Физико-химическая характеристика ДНК и риюосом хлоропластов хлопчатника

Рахматов, Негбой Аманович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физико-химическая характеристика ДНК и риюосом хлоропластов хлопчатника
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физико-химическая характеристика ДНК и риюосом хлоропластов хлопчатника"

ЮаШ. <оТ

академия наук узбекской сср 29. институтбиохимии ^

На правах рукописи

РАХМАТОВ Негбой Аманович

удк 547.963.3;576.311.1 ;581.19.633.51

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДНК И РИБОСОМ ХЛОРОПЛАСТОВ ХЛОПЧАТНИКА

03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ТАШКЕНТ - 1989

Работа выполнена в Институте оксяврямзнтаяьяоЕ биолег растошй Акадеши наук Узбекской СОР

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Одинцова И,С«

академик АН Таджикской СОР Насыров 0.(2,

член-корр. АН УабекскоЗ ССР Касшов А.К.

Ведущее учреждение; Ордена Лвшша Иастяэуг яддагзеско" физики All COOP

Защита состоится "_" IS89 г. а 10.00

на заседании специализированного совета Д.015.16.01 по за: диссертаций на соискание ученой степени доктора бяологпчо( наук при Институте бкохяман All УзССР (700125 г, Тааке.тг, пр-? М. Горького, 56).

С диссертацией можно ознакомиться з библиотеке Ннсж биохимии АН УзССР (700125, Тапкегт, np-i' И. Горького, 56)

Автореферат разослал _. ■ •' 1989 г.

Ученый секретарь

специализированного советг, , л S

(■y/J-г к.н.

доктор биологических наук

НКПАНЕА.

ОНЩШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность проблемы. Исследованиями последних лет установлено, что генетический материал растительной клетки сосредоточен иэ только в ядре, которое служит главным хранителем наслег гвен-ной информации, но и распределен в субклеточных структурах-хлоро-пластах п митохондриях. В кольцевой молекуле ДНК хлоропласта локализована часть цитоплзматических генов, которые несомненно вносят определенный вклад в функционирование я развитие растительных клеток. Выяснение локализации генов и механизмов регуляции их действия в биогенезе хлоропластов является ва&чой задачей ге-кетико-селекционных работ по выведению высокопродуктивных «Торг.» 'растений. Биогенез хлоропластов и их функциональная активность управляется тесной коопераци'" дискретных генетических факторов ядра и цитоплазмы. Исследование структурной организация хлороп-ластноЯ ДИК является.необходимым условием для выяснения механизмов этого взаимодействия.

По мере углубления знаний о синтезе белка в клеточных структурах обнаруживаются все новые отличия отдельных компонентов бе-лок-синтезирукшх систем, находящихся в хлоропластах, митохондриях я остальной части цитоплазмы. Изучение свойств компонентов белок-синтезпрущеЗ системы я выявление различив .тих компонентов в разных.структурах способствует выяснению причин, обуславливающих органойдную специфичность белков. Кроме того, сравнк/е-льное изучение компонентов систем, синтезирующих белки и нуклеиновые кислоты в.хлоропласта, и других плеточных структурах, монет пролить свет на происхоздениэ •* генезис этих органелл клетки.

Создание высокопродуктивных сортов сельскохозяйственных культур- связано .с изменением генетической природа растения и его ■ функциональных структур, в том числе а фотосинтетического аппарата. Этим и определяется тот большой интерес, который привлек зт к себе хлоропласты-органоидн, в первую очередь связанные 5 процессом фотосинтеза.

Работа посвящена одной из важнецких проблем современной биологической химия - изучению белок-скшсезируквдй системы хлопоп-ласыв в целя« разработки принципов управления биогенезом 1ыао-тпд через наследственность и процессом <?стосьл7еза. Разрешение

молекулярных механизмов этих процессов выявит дополнительные-возможности обоснования практических рекомендаций по повышению урожайности хлопчатника - основной технической культуры Узбекистг на.

Цель и задачи исследований. Настоящая работа посвящена изучению структурно?; организации ДНК, рибосом, полисом, рЕНК, рибо-сомных белков, а такяе основного фермента процесса фотосинтеза -рибулозо-1,5-бясфосфяткарбоксилазы-оксигеназы (РЕФК) хлоропласте] хлопчатника. Для достижения этой цели необходимо было решить еле-дуодие экспериментальные задачи:

- идентификация хлоропластной ДНК хлопчатника методами физико-химического анализа;

- тзучить структурную организацию хлоропластной ДНК диплоидных и тзтраплоедных аидов хлопчатника рода Gossypiumi .

- изучить физико-химические и функциональные свойства pnöoci хлоропластов и цитоплазмы хлопчатника;

- сравнительно изучить фракционный и аминокислотный.состав рибосомных белков хлоропластов и цитоплазмы хлопчатника в. норме И при заражении Грибом Verticllllum dahliae Klebî . .

- изучить структуру и физико-химические свойства РБФК хлоро пластов хлопчатника в норме и при заражении грибом Verticiiilua dahllae Kleb.

Научная новизна. В работе дана хг 1ктеристика структурной организации хлоропластной ДНК. различных видов хлопчатника. Методом рестрикционного анализа и равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия показано существовали значительной внутримолекулярной гетерогенности хлоропластной ДНК хлопчатника. Гибридизацией ДНК-ДНК показана высокая степень го--о логии нуклеотидных последовательностей различных видов хлопчатника, что иояет свидетельствовать об их близкой структурной орга низации и значительной генотипяческой гомогенности хлоропластно-го генома в пределах рода ûoasjpiuL

Показано существенное отличие рибосом хлоропластов от цито-плазштических рибс dm по величине плавучей пло'. ости. Изучены физико-хиштческие свойства рРНК хлоропластов и цитоплазмы хлопу-четника. Изучен аминокислотный и фракционный состав рибооодшых

белков .:_лороиластов к цитоплазмы в онтогенезе, а такте б норме И при заражении грибом Vercicilliuu' äatiiiae kleb. Охарактеризована РВЕК хлоропластов и ее субъединиц, дана аминокислотная характеристика. Отмечено значительное уменьшение физиологической активности РБФК при заражении хлопчатника Verticiiiiua daniiae i.le'o а также потеря нативности самого холофермента; неспособность субъединиц образовывать активную форму фермента может быть связана либо с количественны!.! изменением их соотношения, либо с изменением в их структуре.

Практическая, ценность табота. Полученные данные woityr слу- . жить дальнейшему развитии теоретических представлений о гзнети- .' ческой автономия хлоропластов. Одновременна и практическая перспектива этой работы, так как подученные результаты позволяют вплотную подойти к выделении'индивидуальных мРЖ для большой субъединиц РБФК, исследование которых является необходимой предшосьш-кой для картирования пластидншс генов, изучения их экспрессии, а в дальнейшем - и для их биосинтеза.

Специфическое фрагментироваяиз ДНК хлорсшгастов ферментами рестрикции с успехом применяется для расшифровки первичной структуры хлоре 'ластной ДНК, а также является начальным этапом получения отдельных генов.

Фрагменты ДНК хлоропластсэ хлопчатника, полученные после обработки эндонуклеазой iäcoEl , монно использовать для получения банка генов, несущих гены рибосомной РНК хлоропластов заюпчатни- . " ка„ ' ■ ''.■'■:•'''.

Получение липосомных форм ДНК, после выделения отдельных фрагментов зиоропласткой ДНК и введение их з растения даст в.оз- ; модность получить новые формы хлопчатника", устойчивый к болезням.

Относительная простота генома хлоропластов.дает возможность. генеетчс окого конструирования клеткй .через ее .'пластидный; геном, что в' перспективе позволит создать формы растений хлопчатника о , гажаемым сочетанием' хозяйственно-ценных признаков. .

Полученше данные расширяют современные знания о структурной организации ДНК„рибосе-в полисом, рРШ, рибосомных'белков, ■ ШК югорепяастоз хлопчатника, углубляют наши знания относигель-- ' но взаимодействия хяоропластнгх геномов, чго еносжр 1сущвствек-шй вклад в разработку вопросов экспрессии генетического ашара-. .

та хлоропластов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, экспериментальной Части, включающей 8 глав, заключения, выводов и списка литературы.

Объем работы. Диссертация написана на 284 страницах машинописи, содержи 40 таблиц, 45 рисунков и список литературы из 478 источников.

Апробация работы. М^ерпалы диссертационной работы доложены на симпозиуме "Действие радиации на растения" (Ташкент,-1971) "Биоэнергетика при лучевом поражении -кивых организмов" (Ленинград, 1973); "Структура и функции.нуклеиновых кислот и биосинтез белка в растениях" (Ташкент, 1973); "Влияние радиации на рзгуляторнна процесса в клетке" (Пущино, 1976); ЗУ Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1979); 1У Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1979); на I Всесоюзном совещании "Генетика развития растений" (Ташкент, 1980); на Шконф. биохгашг ов Средней Азии и Казахстана (Душанбе, X98I); на Всесоюзном симпозиуме "Механизмы усвоения азота и биосин^за балка в растениях" (Алма-Ата, X98I); на научной конференции "Геном растений" (Черновцы, 1983); на 7 Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1985); на 1У конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (Ашхабад, 1986); на научно-техническом совете Института экспериментальной биологии растений АН УзССР. .

Публикация. По материалам диссертации опубликовано 44 работы .

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Объектом исследования слуя"ии семена, 2-х к 14-дневные листья проростки различных сортов хлопчатника, представляющих четыре вида ( G. агЬогеиш L. сорт 7059; G. Ьег-Ьаоеиш L. сорт 7090; G. birsutum L. 108-5; G.baDbadensQ L. сорт ñ030) рода Gossyplum , выращенных в условиях теплицы. По данным Макроносова и соавт. (1974), в 10-14-дневных листьях хло-

ропластн достигают полной физиологической зрелости» Изученные вида хлопчатника отличались между собой эволюционной продвинуто-стью, числом хромосом и хлоропластов в клетке, продуктивностью фотосинтетического аппарата, а также по ряду хозяйстввнно-ценных признаков. * .

РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИЙ Ч ИХ ОБСУЗДЕНЙЕ

5. ЮТТИФИКАЦИЯ ХЛОРОШШЕОЙ ДНК ХЛОПЧАТНИКА 1ЖГ0ДА1Ш ФИЗШО-ШМЧЕСКОГО АНАЛИЗА .

5.1. Характер распределения хлоропластной ДНК хлопчатника в градиенте плотности csci и ■ EthBr-CsCi

В настоящее врегжт локализация части клеточной ДЕК в субклеточных структурах - хлоропластах и митохондриях доказана экспериментально. Однако изучение структуры ДНК этих клеточных орга-пелл на молекулярном уровне до недавнего времени не проводилось. Объясняется это методическими трудностями выделения изолированнее препаратов хлоропластов а митохондрий. 1шь после применения таких методов молекулярной биологии, как дифференциальное и равновесное улътрацентрифугпрованис, многим лсследовг тслягл удалось получить чистые препараты ДНК из цитоплазматяческйх оргэяовдоэ сыспих растений.-

К настоящему времени разработало зиачдтёльноэ количество ■■ чатодов выделения хлоропластной ДНК из растительных организмов ( Xolodner Tewari , 1975; Hermann et al. , 1975; Акерханова Я 305ET., 1977; Каримов и соавт., I97B). Однако, в зависимости'оч? зпецифякп объекта условия выделения хлоропластов из различных гканей вмевт своя особенности. , '.-.

В связи с этим пами были использовали катода 'выделения г-с-зспластов з хлоропластной ДНК, рибосом0 поли ом, pFHK, рихоссм-тчх бзлкез, РБФК хлопчатника, представляющие собой сочетание отдельных общепринятых методов ( Kirby , IS59; Нагзиг , IS6I; Kis-lev et al. , 1965; Одгшцова И ССЭВТ., 1970; Ko3tler at al., 1977; Hasaka rt al., 1988)..,

При центрифугировании' клеточных оргапелл слотгатляка л лд-юйпом грэдяенгэ плотности сахарозы (0,5-2,5 М) с лоолсдутацим 1лектроппо-?.икроп?ояячоспя.! и рефрактометрическим исследованием

полученных Фракций ш обнаружили, что величина изопикнической-плотности целых хлоропластов не превышает 1,21 г/см3, что соответствует плотности 1,75 М сахарозы, использованной для очистки фракций хлоропластов хлопчатника.

Иа полученной фракции после лизиса (0,15 М Nací, 0,05 М ■ трис-HOl , рн 8,0, ОД М еД'М. 4% тритон Х-ЮО, 1% SDS , сухой csci до плотности 1,700 г/с&г) методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности csci выделяли ДНК. Полученные таким образом препараты ДНК по спектрофотометрической характеристике были достаточно чистыми и могли быть "спользованы в дальнейших исследованиях. '

Идентификацию хлоропластной ДНК хлопчатника проводили методом аналитического равновесного ультрацентрифугирования в линейном градиенте плотности хлористого цезия (рис. I). Для того чтобы доказать, что полученные вами ДНК являются хлоропластными, мы . сравнивали профили распределения в градиенте плотности csci препаратов ДНК, выделенных из фра'кц:и "больших гранул", с таковыми для ядерной й хлоропластной ДНК* ДНК "больших гранул" хлопчатника четко разделяется на три фракции: величина плавучей плотности основной фракции ДНК составляла 1,692 г/см3, а двух минорных -1,697 и 1,706 г/см3 (рис, 2>. Относительное содержание ядерной ДНК в клетке достигает 89,7$, а хлоропластной и митохондриальной ДНК 7,4?; 2,9# соответственно. Препараты ДНК,' выделенные из очищенных ядер, распределяются в градиенте CsCi в виде симметричного пика с плотностью 1,692 г/см , аналогично плавучей плотности основного компонента ДНК из фракции "больших гранул" (рис, 2 б). Препараты ДНК, выделенные из хлоропластов хлопчатника, полностью свободных от примесей ядер и митохондрий, проявляют унимодальный характер распределения в градиента плотности • csci, с плавучей " плотностью 1,697 г/см3, что совпадает о таковой для второго компонента ДНК фракции "больших гранул" (рис. 2 в). Эта величина хорошо согласуется со значениями Плавучей плотности хлоропластной ДНК ряда высших растений ( Wbltfeld, -.pencer , 1968; Baxter, Kirk , 1969; Wells, Biratiel , I9S9; БериДЗв И ООавт., 1976; Амерханова и соавт,, 1977).

' Таким образом, полученные результаты показывают, что ДНК хлоропластов хлопчатника в клетке содержится в.достаточно висо-ко£ концентрации, а ео плавучая п-.отность существенно отличается г так:\зой ДНК ядер, что обеспечивает их достоверное разделе-

ние в градиенте CsCl.

ftrtaï t.ta

I.*»

ЯИвР вЛКЗЯ

Рис.1.Р&спределениэ ДНК хлоропластов хлопчатника в градиенте плотности хлористого цезия

m уа

Vis

Рис. 2.Распределение ДНК "больших гранул"(а), ядер(б), хлоропластов (а), и митохондрий(r) t градиенте плотности хлористого, цезия, М-ДНК

Micrococo us ly'eodeikfcicua с ПЛОТНОСТЬЮ 1,731 r/сМ3 пр-т 25°С

При исследовании ДНК в градиенте плотности Ceci, содержащем EtbBr , било обнаружено, что EthBr не влияет на унимодаль^сть расрпделения хлоропластной ДНК хлопчатника, однако уменьшает величину ее плавучей плотности на 0,040 г/см3, что совпадает с- данными, полученными Турищевой и'Одинцов ей (Î978) при исследовании хлоропластной ДНК гороха. ' '<

Унимодальный характер распределения хлоропластной дпН в градиенте плотности CsCl и BjîhBr-CsCi. указывает на отсутствие в ней сателлитного компонента и слукат-ватлшл тестом отличия ПК хлоропластов от ядерной и митохоядриальной ЛВС.

Таким образом, на основе характерной плавучей плотности нам удалось отделить хлоропластнуи ДНК^хлопчатника от ядерной и мито-хондриальной ДНК.

Для получения данных о специфике структурной'организации хлоропластной ДНК ш попытались изучить ее другие физико-химические свойства, ярко демонстрирующие сходство и различие структур-

ной организации ДНК.-

5.2.-Физико-химическая характеристика хлоропластной ■ и ядерной ДНК хлопчатника

Данные хроматографического анализа кислотного гидролизата ядерной и хлоропластной ДНК показали, что ДНК изученных клеточных структур хлопчатника относятся к резко выраженному АТ-типу. По содержанию Щ-пар хлоропластная ДНК близка к ДНК ядер - 37,0 и 37,9 мол. % Щ-пар, соответственно (табл. Г).

Таблица I

Нуклоотидный состав и физико-химические характеристики ядерной и хлоропластной ДНК хлопчатника

ДНК :Содзржание : дов, мол. рклеоти- : : AT ;5-Щ: Щ :Гшер-:Т-плав~: :хроми-:ления : Козфф. диспе-

{ А : Т : • • * г : ц • :зм, % : Oq : рсии, °С (¿'.

* ' « « •' ...... . ■ v *

Ядер 31,6 31,4 18,7 14,6 3,7 1,97 33 85,6 18,4

Хлоропластов 31,3 30,8 20,1 17,8 . - 1,64. 29 85,4. 8,3

Полученные данные указывают на отсутствие-5-метилцитозина в хлоропластной ДНК, тогда как ядерная ДНК хлопчатника содержит 3,7 мол. % 5-Щ. Отсутствие 5-Щ в препаратах хлоропластной ДНК является надекным критерием ее чистоты

Аналогичные результаты бнди получены при сравнительном изучении ДНК ядер к хлороаяаотоа других высших растений ( Tewari, Wildaaa, 1966-, Whitfold, Spencer, 1968).

Нами не обнаружено какой-либо корреляции между нуклеотидным составом хлоропластов и ядер хлопчатника. По-видимому, это объясняется независимым дивергироп^ниеы нуклеотидного состава двух генетических систем в ходе эволюции.

Изучение кривых термического плавления ядерной и хлоропластной ДНК хлопчатника показало, что тг-пература плавления ДНК ядер и хлоропластов приблизительно одинакова и равна соответственно, 85,6 и 85,4°С. Однако по ширине интервала плавления ( й Т) ДНК хлоропластов значительно отличается от ДНК ядер (табл. I). й Т у ДНК ядер на 4,1°С выше, чем у хлоропластной ДНК. Это, по-видимому, связано с большей сложностью ч гетерогенностью ядерно! . ПК.

Акаг-;з форм кривых реассоциатдаи ДНК, предстаслшпш: hü

рис.3,, подтверждает существование значительных различий в ренату-.рационных свойствах ДНК ядер- и хлоропластов. В составе ядерной ДНК мы обнаружили повторяющиеся последовательности нуклеотидов, различающиеся по частота повторяемости» Фракция частдаовтосяющях-ся последовательностей нуклеотидов в ядерной ДНК, роассоциирую-щая в интервале Cot« 0-I0"2, составляет ссдерглкпз фракция прометку точных повторов - 60,4$ (Сой = Т0~2-Ю3). Остальная часть генома представлена уникальными последовательностями нуклеотидов. В отличие от ДНК ядер, при анализа процесса реассодааи-:и хлоро-пластной ДНК мы не смогли обнаружить наличия повторяющихся последовательностей. Кривая КШ'ТШШ реассоциации хлоропластной ДНК имеет более простой характер, чем ядерной ДНК, и подтверждает 'структурное сходство ДНК хлоропластов с геномом нрокаряотичеспх организмов,,

В настоящее время показано, что х&оропластная ДНК многих изученных видов растений имеет большую янвортирярованяую повторяющуюся последовательность нуклеотидов - 20-28 т.п.о. сегменты которой разделены на циркулярной молекуле хлоропластной Д1Г ббл£ням я гллым районами, представленными одной копией ДНК (.Bohnert et йт- ; т9р2t tivfт r rdoa- одги^спз, ics?; iocs). • ,

Следует отметить, что' использованные nam методы на поз^ол*-лл обнаружить указанные особенности в структуре хлоропла^гной ДНК хлопчатника (Рахматов и соавт., 1986). .

Так км образом, данные физико-химического анализа ДНК ядер и хлоропластов хлопчатника подтверждаю? наличие значительных различий в их структурной организации, а такие могут слуштть одним из взжпейших критериев чистоты выделенной нами хлоропластной ДНК.

Рис, 3. Кривые кинетики ре-ассоциация ДНК ядер (-л -) я хлоропластов (-о-) хлопчатника

иг- иof- tt1 tv* it • «si

5.3. Рестрикциошагё анализ хлоропластпоЗ и ядерной ДНК хлопчатника

Применение метода рестрикционного анализа открыло новые возможности для изучения структуры хлоропластншс ДНК высших растений ( кореска еЪ а1. , 1977; Амерханова, 1978; Каримов и соавт.,1978; Рахыатов и еоавт., 1984; Табидзе а соавт., 1985).

Сравнивали рестрикционныа картины хлоропластной и ядерной . ДНК хлопчатника, полученные при помощи рестрикциснной эндонукле-азы ВссН1 (рис. 4). Хлоропластная ДНК хлопчатника после расщепления рестрактазой Ео оН1 при электрофорезе распределяется в виде дискретных полос, что указывает ш наличие в ее молекуле ограниченных сайтов рестрикции для рестриктазы ЕооИ1.Анализируя элект-рофореграмму и денситограмму геля (рис. 4), мы обнарукили 21 полосу различной интенсивности овечения после окраски гелей атидиум бромидом. Распределение в агарозном геле ЕссЖ1 фрагментов хлоропластной ДНК в виде дискретных полос показано также рядом советских (Амерханова, 1978; Каримов и ооавт., 1978) и зарубежных ( Уейе! аЬ а1. , 1976; АЪс^аоп et а1. , 1976; СЬгШпа еЪ а1.,

1986; Haeaka et al.

щ.....

1987) ученых.

Рис.4,Элекч?офорвтйческое разделение EcoHl-фрагмеитов ДНК хлоропластов и ядер хлопчатника в 1#-аГарозком геле. А - EcoRI фрагменты ДНК фага лямбда. Б - ДНК хлоропластов хлопчатника. В -EcoRI '-фрагменты ДНК хлоропластов хлопчатника. Г - ДНК ядер хлопчатника. Д - EcoRI -фрагменты ДНК ядер хлопчатника.

Молекулярные массы фрагментов ДНК, определенные на основании электрофоретической подвижности, нахс длясь в пределах 5,71-<У7»Ер дальтон. Суммируя молекулярные массы всех фрагментов ДНК, ш получили величину 50,44«10® дальтон, что меньше молекулярных масс кольцевых ДНК хлоропластов других высших растений (иглеепе et а1. 1982). Это несоответствие может быть вызвано потерей низкомопеку-лярных фрагментов ДНК при электрофорезе, а также множествен.^,,;гью $раг«ентог- в некоторых зонах, которые содержат последовательности,

псвторепшх в хлоропластной ДНК, либо близостью значений молеку-•ЛЯ$)НЫХ Масс ра31ШХ фрагментов ( Уейе1 еЪ а1.,198б}Во(1Ьгоок о-ь а1., 1386).

В отличие от ДНК хлоропласте", ядерная ДНК хлопчатника, обработанная рестриктазой ЕсоШ , при электрофорезе характеризуется равномерным распределением: на деноитограммах геля ми наблюдали один широкий пик (рис. 4 д). Это объясняется множественностью сайтов рестрикции в молекуле ядерной ДНК для рестряктазн ЕсоМ, Молекулярная масса наибольшого фрагмента составляла 9.С3.105 дальтон, наименьшего - 0,3.10® дальтон.

Такигл образом, данные толучеяннэ при сопоставлении рестрикци-онных картин ДНК хлоропластов и ядер свидетельствует о различал ' их структурной организация» Крока различна в молекулярных шегх, полученные Во оН1 -фрагмента: хлоропластной ДНК хлопчатника проявляют значительную гетерогенность по составу оснований.

Путем центрифугирования в градиенте плотности сзсг определено содержание ГЦ-пар нуклеотндев Ее сН1-фрагментов хлоропластной ДНК, которое составляло от 25,5 до 52,0 Полученные результаты

демонстрируют внутримолекулярную гетерогенность состава хлоропластной ДНК на уровне Ее оих-Фрагментов (Рахматсз я соавт.,1984),

Юшгомодальность профиля правления хлоропластной ДНК высоих растений продемонстрирована Берпдзе и соавт. (1973,1979). Анализируя дифференциальные кривые плавлений,авторы обнаружили в ДН" хлоропластов восемь термических субкомпонентов,содержание ГЦ-~яр оснований в которых варьировало от 17,3. до 53,9 г.гал.$ (Табядзе,1981),

'Галет образом, рестрияционннй анализ мозет служить-для изучения структуры хлоропластной ДНК,а такно для отличия со от ядерной ДНК п,следовательно,мояет бнть еще одним"критерием чясзто.ы ирега-

' рахиВ .мл* ооцчоЛ¿НННл До раЗЛГ агйл. 5зу~ц13 лЛОП-глТНЛжч^»

в» сравшеякюё тошозтт шкшдстиоя днк

ДКШЮ1ЩШХ и теяшщвшк БЩ.В х2юпчшг' РОВ 0033П?1ТП.1

6.1. ЗязЕко-хс.глческая характерного плорспластной ДНК диплоидных и тетраплоидэнх зпдев хлопчатника

Известно, тто полиплоидия приводят к пзгтэноняэ некоторых мор-фобяологлческях признаков, вызнзает усплепио активности физислого-

бпохвмячйских процессов в клетке. Исходя пз этих соображений, яослодовалв физшсо-хпшческио характеристики хлоропластной ДНК дппдодданх и гетрйпяоидшк видов хлопчатника.

Препараты хлоропластной ДНК, выделенные пз хлоропластов диплоидных и татраплоидшх видов хлопчатника (рлс.5) при цаптрпфуп ровании в-линейном градиента плотности Сезх дают сншэтричнш пики, величина их плавучей плотности варьирует в пределах от 1,697 до 1,698 г/ал3 (Рахиатов я соавт., .1986),

Passa в нашей лаборатория былд пссдедованы физико-хямичвскш особенности ядарноЗ ДНК диплоидных я тетраплоидных видов хлолча^ няка (Турсунов, 1978). Сопоставление значений плавучей плотное« ДНК ядер и хлоропластов свидетельствует, что хлоропластная ДНК диплоидных и тетраплоидных видов хлопчатника'Значительно отличается по плавучей плотности и, соответственно, по составу оснований от ДНК ядер тех яе видов хлопчатника.

Сходные данные балл получены при сравнения ядерной и хлоропластной ДНК других растительных'объектов (wells, Birnstiel, 1969; Ingle, Walls , 1970; Kolodner efc al. , 1975; Kastlsr et al., 1977).

Значения плавучей плотности хлоропластной ДЕ. исследованных дшлоидных и тетраплоидных ендов хлопчатника довольно близки,, It рг-ктерным дня-препаратов хлоропластной ДНК везх 'ссследовашшх видов хлопчатника является отсутствие в их составу сателлятних

'Ряс .5 .Распределение хлоропластной ДНК диплоидных и тетраплоидных видов хлопчатника в градиенте плотности Ceci -а - G.arboreuia L. сорт 7059; б - G.herbaoeum L; сорт 7090; В - G.herbacoun L., esp.africanuai} г - • G.hlrsututa L. Ю8-Ф; Д - G.blrsuÇua L., Bsp.maxicanuEj e - G .barbadon.se L. сорт 6030; M - ДНК Micrococcus lysodeiktlcus.

Кршзые плавления ДНК изученных видов хлопчатника имеют унимодальный характер плавления, только с одной точкой перегиба, '¡¡тачание величины температуры плавления варьирует в очень узкой янтерзало ст 85,2° до 85,6°С, что свидетельотвуот о значительно;, сходстве внутримолекулярной организации хлоропластной ДНК дипло-

цншс и тетраплоидшх видов хлопчатника (Раг'лтоз и еоаэт, ДГ8С). змпература плавления ядерной ДЖ исследования: зяков хлопчатнп-а (Турсунов,1978) варьируег в более ппрокдх продэдах - о? 85,0 э 87Д°С.

Унимодальность профилей теплового плавления ДШС продемонстоп-звана также рядом авторов пря исследовании хлорсайЕСТИой ДНК че-зторше видов высших растепгй ( Kolcdner, Tewari » 1375; ¿мзруапо-1 и соавт., 1978).

Сопоставление кривых , кинетики реасеоциацяи хлорсшастной ДНК 1зличных видов хлопчатника показало идентичность структурной ор-«шзацяи генома хлорсяластов в отношении как диплоидных ((З.аг-огеиш L. сор? 7059;G» ЬзгЬасеия L. сорт 70S0), так и тэтра-юядных ( G. hirsutun Ь. 108-Ф; G. barbadense' Ъ. сорт SOSO) тдов хлопчатника (рисо 6>о. Как видно.из рис0 S, кривая кинетики зассоцпации хлгпопластшй ДНК всех исследованных видов хяопчат-iita свидетельствуют о ее кинетической гомогенности. Кинетическая шородность структурных компонентов, составляющих хлоропластчпй ¡ном, указывает на отсутствие в нем куклеотидвнх носледователь-ютей, различных по частоте повторяемости. Полученные результата iporao согласуются с данными ряда авторов (tewari et al. ,1975; ¡ерханова, 1977; Боброва и соавт.,1978), изучавших кинетику.ре-юоциапяи. хлоропластной ДНК различных видов высиих растений,

Данные о■структурной организации хлоропластной ДНК высших ра-■ений, полученные при исследовании уянетмг.й ее реассоциадкя, не-огочислеян. Так, в работе iVells ее al- (I9S9), показала кянети-ская гетерогенность хлоропластной ДНК салата. На оснояанли полу-шшх данных авторы предполагают, что ДЕК хлороплаотов салата

дераит повторяющиеся нуклеотлдныо поолецсгатольностИс 1 -

Рис.6.Кинетика реассоциации хлоро-• . лластпо"; ДНК диплоадных г тотра--плопднцх еядоз >ло1патчика„

1 - fj.herbr.ccun сорт 7030;

2 - з.hirsutun L. 'XC8-J;

3 •• 2КК i.. col;.

При сормостногт применении метсдо? рпстрпкшонного аяилиза р тегсуляркс" гябради?аишт -ряд-ок аг-торов р хлероплиеиюй ДНК вестях зтешй обнаружено присутствие интгр-.-прованных повторяться пос-

ледоватзльноотей, содержащих гены рРНК ( Hawson et al.f 1978; • Helling et al., 1979).

Два инвертированных повтора в ДНК хлоропластов составляют 30% всего генома» Следует отметить, что использованные нами метода не позволили обнаружить указанные особенности структуры.

На основании данных кинетика реассоцпации было установлено, что размер хлоропластного генома всех исследованных видов хлопчатника, в среднем составляет 1,54.10® дальтон (Рахгатов я соавт., 1986).

Ранее в нашей лаборатории (Ибрагимов, 1975; Турсу нов, 1978) было установлено, что в геноме хлопчатника содерлаше палиндромов, при Cot = .'составляет 3%, бистро и умеренно реассоцирую-

щих повторяющихся последовательностей 36,4-38,5$ при Cot -Ю"1 и шкальных нуклеотидных последовательностей - 58,5-60,6$. Сравнение результатов исследования кинетики рзассоциация хлоропла-стыой ДНК с аналогичными данными по ядерной ДНК.позволила сделать вывод о более простом строении хлоропластной ДНК. Кроиз того, со-поотавленяе полученных кривых кинетики реаосоцяации хлоропластпой ДНК хлопчатника и ДНК из клеток Escherichia coli подтверждает структурное сходство хлоропластного генома и генома прокариот»

6.2. Нуклеотидшй состав хлоропластной ДНК'диплоидных п тетраялоидных видов хлопчатника.

Изучение первичной структуры ДНК в сравнительном аспекте необходимо как для выяснения специфичность различных ДНК, так и для решения вопросов, касающихся их функционирования, происхождения и эволюции .Первый отапоц нссздовашш первичной структура дш явдяе; ■ея; изучение пуклеоящкого состава «При изучении нуклеотядного со: тава хлоропластной ДНК четырех видов хлопчатника рода Gossypiun ш использовали метод бумакной хроматографии кислотных гидроляза-тов ДНК и метода, основанные на. определении нуклеотядного состава ДНК по их плавучей плотности и температура плавления.

Хлоропластная ДНК всех исследованных видов хлопчатника относится к резко выраженному АТ-типу. Отношение Л+Т/Г+Ц для разляч-пых видов хлопчатника равно 1,55-1,60. сто хорошо согласуется с известной закономерностью - близостью (сходством) нуклеотядного состава ДНК хлоропластов высиях растеаяй, установленной рядом авторов (Одинцова, 1976, 1988).

Сра?'"!ТОльный анализ содержания ГЦ-nnp в хлоропластис" :

различных видов хлопчатника, полученных па данных распределительной хроматография па бумаге (37,9-39 „2 аоя.%), измерения плавучей плотности (37,7-38,8 мол.#) и температуры плавлошет (39,3-39,7 мол./?) ДНК, показывает незначительную вариабельность нуклеотпдно-го состава хлоропластпой ДНК как диплоидных, тал и тетрапловдннх в идов хлопчатника (Рахматов п ссавт., IS36).

Ранее в напей лаборатории било установлено, что нуклеотлдный состав суммарной ДНК тех se видов хлопчатника варьирует з болсо широких пределах; содерзание ГЦ-пар составляет от 37,2 до 42,8 мол./2 (Арппдаанов, 1976; Турсунев, 1978). При этом содержание 5-МЦ колебалось в предела;: от 3,5 до 4,4 мол.:?.

При сравнении данных пуклзотгошого состава ДНК згтороплас'^в 'и ядер хлопчатника, можно отметить роль нуклеотидного состава "ло-рспластной ДНК в систематика хлопчатника, по сравнению с ядерной ДНК невелика. Однако, это не,исключает возможности существования видовой специфичности хлорошхастпой ДНК хлопчатника, Tai? как она определяется, главны:.! образом, нуклеотядной последовательностью. Отсутствие различий в пухлеотядкем составе ДНК, свидетельствует о единства происхождения исследовании* видов хлопчатника и позволяет предположить, что становление рода Gossypiun в ходе эволюции сопровождалось незначительная! чгпенешши в составе хлорсиластной ДНК образующих его видов. ,

б.З.-Рестрзкциошшй анализ хлоропластнэЗ ДНК . различит видев хлопчатника. . .

Хлоропластная ДЕК высших растений представляет собой- кольцевую молекулу с длиной контура 40-45 мй, что соответствует молекулярной массе от 88 До 100 Ща. Отличительной особенность'- хлоро-нластнсй ДНК межпо czrraxü сущасхьсьанйо. а нал исвхорящдхся последовательностей, в виде" двух обращенных с оптантов длипсЗ 20-24 т «и.о. Исключение составляет лишь' хлоропластная ДНК гороха п'копезии бп~ бов, где повторяющиеся последовательности отсутствуют ( ¿airar et ai., 1982). Обращенные повторы разделены двумя сегментами уникальных последовательностей длиной 13-24 и 77-100 т.п.о. соответственно (Bohnert et ai. , IG82). Определение плавучей плотности рестрлкщюшшх фрагментов Tasse указывает па существование в молекуле хлоропластной ДЕК гетерогенных по нуклеотидному составу сегментов ( Schnitt et al., 1981).

Анализ хлоропластной ДНК двух видов хлопчатника ( ß.hlrsu-

■PUB L. ccpï Х08-Ф И G.barbadense 1,. COp.T-6037) С ПОМОЩЬЮ фар-ь:ентон рестрикции Pvu il, Кра I, Bal I, показал0 что фрагшнш аипс ДШ со молекулярной массе и по волокеняю на электрофорегрш^-ма блазкз (ряс» 7). Это указывает на то, что хлороплаетнне ДНК Есследсзсккнх задов хлопчатника дают сходные профили рестрикции, хотя п@ чаолу фрагментов рестрикции при использовании различных рестрянгаз ■ отличались «

Эгя фармзкгы расщепляют препараты хлоропластной ДНК на боль-сое кодагзоио фрагментов, сумма молекулярной массы которих варьирует в продзлах 57-675? от массы хлоропластной ДНК. Возможно, чтс РЕЗксмолекулярше рестриктн вымываются во вреия электрофореза. Некоторые из растряктов обладает более интенсивным свечением в ультрафиолетовом свете по сравнению с остальными и, ногвццимзыу, встречают с;.' в молекуле болеэ, чем б одной копки.

Рис.7.Электрафоратичвское разделение фрагментов"хлоропластной ДНК сорта 108-Ф (А)-И сорта 6037 (Б) хлопчатника» i - eocr'i -фрагменты ДНК фага Лямбда; 2 - eccrl -фраг» ■ мэнтц хлорссжаетно" ДНК хлопчатни-• г.а; 3 - Рта Il-фрагманты хлсролла-стиой ДНК хлопчатника; 4 - Нра I-фрагызпти хлоропластной ДНК хлолчат ЕЕка; 5 - Bgil-фрагшпвы хлоропластной ДНК хлопчатника.

! „443 ра да, i ь. м

rwt"""« та «и »¿Î * п m

гм5 « И Ni ~ р

H^râgil te^fqSll m»»Ш ¿л ш Ш» «• «в й rj

l-ilpl-pfeft Ipllifeill

blSIiliH-ll

ISllIMl

ГЗ*

12 3 4 A

2 3. k h

Таким образом, данные рестрикционного анализа свидетельствуют о том, что хлороплаетнне ДИК изученных видов хлопчатника (108—1» С-6037) имеют сходные рестриктные картины, что подтверждает их близкое родство»

6.4. Исследование гомологии нуклеотидных последовательностей хлоропластной ДНК различных видов хлопчатника

В ряте работ приведены исследования гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК на уровне тотальных препаратов ДНК эукари-стЕческих организмов (Марннова и соаьт.,1969; Слюсаренко и соавт.,

1973; Инеер и соавт.» 1975; Bendlsli et al.,1970} Flavgil, 1977} Турсунов, I978¿ Антонов„ 1283; Спвегш, ÏS83)»

Рабода, посвященные изучению гикзлотш пуклеотя&тах последовательностей хлорепластпой ДНК впсзях растения „ гегтего'чзмошш (Боброва я соавт0„ 1977j Карэлоз я сеавт.» Ï373; Та&дзз» 1981), а на хлопчатнике таянэ исследования па.проводилась»

В задачу наших псслздовадяЗ входило получить сведения о генетическом родстве хлоропдаотяого генома некоторк вйдоз ялопчат--няка¡,, отлячазшщхся - между собой эвол^сшно'Я г^одсгтутостью, выяснять степень дпввргирсванял " пуклеотядшз: последовательностей ыо-роштстной ДШ-вышеуказанных представителей рода Gossypiua. Для решения поставленной-задача был использовал иэтод ДНК-ДНК шбряде-задай'на мембранных.

Полученные наш результата пояаз'гввзт высокую степень гомология последователиностей нуклеотндов (72,3-92,35?) хлоропластной ДНК изученных нами,видов хлопчатника, что указывает на значительное сходство первичных структу их геномов. Максимальная гомология нуклеотядных последовательностей хлоропластной ДНК хлопчатника наблюдается между сортами С-7059 и С-7090 7 представителями диплоидного вида рода Gossypiuta. Исклгчзниэ-составляет ssp.sfri-canun L. , являюпщйся подвидом З.пегЬе.сеиа L. , у которого процент сходйых последовательностей нуклеотидов в ДНК о репергам сортом C-7D59 относительно низок (50,9$) (табл. 2).

Высокая степень гомологли нуклеотидных последовательностей в хлоропластной ДНК обнаружена'также между представителями ра?ляч-ных по плокдностя видов хлопчатника. Тал, сходные последовательности нуклеотидов хлоропластной ДНК рзперного сорта П-тпрда (ттпт-яд) п сортов 108-3 и С-6030 (тетраплсид) составляет, соответственно 81,5 и 82,2$. Несколько меньшая гомология обнаружена меяду хло-ропластноч ДНК реперного copia С-7059 с ssp.mexicanum(72,3£), относящегося к подвиду G. hirsutun Ь. (Гэ-ситое и соавт., ISS6).

Изучение сходства нуклеотядных последовательностей хлоропластной ДНК разш-'х сортов хлопчатника с использованием в д^чеотае рэ~ перной ДЕК сорта 108-$ (тетраплоид), вкйвяео зап?сямост* i/eijrj степенью сходства нуклеотяшс: послед сват льпостеЧ. хлорга/ласткоС FKK я отдаленностью видов хлопчатника; процент гомолагичностп сор-тоЕ С-705?, С-7090 я его подврда ( G.horbaccuc L. ) состав дя:" 70,2; 8?,5; 74,3 соотгптгтглгно

ïïdh использовании в качэг/гпе испорол сортов Ташкент-I я

0-6030 наибольший процент гибридизации наблюдали в случае тетра-плоидшх сортов хлопчатника.

Таблица 2

Гомологичные последовательности нуклеотидов в ДНК хлоропластоз хлопчатника (М ± а )

Сорт

Относительная гомология в %

хлопчатника • 1125-ДНК : 1125_д1К ! 11г5-днк : 1125_1щ

: 0-7059 : Ташкэнт~1 : С-6030

G.arboreum L.

С-7059 Ю0±1,5 70,2±4,0 80,6*1»4 76,9*1,8

G.herbaceuai L.

С-7090 . 92,3±2,9 82,5±3,2 80,0±1,6 78,5*1,4

G.herbaceuo L. 74,3±4,1 73, Щ ,4

ssp. afi-icanum 80,9±3,7 72,2*1,3

G.hlrsutum L.

Ю8-Ф 81,5*3,5 100±1,4 96,5±2,0 9^,1*1,5

Gchirsufcum L.

ssp.msxicanuia 72,3£4,1 83,5*3,4 80,0±1,5 79,0±Г,2

G. barbadense L. 100*2,8

C-6030 82,2±3,0 91,4+3,8 , 89,г±1,г .

P2 (P 140 a) - • - 95,5*2,5 ' Э4,г±1,б

(Л 57) - - 97,5*1,2 90»0^1,4

Неспецифическая

сорбция

Тимус теленка 2,0*0,4 - -

Контрольный •

фильтр • 0,0 - - -

В гибридных поколениях (.Щ-Р^) при использовании в качестве репера сорта 0-6030 гомологичнопть составила 90,0-94,2$, а при * использовании в качестве репера сорта Ташкент-I, гомологичнооть Доходила до 95,5-97,5$ (табл. 2).

Данные об'уменьшении степени гибридизации ДНК-ДНК с переходом к более отдаленным видам хлопчатника согласуется с результатами исследования гомологии нуклеотндных последовательностей хлоро-пластной ДНК ряда других'видов высших растений (Каримов и соавт„, 1978; Табидзе, 1981). ..

Таким образом, полученные нш.щ результаты по ДНК-ДНК гибридизации показали довольно высокую степень гомологии посладои;.'.'ель-нос. й нуь.'.еотпдов в хлоропластной ДНК изученных нами видов yj.ori-

чатпкка, что мода? свидетельствовать о близкой структурной срга-йизалии и значительной гепотипической гомогенности хлоропластно-го генома в предела:: рода Gossypiua.

?. piffiocom хлорошастор и цнтопмбш хгопттнш

7.1. Физико-химическая характеристика рибосом и полисом хлоропластов и цитоплазмы хлопчатника

Имеется много работ, посвященных изучению рибосом хлоропластов и цитоплазмы вксших растений ( Bcardnan efc al. , 19^6; Одипцо-ва п.соавт., 1969; Филиппович и соавт., 1968; Тонгур и соавт., , 1269; Eouque et al. , 1973* Филиппович, 1975, 1976; Одшцсза и со- ' авт^, 1976, 1951}. Однако данные по рибосомам хлорошгстов fli.:- ' 'топлазмы хлопчатника в литература отсутствуют.

Нами было проведено сравнительное изучение рибосом хлоропластов и цитоплазмы хлопчатника.

Евделеннае методом дифференциального центрифугирования с применением Притона Х-100, рибосома.хлорспластоз и цптоплазш хлопчатника имели желтоватую окраску. ;

Рибосош хлоропластов содержат 45-53$ белка л у различных ви- \ дов растопиЗ близки по соотношению FEK/белок- (1,13-1,20). Содержание белка в рибосомах пластид незначительно отязчаозся от содержания белка в цптоплазттпчзскш: рибосомах, по визе, чем в рибосомах прокариот (Юрина и соавт., 1974; Туликова и ссавт., 1974)

Изучение содержания РНК и бейка в препаратах рибосом хлоропластов я цитоплазмы, вздэленпхх из семян, проросткова такие листьев хлопчатника, яокасало, что они являются достаточно чистима (22gg/235 я Sjgg/ggg)» а по сод .¿панда РНК и белка незначи^е-

миаО '¿аЗЛиЧаишСо Ъ дооса я j/isvatixmt ЛЛиича'ШШШ.

Гогагейкосгь препаратов isaensssiarns«**1?*» и плбропластннх рибосса доказала ^трзхщг^гезревжхтл в лннгй'пем градиенте сахароза и в градгеятз плотносгл СсМ (рис. 0) (Рагкатов и соав-.,

1968).

Кооф^ациогаи саяготазадйя ялсрспяастхт: л цягезяагкатгэдохлх рябосои хлопчатника боля ргвки 70s п СО а сссгвстствепгго. Поскольку рибосомн хлоропластов резко отличаются о? рибосом «дасцтазмк по кс5#1щпеи'гу ездаментадеи - соответственно 70 з и СО 3 б:иш 233 основания говорить о генетической близости хтерсаяасхсв я Однако исследование рибосом хторелламез я градиенте клздесста хлористого цозкя показало, что по шгпу~сЗ плотности

рибосомы хлоропластов .( о- 1,56 г/см .) отличаются от рибосом-бактерий ( р = 1,64 г/ci,г) в большей степени, чем от рибосомы цитоплазмы ( j)= 1,53 г/см3) (Филиппович я соавт., 1969).

Плавучая плотность рибосом хлоропластов и цитоплазмы хлопчатника (рис. 6 А, Б) равны 1,57 г/см3 и 1,53 г/см3 соответственно, и не отличается от плавучей плотности рибосом пластид и цитоплазмы других объектов (СветайлО'и соавт., 1967; Одинцова и соавт., 1969; Филиппович, 1969).

При электрофорезе рибосом хлоропластов и цитоплазмы в НААГ обнарукено по две оснозных полосы: по-видимому, это субъединипд 70 S и 80S рибосом хлопчатника. По распределению в uAAT субъедя-шщы 70s и 80S рибосомы заметно отличались друг от друга. Это означает, что субъединицы рибосом имеют различные молекулярные массы.

Согласно последним данным, в хлоропластах имеется два класса рибосом - свободные и связанные с мембраной ( Chen, Wilâran, 1970s Chua et' al., 1973s Phylippovich et al., 1975î Margulios, Michaela, 1975). •'■'•.

Как оказалось, мембрано-связанные рибосомы входят в состав полирибосомных соединений - ассоциаций, которые имеют.Кольцевидпуэ форму. Впервые такие кольцевые полисош обнаружены в хлоропластах фасоли при электронно-микроскопическом исследования ( Talk, 1964), а выделеш п изучены - из проростков гороха Филиппович И.И. с соавт. в 1970 году. Нами изучен характер распределения полисом хлоропластов хлопчатника в градиенте концентрации сахарозы, центрифугирование в котором позволяет отделить 70s частицы от более тяжелой и более гетерогенной,фракции полисом. На профиле распределения ясно различимы две фракция: I я П. Радиоактивность проочяты-ваетоя по всему градиенту. Фракция I с одним большим пиком поглощения и очень малой радиоактивностью является фракцией мономеров рибосом с коэффициентом седиментация 70S , а высокоактивная фракция П представляет собой наиболее чистый препарат полисом, где чет ко разграниченные пики а,.6, в соответствуют полисомам содержащим две и более рибосом (рис. 9).

После центрифугирования в градиенте плотностя сахарозы поля-сомная РНК распределялась в виде 4 фракции: 23S , 15,9Б , 14,3S II,S s соответственно (рис. 10). Первые две фракции представляют . робой компоненты рРНК хлоропластор à фракция 12-14 s , по-.ч. ашо-i<y, является РНК информационного типа.

, г/сы3

.г/см3

г о.е

§ 0.2

1.70 1.60 1.50

фракЮТ градаекта

Рис.8.Распределение рибосом хлоропластов (А) я цитоплаз-ш (Б) хлопчатника в градиенте плотности хлористого цезии.

Рис.9. Профиль распределения полисом хлоропластов хлопчатника в градиенте плотности сахарозы 10-40$.

1 -'оптическое поглощение

2 -'радиоактивность

Рис.10. Профиль распределения РЫК полисом хлорпластов гороха (а) и хлопчатника (б) в градиенте плотности сахарозы 15-30',-'

7.2. Биогенез рибосом хлоропластов я цитоплазмы- ' ' . . • хлопчатника

Биогенез рибосом хлоропластов и цитоплазмы.хлопчатника исследовали по •-включения меченнх:.~*и-ш.шр2шслот д "С-урддана (табл. 3); Включение *%-ашнокислот.-в рибоссг-зше. белки 2-х '.пев-ных проростков на 61,выше, чем в■ рибосом ме.белки лдс~ъев хлопчатника. Биогенез хлоропластных рибосомшсс белков судя по вклетз-еий кал отдельных аминокислот, тая з смеси ^С-аукноттислот, происходят менее интенсивно, чей цятоплазматячоских рпбосомвых белков.

Такяа яе данные были получены' яшля при ^следования вклта-шхя ^С-урщуша в рЕбосоиную РБК. Уровень матки а цитоплазмам-

ческях рибсссшх из проростков бил на 43,0$ внве, чем из листьев« Удоль!1ая радиоактивность РНК хлоропластных рибосом била значительно (2 я 3 раза) нижа но сравнению с удельной активностью РНК цитошшматпческих рибосом проростков я лястьев, соответственно.

Таблица 3

Удельная радиоактивность рибосом,выделениях: из хлороплаотов я цитоплазмы хлопчатника (иш/мян/мг 'белка рибосом) (М ± ш)

Меченая аминокислота .'Цятоплазтатпческие • рибосомы Хлоропластшэ рибосомы

: проростков листьев : листьев

Смесь аминокислот 414.0+205 36S0¿I8Q 2550+150

Валян 1243+36 1020+25 750±20

Лизян 1462+35 870¿2Q 500±15

Гпстидон 1667+20 I000¿15 970¿I7

ГЛЕЦШ 720+14 550±I0 500±Ю

Алании 2034¿16 I340±20 1Л0±22

Лейцин 1336±20 ' 1200*17 IIOO¿25

Глутаминовая кислота ГГ34±Г5 830±2I . 900+20

Фанялаланин 1374+20 7S0±2Q 760¿25

Максимальная удельная активность рРБК и рибосомных белков

отмечалось нами во фракция мембрано-связаиных рибосом»

"еЗс Рябосошая РНК хлоропластов и цитоплазмы хлопчатника

Ранее в нашей лаборатория СафароьаМ (1974), было показано, что цитоплазматичеокяе рибосомы хлопчатника имеют коэффициент са-диментация 80S я содержат в основном два класса молекул РНК, различающееся по размеру: 25s рРНК имеет молегулярную масоу Г,34.ТО6 дальтон, 18 а рРНК 0,67.10® дальтон. При фракционирова-ияи pFHK хлоропластов я цитогпазш хлопчатника в линейном грали-енте плотности .сахарозы нами выявлена 4 основные фракции: по дазо высокомолекулярные (23 S я 16 Ь ; 25 s и 18s ) я по два низкомолекулярных (5s я 4,5S ; 5,83 и 5S-), соответственно. Всо указанные фракция отчетливо выявились при электрофорезе рРНК в 2,4 ПААГ (рис. 1Г).

Установлено, что рибосомы хлоропластов содержит несколько видов РНК: 23S (1,1.10®), 16s (0.56.I06), 5SPIK и 4,5S (38000) ( Poaver, Ingle, 1971; Payne, Dynr, 1971).

50 п субъединица содераит 2ds и 5S и 4,5s , в то н имя к 16 а компонент локализован в малой (30S ) субъэдпшш?. Рибо-

зоны цптоплазш содержат пошопепш 25 s (1,3.10е), 18S (0,7.10е), 5 S л 5.8S .(.Payne, D<;er, 1972).

Рас.11. Электрофореграпя pFHK хло-25 s ; j | 23 3 ропластов (А) п цптоплазш (Б) хлоп-

5its Ш 16 s 53 ^

Б - A

Содержание ГЦ-пар в рРНК хлороплаотов и цитоплазмы хлопчат-пга;а различных сортоз варьирует от 50,39 до 55,18 мол.52. Нуклео-тпдный состав суммарной рРШС, а такго 25 S , 23 s , 18 3 , 16S рРНК хлороплаотов и цитоплазш хлопчатника относится к слабо вырален-ног.;у Щ-тяпу.

Различия в.нуклеотидном составе рРНК хлороплаотов и цитоплазмы незначительны, но обнаружены рядом авторов ( Rossi ot al., 1970; Thomas,Tewari , 1974).

7.4. ИССЛЕДОВАНИЕ РИБОСОШЫХ ЕЕЛКОВ ХЛОРОПЛАОТОВ

' . ■ ' И ЩШШЛЗШ ХЛОПЧАТНИК 7.4.1. Состав рибосоишх балков хлороплаотов я цитоплазш хлопчатника Сравнительный электрофоретичесниЗ анализ рибосокяих белков хлороплаотов и цитоплазма хлопчатника (сортов 108-5, Таакент-1, С-4727) показал, что они готброгенц : при одномерном электрофорезе в ПААГ они разделяются па 18 и 25 белковых фракции, соотвотст-

В препаратах рпбосошшх белков цитоплазш хлопчатника нами обнаружено Х-полоса. При длительном электрофорезе одна из зтюс полос делится на две (рис. 12 Б). Интересно отметить, что полосы характзрннз для рибосом цитоплазш хлопчатника (Х-полосы), отсутствуют на электрореграммах рибосомных белков хлороплаотов хлопчатника (рис. 12 а). Аналогична данные были получены byttieton (1968) я ОдпнцовоЯ п соавт. (1969) при исследовании белкового состава рибосом хлороплаотов и цитоплазш листьев шпината, гороха, фасоли.

Среди белков рибосом хлоропластов преобладали фракции 2, 5, 6, 9, 14, 17, Ю, а среди балков цитоплазматячеейях рибосом -4, 5, 8, 9, 14, 84, 85.

Таким образоп,- состав рибосоишх- белков хлоропластов хлопчатника отличен от состава белков цитошшштических рибосом (Рахматсз и соавт., 1988).

Исследование методом двумерного электрофореза в ПМГ белкга рибосом хлоропластов и цптоплазш хлопчатника подтвердило, что 70 з и 60 б рибосома различаются как по числу, так п.по электро-форетичеокой подвижности входящих в их состав белков. Белки ци-топлазматических рибосом'хлопчатника содержат до 70 фракций, а белки рибосогл хлоропластов хлопчатника до 58 (рис. 13). Обнаруш ное наш количество белков в рибосомах:цитоплазмы и хлоропластоз хлопчатника близко к найденному в цг^оплазматичеоких и пластидш рибосомах других видов высших растений (Гушлевская и соавт.,19' Удалова и соавт., 1982), хотя отмечаются некоторые различия.в ю электрофоретической подвижности и интенсивности окрашивания. По-видимому, эти различия, связаны с видовой специфичностью растен

г*;

'■а

■ еиз-

'е®> ея» .О

«&* .¿а»

«к XV

с>

г..

* +

I 2

I г в

Рис. 12. Электрофореграшы рибосомных белков хлоропластов (А) и цитоплазмы (Б). I - 108-Ф; 2 - Таикент-1,. . 3 - С-4727.

Исследование аминокислотного соотава структурного белка рибосом хлоропластов и цитоплазмы явилось дальнейшим этапом сравш

Рис .13 .Двумерный электрофоре! рибосомных белков хлоропласт* (А) и цитоплазш (Б) хлопчатника сорта 108-Ф.

тельного изучения их структуры.

Аминокислотный состав структурного рлбосомного бель а хлопчатника характеризуется-сравнительно высоким содержанием основных аминокислот-- аргинина, лизина, гястидина, что з целом придает ему основной характер» В его составе найдено значительное количество аспарагиновой и глутаминовой кислот, в то же время отмечено низкое содержание пиотеина я метионина.

Аминокислотный состав белков рибосом хлоропластов я цито-плазш хлопчатника близок к составу рибосомных белков других выс-ии : растений (Гумилевская, 1971, 1977; Аракельян и соавт., 1972),

При сравнительном исследовании аминокислотного состава- рибосомных белков трех- сортов хлопчатника (108-Ф, Таткент-1, С-4727) в процессе роста и развития обнаружены значительные различия. С возрастом хлопчатника увеличивается содержание отдельных аминокислот, таких как лизин, аланин, и в то же время наблюдается уменьшение содержания аргянина я глутаминовой кислоты»

Интересно отметить, что при прорастания семян хлопчатника число фракций рибосомных белков остается одинаковым как в сема-' нах, гак л в проростках д листьях хлопчатника. При электрофорезе в ПААГ рябосомные белки, вндзле1шые из рибосом сухях семян, проростков и листьев дают до 25 полос (рис. 14). По содержанию различных фракций, рябосомные белки, выделенные из двухдневных проростков хлоп" атника, отличаются от покоящихся семян и листьев 14-днев-1шх проростков хлопчатника. Так, в рибосомах из семян хлопчатника отмечено наибольшее содержание 2, 10, II, 14', 20, 25 фракций, В рибосог.!ах же из листьев хлопчатника выявлено наибольшее содержание I, 9, 14, .21, 24, 25 белковых компонентов.В двухдневных: . • проростках обнаруживается- более интенсивно окрашенные полосы, по. сравнению с фракциями рибссомпни'белков, видслсиних из ее?!ян я листьев хлопчатника. По-видимому, это связано с изменением активности отдельных генов, отвечающих за синтез рибосомных белков при росте и развития хлопчатника.

Такт,; образом, исследования физико-химических свойств белков рибосом хлоропластов и цитоплазмы изученных сортов хлопчатника не выявили каких-либо значительных различий. Однако в рибосомных белках хлоропластов.отсутствуют Г полосы, характерные для белков рибосом цитоплазмы.

Ряс .14 .Электрофорегралша рибосом-пых балков хлопчатника сорта 108-а - семена; б - проростки; в - л: стья, Дпск-электрофорез проводил; в 9,6^-ном ПААГ в -аланяновом 1 форе, рН 4,5, 4сС, 8 час.

е б в

7.4.2. Состав рпбосомных белков хлоропластов Д!Я1лоидных я тетраплоидных видов хлопчатника рода Соазур1ит

Изучение рибосом пластид показало, что оня представляют со-боЛ особый тип рябосомных частиц (Удалова и соавт.,1982). По да: шм плотностного я хшдлческого анализов, рибосомы пластид хараг: рязуится более высоким относительным содерзглняем белка, чем ря~ босош прокариот ( Ораг1п съ а1. , 1975), что монет быть связан! с их высокой молекулярной массоИ пли с большим числом белков.

Ркбосо;.з: хлоропластов как диплоидных, так и тетраплоидных видов хлопчатника содорглт около 48-50$ балка. Плавучая плотное рибосом хлоропластов диплоидных п тетраплоядпых видов хлопчатшг почти одинакова п составляет р - Т 57 г/с.м^, но отличается от плавучей плотности рибосом бактериального типа ( р = 1,64 г/см^

Ка-л был изучен биогенез рибосом хлоропластов диплолдных я тетраплоядпых видов хлопчатника по включения меченых предзветво: н;:;:ов (^С-амяяокяслот я ^С-урядииа). В рибосомах, ■ выделешкх из'тетраплоидных видов хлопчатника ( О.ЫгаиЪип ь. 108-Ф, б.Ьаз Ьайепае ь. С-6030) вклгзчепяо ^С-аминокислот в белки рибосом больше,чей в рпбсЬсЕзя (С .агЬогеии Ь. . С-705Р, 6. ЬсгЬасеиа Ь. С-7090) диплоидных видов хх лчатника.

Вклглспке *4С-урлдина в РНК и С*4-амянокислот в белки рибосом хлоропластов дяплоидшк и тотраплоядгых водов хлопчатника к: чалось как во фракюш свободных рябосом, так л во фракции мембр: но-связаипых рибосом (макросом) и во фракцию полисом. Интенсив»! ТЬ рклшенкя 4С-урпдпиа в РНК различите фракщй рибосом суцост-

зенно различается (табл.4). Включение как ^С-урпдина в РБК так я ^С-шлинокислот в белки свободных рибосом, микросом и полисом хлоропластов у диплоидных видов хлопчатника было значительно низе, чем для тетраплоидннх видов. Так, включение 14С-уридина в РНК звободных рибосом, микросом и полисом в два раза нияе у диплоидных зидов ( й.агЬогеша Ь; С-7059; О.ЬвгЬасеиш Ь. С-7090), чем в РНК свободных рибосом, микросом и полисом тетраплоидных^.Мгаи-

Ь. 108-Ф; О.ЬагЬадепзв Ь. С-6030) видов хлопчатника. Гакзхе показано более интенсивное включение *4С-амино;$ислот в бел-рибосом тетраплоидннх видов хлопчатника (табл. 5).

Таблица 4

Включение ^С-уридина в РНК рибосом хлоропластов диплоидных и тетраплоидннх видов хлопчатника (имп/мян/мг РНК)

~ 1 : Сорт хлопчатника

^.ракция . с_ТО5д : с-7090 : 108-Ф : С-6030

Свободные рибосош 1000*10

Яембрано-связапкыа рибосомы (микросомы) 1800*25

1олисомы Г200+Г0

Включение ^С-аминокислоТ в пдных и тетраплоидных видов

900*15 2140*40 2Г00±15

1700*20 4000*30 3200*15' 1300*15 2800*Г5 2000*20

Таблица 5 белки рибосом хлоропластов длило--хлопчатника (имп/мин/мг белка)

. Фракция '*_Сорт хлопчатника_

_; С-7059 : С-7090 :. 108-Ф : - С-6030

Свободные рибосош 1200*15 1300*10 • 2550*15 2100*10 "" Лембрано-связанные

рибосош (мпкросомч) 2200*20 • 2000*15 ' 3900*20 3100*20 1оллсомы 1800*15 • 1700*10 2500*15 2400*10 ■

Таким образом, результаты исследований включения ^С-уридкна

I *4С-амянокислот в РНК и рибосошые белки хлоропластов показали, 1То меченые предшественники более интенсивно включаются в тетра-шоидныв сорта хлопчатника. Интенсивность биогенеза рибосом после-юванных нами тетраплоидных сортов хлопчатника выше, чем дпплоид-

ШХ„

Состав ОСНОВ1ШХ белков рибосом хлоропластов диплоидных н тет-эаплоидных видов хлопчатника-олизок. В препаратах белков рибосом слоропластов как диплоидных, так я тетраплоидных шгдез хлопчатни-<а методом одномерного электрофореза а ПЛАТ обнаружено по 18 ком-юнентов (рис, 15), Однако, в содержании кянорных фракшгё В!шзк-

Peo .15 „Элоктрофорегрш»2.а рибосом-них белков диплоидных а тстрапло: пых видов хлопчатника, I - 108-Ф; 2 - С-С020 j 3 - 0-7051 4 - 0-7090.

Изучение количественного соотношения белковых фракций выяви, преобладание 2, 5, 6, 7, 17 р 18 компонентов как у диплоидных (С-7059, С-7090), так а у тетраллоидных (I08-®, С-6030) видов хлопчатника.

Молекулярные массы рибосомннх белков хлоропластов как дипло идных, так и тетраплоидных видов хлопчатника варьировали от 5500 до 15500 дальтон соответственно.

Аминокислотный состав рибосомннх белков хлоропластов как дл пяоидннх» так и тетраплоидннх видов хлопчатника довольно близок: по содержанию основных аминокислот - аргинина, лизина, гистидша что в целом придает ему основной характер, а также по содержанию аспарагиновоЗ и глутамяновой кислот.-

Таким образом, сравнительное изучение состава рибосомных б( ков хлоропластов изученных нами диплоидных и тетраплоидных сорто хлопчатника не выявило каких-либо существенных различий.

7.4.3. Изучение рибосомных белков хлоропластов и Цитоплазмы хлопчатника при заражении грибом vertióiiiium dahiiai Kleb.

Сравнение удельной радиоактичности цитоплазматических рибосом, выделекяшс из листьев здоровых и зараженных v.dabllae к. растений (табл. 6), показывает, что в начальные периоды зараяени (3-Й п 7-й дни) наблюдается усиление биогенеза рибосомннх белков по вкявчошга как с^зск, так и отдельных ^С-ашнокислот, в частности гдутаканозсЯ кислота, лейцина, феаплаланина и изолеЯцина.

лась некоторые различия.

"4- ......

«во. 05??

12 3- Л

йа балов поздняя стадиях (14 дохой) удельная радиоактивность ра-

боссшшх белков i. зараженных листьях постепенно сличается (в нет-коз'оршс случаях даяэ лазэ контрольного уровня (табл. 6).

'Таблица 6

Удельная радиоактивность рибосом хлоропластов я цитоплазмы выделенных из здоровых я зараяеникх v.dahliao Kleb растении

хлопчатника (иш/дшн.яа мг белка рибосом)

BRQKI 1 ; «о- 14с- Ия и—

псслэ Гр^рггллг шгьзк-: •емзеь :глутамя-:леАцкн фенила- цзолей- ГЛЕПЕП

:агяино- ;новая « ланин цин

0 „ дня • : кислот ;кяслота в #

Рпбосо;ш хлоропластов

3 Контроль гез7 13Г5 1703 19II 1543 -

Заражение 22X6 1618 2136 2584 1732 -

7 Контроль 1642 894 712 II3S Г016 -

Заражение 2275 1315 1025 1598 1429 „

14 Контроль - II0B ггсо 1120 1334 -

Заражение •938 1062 1064 1298 -

Рябосош цитоплазмы

з'. Контроль 2417 1907 2108 2395 1895 2177

Зараяение 2920 2653 2433 28Г6 2295 2697.

• 7 Контроль 2038 1212 808 1220 III3 1000

Заражение 2420 Г532 ГЗОО Г864 14 Г5 1500

14 Контроль 2200 ' . IIIS 1280 1365 1293 2060

Заражение 2190. 1030 1140. teso Г040 2012

Представлялось интервент.? исследовать биогеназ рибосом хлоропластов в зараженных и здоровых листьях хлопчатника, Интенсивность включения меченых аминокислот возрастала на З-ü п 7-й донь" заболевания, а на 14-й День - снижалась. ■

Б связи с тем, что хлоропласта обладают генетически обособленными функциями к отличаются по структуре и биохимическим свойствам от цитоплазмы, интересно было исследовать удольпуи радиоактивность изолированных хлорспластоз зарапонного хлопчатника.

В начале заражения (36 чао), как в случаз ядерной фракция," , отмечено небольшое подавленно включения меченых аминокислот в белки хлоропластов. Наибольшая удельная радиоактивность хлоропластов я цитоплазмы выявлена на 3-7 дни после зараяеняя грибом v.dahUa-э Kleb. Через 14 дней пооле заражения удельная ектявкость хлороп-

ластов п цитоплазмы, выделенных из зараженных тканей, становится няхе контроля, .

Рубли и соавт. (19о5, 1866, 1971} наблюдали активирование ряда окислительных ферментов при заразения капусты в.с3.пеагеа за счет дополнительного количества ферментативныхО&гясз.что е к очередь бчло обусловлено новообразованием рибосом. Ряд авторов наблюдали изменение количества протеолнтических ферментов в зара яенпых растениях. Обнаружено усиление синтеза белка п увеличение количества рибосом в тканях при заражении различными паразитами (Чеголина, 1969; Рагозина и соавт., 1969),

Удельная радиоактивность'растворимых белков в хлороплаотах и цитоплазмы зараженных р .степШ) хлопчатника увеличивается на 3-и 7-й дни после пньавдш, а затем постепенно' уменьшается. Следовательно, из..оненяе их удельной радиоактивности происходит анало гячяо изменению биогенеза рибосом цитоплазмы и хлоропластов.

Пря сравнятельном ясследованпя основных белков рибосом цито плазмы нормальных я зараженных растений хлопчатника с помощью электрофореза в ПААГ обнаружены различия в содорнаннп некоторых фракций. Так при заранешш растений хлопчатника содеряаняе 3 фракция увеличивается в 3,1; 4 - в 6,7; 5 - в 7,3; 10 - в 2,94; в 25 - в 2 раза по сравнению с контролем. В то ае время содержание ряда фракций уменьшается: 9 - в 5,6;' 31-24 - в 3 раза по ера копию с контролем. • •

На 7-й День заражения грибом У.йаЬНае к. в составе основ пых белков хлоропластов.по данным электрофореза в ПЛАТ оплачено увеличение содеряания'З фракция в ¿,9; 7 - в 2,6; 16 - в 1,9; 18 - 1,6 раза, сниаение содержания I, 6 и 17 фракций - в 2,5;раз Из результатов полученных нами по изменению содерзания фрак пий белков цктоплазматяческях я хлоропластных рибосом, особое вн мание заслуживает тот факт,' что на 7-й день после заражения обна руяивается наибольшее различие между здоровыми и больными растен. ями хлопчатника,, по срарчешго с 3 я 14 дпяш после инъекции. Это указывает на возможность изменепля скорости биогенеза рибосом в различные сроки развития заболевания.

8. ИССЛЕДОВАНИЕ ЖШ-ШШЕШЯ СВОЙСТВ РБгХ

ХЛОРОПЛАСТОВ ХЛОПЧАТНИКА 8.1. Выделение и физико-химические свойства РР&К хлороиластов хлопчатника

Известно, что'фракция I белков хлоропластов составляет около 50% растворимых белков пластид и играет важную роль в процессе фотосинтеза (Kawastilna , 1969; Kawasbima, Yíildman , 1970; НасырСВ, 1975, 1979; Красновский, 1979). Она представлена, главным образом, ферментом рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксплазой/оксигейазой (РБФК), катализирующей уникальную по своей природе реакцию - фиксацию атмосферного COg с дальнейшим превращением в первичную органическую молекулу ( Ogron, B'oweo, 1971} Lorimer et al., 1973? Andrews et al., 1973).

Исследование структуры растворимых белков хлоропластов хлопчатника показало, что при хроматографироваиия на колонке с coja-дексом G-75 белки надосадочной жидкости после центрифугирования прп 105000 s » разделялись на две фракции. Первая была более концентрированной и менее окрашенной, чем вторая. Дальнейший анализ путем электрофореза на ПААГ обнаружил, что в составе I фракции имеются примеси П (рис, 16). Аналогичная картина разделения наблюдалась при исследовании фракции I из листьев Alfalfa ( Noguohi et-"ai. , 1978) и волоснеца ситникого (Русанова и соавт»г Г978).

Пос^е дополнительной очистки РБФК па колонке с ДЭАЭ-целлкшо-зой электрофорез в ПААГ показал гомогенность .белка (рис. 16 в)„

Для разделения РБФК на большую и малую субъединици использовали хроматография на колонке с сефадексом G-150 с 0,5^ ses. Это позволило получить чистые,'взаямонезагрязяеннио субъедяняцы: при электрофорезе в ПААГ оба субъединяцы дали по одной гомогенной полосе (рис. 17 А, ь).

Сравнение аминокислотного состава РБФК и ее субъедкшщ яз хлоропластов хлопчатника, с аминокислотным составом РБФК табака выявило различия в содержат -и 13 аминокислот: из них 4 относится к большой субъединице, тогда как 9 различий относятся к малой субъедишще.'В большой субъединице РБЙС хлоропластов хлопчатника количество лизина и метяонина больше (7,94 я 6,69 в хлопчатнике я 5,04 и 1,65 в табаке), а аспарагиновоЯ кислоты и проляна меньше (6,54 и 1,46 в хлопчатнике я 8,92 и 4,32 в табаке). В малой субъ-одиницо РБТ'К хлоропластов хлопчатника, содержание лизина, аргиии-

на, яланнна, метионина ште (11,37; 14,50; 9,17 и 5,20 в хлопчатнике), против (7,90; 4,20; 5,72 и 1,61 в табаке), тогда как содержание гистидина, аспарагиновоИ и глутаминовоЛ кислот, пролила п тирозина ниже чем в ферменте из табака.

РисЛ6,ЭлентроФореграмма РБФК хлоропластов поело гель-фильтрации на колонке с сефадексом 0-75.а - РБФК; б - окрашенная фракция; в - электро-фореграмш РБФК хчоропластов после хроматографии на колонке с ДЭАЭ-цел-лшозой.

Ряс. 17» Элентрофореграмма большой (А) к малой (Б) субъединиц РБФК хлоропластов хлопчатника.

Молекулярные массы субъединиц, РБФК из хлоропластов хлопчатника, которые оказались равными 54000 дальтон и 12000 дальтон для большой и малой* су б*, единиц, соответственно. Следовательно молекулярная масса холофермента будет равна 528000 дальтон. Таким образом РБФК хлоропластов хлопчатника я ее субьедпнщы отличается от молекулярной массы других высших растений. Так, молекулярная масса большой и малой субъединиц РБФК из пшеницы составляла, соответственно, 53000 и 13500 дальтон ( Усоп еЬ а1. , 1979), из листьев кукурузы 52000 п 1X00 дальтон (Беляева и соавт», 1979).

Антисыворотки (АС), полученные к большой и малой субъедини-па,м,П0Казайг! жх егрегуе спецдФкчнссть к свопы аятпгснан(рпс.18).

Рис.18.Иммунодйфг¥узия РБФК хло-({ ропластов хлопчатника о сыво-

р°5квш* а - сыворотка к больше"; субъединице; Б - сыворотка к мало!! субъедшшпе. I - РБФК; 2 - большая субъединица; 3 -малая с/бъединица.

г—1

у щ)

Рис. 16

РЙ1

ШШ к •"

А Б Рис. 17

О N0 О. ©

& ЧЭ

Как видно ия рисунка 18, при взаимодействии АС-РБШ с суммарной РВЩ образуются дао основные дискретные полосы, что свидетельствует о поливалентности АС-РБЙС и о присутствии в суммарной РБШ двух различных белков. Отсутствие дополнительных полос, характерных для РБФК, указывает на то, что большая и малая субъо-дшшцн свободны от примесей других антигенных компонентов РБФК.

Таким образом, исходя из приведенных выие экспериментов, видно, что большая и малая субъединяцн РБФК являются га?,миологически гомогенными белками, а их антиенворотки - моновалентннмя.

8.2. Изучение содержания я активности РБ£К хлоропластов хлопчатника в норма я при заражения грибом Vertlcllli.ua daUliae Kleb

Одной из задач, стоявших перед нш.ш, было определение влияния заражения хлопчатника грибом v.daallae к. на содержание и активность РБФК. Активность РБФК определяли по включении меченой углекислоты в белковые продукты фотосинтеза. Количество РБ1К в зараженном глатериале увеличивается в I неделю после заражения на • 147$, во П - 120$, в Ш - 110$. Активность РЕЙС по сравнении с контролем понижается, начиная ухе с первой недели посла зараке-пия на 72,9$, второй неделя после заражения на 46,5$. К третьей педеля посла заражения она падает уде до 32$ против контроля

(табл.7). _ х

. - Таблица 7

Вляяпяэ заражения V.dahlia а Kleb щ содержание я активность РБФК хлоропластов хлопчатника

РБФК * I неделя после • 2 неделя поело : 3 неделя поело

заралоняя • ■ заряжения заражения

: Конт- ' Зара- : Конт-.: Зара- Конт- : Зара- .

: воль : ийнип ? плттт. ? н^нтго ; ГЧЛТТГ. • -

Содержа-

Нгга 3,21±0,2 4,74±0,3 3,50±0,4 4,30^0,2 3,73*0,4 4,20±0,5

I г ткани

Активность РВБК

( ПП T^Ti

чешго 1937±15 Т322±Ю 18Н±Ю 846±I0 I9I6±I5 627-10

MaH'l'KJOj

в я? от/мин )

Подобные работы быля проведены на пшенице ( Herding et ai.. 1976). Выявлено, что при заражении листьев пшеницы возбудителе!}

келтоЯ ркавчины активность РБФК в зараженных листьях уменьшается, начиная с первой стадии заоолевания. В пораженных листьях дег радапия хлоропластов - разрушение их оболочки и системы тилакоп-дов в цитоплазмы происходит быстрее и начинается раньше, чем.в здоровых.

Причиной резкого уменьшения физиологической активности РБФК хлоропластов хлопчатника мояет быть потеря нативности самого хо-ло?ермеита: неспособность субъединиц образовывать активную форму фермента монет быть связана либо с количественным изменением их соотношения, либо с изменением в их структуре.

в ив о д ы

1. Из хлоропластов 4-х разновидностей хлопчатника (G.arbo-геиш L. , G.Uerbacauia L., G. hirsutr-, L., G. barbadense L.) ВЫД(

лена хлоропластиая ДНК. Установлено, что все исследованные хлоро-пластине ДНК в градиенте плотности CsCl проявляет унимодальный характер распределения с плавучей плотности J» -- 1,697-1,698 r/ctP и относятся к АТ-типу. Содержание ГЦ-пар в них варьирует от 37,9 до 39,2 мол.Я; 5-метилцитозин в хлоропластноЗ ДНК не обнаружен.

2. Хлоропластиая ДНК хлопчатника после расцепления рестрикт; зой. EcoRI при,электрофореза распределяется в виде дискретных п лос, что указывает на наличие в ее молекуле ограниченных сайтов рестрикция для рестриктазы EcoRI. Молекулярная масса фрагментов ДНК находится в пределах 5,71-0,17хТ06. дальтон. Ядерная ДНК хлоп чатнпка после обработки рестряктазоИ EcoRI при электрофорезе ха рактеризуется равномерным распределением: на денситограммах геля ш наблюдали один широкий пик, что.по-видимому, объясняется множественностью сайтов в молекуле ядерной ДНК для рестриктазы Bcol

Анализ хлоропластноП ДНК двух видов хлопчатника ( G. htrsu-tun Ь. 108-Ф И G.barbadenso L. С-6037) с помощью ферментов EcoRI, Pvu Ii, Нра I, Г31 I , показал, что фрагменты этих ДНК по молекулярной гассе и по г лояенизо на электрофореграмме сходны

3. Совместное использование рестрикционного анализа я равно веского ультрацентркфугпроваяяя в градиенте плотности СсСХпозво лило выявить значительную внутримолекулярную гетерогенность хлор пласткой ДНК хлопчатника.

4. Сопоставление кривых кинетики реассопиация хлоропластноП ДНК различных видов хлопчатника показало идентичность структурно

зрганизация генома, хлоропластов в.отношении как диплоидных, так 1 тетраллоидных видов хлопчатника. Кинетическая однородность структурных компонентов, составляющих хлоропластныА геном, указы-зает на отсутствие в нем нуклеотядных последовательностей, разлитых по частоте повторяемости. Размер хлоропластного генома всех тсследовапных видов хлопчатника составляет, в среднем 1,54x10® зальтон.

5. ДНК-ДНК гибридизацией показана высокая степень гомология [72,2-92,3$) хлоропластной ДНК изученных видов хлопчатника, что

,тонет свидетельствовать о близкой структурной организации и зна-штельной генотипической гомогенности хлоропластного генот в пределах рода Goasyplua. Выявлена незначительная дивергенция хлоро-1ластного генома в процессе эволюции я ого более простая организация по сравнению с геномом ядра.

6. Геном хлоропластов по информационной et.®ости, конформации лолекул и ряду физико-химических свойств, а такяе структурной и .голекулярной организации ДНК существенно отличается от ядерного ?енома хлопчатника,

7. Изучены химические и физико-химическле свойства рибосом слоропластов и цитоплазмы хлопчатника. Коэффициент седиментация слоропластных и цитоплазматических рибосом хлопчатника равен 70s i 80s , а плавучая плотность в градиенте плотности CsCi равны [,57 и 1,53 г/см^ соответственно. Биогенез хлоропластных рибосом-шх белков и рибосомной РНК судя по включению с-аминокислот и ■^С-уридина, происходит менее интенсивно, чем цитоплазматических. йкоимальная удельная активность рпбосомных белков я рРНК отмотаюсь во фракции нембрано-связашшх рибосом.

а) При фракционировании полисомной РНК в градиенте плотности ;ахарозы получены 4 фракции: 23 s, 15,9 s , 14,3 S, II.9S . Первые цзе фракции представляют собой компоненты рРНК; фракция 12-14 S вносящаяся к резко выраженному АТ-типу, по-видимому, является ПК информационного типа.

б) Показано, что рРНК хлоропластов хлопчатника имеет коэффициенты седиментации 23S, 16 s , 5s, 4,5s, тогда как рРНК цитопла-!мн 25 s, 18 s , 5,8 s, 5s. Суммарная РНК и рРНК больгакх и малых :убчастиц хлоропластов и цитоплазмы хлопчатника относятся к слабо траженному ГЦ-типу. Содержание ГЦ-пар в рРНК хлоропластов и цп-:оплазмн различных сортов хлопчатника варьирует от 50,39 до 50,18

8. Методом одномерного электрофореза в ПААГ выявлено, что Х-полосы характерные для рибосом цитоплазмы хлопчатника, отсутствуют на электрофорограммах рибосомных белков пластид. Аминокислотный состав рибосомного белка хлопчатника характеризуется высоким содержанием основных аминокислот - аргинина, лизина, гис-

тполна, в целом, придает ему основной характер. В его составЕ наедено значительное количество аспарагиновой и глутаминовой кислот , в то же время отмечено низков содержание цистина и метиони-на.

а) Сравнительное изучение состава рибосомных белков хлоро-пластов диплоидных и тетраплоядных видов хлопчатника не выявило каких-либо существенных различий: методом одномерного электрофореза в ПААГ обнаружено по 18 компонентов, молекулярная масса'рибосомных белков хлоронластов хлопчатника варьирует от 55000 до 15500 дальтон.

б) При прорастании семян хлопчатника число фракций рибосомных белков одинаково как 'в семенах, так и в проростках и листьях хлопчатника. Рпбосомше белки семян, проростков и листьев дают 2Í полос при электрофорезе в ПААГ, однако, в двух дневных проростках обнаруживается более интенсивно окрашенные полосы, по сравнению с фракциям рибосомных белков, выделенными из семян и листье! хлопчат!шка, чтр, по-видимому,, связано с изменением активности генов, отвечающих за синтез рибосомных белков при росте и развитии хлопчатника.

в) Показано, что в начальные периода заражения хлопчатника грибом v.dahiiae Kieb (3,7 дни) судя по включению 14С-аминокис-лот, наблюдается усиление биогенеза рибосомных белков хлороплас-тов и цитоплазмы, а на более поздних стадиях (14 день) удельная радиоактивность рибосомных белков зараженных листьев снижается ниже контрольного уровня.

9. Рибосомы хлоронластов хлопчатника представляют собой осо бнй тип рибосог.шых частгкоторые по своим своЗствам существенно отличается от рибосом щгоплазмы хлопчатника.

10. Охарактеризована РБФК хлоропластов хлопчатника и ее суб единиц, дан аминокислотный состав. Показано высокое содержание всех аминокислот, кроме метионина и цистина. Молекулярная масса большой и малой субъединиц равна 5400^ и 12000 дальтон, соответственно. Выявлено существенное уменьшение физиологической актив-

ностя РБ5К при заражении хлопчатника v.dahiiae Kleb , а также потеря нативностя самого холофермента: неспособность су^ьедишщ образовывать активную форму фермента, по-видимому, связана с количественным изменением их соотношения, либо с изменением в их структуре.

II. Полученные нами данные в совокупности с литературными данными указывают на значительное сходство структурной организации ДНК и рибосом хлоропластов с генетическими и белок-синтези-рующими аппаратами прокариотических клеток и дает'возможность iY-зорить об эволюционной связи пластид с цианобактеряями.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Действие радиация на биосинтез балков и нуклеиновых кислот хлопчатника / А.П. Ибрагимов, Т.У. Каракузиев, Л.С. Плеханова, Ш. Юнусханов, H.A. Рахматов, Ш. Сафаров //Действие радиации на биосинтез белков и нуклеиновых кислот хлопчатника: Тез.докл. П Всесоюз. симпозиума по радиобиологии растений. 25-28 октября 1971. г Ташкент, 1971. - С. 26.

2. Действие гамма-облучения на метаболическую активность рябосомальной фракции клеток хлопчатника. / Ибрагимов А.П., Плеханова Л.С., Геворкьян Ж.Г., Сафаров Ш., Рахметов H.A. // Радиобиология. - 1972. -.Т. XII, }Ь 6. - С. 835-839.

3. Ибрагимов А.П., Рахматов H.A. Выделение и изучение некоторых свойств тотальных рибосоыалышх белков хлопчатника сорта 108-Ф // Узб. биол. ж. - 1973. - й.2. - С. 3-5.

4. Рахматов H.A., Ибрагимов AJI. Изучение изменения фракци-

nwwr»r»n пплтоао ^атоло ^плгтгттпт*п г» ггл^ил г» rtpгт т*^^.^—

облучения.// Биоэнергетика при лучевом поражении живых организмов Гез. докл. 23-25 октября 1973. - Ленинград, 1973. - С. 221.

5. рахматов H.A., Ибрагимов АЛ. Сравнительное исследование рибосомальшх белков хлопчртника сорта 108-Ф и гриба V. dahiiae Kleb // Узб. биол. ж. - 1973. - К 6. - С. 7-9.

6. Ибрагимов А.П., Рахматов H.A. Электрофоретическое исследование рибосомальшх белков сорта Ташкент-1 // Вопросы физиологии, биохимии хлопчатника и других сельскохозяйственных куль-гур. - Ташкент: Фан, 1973. - С. 31-35.

7. Исследование метаболической активности клеточных структур хлопчатника в процессе заражения растони2 грибом v.dahiiae

Kleb /АЛ. Ибрагимов, Л.С. Плеханова, Ж.Г. Геворкьян, Ш. Сафа-ров, H.A. Рахматов // Тез. док;., симпозиума по вилтоустойчивости хлопчатника. - Ташкент: Фан, 1973. - С. 28.

8. Рахматов H.A., Ибрагимов АЛ. Изучение рибосомалышх.бег ков хлопчатника в процессе роста и развития // Узб. биол, ж. -1974. -г ff.-2. - С. Зт5.

9. Ибрагимов АЛ., Рахматов H.A. Изучение изменений количественных соотношений белковых фракций рибосом хлопчатника в норме и при гамма-облучении // Радиобиология» - 1974. Т. 14. - Д I. С. 147-149.

10. Об участии v.dahllae Kleb в метаболизме растений хлог чатника, пораженных вертяыллезным вилтом / АЛ. Ибрагимов, Т.А, Усманов, ЗЛ. Аширова, H.A. Рахматов // Структура и функции нуклеиновых khcj.jt и биосинтез белков в ^астениях. Тез. докл. 4-6 ноября 1974. - Ташкент: Фан, 1974. - С. 41.

11. Ибрагимов АЛ., Рахматов H.A., Арипджанов Ш,А, Изучение радиационного поражения генома. хлопчатника // Влияние радиации * регуляторные процесса в клетке. Тез, докл. 25-28 мая 1976, - Пу| но, 1976, - С. 52.

12. Исследование .ДНК хлоропластов хлопчатника сорта 108-Ф /АЛ. Ибрагимов, H.A. Рахматов, У. Туроунов, Ф. Цухамедханова, Э.М, Исмаилов // Узб. биол, я,. - 1976. Ii 2. - С, 3-5,

13. Исследование некоторых физико-химических свойств ДНК хлопчатника / АЛ. Ибрагимов, Э.М. Исмаилов, Т.А. Усманов, Э.А. рагимова, Т, Юсупов, H.A. Рахматов // Узбек, биол, ж. - 1977, -tf I. - С. .64-66.

14. Исследование гомологичности рРНК-ДНК хлопчатника в яорг. и при гамма-облучении / ПЛ. Ибрагимов, H.A. Рахматов, ЭЛ. Исые ялов, Т.А. Усманов // Радиобиология. - 1977. - Т. 17. - 4. -С.579-581. .

15. Исследование ДНК в градиенте плотности хлористого цезия / АЛ. Ибрагимов,Т. Юсупов, H.A. Рахматов, М.И. Юсупов // Узб. биол. к, - 1977, - й 5, - С. 81-82.

16. Дезоксирябояуклеиновые кислоты внутриклеточных органоидов хлопчатника / H.A. Рахматов, Т. Юсупов, М.И. Юсупов, А.П. № рагимов // Структура и функция нуклеиновых кислот и биосинтез бе ков в растениях. Тез. докл. Второго Всесоюз. симпозиума 11-13 он тября 1977. - Ташкент: Фан. - 1977. - С. 41-42.

- 17. Юсупов М.И., Рахматов H.A., Юсупов Т. Полприбосомы хлор

[ластов хлопчатника // Структура и функция нуклеиновых нисдот с биосинтез балков в растениях. Тез. докл. Второго Бсесоюз. сим-[озиума.П-13 октября 1977. - Ташкент: Фан, 1977, - С. 80.

18. Рахметов HJL, Юсупов М.И., Юсупов Т. Некоторые физихо-ишические свойства рибосомальных белков я РНК хлоропластов лопчатника // Структура и функция нуклеиновых кислот я биосин-'93 белков в растениях. Тез. докл. Второго Всэсоюз, симпозиума I-I3 октября 1977. - Ташкент: Фан, 1977. - С. 42.

19. Рахматов HJ.. Исследование рибосомальных белков при сражении хлопчатника Verticiiiiun dahliae к. / Структура и функция нуклеиновых кислот и биосинтез белков в растениях. Тез, юкл. Второго Всасоюэ. симпозиума II-I3 октября 1977. - Ташкент: >ан. 1977. - С. 43. .

20. Ибрагимов АЛ., Рахметов H.A. Влияние гамма-радиации

ia фракционный и аминокислотный состав белков рибосом хлопчатни-ta в онтогенезе // Радиобиология. - 1978. - Т. 18. - К I. - С.

:оо-тоз.

21. Юсупов М.И,, Рахматов H.A., Ибрагимов АЛ. Исследование голирибосом хлоропластов хлопчатника // ДАН УзССР. - 1978. -

5 ТО. - С. 61-63.

22. Ибрагимов АЛ., Юсупов Т., Рахматов H.A. Исследование гекоторых свойств рибосомальных генов хлопчатника // Молекулярные юханизмы генетических процессов. Тез. докл. 4 Всесовз. симпозиу-а 26-28 ноября 1979. Москва. - 1979. - С. 33.

23. Исследование нуклеиновых кислот хлоропластов хлопчатни-:а / АЛ. Ибрагимов, Т. Юсупов, М.И. Юсупов, H.A. Рахматов // -ВБС. Тез. докл., 1979. - Ленинград. - 1979. - Т. 3. - С. 260.

24. Ибрагимов АЛ., Юсупов Т., Рахматов H.A. Некоторые физи-;о-химические свойства ядерной я хлоропластноЯ ДНК хлопчатника. '/ Узб,.биол. к. - 1980. - й 4. - С. 5-7.

25. Юсупов М.И», Рахматов H.A., Ибрагимов АЛ. Изучение лбонуклеиновых кислот хлор пластов хлопчатника // Узб. биол. я. • 1980. - Л 3. - С. 3-5.

26. Изучение распределения ДНК хлоропластов хлопчатника в 'радиенте плотности CsCi и CsCl-EtbBr / Т. Юсупов, П.А. Рахма-'ов, З.М. Хамидова, АЛ. Ибрагимов // Узб. биол, ж. - 1980. -

i 6. - с. 63-64.;

. 27. Ибрагимов А.П., Рахматов H.A., Юсупов М.И. Выделение и гаследование фракции I хлоропластов хлопчатника// ДАН УзССР. -

i960. - » 4. - С. 58-61,

28. Определение локализа^ии.рРНК в EcoRI -фрагментах хло-ропластной ДНК хлопчатника /АЛ. Ибрагимов, Т. Юсупов, 3. Хами дова, H.A. Рахматов // Генетика развития растений. Тез. докл. I Всесоюз..совещания 23-26 сентября 1980. - Ташкент: Фан, 1980. -С. 84-85.

29. Рахматов H.A. Изучение изменения содержания рибосоыаль ных белков при заражения v.dahiiae Kleb. // Узбек, биол. ж. -1980. - К 3. - С. 11-13.

30. Рибосомы хлоропластов хлопчатника /H.A. Рахматов, АЛ Ибрагимов, Т. Юсупов, М.И. Юсупов //Узбек, биол. к. - 1981. -II 2. - С. 10-13,

31. Фракционный и аминокислотный состав рибосомальных белков хлоропластов и цитоплазма хлопчатника /H.A. Рахматов, АЛ. Ибрагимов, М.И. Юсупов, Т. Юсупов // Механизмы усвоения азота и биосинтез белка в растениях. Тез. докл. Всесоюз. симпозиума. Алма-Ата. - 1981. - С. 104.

32. Структурная организация генома хлоропластов хлопчатника /H.A. Рахматов, АЛ. Ибрагимов, Т. Юсупов, М.И. Юсупов //

3 конф. биохимиков.Ср. Азия и Казахстана. Тез. докл. 20-25 апре ля 1981. - Душанбе. - 1981. - T. I. - С. II.

33. Юоупо^ М.И., Рахматов H.A., Ибрагимов АЛ. Индизидуаль ная »РНК я ФракияI. I белков хлоропластов хлопчатника // 3 конф. биохимиков Ср. Азии я Казахстана. Тоз. докл. 20-25 апреля 1981.

- Душанбе. - 1981. - T. I. - С. 26. .

34. Ибрагимов АЛ., Юсупов Т., Рахматов H.A. Гомология в нуклеотядных последовательностях хлоропластной ДНК хлопчатника // 3 конф. биохимиков Ср. Азии и Казахстана. Тез. докл. 20-25 с реля 1981. - Душанбе. - 1981. - T. I. - С. 26.

35. Юсупов Т., Рахматов H.A., Ибрагимов АЛ. Рестргшшганнь анализ хлоропластной ДНК хлопчатника // ДАН УзССР. - 1983. - й

- С. 46-48.

36. Ибрагимов АЛ., Ряхматов H.A., Юсупов Т, Определение содержания ДНК п некоторые физико-химические свойства рРНК хлор пластов хлопчатника // ДАН УзССР. - 1983. - ß 4. - С. 52-54.

37. Рахматов H.A., Юсупов Т., Юсупов М.И, Сракцяонный и &v кокяслотныЗ состав белкоЕ рибосом митохондрий и цитоплазмы хлоп

чатника // Гоном растений. Тез. докл. науч. конф. 29 сентября I октября 1983. - Черновцы. - 1983. - С. 63.

38. Рахматов H.A., Юсупов Т., Ибрагимов АЛ. Рестрикцион-кыА анализ хлоропластной ДНК хлопчатника // Физиология растений.

- 1984..- Т. 31. - $ 2. - С. 312-316.

39. Получение чистых препаратов ДНК из клеточных органоидов хлопчатника и некоторые данные о их структурной организации /

Т. Юсупов, A.A. Ирисметов, АЛ. Рахматов, А.П. Ибрагимов // Физиология и биохимия культурных растений. - 1985. - T.I7. - 15 2. -С. 157-162,

40. Рахматов H.A., Ибрагимов А.П., Юсупов Т. Изучение структурной организации хлоропластной ДНК у различных видов4 хлопчатника // Прикладная биохимия и микробиология. - 1986. - Т. XXIX. -

№ I. - С. 118-125,41. .Структурная организация хлоропластной и митохондриаль-ной ДНК разноплоидных видов хлопчатника и их 'гибридов / А.П. Ибрагимов, H.A. Рахматов, Т. Юсупов, A.A. Ирисметов, П.Р. Хазратов // 5-ВБС. Тез. докл. 18-23 января 1986. - Киев. - 1986. - Т. 2.

- С. 354.

42. Сравнительное исследование генома хлоропластов различных видов хлопчатника / H.A. Рахматов, Т. Юсупов, А.Р. Тлеуов, Н. Камалов // УзОГиС. Тез. докл. 2-4 июня 1986. - Ташкент: Фан, 1986, - С. 129.

43. Рахматов H.A., Ибрагимов. АЛ., Юсупов М.И. Биохимическая характеристика генетического и белок-синтезирующего аппарата хлоропластов хлопчатника //4 конф. биохимиков.Ср. Азии и Казахстана. Гез. докладов 9-12 сентября 1986. - Ашхабад. - 1986. - С. 37,

44. Сравнительная характеристика рибосом а рабосошшх белков хлоропластов и цитоплазмы хлопчатника / H.A. Рахматов, АЛ. Ибрагимов, Т. Юсупов, М.И. Юсупов // Физиология растений. - 1988. -Г. 35. - К 4. - С. 805-808.

Пздпклио в печать — ¡¿3, £ . ¡¡,'!г Р. * / £ Осриат бумага Их£4'/и- Бумага типографская ¡¡г 1. Печать «РОТАПРИНТ». Объем >~Тнраж /.'¿экз. Заказ ^

Типография кздательовз «Фан» АН УзССР. 703170. Ташкент, кр. М. Горького, 73.

Информация о работе

Рахматов, Негбой Аманович
доктора биологических наук
Ташкент, 1989
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Физико-химическая характеристика ДНК и риюосом хлоропластов хлопчатника ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физико-химическая характеристика ДНК и риюосом хлоропластов хлопчатника"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физико-химическая характеристика ДНК и риюосом хлоропластов хлопчатника
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия