Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика ядрышка в клеточном цикле диплоидных и полиплоидных клеток различных тканей пшеницы Triticum aestivum L

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лазарева, Елена Михайловна, Б. м.

/'Л

1 п

'< и;

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

ЛАЗАРЕВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

УДК 576.315.45:577.112

ДИНАМИКА ЯДРЫШКА В КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ ДИПЛОИДНЫХ И ПОЛИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ ПШЕНИЦЫ ТШТЮиМ АЕБТТУЦМ Ь.

03.00.11

эмбриология, гистология и цитология

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.С. Ченцов.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 1

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1. Структурно-функциональная характеристика локусов организатора ядрышка 7

2. Структурная организация ядрышка 13

3. Молекулярная композиция доменов ядрышка 14

3.1. Локализация ДНК 15

3.2. Белки ядрышка и га локализация 18

4. Динамика ядрышка в клеточном цикле 31

4.1. Белки, ассоциированные с районом ядрышкового организатора 32

4.2. Белки периферического слоя хромосом. Структурно-функциональная характеристика периферического хромосомного материала (матрикса), как специфического домена ми-тотических хромосом 33

4.3. Белки ядрышка, мигрирующие во время митоза в цитоплазму 39

5. Нуклеологенез 40 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 52

1. Клетки апикальной меристемы корня 52

1.1. Приготовление препаратов хромосом 52

1.2. Выявление аргентофилъных белков в клетках корневой меристемы 53

1.3. Визуализация ядрышек на различных стадиях клеточного

цикла 53

2. Клетки эндосперма 54

2.1. Изоляция эндосперма 54

2.2. Выявление аргентофилъных белков в клетках эндосперма 55

2.3. Иммунофлуоресцентное окрашивание 55

2.4. Окрашивание ядер клеток эндосперма по методу Фелъгена 56

3. Определение молекулярной массы аргентофилъных белков 57

4. Определение молекулярной массы белков ядрышка -антигенов к аутоиммунным сывороткам 58

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 60

1. Локализация аргентофильных белков ядра в интерфазных и митотических клетках апикальной меристемы корня

и эндосперма пшеницы 60

1.1. Выявление аргентофильных белков клеток апикальной меристемы корня 60

1.2. Локализация аргентофильных белков в интерфазных и делящихся клетках эндосперма 63

1.3. Обсуждение 64

2. Иммуноцитохимическое изучение локализации некоторых белков ядрышка в интерфазных и митотических клетках эндосперма 68

2.1. Определение молекулярной массы белков ядрышка, являющихся антигенами к аутоиммунным сывороткам Р-127 и К-56 68

2.2. Иммуноцитохимическое выявление полипептида с мол массой 34 кД (сыворотка К-56 69

2.3. Иммуноцитохимическое выявление белка с мол массой 53

кД (сыворотка Р-127) 70

2.4. Обсуждение 71

3. Динамика структурно-функциональной ассоциации яд-рышкообразующих хромосом в клеточном цикле и в связи с полиплоидизацией генома 73

3.1. Количество хромосом с ядрышкообразующими районами в митотических клетках меристемы корня 76

3.2. Количество ядрышек в ядрах диплоидных и эндополиплоид-ных клеток меристемы корня на различных стадиях клеточного цикла 76

3.3. Количество ядрышек в клетках антипод с политенными хромосомами 78

3.4. Количество ядрышек в триплоидных клетках эндосперма

на различных стадиях клеточного цикла 78

3.5. Ранние этапы нуклеологенеза в постмитотических клетках эндосперма 80

3.6. Обсуждение 81 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 89 »МИОДЫ 92

библиография

ВВЕДЕНИЕ

Ядрышко представляет собой дискретный домен интерфазного ядра эукариот, в котором осуществляется интенсивная транскрипция рибосомной РНК и ее процессинг (Scheer, Benavente, 1990).

Интерфазное ядрышко включает три основных структурных компонента: фибриллярные центры (ФЦ), плотный фибриллярный компонент (ПФК) и гранулярный компонент (ГК) (Goessens, 1984). По современным представлениям, в ФЦ локализованы гены рРНК и некоторые белки, необходимые для транскрипции РНК - РНК полимераза I, транскрипционный фактор UBF и топоизомераза I. ПФК является сайтом транскрипции рРНК и содержит такие белки, как нуклеолин; в ГК локализованы процессирующиеся молекулы РНК и предшественники рибосом и белки, участвующие в транспорте и созревании рибосом - нуклеолин, В23, и Р52 (Scheer, Benavente, 1990; Hernandez-Verdun, 1991; Shaw, Jordan, 1995; Gautier et al., 1994).

Количество и размеры ядрышек в различных типах клеток коррелирует с числом активных ядрышковых организаторов (ЯО) (Schwarzachen Wachtier, 1983). В то же время, количество ядрышек в ядре может быть меньше, чем число активных ЯО (Jordan et al, 1982; Wachtier et al, 1986; Rawlins, Shaw, 1990). Этот феномен авторы объясняют специфической ассоциацией ядрышкообразующих хромосом в области ЯО, которая может сохраняться в метафазе (Avivi, Feldman, 1980; Rawlins, Shaw, 1990; Wachtier et al, 1986; Hadlaczky et al, 1986; Haaf et al, 1990; Haaf, Schmid, 1991). Причины, определяющие формирование такой ассоциации, ее динамика в клеточном цикле и в связи с полиплоидизацией генома, так же, как

функциональное значение феномена слияния ядрышек остаются неизвестными.

Структурно-функциональная композиция ядрышка и динамика его поведения в клеточном цикле зависят от уровня экспрессии генов рДНК (Hadjiolov, 1985). В профазе митоза, на фоне общего ингибирования синтеза РНК, ядрышки диссоциируют. С локусами ЯО остаются ассоциированными такие компоненты, как РНК-полимераза1 (Weisenberger, Scheer, 1995), топоизомераза I (Guldner et al., 1986), транскрипционный фактор UBF (Roussel et al, 1993; Zatsepina et al, 1993) и белки, участвующие в транскрипции рРНК (Dundr et al, 1997). Некоторые другие белки ядрышка и РНП частично выходят в цитозоль, или ассоциируют с митотическими хромосомами, формируя слой периферического хромосомного материала (Hernandez-Verdun, Gautier, 1994; Medina et al, 1995). Слой нехроматинового материала, на периферии хромосом был описан в ранних цитологических работах как хромосомный матрикс (Sharp, 1929; Nebel, 1932; Dangeard, 1937). Впервые, матрикс хромосом на электронномикроскопическом уровне был изучен в работах Ю.С.Ченцова и В.Ю.Полякова (1968; 1969). Авторы предположили, что матрикс включает некоторые компоненты ядрышка, в том числе, РНП, которые переносятся на хромосомах для ' быстрой реорганизации аппарата синтеза рРНК в телофазе.

Реорганизация ядрышка в телофазе происходит в два этапа: сначала специфические ядрышковые белки накапливаются в кариоплазме дочерних ядер, а затем конденсируются в зоне активирующегося организатора (Benavente, 1991). Промежуточной фазой формирования дефинитивного ядрышка является компактизация белков в многочисленные компактные структуры, т.

наз. «предъядрышки» (см. Zatsepina et al., 1997). Существование «предъядрышек» (prenuclear bodies) убедительно показано для многих клеток животных. В них с помощью иммуноцитохимических методов обнаружены ядрышковые белки, такие как В23 (Ochs et al., 1985), нуклеолин (Ochs et al., 1983), фибрилларин (Azum-Gelade et al., 1995; Medina et al., 1995) и ряд других. Во многих работах показано, что предъядрышки обладают аргентофилией (Ochs et al., 1985; Jimenez-Garcia et al., 1989). На основании данных, полученных методом гибридизации in situ, в «предъядрышках» выявлена низкомолекулярная РНК (U1-U3,U14) (Jimenez-Garcia et al., 1994; Azum-Gelade et al., 1995; Beven et al., 1996). В клетках лука этим же методом в «предъядрышках» обнаружили молекулы предшественников рРНК (Medina et al., 1994). В то же время, вопрос о наличии «предъядрышек» в телофазных ядрах растений вызывает определенные сомнения. В. работе Lafontaine, Chouinard (1963), в которой с помощью электронномикроскопической техники был детально прослежен процесс реорганизации телофазных ядер в клетках конских бобов Vicia faba, не обнаружено структур, соответствующих фибриллярным предъядрышкам животных объектов.

Процессы деструкции ядрышек в профазе и их реорганизации в телофазе детально описаны в синхронизированных клетках культуры ткани животных объектов (Sommerville, 1986; Hernandez-Verdun, Gautier., 1994; Dundr et al., ,1997; Suja et al., 1997). Данные о цикле различных молекулярных компонентов ядрышка в клетках растений гораздо более фрагментарны (Vaughan, 1987; Medina et al., 1997). В особенности, мало изучены начальные этапы миграции белков ядрышка на стадии ранней профазы и динамика реконструкции

ядрышка в телофазе. Отчасти, это связано с чисто методическими трудностями. Во-первых, в растительных объектах сложно подробно "реконструировать" последовательность митоза, т.к. приходится иметь дело с единичными срезами ткани или отдельными диссоциированными клетками. Во-вторых, для клеток растений не удается в полной мере адаптировать те цитохимические методики, которые используются для клеток культуры ткани.

Объектом, позволяющим преодолеть перечисленные трудности, является созревающий эндосперм некоторых представителей покрытосеменных растений (Петрова, 1970). Изолированный на нуклеарной стадии развития, эндосперм представляет собой тонкую пленчатую структуру, содержащую один слой клеток. Характерной особенностью эндосперма является синхронное деление клеток, связанное со сменой митотических стадий, которые волнообразно распространяются по ткани (Поддубная-Арнольди, 1976). Это позволяет надежно идентифицировать последовательные стадии митоза, начиная от ранней профазы и кончая поздней телофазой. В настоящей работе в качестве основного объекта исследований использовались клетки эндосперма пшеницы Triticum aestivum.

Пшеница является излюбленным цитогенетическим объектом, который достаточно полно охарактеризован по следующим параметрам: (1) все хромосомы пщеницы четко идентифицированы методом N- и С-окрашивания и на основании этого создана цитогенетическая номенклатура ее хромосом (Seal, 1981; Бадаева и др., 1982; Lakadena et al., 1984; Лазарева, Айзатулина, 1985); (2) методом гибридизации in situ в геноме 'пшеницы выявлены шесть хромосом (1А, 5А, 1В, 6В, 5Д, 7Д), в которых имеются кластеры рибосомных генов (Cermeño et al., 1984; Miller et al., 1985; Jiang, Gill,

1994); (3) показано, что в интерфазных клетках активно транскрибируются ядрышковые организаторы хромосом 1В и 6В, ядрышковые организаторы хромосом 1А и 5Д являются латентными в отношении транскрипции, а кластер рибосомных генов в хромосоме 5А всегда репрессирован и никогда не формирует ядрышко (Cermeño et al., 1984; Lacadena et al., 1984); (4) разработан метод изоляции зародышевого мешка с триплоидным эндоспермом и гаплоидными клетками антипод, содержащими гигантские политенные хромосомы (Петрова, 1970).

Таким образом, используя различные ткани пшеницы, можно провести комплексное исследование динамики ядрышка и его компонгентов как в клеточном цикле, так и в клетках, в которых полиплоидизация генома происходит различными способами.

В работе были поставлены следующие задачи:

Í. На ткани изолированного эндосперма провести скриннинг аутоиммунных сывороток, которые преципитируют с ядрышками клеток животных. Определить молекулярные массы белков, являющихся антигенами к сывороткам, избирательно окрашивающим ядрышки клеток пшеницы.

2. Используя отобранные сыворотки в качестве маркеров, изучить динамику белков ядрышка в делящихся клетках эндосперма.

3. Изучить характер распределения аргентофильных белков в интерфазных и делящихся клетках эндосперма и в клетках меристемы корня.

4. Методом Вестерн-блота определить молекулярные массы аргентофильных белков ядер клеток пшеницы.

5. Изучить феномен ассоциации ядрышек на всех стадиях клеточного цикла в диплоидных и полиплоидных клетках меристемы, в триплоидных клетках эндосперма и в политенных клетках антипод зародыша.

6. С помощью иммуноцитохимических методов и Ag-NOR окрашивания детально изучить динамику формирования ядрышек на ранних этапах нуклеологенеза в телофазных клетках эндосперма.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В настоящее время установлено, что ядрышко представляет собой активный локус специальных ядрышкообразующих хромосом, в котором с помощью фермента РНК-полимеразы I транскрибируются гены рибосомной ДНК. Эти гены кодируют три из четырех типов рРНК - 18S, 5,8S и 28S РНК. Кроме того, в ядрышке происходит процессинг рРНК и осуществляются основные этапы биогенеза больших и малых субъединиц рибосом.

1. Структурно-функциональная характеристика

локусов "организатора ядрышка".

В ранних цитологических работах было показано, что в формировании ядрышка могут принимать участие только определенные хромосомы кариотипа; эти хромосомы были названы "ядрышкообразующими".

В 1931г. Гейтц обнаружил, что в клетках Drosophila funebris существует прямая корреляция между числом митотических хромосом, имеющих вторичные перетяжки и количеством ядрышек в интерфазном ядре (Heitz, 1931). По его гипотезе, не только число, но и размеры ядрышек зависят от активности локусов, располагающихся в этих районах хромосом.

Примерно в то же время, в области вторичных перетяжек ядрышкообразующих хромосом кукурузы был обнаружен специфический маркерный блок компактизованного хроматина, который был назван "ядрышкоорганизующим тельцем" или "организатором ядрышка" (NOR) (McClintock, 1934). Впоследствии

выяснилось, что этот блок включает только часть "молчащих", нетранскрибирующихся генов, отвечающих за формирование ядрышка, однако, термин "организатор ядрышка" сохранился для характеристики всей области вторичной перетяжки до настоящего времени.

Прямые доказательства наличия в области вторичной перетяжки генов рибосомной РНК были получены в классических работах Брауна и Гордона на мутантах шпорцевой лягушки Xenopus laevis (Brown, Gurdon, 1963) и Ритоссы и Спигельмана на гибридных линиях Drosophila melanogaster (Ritossa, Spiegelman, 1965).

В многочисленных биохимических экспериментах было показано, что в геномах эукариот гены рРНК представлены большим числом тандемно расположенных копий. В целом, количество генов рРНК коррелирует с размером генома, однако довольно часто встречаются внутривидовые и даже индивидуальные различия в числе копий рибосомных генов. Особенно большое количество повторов (до нескольких тысяч на геном) обнаружено у высших растений (Hadjiolov,1985).

С помощью метода гибридизации in situ, гены рибосомной ДНК были визуализованы на цитологических препаратах ядрышкообразующих хромосом многих объектов животного и растительного происхождения. В целом, метод гибридизации подтвердил ранее сформулированные представления о локализации генов рРНК в области вторичной перетяжки ядрышкообразующих хромосом. Однако совпадение результатов цитологического и гибридизационного анализов оказалось не абсолютным: в некоторых изученных объектах радиоактивно меченые зонды 18s и 28s рРНК гибридизовались с хромосомами, не имеющими

вторичной перетяжки, выявляемой цитологическими методами (Hsu et al., 1975). Причина такой ситуации выяснилась после введения в цитологическую практику метода импрегнации организаторов ядрышка серебром (Goodpasture, Bloom, 1975). Авторы предложили простой и хорошо воспроизводимый метод серебрения организаторов ядрышка (Ag-NOR staining), позволявший селективно окрашивать в митотических хромосомах локусы, которые гибридизовались с зондами 18s и 28s рРНК. В то же время, было отмечено, что способностью к аргентофилии обладют не все хромосомы кариотипа, потенциально способные формировать ядрышко, а только те, которые имеют хорошо выраженную область вторичной перетяжки.

В связи с полученными данными, Goodpasture и Bloom в своей работе поставили две проблемы: какова природа окрашивания организаторов ядрышка и почему серебром импрегнируются не все хромосомы, несущие гены рРНК.

Для решения первой проблемы - механизма взаимодействия нитрата серебра с локусом организатора ядрышка - были проведены специальные эксперименты, которые показали, что окрашивание не снимается после гидролиза нуклеиновых кислот нуклеазами (ДНК-азой или РНК-азой); предобработка препаратов протеазами (трипсином или проназой) полностью элиминировала окрашивание. Было высказано предположение, что сродством к серебру обладают не нуклеиновые кислоты, а, скорее, негистоновые (кислые) белки, ассоциированные с рибосомными генами в зоне организатора ядрышка (Goodpasture, Bloom, 1975). Как показали дальнейшие исследования, эта гипотеза оказалась верной. В настоящее время специальными экспериментами в зоне организатора ядрышка

митотических хромосом выявлено семейство белков, обладающих способностью при определенных условиях специфически связываться с ионами серебра. К ним относятся такие важные для функционирования ядрышка белки, как РНК-полимераза I, транскрипционный фактор UBF и т.д. В связи с тем, что эти аргентофильные белки принимают непосредственное участие в транскрипции рРНК, возникла идея о том, что транскрипционные "машины" в активированных организаторах на всех стадиях клеточного цикла, включая митоз, сохраняют струтурно-функциональную ассоциацию с генами рРНК (Roussel, Hernandez-Verdun, 1994).

Вторая проблема, поставленная в работе (Goodpasture, Bloom, 1975) связана с несовпадением результатов, полученных разными методами. Так, например, методом гибридизации in situ показано, что в геноме человека имеется 5 пар акроцентрических хромосом, несущих гены рРНК, а преципитат серебра выявляется не во всех ядрышкообразующих хромосомах. Эта проблема была решена в работах, посвященных изучению гибридов культивируемых соматических клеток человека и мыши (Miller et al., 1976). На основе проведенных экспериментов, авторы показали, что аргентофилия организатора ядрышка проявляется только в том случае, если содержащиеся в нем г�