [Вейко и др., 2005]. Интересное наблюдение было сделано при сравнении содержания копий рДНК у больных шизофренией и здоровых доноров. Оказалось, что число копий рДНК в геноме больных шизофренией примерно на 20% выше, чем у здоровых доноров. При этом содержание сателлита III и гистоновых генов в геномах исследуемых групп индивидов практически не различалось. Цитогенетический анализ (окрашивание серебром метафазных хромосом) показал, что содержание активных генов рРНК у больных шизофренией также выше, чем у здоровых людей [Вейко и др., 2003]. За последние годы получено много данных, которые позволяют предположить, что количественные и качественные изменения в синтезе рРНК могут быть важными молекулярными показателями злокачественности клеток [Williamson et al., 2006; Drygin et al.,2010].

Эти результаты открывают новое поле исследований для изучения связей между транскрипцией рДНК и клеточной пролиферацией [White, 2008; Montarano et al., 2008]. Понимание этих тонких связей необходимо для развития новых подходов к молекулярной характеристике и последующей терапии неопластических заболеваний. В рамках общей структурно-функциональной организации генов рРНК человека недостаточно изучены вопросы внутри-геномного полиморфизма рДНК и регуляции работы мультигенного семейства рДНК.

Целью данной работы является поиск и изучение вариаций в первичной структуре рМГС человека, и прилежащих к кластеру рДНК областей генома. Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• 1. С помощью ПЦР-амплификации провести анализ участков предпромоторной рДНК, содержащих повторы различных типов.

• 2. Определить уровень и изучить молекулярную природу вариабельности участка LR2 рибосомного межгенного спейсера.

• З.Из космидной клонотеки хромосомы 13 человека выделить клоны, содержащие рДНК и определить первичную структуру участков, предшествующих кластеру рДНК.

• 4. Определить вероятные «горячие точки рекомбинации» фрагментов области 1Л1-Ы12, с наибольшей вероятностью реализующиеся при рекомбинации в рДНК человека.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Организация, локализация и количественная оценка содержания рибосомной ДНК

(рДНК) в геноме человека.

Рибосома является одной из самых древних и важных органелл клетки, сохранившей общие черты организации у всех ныне живущих организмов. Гены, ответственные за синтез нуклеиновых кислот и белков, формирующих рибосому, а также гены, обслуживающие процесс работы этих генов, созревание продуктов транскрипции и переход зрелых продуктов в активное состояние, образуют крупнейший полигенный комплекс, от согласованной работы которого зависит жизнеспособность отдельных клеток и всего организма в целом.

В геноме высших организмов гены, кодирующие рРНК, образуют тандемные повторы. Анализ имеющихся данных показывает, что количество повторяющихся элементов рДНК резко отличается у представителей разных классов эукариот. Так, число повторов (n¡) в гаплоидном геноме покрытосеменных растений колеблется в пределах от 600 —800 у цитрусовых (Citrus sinensis) и артишока (H.tuberosus) до 7-8000 у лука {Allium сера) и кукурузы {Zea mais). У насекомых n¡ рДНК в геноме значительно ниже: например, 45 копий у мухи {Sciara coprophila) и 200-300 у Bombyx morí и D. hydei. Большой разброс n¡ в кластерах рДНК существует у рыб: от сотен {Abramis brama, Tinca tinca) до 5000 у луны рыбы {Neoceratodus forster i). Бесспорным чемпионом по степени повторности в кластерах рДНК являются амфибии, у которых n¡ в среднем составляет 3-5000, а у Amphiuma means это значение приближается к 20000. У птиц {Gallus domesticus) значение n¡ невелико (около 200). В геномах млекопитающих n¡ рДНК незначительна и колеблется в узких пределах: от 100 до 250 у мыши, кролика и хомяка. У человека n¡ была определена как примерно 200 в пересчете на гаплоидный геном [Long and David, 1980]. Видно, что приведенные данные получены более 20 лет назад, но с тех пор новые исследования в данном направлении проводились редко. Из более поздних исследований можно упомянуть работы по рДНК злаковых [Вахитов и др., 1983], таракана Blatella germanica [Mukha et al., 2000], крупного рогатого скота [Морзунов и др., 1992] и рептилий [Воронов и др. 2008].

Существует общая тенденция возрастания числа повторов в кластерах рДНК параллельно увеличению размера генома в эволюции. Тем не менее, большой разброс в количестве генов существует не только у близко родственных видов, но даже у различных линий одного и того же вида, например, у Drosophila melanogaster [Spear and Gall, 1973], у амфибий [Sinclair et al., 1974] и у мышей [Henderson et al., 1976].

Точность определения числа повторов рДНК в геноме прямо зависит от точности используемого метода. В более ранних работах число повторов рДНК в геноме определяли

методом насыщающей гибридизации нитроцеллюлозных фильтров, содержащих ядерную ДНК, с меченой рРНК известной удельной активности [Long and David, 1980]. Число повторов рДНК у человека, определенное этим способом, составляет около 200 единиц на гаплоидный геном. Более точный метод, разработанный [Вейко и др., 1996] позволяет утверждать, что количество повторов рДНК в геноме человека может варьировать у различных индивидов от 195 до 290 копий в пересчете на гаплоидное ядро.

Тандемная организация генов рРНК показана различными способами: возможностью их выделения при центрифугировании в градиенте плотности CsCl в виде дискретной полосы с характеристической плотностью; непосредственным наблюдением процесса транскрипции рРНК в гаметогенезе некоторых организмов (петли хромосом "ламповые щетки") [Scheer et al., 1977; Kupriyanova et al., 1982]; характером расщепления рестриктазами, специфичным для тандемных повторов; фракционированием крупных фрагментов ДНК в условиях электрофореза в пульсирующем поле [Srivastava et al., 1993; Gonzalez and Sylvester, 1997]. Хотя время от времени появлялись данные, противоречащие утверждению о непрерывности кластеров рДНК [Labella and Schlessinger, 1989; Winokur et al., 1996], все они впоследствии опровергались, так что в настоящее время тандемную организацию основной, функционально активной части рДНК можно считать практически доказанной.

Существует огромное разнообразие в числе и хромосомной локализации ЯОР у разных организмов. Даже у человекообразных обезьян они расположены неодинаково. У человека, например, тандемные кластеры рДНК локализованы на коротких плечах пяти акроцентрических хромосом (13, 14, 15, 21 и 22). У шимпанзе Pan paniscus и Pan troglodytes, наиболее морфологически родственных человеку, кластеры рДНК находятся на хромосомах 14, 15, 17, 22 и 23, у гориллы - на хромосомах 22 и 23, у орангутана они распределены по 9 парам акроцентрических хромосом, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 22, 23, а у гиббонов ЯОР присутствуют лишь на хромосоме 15 [Long and Dawid, 1980; Gonzalez and Sylvester, 1997]. Чрезвычайная вариабельность характерна для распределения кластеров рДНК на хромосомах грызунов. Например, у мыши Mus musculus внутри вида обнаруживаются четыре подвида с различным расположением ЯОР на разных хромосомах и с различной интенсивностью окрашивания AgN03, что отражает различную активность экспрессии рРНК [Suzuki et al., 1990]. У различных амфибий обнаружено от одного до четырех ЯОР, локализованных на разных хромосомах.

Во время митоза ядрышко исчезает, а ЯОР выглядит как вторичная, часто прителомерная перетяжка в конденсированных хромосомах. В телофазе существует корреляция между числом вновь образованных ядрышек и ЯОР, но в ходе интерфазы число

ядрышек уменьшается, так как они имеют тенденцию сливаться друг с другом [Miller et al., 1977; Грабовская и др., 1992]. В последние годы появилась тенденция использовать цитогенетический показатель - участие акроцентрических хромосом в ассоциациях - для диагностических и прогностических целей при острых заболеваниях, затрагивающих иммунную систему и при развитии опухолей [Pedrazzini and Slavutsky, 1991]. Известно, что способность акроцентрических хромосом вступать в ассоциации так же, как интенсивность серебрения их ЯОР, отражает функциональное состояние ЯОР [Вейко и др., 2003].

При изучении тонкой структуры ядрышка методом FISH и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии показано, что кластеры рДНК занимают около 10% коротких плеч акроцентрических хромосом и надежно изолированы от других генов протяженными блоками сателлитных последовательностей (порядка млн. п.н.) [Kaplan et al., 1993; Vogt, 1992]. Помимо рДНК в ядрышке локализованы крупные блоки гетерохроматина, образованные повторами нерибосомной природы. Рассеянные повторяющиеся элементы и сателлитные последовательности, из которых в основном формируется гетерохроматин, имеют тенденцию образовывать необычные трехмерные структуры, возможно, имеющие значение для организации ядрышка и эволюции генома [Vogt, 1992; Moyzis et al., 1989]. Использование указанных методов позволило также оценить реальное пространственное расположение отдельных компонентов, формирующих ядрышко. В частности оказалось, что как центромера, так и кластер рДНК находятся на периферии ядрышка и пространственно сближены друг с другом. Это может объяснить, почему происходят рекомбинационные события между рДНК и прицентромерными альфоидными сателлитами акроцентрических хромосом [Cheung et al., 1990].

1.2 Строение мономерных единиц рДНК. Орфоны.

В настоящее время первичная структура полноразмерных повторов рДНК определена среди позвоночных только для лягушки, мыши и человека и составляет 20-25, 45 и 43 т.п.н., соответственно. Для некоторых других организмов построены рестриктные карты рДНК и определена нуклеотидная последовательность отдельных элементов.

Каждая повторяющаяся единица рДНК состоит из транскрибируемой области (рибосомного оперона) и рибосомного межгенного спейсера (рМГС). В эукариотических клетках гены рРНК транскрибируется в ядрышке РНК-полимеразой I (Pol I) в виде большого (40-47S у разных позвоночных) предшественника рРНК (пре-рРНК). Молекула пре-рРНК содержит 5'-транскрибируемый спейсер (5'-ВшТС); 18S рРНК, левый внутренний транскрибируемый спейсер (ВТС-1); 5,8S рРНК; правый внутренний транскрибируемый

спейсер (ВТС-2); 28S рРНК и 3'-транскрибируемый спейсер, (З'-ВшТС). Зрелые продукты (28S, 18S и 5,8S рРНК) формируются в результате серии специфических эндонуклеазных расщеплений пре-рРНК. В процессе эволюции происходит увеличение длины генов 18S и 28S рРНК и транскрибируемых спейсеров, однако общие принципы структурной организации транскрибируемой области остаются неизменными. 28S рДНК у млекопитающих примерно на 1,5 т.п.н. длиннее, чем 26S рДНК дрожжей и представляет собой мозаику эволюционно консервативных и вариабельных областей. Единица транскрипции рДНК у человека имеет размер около 14 т.п.н., являясь одной из самых длинных из известных, а соответствующая единица транскрипции у S.cerevisiae - одна из самых маленьких, между 6 и 7 т.п.н. Сегменты ДНК по обе стороны от сайта инициации транскрипции на 5'-конце ВшТС существенны для транскрипции ДНК при участии РНК-полимеразы I. В отличие от кодир�