Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействий белков с ДНК в интактных хлоропластах методом ковалентной фиксации

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействий белков с ДНК в интактных хлоропластах методом ковалентной фиксации"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н.БАХА

На правах рукописи

¡МЕЛЬНИК СВЕТЛАНА МИХАЙЛОВНА

- : 1СОЯ

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ БЕЛКОВ С ДНК В ИНТАКТНЫХ ХЛОРОПЛАСТАХ МЕТОДОМ КОВАЛЕНТНОЙ

ФИКСАЦИИ

03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1998

Работа выполнена в Лаборатории биохимии хлоропластов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и в Лаборатории структуры и функции хроматина Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук Н.П. Юрина

доктор биологических наук С.Г, Бавыкин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И.И. Филиппович

доктор биологических наук Д.А, Лось

Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится г^^Ы^С/ 1998 г. в

часов на

заседании специализированного совета К 002.96.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (117071, Москва, Ленинский проспект, 33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОБН РАН (Москва,

Ленинский проспект, 33). ,

.Автореферат разослан -7 '1998г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук М.И. Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ключевая роль макроструктуры генома эукариот в процессах генной регуляции клеточного метаболизма получила в настоящее время достаточно глубокое теоретическое и экспериментальное обоснование. Общепринятым стало представление, что геном как интегральная генетическая система может быть осмыслен только при одновременном развитии исследований всех уровней его структурной организации. Подобные исследования для генома хлоропластов, без которых невозможно понимание механизмов репликации и транскрипции в пластидах, находятся в начальной стадии. Каким образом осуществляется в клеточных органеллах компактизация ДНК и каковы механизмы, с помощью которых поддерживается надмолекулярное состояние ДНК хлоропластов in vivo, остается неизвестным. На данный момент существуют лишь данные электронной микроскопии (Briat et al., 1982; Salganik et al., 1991), свидетельствующие о наличии сходства в строении хромосом на молекулярном уровне в ядрах эукариот и геномах пластид. Однако совсем не изучен способ формирования нуклеопротеидного комплекса хлоропластов, в частности, неизвестно, соблюдается ли нуклеосомный принцип упаковки ДНК или же существует другой, принципиально отличный механизм компактизации пластидной ДНК. Очевидно, что упаковка ДНК должна осуществляться посредством взаимодействия с одним или несколькими ДНК—связывающими белками. Существует ряд исследований нуклеоидов хлоропластов, охарактеризован их общий белковый состав, но не решен вопрос, какие именно белки и каким образом непосредственно принимают участие в организации макроструктуры нуклеопротеидного комплекса пластид (Briat et al., 1982; Юрина и др., 1988; Crevel et al., 1989; Neraoto et al., 1989, 1990, 1991; Yurina et al„ 1995).

В этих исследованиях все методы изучения ДНК—связывающих белков хлоропластов основывались на выделении нуклеоидов с предварительным лизисом пластид. При этом в случае использования

ионных детергентов и сильных восстановительных агентов белковые контакты с ДНК могут нарушаться, что приводит к потере некоторых белковых компонентов в процессе выделения нуклеоидов, а в случае использования неионных детергентов может происходить также и артефактное перераспределение белков на ДНК.

По этим причинам представляется особенно интересным. использование методических подходов, связанных с фиксацией белков на ДНК в интактных хлоропластах с образованием прочной ковалентной связи ДНК—белковой сшивки в месте их контакта с последующей идентификацией как пришитых белков, так и последовательностей ДНК, участвующих в формировании нуклеопротеидного комплекса пластид.

Методика ковалентных сшивок позволяет зафиксировать существующие ДНК—белковые контакты как in vitro, так и in vivo, в результате чего образуется стабильный комплекс ДНК с белком. Преимущества этого очевидны: материал в процессе изучения можно подвергать достаточно жестким воздействиям без нарушения стабильности полученной структуры.

Такой методический подход представляется достаточно перспективным, вследствие чего появляются многочисленные новые модификации этого метода, Объединяя его с методом гибридизации с "белковыми тенями" (Karpov et al., 1982), исследователи получают возможность наиболее адекватно исследовать распределение белков на ДНК.

Цель работы. Цель работы состояла в исследовании ДНК— связывающих белков хлоропластов с использованием метода ковалентной ДНК—белковой фиксации в условиях in vivo. При этом были поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода ковалентных ДНК —белковых сшивок, индуцированных радикал—продуцирующим комплексом 1,10— фенантролин —Cu(II). Исследование механизма химических реакций, сопровождающих образование сшитого дезоксинуклеопротеидного комплекса,

2. Обнаружение ДНК — связывающих белков хлоропластов с использованием нового метода ковалентной сшивки и определение их функциональной роли,

3. Выявление участков хлоропластного генома, взаимодействующих с обнаруженными ДНК—связывающими белками.

4. Исследование роли ДНК—связывающих белков в упаковке хлоропластной ДНК.

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе для обнаружения ДНК—связывающих белков хлоропластов впервые был применен метод ДНК—белковых сшивок, индуцированных радикал—продуцирующим комплексом 1,10—фенантролин — Си (II) в условиях in situ. Бесспорное преимущество данного метода состоит в том, что, в отличие от других подходов, он позволяет исследовать нативную структуру нуклеоидов без разрушения хлоропластов. Этот метод в комбинации с подходом, известным под названием гибридизации с "белковыми тенями" (Karpov et al., 1982; Nacheva et al., 1989), дает возможность сравнивать белковый состав различных нуклеотидных последовательностей генома. С использованием этих методов было выявлено существование нескольких ДНК—связывающих белков, которые входят в состав нуклеопротеидного комплекса хлоропластов. Они взаимодействуют со всеми исследованными фрагментами хлоропластной ДНК, содержащими как фотоиндуцируемые, так и конститутивные гены. Таким образом, было показано, что обнаруженные белки выполняют структурную функцию.

Дальнейшее исследование ковалентно связанных с ДНК белков, радиоактивно меченных по нуклеотидному остатку, позволило определить молекулярные массы семи полипептидов, образующих ДНК —белковый комплекс хлоропластов, которые составили: 12; 14; 17; 20; 2?; 31 и 34 кДа, соответственно. Сопоставление электрофоретической подвижности в ПААГ в присутствии ДДС—Na хлороплаегных сшитых нуклеотид —пептидов, белков, экстрагирующихся 0.4N серной кислотой, и полипептидов, образующих ДНП — структуры в хлоропластах, выявило, что в целом они совпадают.

Теоретическое значение работы состоит в том, что впервые было показано наличие субъединичного принципа строения макромолекулярной структуры нуклеоидов хлоропластов (на примере гороха), элементарной единицей которой является нуклеосомо — подобная частица. В ее состав входят обнаруженные ДНК — связывающие белки и фрагменты хлоропластной ДНК, кратные 184 п.н„. что отличается от длины нуклеосомного повтора хроматина ядер (гороха), составляющей 170 пл. Было показано, что белковый состав обнаруженных хлоропластных ДНП—структур очень близок по электрофоретической подвижности в ПААГ в присутствии ДДС —Na с гистонами клеточных ядер. Все эти данные являются первым биохимическим подтверждением гипотезы, предполагающей существование нуклеосомо—подобных структур, принимающих участие в упаковке хлоропластной ДНК (Briat et al, 1982; Kiseleva et. al, 1988, 1989; Salganik et. al, 1991).

Практическое значение работы состоит в разработке нового метода фиксации ДНК—белковых взаимодействий с использованием радикал—продуцирующего комплекса 1,10—фенантролин—Cu(II), основными достоинствами которого, являются: мягкие условия сшивки, широкий диапазон температур и рН, небольшая продолжительность реакции, высокая эффективность сшивки белков с ДНК, отсутствие модификации белков и оснований нуклеиновых кислот, возможность проведения сшивок как в условиях in vitro, так и в условиях in vivo. Все это позволяет использовать данный метод при анализе ДНК—белковых комплексов в различных биологических системах. В работе были изучены возможности метода и механизмы химических реакций, сопровождающих образование ковалентной связи между дезоксирибонуклеиновой кислотой и аминокислотами белка, индуцированной комплексом 1,10—фенантролин — Си(Н) в присутствии перекиси водорода в анаэробных условиях.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме под эгидой ЮНЕСКО "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии" (Москва, .Дубна, 1997), на Международном симпозиуме "Проблемы и тенденции

фотобиохимии" (Москва, 1997), на III—ем Симпозиуме российского общества физиологов растений (Москва, 1997), на II —ом Съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), на Международной конференции под эгидой Центра научных исследований г. Афины "Хлоропласты: молекулярная биология и биотехнология", (Крит, Греция, 1998), на Международном симпозиуме "Молекулярные механизмы стрессовых ответов" (Москва, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, заключения и списка цитированной литературы. Работа изложена н^^'страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 2 таблицы. Список цитированной литературы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ И МЕХАНИЗМА МЕТОДА ДНК-БЕЛКОВОЙ СШИВКИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ КОМПЛЕКСОМ 1,10- ФЕНАНТРОЛИН - Си (II).

1. Образование ДНК-белковой сшивки а условиях in vitro

продуцирующего комплекса 1,10—фенантролин—Cu(II) для индукции образования ковалентной ДНК —белковой связи в условиях in vitro проводили на хроматине из ядер эритроцитов курицы. На примере этой системы исследовали несколько характеристик данного метода: эффективность образования ДНК—белковых комплексов, влияние на нее каждого из компонентов системы: фенашролина, ионов меди и перекиси водорода, а также основного химического механизма образования ковалентной связи между дезоксирибонуклеиновой кислотой и аминокислотами белка.

Идея использовать "химические нуклеазы" (Sigman, 1990) для индукции ДНК —белковой сшивки возникла на основании установленного факта, что при инкубации ДНК в буфере, содержащем комплексы блеомицина с переходными металлами, в анаэробных

Исследования возможности применения радикал

условиях происходит вьнцепление оснований нуклеиновой кислоты, что сопровождается раскрыванием фуранозного кольца дезоксирибоэы и образованием активной альдегидной группировки в С—1—положении. Сделано предположение, что подобный механизм реакции характерен также и для комплекса 1,10—фенантролин—Си(И) в анаэробных условиях (БШЬЬе & КохапсЬ, 1987). Ранее было показано, что в случае применения диметилсульфата для индукции ДНК—белковых сшивок, такая альдегидная форма дезоксирибоэы, появляющаяся в месте образования апуринового сайта в результате метилирования гуанинов, взаимодействует с азотсодержащими группировками имидазольного кольца гистидинов, с е — аминогруппой лизиновых остатков или с первичными аминогруппами концевых аминокислот с образованием иминов, — соединений с ненасыщенной двойной связью — С = Ы —, так называемых оснований Шиффа. В результате последующего восстановления борогидридом натрия, сопровождающегося элиминацией 3' —концевого фрагмента ДНК, между 5'—концом ДНК и аминокислотой белка образуется одинарная коваленшая связь (Ьелапа е! а1.,1981; Ргизэ & Вауукш, 1997). Важной особенностью данной реакции является расщепление нити ДНК по месту сшивки по механизму ¡5 — элиминации.

Полученные ядра из эритроцитов курицы лизировали ультразвуком для разрушения оболочки и частичной фрагментации ДНК. После центрифугирования получали растворимый хроматин, используемый в дальнейшем для сшивки. Сшивку ДНК с белками проводили в бескислородной среде, для чего рабочие растворы перед реакцией и саму инкубируемую смесь в течение всего времени до остановки реакции продували аргоном. После инкубации хроматина в буфере, содержащем 1,10—фенантролин, ионы Си2+ и перекись водорода, проводили очистку ДНК—белковых комплексов. Несвязанные белки удаляли переосаждением ДНК и ДНК—белковых комплексов цетавлоном, а непришитую ДНК отделяли экстракцией фенолом. При этом ДНК—белковые комплексы оставались в фенольной фазе, Далее ДНК —белковые комплексы анализировали при помощи двумерного гель — электрофореза (рис. 1).

Идея этого метода анализа состоит в том, что при электрофорезе в первом направлении происходит разделение сшитых комплексов по молекулярной массе, которая зависит как от длины фрагмента ДНК, так и от молекулярной массы сшитого белка. При электрофорезе во втором направлении предварительно проводится деградация пришитых к ДНК белков путем гидролиза их проназой непосредственно в геле и разделение освободившихся фрагментов ДНК. В результате фрагменты ДНК, пришитые первоначально к одному и тому же белку, располагаются на одной диагонали (Shick et. al, 1980). Анализируя интенсивность окраски бромистым этидием, количество и углы наклона диагоналей, можно оценить сравнительную эффективность реакции сшивки в различных экспериментах, состав и молекулярные массы белков, сшитых с ДНК.

При распределении ДНК—белковых комплексов в системе двумерного электрофореза после проведения реакции in vitro, наблюдаются диагонали, соответствующие белкам, сшитым с ДНК (рис. 2 а; СН, LH). Количественный выход сшивки с гистонами нуклеосомного кора (диагональ СН, рис. 2 а) и гистоном HI (диагональ LH, рис. 2 а) составил 12,9% от суммарного количества ДНК (в ед. D260). В качестве контроля использовали хроматин, не инкубировавшийся с радикал— продуцирующей системой и не восстановленный борогидридом натрия, подвергавшийся всем дальнейшим процедурам очистки ДНК —белковых

* ntofuwcut

(К'ЛПК I fu'jmit 2 ДНК

Си/Н„0„

Си/ОР

В

В

рис.2 ВЛИЯНИЕ КОФАКТОРОВ РАДИКАЛ-ПРОДУЦИРУЮЩЕГО КОМПЛЕКСА НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ ДНК-БЕЛКОВОЙ СШИВКИ а- 0Р/Си/Н202; б- Си/Н202; в- Си/ОР; г- ОР/Н2Ог; д- Си; е- ОР; ж — Нг02; з— контроль; СН— ДНК, сшитая с горовыми гистонами; Ш — ДНК, сшитая с линкерными гистонами; О— свободная ДНК.

комплексов параллельно с пришитым хроматином. В контрольном эксперименте наблюдается только диагональ свободной ДНК (рис. 2 з). Таким образом, можно сделать вывод о высокой эффективности применения комплекса 1,10—фенантролин —Си для получения ДНК-белковой сшивки в присутствии перекиси водорода в анаэробных условиях in vitro.

2. Исследование механизма реакции образования ДНК-белковой сшивки

Для проверки предполагаемого механизма сшивки ДНК с аминокислотами белков через образование такого промежуточного продукта как основание Шиффа, ненасыщенная двойная связь которого легко распадается при рН 3.0 (Levina et al., 1981), был поставлен модельный эксперимент, в котором сшитый хроматин эритроцитов курицы подвергали гидролизу в слабокислой среде до и после восстановления двойной связи в промежуточном продукте борогидридом натрия. В случае, если основание Шиффа действительно является интермедиатом реакции образования ДНК—белковой связи, инкубация сшитого хроматина в буфере с рНЗ.О должна приводить к распаду кислотолабильной ненасыщенной связи иминов.

Было обнаружено, что воздействие слабокислой среды вызывает значительное уменьшение относительного содержания пришитых ДНК — белковых комплексов, что выражается в уменьшении интенсивностей соответствующих диагоналей (рис. 3 в). Это подтверждает сделанное предположение о том, что значительная часть взаимодействий между белком и ДНК происходит с промежуточным образованием оснований Шиффа. Однако при этом оказалось, что часть ДНК—белковых комплексов остаются стабильными в этих условиях, так как диагонали сшивки исчезают неполностью (рис. 3 в), из чего следует, что существует некий дополнительный механизм взаимодействия нуклеиновых кислот с белками в данных условиях. При этом происходят также качественные изменения (рис.3 в): среди ДНК-белковых комплексов, устойчивых к кислотному гидролизу, возрастает количество комплексов, содержащих длинные фрагменты ДНК (рис. 3 в) по сравнению с контролем (рис. 3 а),

а ОР, контроль 6 КаВНгрН3.0

иГснЪ ш сн Ъ

рис. 3 СУЩЕСТВОВАНИЕ ТРЕХ ТИПОВ ХИМИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ ПРИ ОБРАЗОВАНИИ ДНК—БЕЛКОВОЙ СШИВКИ КОМПЛЕКСОМ 1,10-ФЕНАНТРОЛИН-Си(И). а — контрольная сшивка;

б— сшивка, гидролизованная при рНЗ.О после восстановления борогидридом натрия;

в— сшивка, гидролизованная при рНЗ.О до восстановления; г— несшитый хроматин; Б — свободная ДНК;

СН- ДНК, сшитая с коровыми гисгонами; Ш— ДНК, сшитая с линкерными гисгонами.

Это указывает на то, что часть ковалентных связей, которые не гидролизуются при инкубации в буфере с рН 3.0, образуются без разрыва цепи ДНК в месте сшивки.

Сравнивая опыт, в котором восстановление сшитых комплексов ДНК с белками предшествовало инкубации в кислой среде (рис. 3 б), с контрольной пришивкой (рис. 3 а), отмечаем, что уменьшаются интенсивности диагоналей фрагментов ДНК, соответствующих сшитым комплексам с белками в первом случае. Таким образом, небольшая часть ДНК —белковой сшивки образуется посредством кислотолабильной связи, на стабильность которой восстановление борогидридом натрия не влияет. Известно, что ковалентная связь между С—6 тимина и а—аминогруппой лизина может легко разрушаться в слабокислой среде (Байо е1 а1„ 1983), и восстановление борогидридом натрия никак не влияет на ее устойчивость к гидролитическому расщеплению. Возможно, часть комплексов ДНК с белками в системе 0Р/Си/Н202 образуется посредством такой или аналогичной связи. Следует отметить, что уменьшение количества ДНК —белковой сшивки в этом опыте не сопровождается изменениями длины фрагментов ДНК, взаимодействующих с белками (рис. 3 б, диагонали СН, Ш), по сравнению с контрольной сшивкой (рис. 3 а, диагонали СН, Ш). Это свидетельствует о том, что образование такой кислотолабильной, не стабилизируемой восстановлением ДНК —белковой связи сопровождается расщеплением ДНК.

Обобщая полученные результаты, можно сделать вывод, что ДНК —белковая сшивка при воздействии радикал—продуцирующей системы, содержащей комплекс 1,10—фенантролин—медь и перекись водорода, в анаэробных условиях идет через образование трех видов химических связей:

— кислотолабильной, стабилизируемой восстановлением связи С = К основания Шиффа, сопровождающейся разрывом цепи ДНК в месте пришивки;

— кислотолабильной, не стабилизируемой гидрированием связи, сопровождающейся расщеплением ДНК;

— кислотоустойчивой связи, не сопровождающейся разрывом

ДНК.

3. Влияние компонентов радикал-продуцирующей системы (фенантролина, ионов Си3*, перекиси водорода) на эффективность образования ДНК-белковой сшивки

Ранее было исследовано, что перекись водорода самостоятельно (Szmigiero & Studzian, 1987; Dizdaioglu et al„ 1989; Olinski et al., 1992) или в присутствии ионов переходных металлов, таких как Fe2+, Cuî+ (Nackerdien et al., 1981; Chiu et al., 1993), NiJ+ и Cr3+(Patierao et al., 1985; Wendrichowski et al., 1985; Lin et al., 1992; ) способна генерировать ДНК —белковую сшивку, образование которой сопровождалось образованием химических связей между аминокислотами белков и основаниями нуклеиновых кислот. При этом всегда происходят значительные модификации как оснований ДНК, так и белков, Было показано, что комплекс Fe—ЭДТА в присутствии перекиси водорода индуцирует образование радикалов ОН', которые вызывают ковалентное связывание белков с ДНК. Сделано предположение о том, что реакция протекает по радикальному механизму и состоит из превращений Фентона, из чего был сделан вывод, что любая система, построенная по типу; лиганд + ионы переходных металлов + перекись водорода, — может индуцировать образование ДНК —белковой сшивки (Lesko et al., 1982).

Для исследования влияния каждого из компонентов радикал-продуцирующей системы на эффективность образования ковалентной ДНК—белковой связи были проведены контрольные эксперименты, в которых хроматин инкубировали в буфере, не содержащем один из кофакторов (фенантролин, ионы меди или перекись водорода), необходимых для образования радикал—продуцирующего комплекса и затем, после очистки, анализировали ДНК—белковую сшивку при помощи двумерного диагонального гель—электрофореза (рис. 2). Эффективность сшивки в разных системах определяли по общему содержанию ДНК после проведения эксперимента, а также по количеству ДНК, оказавшейся ковалентно связанной с белками, которое можно оценить при сравнении интенсивностей соответствующих

диагоналей р, и СН+Ш, на рис. 2). Кроме того, сравнивалась относительная длина диагоналей, соответствующих свободной ДНК (О) в разных экспериментах, что позволяет оценить уровень деградации ДНК: чем длиннее диагональ, тем выше степень расщепления.

Проведенный анализ выявил наличие наибольшего количества ДНК—белковых комплексов в полной трехкомпонентной системе (ОР, Си2+, Н202, рис. 2 а), а суммарный выход сшивки во всех двухкомпонентных системах был больше, чем в случаях обработки хроматина одним из компонентов реакции. Это указывает на участие всех трех кофакторов в процессе индукции реакции сшивки. Исключение из реакционного буфера фенантролияа приводит к снижению количественного выхода обогащенной фракции ДНК— белковых комплексов и увеличению содержания несшитой ДНК (рис. 2 б). Полученные результаты позволяют предположить, что хотя фенантролин и вовлечен в процесс индукции реакции образования ДНК —белковой сшивки, он не оказывает решающего влияния на ее эффективность и привносит наименьший вклад в количественный выход ковалентных комплексов (рис. 2 б, е).

Отсутствие в реакционном буфере перекиси водорода приводит к значительному уменьшению содержания продукта реакции (рис. 2 в). Однако то, что наименьшее количество ДНК—белковых комплексов среди всех двухкомпонентных систем наблюдалось в эксперименте, где хроматин инкубировали в буфере, содержащем фенантролин и перекись водорода (рис. 2 г), указывает на важность присутствия в реакционном буфере именно ионов меди, так как они оказывают наибольшее влияние на эффективность индукции образования ДНК — белковой связи. Этот вывод подтверждается результатом эксперимента, в котором хроматин подвергали воздействию одних ионов меди (рис. 2 д). В этом опыте наблюдали образование небольшого количества сшитых комплексов, в то время как в остальных однокомпонентных системах ДНК—белковых комплексов не обнаружено (рис.2 е, ж).

Важно отметить, что уровень расщепления ДНК во всех экспериментах находился в прямой зависимости от количества образующейся сшивки. При этом присутствие в реакции только

перекиси водорода, часто используемой для индукции нуклеазной реакции (Armel et al., 1977; Szmigiero & Studzian, 1987), в анаэробных условиях эксперимента не привело к увеличению уровня деградации ДНК хроматина (рис 2 ж), что указывает на существование отличий между химическими механизмами процессов индукции окислительного расщепления нуклеиновых кислот и образования ДНК—белковой сшивки.

Л. Исследование возможности применения радикал-продуцирующего комплекса для ковалентной фиксации белков на хлоропластной ДНК в условиях In situ

Известно, что геном хлоропластов, подобно бактериальной хромосоме, существует в высококонденсированном состоянии, ассоциируясь с белками, гетерогенными по молекулярной массе, аминокислотному составу и происхождению, среди которых были идентифицированы и гистоноподобные белки (Юрина и др., 1988; 1992; Yurina et al., 1995). Их число и состав меняются в течение дифференцировки (Лось и др., 1987; Nemoto et al., 1990; Филиппович и др., 1993; Sato et al., 1997) и под воздействием условий внешней среды. При этом наблюдаются и морфологические изменения нуклеоидов (Miyamura et al., 1990; Sato et al., 1997). Сообщалось об обнаружен™ нуклеосомо — подобных частиц, которые наблюдали при помощи электронной микроскопии (Kuroiwa et al., 1981; Briat et al., 1982; Rose et al., 1982; Kisëleva et al.,1989; Salganik et al., 1991).

Однако до сих пор не исследован вопрос о том, какие именно белки непосредственно взаимодействуют с ДНК, как распределены их контакты на различных нуклеотидных последовательностях генома хлоропластов, а также о наличии регулярного строения ДНК — белковых комплексов и возможности существования нуклеосомо—подобной организации хлоропластных нуклеоидов.

Для исследования взаимодействий ДНК с белками в хлоропластах был использован разработанный нами метод фиксации ДНК —белковых контактов радикал—продуцирующим комплексом 1,10—фенантролин — Си (II).

Эксперименты проводили на структурно интактных очищенных хлоропластах 12—14—дневных проростков гороха Pisum sativum L. Для

возможности применения данного методического подхода важно было убедиться, что инкубация хлоропластов с компонентами радикал — продуцирующей системы не приводит к нарушению структурной интактности и при этом не происходит существенного изменения суммарного белкового состава: деградации белков и образования их димеров.

Структуру хлоропластов контролировали при помощи световой микроскопии органелл непосредственно после их выделения из растений и инкубации с комплексом фенантролин—медь в присутствии перекиси водорода, при продувании аргоном в течение 30 минут на льду. Результаты исследования показывают, что структурная интактность хлоропластов не нарушалась в ходе эксперимента. Распределение суммарных белков хлоропластов при электрофоретическом разделении в присутствии ДДС —Na также не изменяется после ДНК—белковой сшивки. Таким образом, при данном методе сшивки не происходит модификации белков, как это бывает при сшивках, индуцированных ультрафиолетом, и не требуется предварительная модификация оснований нуклеиновых кислот, вызывающая изменение ДНК—белковых контактов, как при использовании диметилсульфата, что делает данную методику предпочтительной для исследования в условиях in vivo.

II. ИЗУЧЕНИЕ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ ХЛОРОПЛАСТОВ

1. Обнаружение белков, взаимодействующих с хлоропластной ДНК

Схема эксперимента изучения ДНК — белкового комплекса нуклеоида хлоропластов представлена на рис. 4.

Для обнаружения и исследования ДНК—связывающих белков хлоропластов был использован подход, основанный на фиксации ДНК— белковых контактов непосредственно в интактных очищенных хлоропластах. Этот метод позволяет изучать нативную структуру ДНК— белковых комплексов в хлоропластах in situ, определять и сравнивать их состав в различных физиологических состояниях.

12-14 - дневные проростки гороха

ХЛОРОПЛАСТЫ

ДНК-белковая сшивка

восстановление

ядра

гидролиз ЛШаве

I направление Электрофореза ДНП в нативных условиях

удаление непришитых белков и ДНК

II направление электрофореза ДНП в денатурирующих условиях

выделение ДНК

электрофорез в агарозном геле

(анализ ДНК) (анализ белков)

2В-диагональный гель-электрофорез

перенос ДНК на мембрану

электроперенос ДНК на мембрану

ГИБРИДИЗАЦИЯ

гидролиз МЫаве

введение 32Р по месту сшивки

ДДС-ПААГ-электрофорез

ГИБРИДИЗАЦИЯ

1

рис.4. СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЯ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ ХЛОРОПЛАСТОВ

Для идентификации белков, сшитых с ДНК, очищенные ДНК — белковые комплексы фракционировали в системе диагонального двумерного электрофореза (Shick et al„ 1980), В эксперименте все фрагменты ДНК после разделения во втором направлении распределились вдоль четырех диагоналей (рис. 5 Б). Диагональ D содержит непришитую, свободную ДНК. Дополнительные диагонали 1, 2, 3 соответствуют ДНК, ковалентно связанной с тремя белками. Таким образом, было показано существование по крайней мере трех белков, непосредственно взаимодействующих с хлоропластной ДНК.

Для более точного определения числа и молекулярных масс белков, сшивающихся с хлоропластной ДНК, в нуклеотид—пептиды была введена радиоактивная метка (Ebralidze et al., 1988; Mirzabekov et al, 1989). ДНК—белковые комплексы, выделенные из хлоропластов, подвергали действию микрококковой нухлеазы для исчерпывающего гидролиза ДНК, в результате чего оставалась негидролизуемая часть ДНК в виде 5'— нуклеотида, ковалентно связанного с белком, которую кинировали 33Р—уАТР полинуклеотид—киназой фага Т4. Таким образом, белки были помечены по месту сшивки (с ДНК). Индивидуальные нуклеотид—пептиды разделяли с . помощью электрофореза в присутствии ДД.С — Na. Сравнивая их подвижность в геле с подвижностью белков — маркеров, можно оценить их молекулярные массы. На авторадиограмме (рис. б) представлены семь полипептидов, меченных по месту сшивки, молекулярные массы которых составили около 12; 14; 17; 20; 27; 31 и 34 кДа, соответственно. Ошибка определения молекулярных масс этим методом составила ±1кДа. ДНК—связывающие белки, которые обнаруживают в хлоропластах, можно разделить на две основные группы; сайт—специфические и неспецифические. Среди белков, которые связываются с определенными последовательностями, можно выделить факторы, влияющие на процессы транскрипции, и белки, которые прикрепляют хпДНК к тилакоидной мембране хлоропластов (Lam et al,,1989; Baeza et al., 1991; Sato et al., 1993; Kim & Mullet, 1995; To et al., 1996; Cheng et al„ 1997).

рис.4 ИССЛЕДОВАНИЕ ДНК-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ХЛОРОПЛАСТОВ В

СИСТЕМЕ 2D-ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА. А — Карта хпДНК. Отмечены положения гибридизациониых проб-. Р!2 (1.1 т.п.н., 5' — psbC, З'-psbD); P1I (1.8 т.п.н., 5'-alpB, 5'-rbcL); Р9 (5.7 т.п.н., 5'-psbD, trnE, tmY, tmD, 5'-psaA); K11 (0.7 т.п.н., 23SrDNA); P - PstI; К - KpnI. Б— Распределение хпДНК, сшитой с белками, после их гидролиза проназой. D — несшитая ДНК; 1, 2, 3, — ДНК, связанная с белками (окраска геля бромистым этидием);

В— Радиоавтография блота, полученного после переноса ДНК из геля, представленного на рис. 4Б, на мембрану и последовательно прогибридизованного с пробами Р12; Р11; Р9; КН.; D - диагональ несшитой ДНК; 1, 2, 3 — диагонали ДНК, сшитой с белками хлоропластов.

Неспецифические ДНК — связывающиеся белки, по—видимому, участвуют в структурной организации нуклеоидов. Ранее было показано, что белки нуклеоида хлоропластов весьма гетерогенны по составу. Существует 37 полипептидов с молекулярными массами от 12 до 180 кДа, причем среди них есть высокоосновные полипептиды, выделяемые экстракцией 0.4 н серной кислотой, молекулярные массы которых при определении в системе двумерного гель—электрофореза составляют 14; 16; 20; 21; 27; 31; 32; 46 кДа, соответственно (Briat et al., 1982). Кроме того, оказалось, что среди них есть полипептиды, электрофоретическая подвижность которых в ПААГ в присутствии ДДС —Na, а также аминокислотный состав близки к гистонам НЗ и Н2а + Н2Ь (Юрина и др., 1988; Yurina et al., 1995). Показано, что в составе белков нуклеоидов хлоропластов гороха есть белки с молекулярными массами 17; 20; 26; 34 кДа, дающие иммунологическую реакцию с антителами к гистоноподобному белку HU E.coli (Briat et al., 1984; Henschke & Nucken, 1989),

При дифференцировке пропластид состав белков нукдеоидов изменяется (Nemoto et al., 1988; 1989; 1990). Так, например, нуклеоиды пропластид табака компактно организованы за счет электростатического взаимодействия пропластидной ДНК с четырьмя белками, молекулярные массы которых 69, 31, 30 и 14 кДа. Нуклеоиды хлоропластов табака имеют иной набор ДНК — связывающих белков с

М, кДа

ЛМ„ = +1кДа

Р1 = 12 кДа Р2 = 14 кДа РЗ = 17 кДа Р4 = 20 кДа Р5 = 27 кДа Рв = 31 кДа Р7 = 34 кДа

рис.6. РАССПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ХЛОРОПЛАСТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ПОСЛЕ ДНК-БЕЛКОВОЙ СШИВКИ, В 15% ПААГ В ПРИСУТСТВИИ ДДС-Иа. ДНК—белковые комплексы подвергали исчерпывающему гидролизу микрококковой нуклеазой и вводили 32Р по нуклеотидному остатку. Р1— Р7 — обозначены положения соответствующих нуклеотид—пептидов. М — обозначены положения мархерпых белков.

молекулярными массами 38,- 35,- 26 кДа (№то):о е4 а1.,1990).

Простое сопоставление молекулярных масс обнаруженных ДНК—связывающих белков с данными, которые известны в литературе, по—видимому, не может однозначно, определить функции, которые они выполняют в регуляции хлоропластного генома, — для этого требуется определить участки на ДНК, с которыми эти белки взаимодействуют и

выяснить, являются ли эти взаимодействия сайт—специфическими или не зависят от последовательностей ДНК.

2. Определение участков хлоропластной ДНК, взаимодействующих с обнаруженными белками

С целью сравнить белковый состав функционально отличающихся участков хлоропластного генома использовали метод гибридизации с "белковыми тенями" (Karpov et al., 1982; Nacheva et al., 1989). Для этого после двумерного электрофореза ДНК из геля переносили на мембрану и проводили гибридизацию полученных "белковых теней" с несколькими высокомеченными зондами, содержащими некоторые фрагменты ДНК хлоропластов гороха. Таким образом предполагалось выявить функциональную роль обнаруженных белков, найти среди них структурные и регуляторные белки нуклеоидов хлоропластов. Использовались зонды, содержащие как фотоиндуцируемые, так и конститутивные гены, а именно следующие пробы: Р12 (1.1 т.п.н,, включающая 5'—psbC- и 3'—psbD— фрагменты), Р11 (1.8 т.п.н., включающая 5'—atpB— и 5' —rbcL— фрагменты), Р9 (5.7 т.п.н., включающая 5'— psbD— фрагмент, tmE, tmY, tmD гены и 5'— psaA— фрагмент), К11 (0,7 т.п.н,, содержащая часть 23SrDNA гена) (рис. 5 А). Как следует из рис. 5 В, количество, примерная интенсивность и взаиморасположение диагоналей на всех авторадиограммах одинаковы и совпадают с картиной распределения ДНК—белковых комплексов в двумерном гель—электрофорезе после окрашивания бромистым этидием (рис. 5 Б). Исходя из этого, можно предположить, что обнаруженные белки взаимодействуют со всеми исследованными фрагментами хлоропластного генома, равномерно распределены вдоль них и, следовательно, могут принимать участие в структурной организации нуклеопротеидпого комплекса.

Сопоставление полученных результатов с литературными данными, указывает на сходство обнаруженных ДНК — связывающих белков с гистоноподобными и высокоосновными полипептидами, о которых сообщалось в нескольких исследованиях (Briat et al., 1982, 1984; Yurina et al., 1995).

3. Исследование макроструктуры нуклеоида хлоропластов

Полученные данные предполагают существование некой периодической структуры в организации нуклеоида хлоропластов по аналогии с хроматином эукариотических геномов, элементарной единицей надмолекулярной структуры которого является нуклеосома. С целью обнаружения аналогичных образований в хлоропластах были проведены нуклеазные тесты,

Результат электрофореза после гидролиза хлоропластов микрококковой нуклеазой и депротеинизации фенолом представлен на рис. 7. Наблюдаются дискретные фрагменты ДНК, длина которых кратна 184 п.н. (±2 п.н.) (рис. 7 А, хп). Исследования, проведенные с помощью электронной микроскопии, также выявили наличие "бусиничных" структур в составе нуклеоида. Таким образом, подтвердилось предположение о существовании некой повторяющейся дезоксинуклеопротеидной (ДНП) структуры в организации нуклеоида хлоропластов.

Важно отметить, что некоторые исследователи неоднократно наблюдали с помощью электронной микроскопии нуклеосомо— подобные структуры (Briat et al,, 1982; Rose et al., 1982; Kiseleva et al., 1989; Salganik et al., 1991), однако попытки их биохимического исследования не привели к успеху, в частности, нуклеазные тесты, проводимые на выделенных и очищенных нуклеоидах хлоропластов, не подтвердили наличия периодических структур (Briat et al., 1982). С использованием электронной микроскопии было показано, что эти образования крайне нестабильны и при нарушении целостности мембраны тилакоидов быстро распадаются (Salganik et al„ 1991). Возможно, с этим связаны неудачи при попытке исследовать подобные структуры в изолированных нуклеоидах, при выделении которых всегда проводили предварительный лизис органелл неионными детергентами. В данном исследовании гидролизу микрококковой нуклеазой подвергали интактные хлоропласты, непосредственно после выделения и очистки, подбирая концентрацию фермента таким образом, чтобы максимально сократить время инкубации (не более 1 — 2 мин.) с целью предотвратить

А Б

рис, 7. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ В АГАРОЗЕ (1.5%) ФРАГМЕНТОВ ДНК, ПОЛУЧЕННЫХ ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ ИНТАКТНЫХ ХЛОРОПЛАСТОВ (ХП) И ЯДЕР (Я) ГОРОХА МИКРОКОККОВОЙ НУКЛЕАЗОЙ.

А — гель, окрашенный бромистым этидием (EthBr).

Б — радиоавтограф блота, полученного после переноса ДНК из геля на нейлоновую мембрану (рис. 7А), и прогибридизованного с меченным "Р фрагментом хлоропластной ДНК (Р11; 1.8 т.п.н., содержит 5'—rbcL и 5' — atpB).

M —маркерная ДНК (п123п.н.) справа указаны размеры ДНК в п.н.;

N—, N2—, N6 —обозначены положения моно—, ди—, и т.д., гексамеров, образующихся при гидролизе MNase.

изменение и перераспределение структуры нуклеоида, а также чтобы увеличить эффективность реакции.

Представлялся важным вопрос о сходстве обнаруженных ДНП — структур хлоропластов с нуклеосомами ядер. Были проведены аналогичные исследования на клеточных ядрах гороха, которые

показали, что нуклеосомный повтор хроматина ядер оказался равным 170 и.н. (рис. 7 А, я), что указывает на индивидуальность наблюдаемых структур в хлоропластах. Не было найдено в литературе каких—либо исследований длины нуклеосомного повтора хроматина ядер гороха, однако сопоставление его величины, полученной в данном эксперименте, с длиной ДНК нуклеосом риса и пшеницы, у которых она составляет 175—180 п.н. (Vershinm & Heslop — Harrison, 1998), указывает на то, что это значение, по—видимому, типичное и мало отличается от величины нуклеосомного повтора, характерного для высших растений.

Для доказательства того, что обнаруженные повторяющиеся структуры, выявленные при гидролизе целых очищенных хлоропластов микрококковой нуклеазой, организованы хлоропластной ДНК, а не являются примесями нуклеосом ядерного хроматина, была проведена гибридизация блота, полученного после переноса фрагментов хлоропластной и ядерной ДНК из агарозного геля (рис. 7 А) на нейлоновую мембрану, с высокомеченным 32Р зондом, полученным из рестриктного фрагмента Р11 (по PstI) (рис. 5 А) хлоропластной ДНК, и включающего 5'—rbcL— и 5' — atpB— локусы. Радиоавтограф блота показан на рис. 7 Б. Результат гибридизации показал, что образующиеся в эксперименте кратные фрагменты (N—4N) принадлежат именно хлоропластной ДНК, причем их положение при гибридизации оказывается таким же, как при разделении в агарозном геле (рис. 7 А). Результат этого эксперимента продемонстрировал индивидуальность наблюдаемых периодических ДНП —структур в хлоропластах. Таким образом, биохимическими методами было показано наличие нуклеосомо — подобных структур в хлоропластах, которые раньше наблюдали лишь при помощи электронной микроскопии (Briat et al,, 1982; Kiseleva et al., 1989; Salganik et al., 1991).

4. Исследование белкового состава хлоропластных ДНП-структур

Для изучения белкового состава обнаруженных ДНП—структур хлоропластов их анализировали при помощи двумерного гель—

электрофореза, Выделенные хлоропласта и клеточные ядра гороха подвергали гидролизу микрококковой нуклеазой и затем образующийся гидролизат наносили на неденатурирующий гель первого направления. После разделения в 7% ПААГ с низким процентом сшивки, вырезали полоски с разделившимися ДНП—структурами (moho — , ди, и тримерами) (рис. 8 А) и приполимеризовывали их к денатурирующему гелю второго направления, содержащему 7 М мочевину и ДДС — Na. Для исследования фрагментов ДНК, связанных с ДНП — структурами, гель второго направления окрашивали бромистым этидием (рис. 8 Б), а для изучения их полипептидного состава использовали окраску того же геля Кумасси (рис. 8 В).

Результаты показали, что длина так называемой коровой ДНК хлоропластов гороха и клеточных ядер гороха, которую определяли с помощью гидролизата Нолла (Noll, 1976), примерно одинакова и равняется приблизительно 150 п.н. Однако, уже на уровне димеров можно заметить некоторую разницу в длине получающихся фрагментов ДНК из хлоропластов и ядер. Это дает основание предполагать, что размеры так называемой линкерной ДНК между ДНП — структурами из хлоропластов и ядер различаются между собой.

Дальнейшее исследование белкового состава ДНП —структур хлоропластов и ядер показывает, что между ними существует значительное сходство по электрофоретической подвижности в ПААГ в присутствии ДДС-Na (рис.8 В). Это'не позволяет, однако, утверждать, что белки, которые участвуют в организации компактных структур хлоропластной ДНК являются гистонами: для подобного заключения необходимы более детальные исследования их первичной структуры. Однако данные результаты позволяют предполагать, что определенные аналогии в строении этих белков существуют.

Сопоставление электрофор етической подвижности в ПААГ в присутствии ДДС—Na ДНП—полипептидов и белков, экстрагирующихся 0.4 н серной кислотой, показало, что их молекулярные массы совпадают и составляют примерно 12; 14; 16; 17; 18; 20; 27; 31 и около 50—55 кДа (рис. 8 В, а). Это в целом во многом совпадает с молекулярными массами хлоропластных белков, полученных

а хлоршмасКП" EtilBl' » I

И

Б N 2N :,N EthBr

-jjsi a хлоропласта в 2N

N

100 я.

В

й

а Кумассн

,м

M üb

2N ЗМ ' 3N 2N ■ ■"««jy

6 В

N М, кД(

HL«" .—31

ÍP1

JM

рис. 8. ИССЛЕДОВАНИЕ НУКЛЕОСОМО-ПОДОБНЫХ СТРУКТУР ХЛОРОПЛАСТОВ ПРИ ПОМОЩИ ДВУМЕРНОГО ПААГ— ЭЛЕКТРОФОРЕЗА.

А — электрофореграмма геля, окрашенного бромистым этидием (ЕШВг), после разделения в I—ом поправлении электрофореза (7% ПААГ) в неденатурирующих условиях ДНП—структур, полученных в результате инкубации интактных хлоропластов (а) и клеточных ядер (б) гороха с микрококковой нуклеазой.

Б — электрофореграмма геля II—го направления электрофореза в 15% ПААГ в присутствии ДДС—Иа и 7 М мочевины (окраска бромистым этидием). а— распределение ДНК после денатурации ДНП—структур из хлоропластов (рис. 8 А, а); б— распределение ДНК после денатурации ДНП хроматина ядер (рис 8 А б); в—гидролизат Нолла, использующийся в качестве маркера длины ДНК в денатурирующих условиях (пЮ), размеры указаны в нуклеотидах (н.) справа;

В — электрофореграмма геля, показанного на рис. 8 Б после окраски Кумасси. а— распределение полипептадов (01—08), образующих ДНП—структуры хлоропластов; б— распределение гистонов из хроматина ядер; в— гистоны эритроцитов курицы; М — маркерные белки.

N. N2, N3 — моно —. ди—, тримеры.; хп — хлоропласты; я — ядра.

в экспериментах с использованием метода ДНК—белковой сшивки. Таким образом, двумя независимыми способами — с использованием метода ковалентной фиксации ДНК—белковых взаимодействий и исследованием нативных ДНП—структур, образующихся в результате применения нуклеаз, — было показано существование и определены молекулярные массы ДНК—связывающих белков в хлоропластах, которые, по —видимому, участвуют в формировании компактных периодических нуклеосомо подобных структур.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Все рассмотренные данные позволяют утверждать, что существует сходство упаковки хлоропластной ДНК и хроматина эукариотических ядер посредством организации периодических многокомпонентных ДНК—белковых структур. Это может служить предпосылкой для изучения макромолекулярной структуры нуклеоидов митохондрий и бактерий, в которых также наблюдают методами электронной микроскопии некие периодические нуклеосомо — подобные частицы (Нситеге — Уапиг е1 а1., 1979; РеШ]оЬп е1 а1., 1988; Ба1дашк е1 а1., 1991).

ВЫВОДЫ

1. Разработан высокоэффективный метод ДНК—белковой сшивки, индуцированной радикал—продуцирующим комплексом 1,10— фенантролин—Cu(II) в присутствии перекиси водорода в анаэробных условиях. Показано, что при этом образуются по крайней мере три типа химических связей, две из которых сопровождаются расщеплением ДНК. Обнаружено, что присутствие ионов меди оказывает наибольшее влияние на эффективность образования сшитых нуклеопротеидных комплексов.

2. Показано, что предложенный метод может применяться для фиксации ДНК — белковых контактов в хлоропластах в условиях in situ. При этом не происходит нарушения структурной интактности пластид, деградации белков и образования их димеров.

3. Использование ковалентной сшивки в хлоропластах гороха позволило обнаружить семь ДНК—связывающих белков с молекулярными массами 12; 14; 17; 20; 27; 31 и 34 кДа и показать, что они взаимодействуют со всеми исследованными последовательностями генома хлоропластов, содержащими как фотоиндуцируемые, так и конститутивные гены, и, следовательно, выполняют структурную функцию.

4. С помощью нуклеазных тестов в интактных хлоропластах выявлены повторяющиеся структуры, похожие на нуклеосомы хроматина эукариот. Белки — компоненты регулярных структур хлоропластов гороха совпадают по электрофоретической подвижности в ПААГ с ДНК—связывающими белками, обнаруженными методом ковалентной сшивки. Показано, что средняя длина ДНК, участвующей в образовании таких структур в хлоропластах (184 п.н.), отличается от длины нуклеосомного повтора ядерного хроматина гороха (170 п.н.).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Gavin I.M., Melnik. S.M., Yurina N.P., Khabarova M.I., Bavykin S.G. Zéro—length Protein—nucleic Acid Crosslinking by Radical — generating Coordination Complexes as a Probe for Analysis of Protein — DNA

Interactions in vitro and in vivo., Analytical Biochemistry, 1998, 263 (1), p. 26-30.

2. Pruss D., Gavin I.M., Melnik S. and Bavykin S. Advances in DNA—protein Crosslinking Applications for Chromatin Studies in vitro and in vivo., Methods in Enzymology, 1998, v.304.

3. Odintsova M.S., Melnik S.M., Yurina N.P., The organization and function of chloroplast genome. Adstracts of International Symposium "Problems of biochemistry, radiation and space biology", Moscow, Dubna, 1997, p.lll.

4. Одинцова M.C., Мельник C.M., Юрина Н.П., Организация и функция генома хлоропластов. В трудах Международного симпозиума под эгидой ЮНЕСКО "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии"., Москва, 1997, Т.1, С. 193—196.

5. Oleskina Yu.P., Melnik S.M., Yurina N.P., Odintsova M.S. Nucleoid proteins in chloroplast genome organization. Abstracts of International Symposium "Problems and trends of photobiochemistry", Moscow, May 22-29, 1997, P.52.

6. Мельник C.M., Юрина Н.П., Бавыкин С.Г., Одинцова М.С., ДНК—связывающие белки, обнаруженные в хлоропластах Pisum sativum L. методом ДНК —белковой сшивки. Тезисы III ежегодного симпозиума Российского общества физиологов растений "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология", Москва, 27—28 июня, 1997, С, 14,

7. Олескина Ю.П., Мельник С.М., Юрина Н.П., Одинцова М.С. ДНК—связывающие белки транскрипционно — активной хромосомы из хлоропластов гороха. Тезисы II Съезда Биохимического общества РАН. Москва, 13-23 мая 1997, 4.1, С.219-220.

8. Yurina N.P., Oleskina Yu.P., Melnik S.M., Odintsova M.S. DNA— binding proteins of chloroplast nucleoids. Abstracts of NATO advanced research workshop "The chloroplast: From Molecular Biology to Biotechnology". Crete, Greece, 1998, p.95.

9. Yurina N.P., Oleskina Yu.P., Melnik S.M., Belkina G.G., Odintsova M.S. Chloroplast DNA—binding proteins. Proceedings of Int, Symposium "Molecular mechanisms of stress responses in plants" M.1998, p.160.

Издательство АО "Диалог-МГУ".

ЛР № 063999 от 04.04.95 г. Подписано к печати 17.11.98 г. Усл.печ.л. 2. Тираж 80 экз. Заказ 946. Тел. 939-3890,928-2227,928-1042. Факс 939-3891. 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мельник, Светлана Михайловна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н.БАХА

На правах рукописи

МЕЛЬНИК СВЕТЛАНА МИХАЙЛОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ БЕЛКОВ С ДНК В ИНТАКТНЫХ ХЛОРОПЛАСТАХ МЕТОДОМ КОВАЛЕНТНОЙ ФИКСАЦИИ

03.00.04 - БИОХИМИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

$

Москва-1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

I. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

II. ВВЕДЕНИЕ 6

III. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1. СТРУКТУРА ГЕНОМА ХЛОРОПЛАСТОВ 10

1.1. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ГЕНОМА ХЛОРОПЛАСТОВ 10

1.2. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НУКЛЕОИДОВ ХЛОРОПЛАСТОВ, СРАВНЕНИЕ ИХ С НУКЛЕОИДАМИ МИТОХОНДРИЙ И БАКТЕРИЙ 19

1.3. ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ НУКЛЕОИДА ХЛОРОПЛАСТОВ 27

1.4. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОМА ХЛОРОПЛАСТОВ 34

2. КОМПЛЕКС 1гЮ-ФЕНАНТРОЛИН-Си(П) КАК ХИМИЧЕСКАЯ НУКЛЕАЗА 39

2.1 ХИМИЧЕСКИЕ НУКЛЕАЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 39

2.1.1 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКИХ НУКЛЕАЗ 39

2.1.2. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ МЕХАНИЗМА РАСЩЕПЛЕНИЯ ДНК

2.1.3. ХИМИЧЕСКИМИ НУКЛЕАЗАМИ 39

а) связывание с ДНК 40

б) роль кофакторов взаимодействия: ионов металлов, перекиси водорода 41

в) пути расщепления ДНК и продукты реакции 43 2.1.3. ПРИМЕНЕНИЕ ХИМИЧЕСКИХ НУКЛЕАЗ 45

2.2. НУКЛЕАЗ ПАЯ АКТИВНОСТЬ КОМПЛЕКСА 1,Ю-ФЕНАНТРОЛИН-Си(Н) 46

2.2.1. ОТКРЫТИЕ НУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ 46

2.2.2. СВЯЗЫВАНИЕ КОМПЛЕКСА С ДНК 46

2.2.3. ВЛИЯНИЕ КОФАКТОРОВ: Си2+ И Н202 НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ РАСЩЕПЛЕНИЯ ДНК ФЕНАНТРОЛИНОМ 47

2.2.4. ПРОДУКТЫ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ ДНК, ИНДУЦИРОВАННОГО КОМПЛЕКСОМ

1,10 —ФЕНАНТРОЛИН —Cu(II) 48

3. МЕТОДЫ СШИВКИ БЕЛКОВ С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ

49

3.1. ПРИМЕНЕНИЕ ДИМЕТИЛСУЛЬФАТА ДЛЯ ИНДУКЦИИ ДНК-БЕЛКОВОЙ

СШИВКИ 51

3.2. ДНК-БЕЛКОВЫЕ СШИВКИ, ИНДУЦИРОВАННЫЕ ОБЛУЧЕНИЕМ УЛЬТРАФИОЛЕТОМ 54

3.3. ДНК-БЕЛКОВЫЕ СШИВКИ, ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПЕРЕКИСЬЮ ВОДОРОДА И ИОНАМИ ПЕРЕХОДНЫХ МЕТАЛЛОВ 57

IV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 60

1. МАТЕРИАЛЫ 61

2. МЕТОДЫ 62

2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЯДЕР ИЗ ЭРИТРОЦИТОВ КУРИЦЫ 62

2.2. ПОЛУЧЕНИЕ РАСТВОРИМОГО ХРОМАТИНА 62

2.3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ХЛОРОПЛАСТОВ 63

2.4. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА КЛЕТОЧНЫХ ЯДЕР ИЗ

ПРОРОСТКОВ ГОРОХА 64

2.5. ИНДУКЦИЯ ДНК-БЕЛКОВОЙ СШИВКИ 64

2.6. ВОССТАНОВЛЕНИЕ ДНК-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ 65

2.7. ГИДРОЛИЗ ДНК - БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ 66

2.8. УДАЛЕНИЕ НЕПРИШИТЫХ БЕЛКОВ ПЕРЕОСАЖДЕНИЕМ ДНК И ДНК-

БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦЕТАВЛОНОМ 66

2.9. УДАЛЕНИЕ НЕПРИШИТОЙ ДНК 67

2.10. АНАЛИЗ ДНК-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ В СИСТЕМЕ ДИАГОНАЛЬНОГО ДВУМЕРНОГО ПААГ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА 67

2.11. ЭЛЕКТРОПЕРЕНОС ФРАГМЕНТОВ ДНК ИЗ ГЕЛЯ НА НЕЙЛОНОВУЮ МЕМБРАНУ 69

2.12. ГИБРИДИЗАЦИЯ ДНК, ФИКСИРОВАННОЙ НА НЕЙЛОНОВОЙ МЕМБРАНЕ С РАДИОАКТИВНО МЕЧЕННЫМИ ЗОНДАМИ 69

2.13. ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНО МЕЧЕННЫХ ЗОНДОВ ДНК 69

2.14. УДАЛЕНИЕ БОЛЬШЕЙ ЧАСТИ КОВАЛЕНТНО СШИТОЙ С БЕЛКОМ ДНК 71

2.15. ВВЕДЕНИЕ РАДИОАКТИВНОЙ МЕТКИ В БЕЛОК ПО МЕСТУ СШИВКИ С ДНК 71

2.16. СИСТЕМА ПААГ ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ ДНК - СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ, МЕЧЕННЫХ ПО МЕСТУ СШИВКИ С ДНК 72

2.17. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ДНК - БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА in situ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОКОККОВОЙ НУКЛЕАЗЫ 72

2.18. ВЫДЕЛЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ ДНК ПОСЛЕ НУКЛЕАЗНОГО ГИДРОЛИЗА И ИХ РАЗДЕЛЕНИЕ В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ 72

2.19. ВАКУУМНЫЙ ПЕРЕНОС ДНК ИЗ АГАРОЗНОГО ГЕЛЯ НА МЕМБРАНУ 73

2.20. ДВУМЕРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНП - КОМПЛЕКСОВ 73

2.21. ОКРАШИВАНИЕ ГЕЛЯ КУМАССИ R-250. 73

2.22. ИССЛЕДОВАНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ ДНК - БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА ХЛОРОПЛАСТОВ И ХРОМАТИНА ЯДЕР 75

2.23. ЭКСТРАКЦИЯ СУММАРНЫХ БЕЛКОВ ХЛОРОПЛАСТОВ 75

2.24. ЭКСТРАКЦИЯ БЕЛКОВ ОСНОВНОГО ХАРАКТЕРА 75

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 76

1. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ И МЕХАНИЗМА

МЕТОДА ДНК-БЕЛКОВОЙ СШИВКИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ КОМПЛЕКСОМ 1,10-ФЕНАНТРОЛИН-Си(П) 78

1.1. ОБРАЗОВАНИЕ ДНК-БЕЛКОВОЙ СШИВКИ В УСЛОВИЯХ IN VTTRO 78

1.2. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА РЕАКЦИИ ОБРАЗОВАНИЯ

ДНК-БЕЛКОВОЙ СШИВКИ 83

1.3. ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ РАДИКАЛ-ПРОДУЦИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ (ФЕНАНТРОЛИНА, ИОНОВ CU*, ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА) НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ ДНК-БЕЛКОВОЙ СШИВКИ 86

1.4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ РАДИКАЛ-ПРОДУЦИРУЮЩЕГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ КОВАЛЕНТНОЙ ФИКСАЦИИ БЕЛКОВ НА ХЛОРОПЛАСТНОЙ ДНК В УСЛОВИЯХ IN SITU 88

2. ИЗУЧЕНИЕ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ ХЛОРОПЛАСТОВ 91

2.1. ОБНАРУЖЕНИЕ БЕЛКОВ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С

ХЛОРОПЛАСТНОЙ ДНК 91

2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УЧАСТКОВ ХЛОРОПЛАСТНОЙ ДНК, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С ОБНАРУЖЕННЫМИ БЕЛКАМИ 98

2.3. ИССЛЕДОВАНИЕ МАКРОСТРУКТУРЫ НУКЛЕОИДА ХЛОРОПЛАСТОВ 100

2.4. ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВОГО СОСТАВА ХЛОРОПЛАСТНЫХ ДНП-СТРУКТУР 105

VI. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 110

VII. ВЫВОДЫ 111

VIII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112

I. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А аденозин

бицин N Г]Ч - бис (гидроксиэтил) глицин

БСА бычий сывороточный альбумин

бтш белки теплового шока

Г гуанозин

ДДС-Ыа додецилсульфат натрия

ДМС диметилсульфат

ДМСО диметилсульфоксид

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНКаза I дезоксирибонуклеаза I

ДНП дезоксирибонуклеопротеид

ДТТ дитиотреитол

ИОХ ионообменная хроматография

ИП инвертированный повтор

мтДНК митохондриальная ДНК

мРНК матричная РНК

Р~МЭ р-меркаптоэтанол

н нормальность (оснований и кислот)

н. нуклеотид

ОРС открытая рамка считывания

ПААГ полиакриламидный гель

п.н. пары нуклеотидов

РНК рибонуклеиновая кислота

РНКаза I рибонуклеаза I

рРНК рибосомная РНК

РЦ реакционный центр

саркозил ^-соль N-лаурил-саркозина

Т тимидин

ТВЕ раствор: 89 мМ Трис, 89 мМ борной кислоты

т.п.н. тысяча пар нуклеотидов

Трис трис(гидроксиметил)метилглицин

тРНК транспортная РНК

ТХУ трихлоруксусная кислота

УФ ультрафиолет

фенантролин-медь - комплекс (2:1)1,10-фенантролин Си

ФМСФ фенилметансульфонилфторид ФС I фотосистема I ФС II фотосистема II хп хлоропласты хпДНК хлоропластная ДНК Ц цитидин

цистеамин 2-аминоэтанол гидрохлорид

цетавлон цетилтриметиламмонийбромид

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

я

ЯМР

АТР

В1.М

ВгсШ

ВАР1

с1ЛТР

dCTP

с1СТР

сГГТР

НЕРЕв

5-МГ

МК'аяе

МРЕ

ЫАВН

Ыа-Р

NEP

ОР

ОР-Си

РЕР 88С ТАЕ ТЕ

ТЕМБ

клеточные ядра ядерно-магнитный резонанс

аденозин-5'~трифосфат

блеомицин

бромдезоксиуридин

4\6-диамидино-2-фенилиндол

2'-дезоксиаденозин-5'-фосфат

2'-дезоксицитидин-5'-фосфат

2'-дезоксигуанозин 5'-фосфат

2'-дезокситимидин-5'-фосфат

N - 2 -гидроксиэтилпиперазин- Г\Р- 2 - этансу льфоновая кислота

5-метиленфуранон микрококковая нуклеаза мети д и у мпр опил - ЭДТА дигидроникотинамидадениндинуклеотид фосфатный буфер

РНК-полимеразаг кодируемая ядерным геномом о-фенантролин (2:1)1,10-фенантролин-Си2+ или (2:1)1,10-фенантролин-Си(П) РНК-полимераза, кодируемая пластидным геномом раствор: 0.15 М N80, 0.015 М №-цитрат буфер: 12 мМ Трис-6 мМ ацетат, 0.3 мМ ЭДТА, рН 7.5 буфер: 10 мМ Гри с - НС I, 1 мМ ЭДТА, рН 7.4 раствор: 1М ЫаС1, 5 М мочевина, 10 мМ Трис~НС1 10 мМ ЭДТА, рН 8.0

II. ВВЕДЕНИЕ

Ключевая роль макроструктуры генома эукариот в процессах генной регуляции клеточного метаболизма получила в настоящее время достаточно глубокое теоретическое и экспериментальное обоснование. Общепринятым стало представление, что геном как интегральная генетическая система может быть осмыслен только при одновременном развитии исследований всех уровней его структурной организации. Подобные исследования для генома хлоропластов, без которых невозможно понимание механизмов репликации и транскрипции в пластидах, находятся в начальной стадии. Каким образом осуществляется в клеточных органеллах компактизация ДНК и каковы механизмы, с помощью которых поддерживается надмолекулярное состояние ДНК хлоропластов in vivo, остается неизвестным. На данный момент существуют лишь данные электронной микроскопии (Briat et al., 1982; Salganik et al., 1991), свидетельствующие о наличии сходства в строении хромосом на молекулярном уровне в ядрах эукариот и геномах пластид, Однако совсем не изучен способ формирования нуклеопротеидного комплекса хлоропластов, в частности, неизвестно, соблюдается ли нуклеосомный принцип упаковки ДНК или же существует другой, принципиально отличный механизм компактизации пластидной ДНК. Очевидно, что упаковка ДНК должна осуществляться посредством взаимодействия с одним или несколькими ДНК — связывающими белками. Существует ряд исследований нуклеоидов хлоропластов, охарактеризован их общий белковый состав, но не решен вопрос, какие именно белки и каким образом непосредственно принимают участие в организации макроструктуры нуклеопротеидного комплекса пластид (Briat et al., 1982; Crevel et al., 1989; Юрина и др., 1988; Nemoto et al„ 1989, 1990, 1991; Yurina et al., 1995).

В этих исследованиях все методы изучения ДНК — связывающих белков хлоропластов основывались на выделении нуклеоидов с предварительным лизисом пластид. При этом в случае использования ионных детергентов и сильных восстановительных агентов белковые

контакты с ДНК могут нарушаться, что приводит к потере некоторых белковых компонентов в процессе выделения нуклеоида, а в случае использования неионных детергентов может происходить также и артефактное перераспределение белков на ДНК.

По этим причинам представляется особенно интересным использование методических подходов, связанных с фиксацией белков на ДНК в интактных хлоропластах с образованием прочной ковалентной связи ДНК —белковой сшивки в месте их контакта с последующей идентификацией как пришитых белков, так и последовательностей ДНК, участвующих в формировании нуклеопротеидного комплекса пластид.

Методика ковалентных сшивок позволяет зафиксировать существующие ДНК —белковые контакты как in vitro, так и in vivo, в результате чего образуется стабильный комплекс ДНК с белком. Преимущества этого очевидны: материал в процессе изучения можно подвергать достаточно жестким воздействиям без нарушения стабильности полученной структуры.

Такой методический подход представляется достаточно перспективным, вследствие чего появляются многочисленные новые модификации этого метода. Объединняя его с методом гибридизации с "белковыми тенями" (Karpov et al., 1982), исследователи получают возможность наиболее адекватно исследовать распределение белков на ДНК.

Цель данной работы состояла в исследовании ДНК — связывающих белков хлоропластов с использованием метода ковалентной ДНК — белковой фиксации в условиях in situ. При этом были поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода ковалентных ДНК —белковых сшивок, индуцированных радикал — продуцирующим комплексом 1,10 — фенантролин — Cu(II). Исследование механизма химических реакций, сопровождающих образование сшитого дезоксинуклеопротеидного комплекса.

2. Обнаружение ДНК — связывающих белков хлоропластов с использованием нового метода ковалентной сшивки и определение их функциональной роли.

3. Выявление участков хлоропластного генома, взаимодействующих с

обнаруженными ДНК — связывающими белками.

4. Исследование роли ДНК — связывающих белков в упаковке хлоропластной ДНК.

III. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.СТРУКТУРА ГЕНОМА ХЛОРОПЛАСТОВ

1.1. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ГЕНОМА ХЛОРОПЛАСТОВ

Внеядерные геномы играют важную роль в функционировании эукариотической растительной клетки. Особая роль при этом принадлежит геному хлоропластов, кодирующему около половины белков, участвующих в фотосинтезе и определяющему устойчивость растений к некоторым гербицидам и грибным патогенам. В настоящее время геном хлоропластов изучен довольно хорошо. Известна полная нуклеотидная последовательность шести хлоропластных геномов самых разных представителей растительного мира: от водорослей (Euglena gracilis (Hallick et al., 1993)) и папоротников (Marchantia polymorpha (Ohyama et al,, 1986)) до голосеменных (черная сосна (Wakasugi et al., 1994)) и покрытосеменных (табак (Shinozaki et al., 1986)), рис (Hiratsuka et al., 1989), Epifagus virginiana (Wolfe et al., 1992)), Идентифицировано подавляющее большинство хлоропластных генов, известны принципы их организации, порядок расположения и т.д.

Геномы хлоропластов и других типов пластид представляют собой кольцевые двутяжевые молекулы ДНК, размер которых в большинстве случаев составляет 120—160 т.п.н, и варьируют от 70 до 217 т.п.н.(Юрина и др., 1990, 1991, 1992). В хлоропластах всех изученных видов наземных растений геном представлен одним типом кольцевых молекул ДНК; двукольцевые геномы описаны только у немногих видов водорослей (Юрина и Одинцова, 1998). Основной структурной особенностью большинства хлоропластных ДНК (хпДНК) является длинный инвертированный повтор (ИП), который делит остальной геном на большой и малый уникальные участки, ИП представляет собой две идентичные, но противоположным образом ориентированные нуклеотидные последовательности, которые нередко называют сегментами инвертированного повтора и обозначают буквами А и В. В хлоропластах высших растений ИП содержит, как правило, гены всех рРНК (5'-16S, 23S, 4,5S, 5S -3') и двух тРНК (тРНК^ и тРНКУа|). Функциональная роль ИП неизвестна. Не показано участие ИП в репликации хпДНК (Юрина и др., 1988, 1989; Harris et al., 1994). Тот факт, что

в геноме хлоропластов ряда растительных организмов (голосеменных, некоторых представителей семейства бобовых, некоторых видов водорослей) ИП отсутствует (геном содержит только одну копию генов рРНК), позволяет предполагать, что ИП не имеет отношения к репликации хпДНК.

Для подавляющего большинства сосудистых растений типична структура хпДНК, обнаруженная в хлоропластах табака (Nicotiana tabacum) (рис.1). Все сосудистые растения характеризуются, в основном, таким же порядком расположения генов, как в геноме хлоропластов этого растения (Wolfe et al., 1992; Clegg et al., 1994). Известно несколько вариантов пластидных геномов сосудистых растений, которые в общих чертах отличаются от табака расположением только одной или немногих определенных инверсий (например, трех инверсий у злаков). Консерватизм структуры хпДНК наземных растений может быть проиллюстрирован на примере трех эволюционно далеких видов растений: папоротника (Marchantía polymorpha), голосеменного (Ginkgo biloba) и покрытосеменного (табак) (Palmer, 1992). Структура хлоропластного генома и порядок расположения генов у этих растений очень сходны, хотя они дивергировали около 400 миллионов лет назад. Так, у М.polymorpha, по сравнению с табаком, обнаруживается лишь одна инверсия в большой уникальной последовательности длиной в 30 т.п.н. и около 6 различий в содержании генов, главным образом, открытых рамок считывания (ОРС). Хотя геномы пластид большинства наземных растений консервативны по структуре, содержанию генов и порядку их расположения, известны и сильно измененные геномы пластид, в которых имели место значительные перестройки (инверсии, делеции/инсерции и т.д.) (Palmer, 1985а, 1985b; Palmer & Herbon, 1987; Sugiura, 1989 ).

В пластидах высших растений внехромосомные элементы обычно отсутствуют, хотя они обнаружены в пластидах нескольких видов водорослей (Palmer, 1991), У табака описан внехромосомный элемент пластид, NICE1, который представляет собой миникольцо (868 п.н.) субгеномной ДНК пластид (Staub & Maliga, 1993).

Размер генома хлоропластов может зависет от ряда факторов:

наличия и длины повторяющихся последовательностей; содержания генов и наличия в них интронов; наличия "общих" последовательностей.

1. Повторяющиеся последовательности. В случае пластид, размер генома зависит, главным образом (в 2/3 случаев), от наличия ИП и его величины (Palmer, 1992). Этот повтор, кодирующий рРНК, свойственен всем наземным растениям. В результате наземные растения содержат по две копии генов рРНК и других генов, локализованных в ИП. По имеющимся к настоящему времени данным ИП был утрачен в эволюции в трех семействах покрытосеменных (Lavin et al., 1990) и у общего предка хвойных (Strauss et al., 1988). У большинства растений размер ИП составляет 20 — 30 т.п.н. (15 — 25% генома), но у отдельных представителей наземных растений его размеры колеблются от 10 до 76 т.п.н, (Palmer, 1991, 1992). ИП стабилизирует хлоропластный геном (Palmer, 1985а; Ellis & Day, 1986; Strauss et al., 1988; Palmer, 1992). Потеря одного из сегментов ИП повышает вероятность различных мутационных изменений, которые могут приводить к дефектам в репликации хпДНК и системе ее репарации. Кроме ИП, многие хпДНК не содержат повторов, длиннее 50 п.н. Нуклеотидная последовательность хпДНК не столь консервативна, как последовательности ИП. Наиболее "горячей" точкой мутации является большая уникальная последовательность (Bowman et al., 1983; Tassopullu & Kung, 1984; Weil, 1987).

Это дает основание для двух предположений: 1) существует механизм, поддерживающий консервативность инвертированного повтора; 2) само присутствие инвертированного повтора связано с более стабильной формой хлоропластного генома (Bowman et al., 1983). Последнее подтверждается тем фактом, что перестройки чаще происходят при отсутствии ИП (Palmer & Zamir, 1982). В этой связи представляется интересной гипотеза возникновения ИП в хлоропластном геноме. Предполагается, что ИП возник в результате объединения двух уникальных геномов посредством ковалентного соединения конец к концу, и последующие делеции привели к образованию хлоропластного генома в современном варианте (Tassopulu & Kung, 1984).

Инвертированно повторяющиеся последовательности

характеризуются высоким содержанием ГЦ —пар и отличаются по нуклеотидному составу от уникальных последовательностей. Таким образом, хпДНК характеризуется внутримолекулярной гетерогенностью нуклеотидного состава. Это одна из особенностей структурной организации хлоропластного генома.

рис. 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КАРТА ГЕНОМА Х�