Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, очистка вирусов хлопчатника и их иммунодиагностика

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, очистка вирусов хлопчатника и их иммунодиагностика"

РГО од

t 8 акт 1996

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

УДК 578.74:578.85:578.083 '

жураева умида миркамилобна

выделение, очистка вирусов хлопчатника и их

шшюдиагностика

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент - 1996

Работа выполнена в лаборатории вирусология Института микробиологии АН РУв

Научный руководитель: доктор биологических наук М. М.' Мурадов

Официальные оппоненты! член-кОрр. АН РУз, ирофесоор

А." А. Абдукаримов доктор биологичейких наук А. М,« Сайиткулов .

Ведущая организация I Ташкентский Государственный

Университет

Защита состоится У^" (УЖ'/П-^^Ь?,? 1995 г. в " / часов на ааседанип Специализированного Совета Д.015.02.01 по защите диссертаций на соискание учаной степени доктора наук прп Институте микробиологии АН РУз по адресу: 700128, Ташкент-128, ул; А. Кадара,

С диссертацией можно ознокомится в библиотеке Института микробиологии АН РУз.'

Автореферат разослан " " ______________ 1936 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

доктор биологических наукС.М. Ходаибаева

онцая характеристика. работы

Актуальность работы. Впервые о вирусных заболеваниях хлопчатника сообщалось в 1912 г.. В Нигерии были обнаружены симптома болезни -"курчавость листьев хлопчатника". В последующие года вирусные заболевания хлопчатника были выявлены во многих хлопкосеющих странах: Пакистане, Индии, Бразилии, Канаде, Туркменистане, Азербайджане и др. Б последние годы широкое распространение вирусных болезней хлопчатника отмечено в Пакистане. В 1991 г, из-за вирусных болезней с симптомами "курчавости листьев хлопчатника" было поранено более 14 тыс. га площади, а в 1994 г. оно возрасло до 980 тыс. га . и недобор урожая составил 9 млн. тонн.

В литературе описаны вирусные заболевания хлопчатника о более чем 18-тью различными симптомами - мозаикой, морщинистостью, скручиванием листьев, мелколлсностьга, ко рот таит междоузлиями и др. До сих пор, однако, вирусные болезни хлопчатника изучались, в основном, с позиций фитопатологии и исследователи ограничивалась лишь описанием симптомов болезни. В отдельных работах имеются данные о влиянии вирусного поражения на рост, развитие и урожайность растений, а также установ- ' лено, что при этом ухудшается качество волокна, укорачивается её длина и снижается технологическая прочность. Описано понижение продуктивности семян хлопчатника / Грушёва, 1965; В1пк ■с! аХ» 1973 /.

С позиции биотехнологии вирусы хлопчатника, как и другие фптовирусы, изучены слабо. Это особенно актуально для такой хлопкосеющей страны как Республика Узбекистан. На сегоднящный день неясно в какой мере эти болезни сказываются на продуктив- . ностн этой ценной технической культуры. Отсутствуют данные о выделении вирусов в чистом, препаративном виде. Не изучена связь между водом вирусов и прцессом развития многочисленных проявлений болезни. Отсутствуют данные о биологических и физико-химических свойствах вирусов. Ограничены и сведения о влиянии вирусного поранения на технологические показатели хлопкового волокна. Нет уверенности и в том, является ли в Узбекистане вирусное поражение хлопчатника серьёзным фактором потерь урожая хлопка-сырца, хотя данные в этом отношении были бы весьма полезными. Именно поотолу тему настоящего исследования следует

считать весьма актуальной.

Цель и задачи. Основная цель настоящей работы заклчается в получении сведений о вирусах, поражающих хлопчатник, выделе-шш вирусов и оптимизации условий их очистпи, получении специфических антисывороток к исследуемым вирусам, разработке подходов для ишунодиагностических исследований и изучении влияния вирусной инфекции на образующиеся продукты хлопка.

Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

I/ разработка условий идентификации вирусов хлопчатника;

2/ разработка оптимальных условий очистки и препаративного выделения вирусов, изучение их некоторых биологических и физико-химических свойств;

3/ разработка иммунологических тестов с целью диагностики вируса мозаики хлопчатника /Н$./;

4/ выявление иммунных сортов растений хлопчатника к ШХ и вирусу морщинистости листьев хлопчатника /ШЛХ/;

5/ изучение влияния вирусной инфекции на всхожесть семян, рост растений и на гидролизуемость волокна,

Новизна и практическая ценность работы,. Впервые в посевах хлопчатника в условиях Узбекистана выявлены и идентифицированы два вируса хлопчатника: нитевидный, РНК-лодершций вирус мозаики хлопчатника /ЕМХ/ и сферический, ДНК-содершций вирус морщинистости листьев хлопчатника /ЕЧЛХ/. Определена вредоносность этих вирусов для растений хлопчатника. Изучены проявляющиеся симптомы вирусного поранения.- Разработана оптимальная схема очистки и препаративного выделения, вирусов, получена специфическая антисыворотка к К,К, проведена её диагностика современными иммунологическими методами. Выявлены иммунные сорта хлопчатника при его искусственном порахсенки. Впервые изучено влияние вирусной инфекции на гидролизуемость хлопко-волокна.

Апробащш работы. Материалы работы дололены на Республиканской, ¡.научно-практической конференции "Актуальные проблемы комплексного изучения природа и хозяйств юяных районов Узбекистана" /Карш,1991/, Всесоюзных конференциях "Биотехнология и биофизика микробных популяций" /Алма-Ата,1991/, "Экология тлей" /Андижан, 1991/, научных конференциях "Загрязнение почв и пути его предотвращения" /Ташкент,1992/, "Современные проблемы биологии н экологии" /Ташкент,1995/.

Публикащш. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и обьём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включаюшей описание материалов и методов исследований, изложения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы.

Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 16 рисунков и 3 схемы. Список литературы включает 204 источников, опубликованных в республиканских и зарубежных изданиях.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Впервые систематизированы данные мировой научной лите- ■ ратуры о распространении вирусов хлопчатника и проведен критический анализ работ, выполненных различными исследователями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

При исследованиях вирусных заболеваний хлопчатника нами была использована коллекция 87 различных сорто-образцов и линий хлопчатника, собранных из разных учереддений: НИИ селекции и семеноводства хлопчатника, НИИ растениеводства, НПО "Союз-хлопок" УзАСХН, НПО "Биолог" АН РУз, кафедры генетики биолого-почвенного факультета ТашГУ и проведён скрининг хлопчатника по поразхаемости его вирусами. Полевые мелкоделяночные опыты проведены на ох'ытном участке Ботанического сада ТашГУ в I99I-I994 гг. .

При экспериментальном заражении хлопчатника инокулюмом слунил инфекционный сок, выделенный из больных растений хлопчатника сорта АН-Баяут-2, линии Л-446 и из многолетних растений хлопчатника, поддер;лИваемых в теплицах НПО "Еиолог". По степени пораяаемости вирусами 87 сорто-образцов и линий хлопчатника разбивали на 5 групп по методике НИИ растениеводства

УзАСХН.

Препараты вирусов из листьев хлопчатника с симптомами мозаики, хлоротичными пятнами и морщинистостью листьев выделяли с помощью лолиэтиленгликоля /ПЭГ/ и дифференциального центрифугирования. Морфологию вирусных вирионов изучали электрон-номикроскопическими методами в очищенных препаратах. Препараты контрастировали 2% этаноловым раствором фосфовольфрамовой кис-

лоты или уранил ацетатом.

Благодарность. Считаю своим прямым долгом выразить благодарность профессору А.Х. Вахабову за постоянную теоретическую и методическую помощьi консультации и подготовке диссертационной работы.

i

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ '

Глава 3.1. Природа фитовируоов хлопчатника, ,

выявленных в Узбекистане i

Выявление ВЖ и И.1ЛХ. Вирусные заболевания хлопчатника в Центральной Азии впервые были описаны. Михлиной A.A. в 1938 г., а затем Бекузиным A.A. в 1941 г. После этих работ и до настоящего времени о вирусных болезнях хлопчатника в данном регионе какие-либо публикации не появлялись.

Проведенные нами обследования тепличных хозяйств и опыт- ; ных полей НПО "Биолог" АН РУз в Янги-Юльском районе Ташкентской области дали определённые результаты. Общая обследованная пло- : щадь составила 20,5 га хлопкового поля, засеянного различными ; сорто-образцами и линиями хлопчатника. Больными считали расте- ; ния с явными симптомами морщинистости со вздутиями листовой пластинки, курчавостью, мозаичностыо листьев и Др.

Поражаемость растений хлопчатника в зависимости от сорта варьировала в пределах от 5 до 61$ /табл.1/. Максимальная по' Таблица I

Поражаемость различных сорто-образцов и линий хлопчатника BMX ix ШЛХ в производственных посевах Ташкентской области

Название сорто-образцов и линий ! Обследованная пло-! щадь, га ! Поражаемость, ! %

Юлдув 7 6

5 15

3 32

АН-хосилдор 0,25 II

AH-5I0 0,25 5

||_Ч_И 2 31,4

Различные сорта • 3 61

разаемость имела место в полях, засеянных смесью различных сорто-образцов и линий. Наблюдали также неравномерное поражение одного и того же сорта, посеянного в различных частях опытного поля.

Помимо наших наблюдений, другими исследователями /Петрова и др, 1994/ были обследованы хлопковые поля в 8 областях Республики Узбекистан, Вирусные заболевания выявлены в фазах 6-7 листьев, бутонизации, цветения, завязывания и созревания коробочек. Отбирали растения со следующими симптомами: задержкой роста, укорочением или удлинением междоузлий, морщинистостью и курчавостью листьев, изменением окраски, формы и размера листа и т.д.

На основании полученных результатов авторы идентифициро- ■ вали выше описанные симптомы как вирусподобные аномалии и из 19 обследованных районов в 15 выявлены единичные растения, а в 4 - мелкоочаговые поражения растений.

Проявление симптомов поражения при экспериментальном заражении на различных сорто-образцах и. линиях хлопчатника. Семена 87 различных коллекционных культур были посажены на опытном поле и был проведен скрининг ло поражаемости вирусной инфекцией. Инфекционный сок готовили, гомогенизируя 40-50 г свежих листьев в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5. Листья растений хлопчатника опудривали корборундом и заражали их, втирая инфекционный сок. Для контроля во всех кондах грядок оставляли незараженные растения. Заражение повторяли в фазе 7-8 листьев и бутонизации. В течении всей вегетации вели фенологические наблюдения за проявлением симптомов вирусного поражения.

В фазе созревания /август-Сентябрь месяцы/ нами были обнаружены явные симптомы поражения, заключающиеся в :

. I/ расплывчатых хлоротичных ожоговых поражениях в среднем ярусе листьев;

2/ появлении на лдстьях нижнего яруса коричневых некрозов, пожелтении и опадении листьев;

3/ скрученности листьев вверх, курчавости и морщинистости со вздутиями; .

4/ появлении на верхнем ярусе листьев, в точке их роста .расплывчатых хлоротичеоких пятен;

5/ возникновении на верхнем ярусе листьев мелких хлоро-тичных пятен. "

-e-

Из листьев растений, обладающих выше описанными типами симптомов, получали частично очищенные препарата п просматривали их под электронным микроскопом на содержание вирусных частиц. Препарат из листьев с 3-им вышеописанны!,i типом симптомов содержал вирусные частицы со сферической формой, а 4- и 5-типом симптомов - нитевидные вирусные частицы. D растениях с-1- и 2-типом симптомов вирусные частицы не обнаружены. По-видимому эти типы сш.ттомов являются результатом инфекции невирусной природы.

• Такшл образом, в препаратах, приготовленных из листьев растений хлопчатника с различными симптомами болезни, электрон-номикроскопическими наблюдениями выявлены вирусные частицы, относящиеся к двум морфологическим группам: нитевидной и сферической форм. Вирусные чатицы нитевидной форш, выявленные в соке из листьев хлопчатника с мозаичными симптомами болезни по общепринятой традиции, обозначили как вирус мозаики хлопчатника /ВШС/, а второй- выявленный вирус сферической формы из листьев с симптомами морщинистости обозначили как вирус морщинистости листьев хлопчатника /ВМЛХ/.

На следующем этапе наших исследований были оптимизированы условия очистки и препаративного выделения ВМХ и ВМЛХ.

Очистка вируса мозаики хлопчатника /ВЖ/. При оптимизации условий очистки и препаративного выделения ВМХ использовали различные буферные растворы /глициновый, фосфатный и трис-HCI буферы/, надосадочную жидкость обрабатывали Ь% хлороформом или бутанолом, или же их смесью /1:1/, вирусный препарат осаздали ПЭГ с мол.массами 4000 и 6000 в различных концентрациях /8, 6 и 4$/ /табл.2/. Наш установлено, что для выделения ВМХ эффективным оказывается гомогенизация листьев хлопчатника с 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,5, содержащим 0,1 М^-меркаптоэтанол /Ш/ и 0,0001 М этилендиаминтетраацетат натрия /ЗДТА/. Удаление клеточных компонентов обработкой инфекционного сокй Q%-6у-танолом, концентрирование вирусных частиц 45? ПЭГ с гл.м. 6000 с добавлением 1,5 М I'aCI и дифференциальное центрифугирование. После этих обработок в полученном препарате по данным электрон-номикроскопических исследований количество нативных частиц становилось больше, а содержание клеточных дейтритов намного меньше по сравнению с другими вариантам!! очистки /табл.2/.

Необходимо такяе отметить влияние экстрагирующего раствора

на выход вирусного препарата. Так, при использовании 0,1 М фосфатного буфера выход вируса составлял 3 мг/кг, а в других случаях этот показатель не достигал вышеупомянутого показателя. Разработанный способ очистки и препаративного выделения ВМХ представлен на схеме I.

Таблица 2

Оптимизация условий очистки и препаративного выделения ВМХ различными концентрациями ПЭГ

№ ! Способ концентри- ! Характеристика выделенного препарата пл ! рования «концентрация ! 260/280'чясл0 и Ф0^13

! ¡вируса, мг ! !вириона

Г. В% ПЭГ М.М.* 6000 + I0-50x, arpera-'-

• I цикл УЩ 0,6' 1,09 роьанные нитевид ные частицы и обильное присутствие клеточных компонентов

2. М ПЭГ м.м. 6000 + I цикл УЦ$ через 30$

сахарозную подушку + 2,4 1,22 7-2 Iх

I цикл УЩ

3. То же самое 3 цикла

УЦ5 1,0 . 1,04 0-12х

4. 6% ПЭГ м.м. 4000 +

I цикл УЩ 2,4 1,18 10-20х

тлело вирусных частиц в одном поле зрения

Очистка вируса морщинистости листьев хлопчатника /В?Ш/.

Для препаративного выделения В'.'ЛХ как и ранее нами были использованы различные буферные растворы, концентрации ПЭГ" и циклы дифференциального центрифугирования.

Из апробированных методов более эффективным для ВМЛХ оказались следующие приёмы: первоначальная обработка листьев 1%~ тритоном Х-ЮО для удаления бактериальных и других загрязнений с поверхности листовой пластинки, гомогенизация 0,05 М трис-НС! буфером Ш 7,5, содержащим 4 мМ МЭ, ЭДТА, Я

Схема I

Очистка и препаративное выделение ВМХ

Гомогенизация листьев хлопчатника в присутствии 0,1 М фосфатного буфера /Ф.Б./ гН 7,5 + 0,1М МЭ. 0,0001 М ЭДТА

I

1'0светление сока при 4.500 об/мин 20"Т

ган

I осадок выбрасывается

| Встряхивание в течении 15 мин в 8% бутаноле Центрифугирование при 4.500 об/мин 20 глин "1

.осадок выбрасывается I

| Концентрирование вируса ПЭГ с м.м. 6000 и 1,5 М КаС1

у

I Выдераивание в течении^! часа при +4ЦС 1 [Центрифугирование при 4.500 об/мин 20 мин 1

надосадочная яидкость выбрасы-

_ВЯР.ТР.Е---

Экстрагирование вируса из осадка и осветление при 8000 об/мин по 5 мин

1 осадок выбрасывается !

Ультрацентрифугирование надооадочной жидкости при 35.000 об/мин 2,5 часа пои +4°С

1

надосадочная жидкость выбрасывается

!

Растворение осадка в 0,1 М фосфатном буфере и осветление при 8000 об/мин 5 мин

__т _ _

УЦ5 через сахарозную подушку /30%-ную/ при 35.000 об/мин 2,5ч|

надосадочная яшдкость выбрасн-_ва^тся_

| УЦЕ при 35.000 об/мин 2,5 часа~~1

_._

| Суспендирование осадка в 0,1 М фосфатном буфере" | Чистый вирусный препарат. 2-3 мг/кг~1

2С0 ют/мл ингибитора гепарина, концентрирование 10$ ПЭГ ц.и. 6000 с добавлением 1,5 М КаС1 и I циклом дифференциального центрифугирования. Разработанный способ очистки и препаративного выделения ВМЛХ отражен на схеме 2.

Очистка и препаративное выделение ВМДХ

Схема 2

Промывание листьев 1% тритоном Х-100 30 мин I Промывка водопроводной, водой I

(промывка дистиллированной водой 1

Гомогенизация листьев в присутствии 0,05 М трис-НС1 буфера рН 7,5 + 4 иИ МЭ, ЭДТА, МдСТо и 200 мкг/мл гепарина

X

] Центрифугирование при 15.000 об/мин 30 мин ~1_^^

осадок выбрасывается I

Концентрирование 10% ПЭГ с м.м. 6000 и 0,1 М КаС1 перемешиванием I час на магнитной мешалке при +4°С

Центрифугирование при 5.0Ш об/мин 20 мин

надосадочную жидкость выбрасывали

Растворение вируса в трис-НС1 буфере и осаждение УЩ при 35.000 об/мин 2,5 часа при +4°С_.

надосадочную жидкость выбрасывали

[ Растворение осадка в 0,05 М трис-НС1 буфере [ Осзетление при 8.000 об/мин 5 мин [

надосадочную жидкость выора-сывали

( Растворение осадка в 0,05 М трис-НС1 буфере |

[ Чистый вирусный препарат, 1,5 - 2 мг/кг

При электронномикроскопических исследованиях полученных вирусных препаратов /схемы 1-й 2/ было установлено следующее: ВМХ - РНК содержащие нитевидные вирусные частицы длиной 700-720 нм, ШЛХ - ДНК-содержащие сферические вирусные частицы с диаметром 15-17 нм. При спектрофотометрическом анализе соотношениеФ260/280 ВМХ равна 1,18, что характерно для нитевидных вирусов, а ВМЛХ-1,5, которая характерна для сферических вирусов.

Из вышеизложенного следует, что нами впервые предложены воспроизводи!,ше методы очистки и препаративного выделения вирусов нитевидной и сферической форм, поражающих хлопчатник.

На следующем этапе наших исследовании была предпринята попытка изучения содержания нуклеиновых кислот вирусов и некоторых их физико-химических свойств.

3.2. Выделение ДНК БЧЖ и её некоторые ■ физико-химические свойства Из очищенного препарата ВМЛХ после УЦФ в градиенте плотности хлористого цезия наш выделена ДНКХ. Препараты ДНК ВМЛХ в равновесном градиенте плотности хлористого цезия проявляют унимодальный характер распределения с плавучей плотностью 1,695+0,0005 г/см3, что соответствует 37,54 мол % ГЦ-пар оснований. Показатель специфичности состава ДНК ВМЛХ /отношение Г+Ц/А+Т/ составляет 0,60 мол %. При этом величина плавучей плотности ДНК ВМЛХ отличается от ДНК ядер, хлоропластов и митохондрий хлопчатника, что служит надёжным критерием чистоты препаратов ДНК ВМЛХ.

Изучение Кривых термического плавления ДНК ВМЛХ показало её равномерное плавление с температурой плавления 84,69°С,что характерно для ДНК фагов и вирусов. Для уточнения природы нуклеиновых кислот ВМЛХ обрабатывали различными ферментами. Полученные результаты показали, что препараты нуклеиновых кислот ШЛХ исчезают из геля агарозы только после обработки ДНКа-зой, что указывает на ДНК-овую природу генома ВМЛХ. Сравнение электрофоретической подвижности ДНК ВМЛХ с линейными маркёрны-ми фрагментами известной длины показало, что размеры ДНК ВМЛХ составляют приблизительно 23,130 тысяч пар нуклеотидов.

хВыпеление и изучение некоторых свойств ДНК ШЛХ были проведены

3.3. Разработка иммунологических тестов и диагностика ВМХ

Получение антисыворотки /АС/. Для этой цели мы сначала отработали способ получения антигена к ВМХ, затем для повышения антителообразования использовали тимозин, препарат полученный из тимуса в лаборатории академика Салихова Ш.И. /Институт биорганической химии АН РУз/. Антигены вводили следующим образом: первому кролику внутривенно с физиологическим раствором, второму, третьему кроликам внутримышечно и подкожно с адьювантом Фрейнда и водным раствором тимозина, соответственно.

Кровь брали через неделю после последней иммунизации и в течение 6-8 часов выдерживали при комнатной температуре, затем отделивщуюся от сгустков сыворотку осторожно сливали и центрифугировали при 5.000 об/мин в течении 15 минут.

Диагностика ВМХ методом реакции двойной диффузии /РДД/ и капельным методом диагностики /IЗД/. Полученная нами антисыворотка к очищенному препарату ВМХ реагировала с соком больных растений в цельном состоянии при постановке реакции РДД в 1%~ пом агаре "Дифко". При постановке НМД предельное разведение инфекционного сока был равен 1:2.

Диагностика ВМХ методом виробактериальной агглютинации /АЕВ-тест/. В наших опытах при постановке АЕВ-теста предельное разведение инфекционного сока, вызывающего реакцию агглютинации стафилококка было также равно 1:2. Реакция агглютинации происходила за 1-5 мин, т.е. значительно быстрее, чем при диагностике КМД /8-20 мин/ и РДД /48 ч./.

Диагностика ВЙХ методом иммунойерментного анализа /ИФА/Х. Метод является одним из наиболее чувствительных и позволяет выявлять вирусы в минимальных количествах.

В наших опытах мы использовали глобулины иммунной сыворотки к У-вирусу картофеля /УВК/, так кай в предварительных экспериментах нами было установлено, что именно этот вирус обладает идентичными антигенными детерминантами и даёт положитель- •

Эксперименты по ИФА были выполнены с антигеном ВМХ .приготовленной нами совместно со с.н.с. кафедры вирусологии биологического факультета МГУ Новиковым В.К., за что автор приносит свою искреннюю благодарность.

ную реакцию с ШХ. Для проведения ИФА были получены коныога-ты глобулинов иммунной сыворотки к УВК и пероксидазы из хрена.

Оптимальная концентрация иммуноглобулинов к УВК при . нанесении на плашку составляло 10 мкг/мл. При титровании экстрактов из мозаичных листьев хлопчатника ВМХ выявлялся при разведении экстракта.до 1:256. В качестве контроля были использованы глобулины нормальной сыворотки кролика.

3.4. Изучение степени пораяаемости различных сорто-образцов и линий хлопчатника При искусственном заражении растений хлопчатника, различные его сорто-образцы и линии по-разному реагируют на поражение ВМХ и ВМЛХ. Такие сорто-образцы и линии, как Н-40В1, Н-38 В1, А1воса1а 1016/1, УК-97МВ, Гарант, Сорт-26, Бели избор, РЛМ-575, АН-402, 0ктябрь-60 и др. /всего 50/, которые составляют 57,4/5 от общего числа исследованных нами растений, оказались иммунными к ВМХ. Сорта Местный, АН-Узбекистон, Анди-жон-9, линии Л-446 и Л-472 оказались наиболее чувствительными к вирусному поражению. Остальные по отепени пораяаемости были отнесены в соответствующие группы.

К тих оказались иммунными 83 различных сорто-образцов и линий хлопчатника, такие как Н-40В1 и Н-38В1 были наиболее, чувствительными, Б/Н и Н-55В1 -были мало- и среднепоражаемыми.

В связи с тем, что выявление иммунных сортов хлопчатника имеет большое практическое значение /новые вирусустойчивые сорта/ нами были проведены скрининговые исследования. В Табл. 3 обобщены основные данные. Таблица 3

Группировка 87 различных сорто-образцов и ланий хлопчатника по чувствительности к ВМХ и ВМЛХ

! ВМХ ""! ВМЛХ ! ВМХ ! ВМЛХ

Иммунные, Рх=05? 50 83 657,4 .95,4

2. Практически устойчи-

вые, Рх=до 10$ 2 - 2,3 -

3. Слабопоражаемые, Рх=

до 255? 15 I 17,2 1,14

4. Среднепоражаемые,

Рх= до 50$ 15 I 17,2 1,14

5. Сильнопоражаемые,

Р*=свыше 50$ 5 2 5,8 . 2,3

^оражаемость растений, %, количество растений в штуках.

Таким образом, нами выявлено 50 иммунных, 2 практически устойчивых, по 15 шло- и среднепоражаемых и 5 сильно поражаемых сорто-образцов и линий хлопчатника к ШХ, что составляет 57,4; 2,3; 17,2 и 5,74$ поражаемости, соответственно. К БМЛХ были иммунны 83 сорто-образцов и линий, по I мало- и среднепоражаемых и 2 сильно поражаемых, что составляет 96,4; 1,4 и 2,3$ поражаемости от общего числа исследованных сорто-образцов и линий.

Глава 4. Влияние вирусной инфекции на некоторые параметры /признаки/ {астений хлопчатника

Рост и развития растений. При сравнительном изучении влияния вирусной инфекции на высоту растений хлопчатника нами получены данные, показывающие наличие разницы в высоте между здоровыми и пораженными растениями. У некоторых пораженных растениях, таких как Б/Н, Н-841, Балкан-442, Местный, Ок олтин и др. высота растений оказалась выше в среднем до 20 см. По некоторым данным литературы это происходит за счёт удлинения междоузлий главного отебля при поранении вирусными заболеваниями; Напротив, у таких растений, как сорта Гарант-996, С-4727, Фар-хад, 175-Ф и др.', высота растений несколько нике - в среднем от 1,6 дЪ 23,7 см - по сравнении со здоровыми,- что свидетельствует об их карликовости.

Влияние вирусной инфекции на хлопковую продукцию. В наших исследованиях также было отмечено влияние вирусной инфекции на хлопковую продукцию: вес семян, хлопка-сырца и длину- волокна. При поражении растений вирусом наблюдается уменьшение веса хлоп-; ка-сырпа на 6%, длины волокна на 5,4 мм, веса семян на 37 гр по сравнению со здоровыми растениями. В некоторых случаях отмечено непрочность связывания волокна с семенами.

Исходя из описанных выше данных можно заключить, что заражение вирусом оказывает влияние на рост, развитие и продукцию растеши хлопчатника.

Влияние вирусной инфекции на гидролизуемость волокнах. Одним из тестов, свидетельствующих о качестве волокна считается её гидролизуемость целлюлозами. Как известно, высокая гидролизуемость волокна свидетельствует о нарушении кристаллической

структуры целлюлозы, изменениях длины волокна, а также её прочности. Показано, что кристалличность волокна является фактором устойчивости к биодеградации-: чем выше кристалличность, тем в меньшей степени волокно подвераено расщеплению и напротив, амортизация волокна / в том числе и из-за вирусного поражения/ должна приводить к большей деградации. Действительно, в наших экспериментах эти правила получили своё подтверждение. Когда сравнивали волокна здоровых и пораженных • растений хлопчатника, оказалось, что гидролизуемость волокна под влиянием ферментов различна, как это видаю из рио I.

Время, час

Рис.1. Образование восстанавливающихся Сахаров /1,2/ и глюкозы /3,4/ при ферментативном гидролизе волокон здоровых /1,3/ и пораженных вирусом /2,4/ растений хлопчатника.

Исследования были проведены совместно с К.К.Назаровым.

Образование глюкозы при гидролизе волокна пораженных и здоровых растений неодинаково. В ходе гидролиза наблюдается увеличение константы гидролиза у пораженных растений. Во всех опытах, после'36-38 часов от начала гидролиза, обнаружено более высокое содержание глюкозы. Анологичным образом характеризуется динамика образующихся восстанавливающихся Сахаров.

Данные, полученные при оценке констант гидролиза, позволяют сделать вывод о наличии существенных различий между волокнами пораженных и здоровых растений, по-видимому пораяен-ные растения дефицитны в отношении волокнистой части. Не исключено, что вирус, нарушая метаболические процессы в инфицированных тканях, отрицательно влияет на' созревание волокна. Образование кристаллической целлюлозы происходит с большим числом дефектов. В результате растет доля аморфных участков целлюлозы и, как следствие повышается гидролизуемость при действии целлюлазного комплекса.

заключение

Суммируя полученные данные, можно с очевидностью утверждать, что из полученных выше данных вытекает по меньшей мере три важных аспекта изучаемой проблемы.

Во-первых, получены достоверные данные о поражаемости растений хлопчатника в условиях Узбекистана, симптомах вирусных болезней и природе вирусов в таксономическом плане. Выявлены иммунные сорто-образци и линии.

Во-вторых, разработаны методы очистки и препаративного выделения ВМХ и ВИЯХ, изучены некоторые физико-химические свойства вирионов и их ДНК, получена специфическая антисыворотка к ВМХ, проведена индикация вируса иммунологическими методами.

Наконец, что наиболее важно, показано влияние вирусной инфекции на рост, развитие хлопчатника, хлопковую продукции, в том числе и. на гидролизуемость волокна.

Таким образом, впервые такое ценное культурное растение, как хлопчатник охарактеризован с точки зрения поражаемости его фитовирусами, а сами обнаруженные вирусы исследованы как объекты биотехнологии.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены и;идентифицированы вирусные болезни хлопчатника в условиях Узбекистана с симптомами мозаики и морщинистости листьев. Охарактеризованы времй и специфичность проявления симптомов. Показано, что основной причиной вызывающей эти симптомы болезни являются два вируса: один из них РНК-со-держащий нитевидный вирус, второй - ДНК-содеряащий сферический вирус.

2.' Разработаны методы выделения и очистки обеих вирусов -мозаики /К,К/ и морщинистости листьев хлопчатника /ШЛХ/. Найдены оптимальные условия для препаративного выделения указанных вирусов из листьев'больных растений хлопчатника, используя фосфатный и трис-HCI буферы, 8$-ный бутанол и ПЭГ м.м. 6000 в концентрации 4 и 10$.

3. Получены электронномикроскопические снимки вирионов на разных стадиях очистки. Установлено, что вирусные частицы ВМХ имеют длину 700-720 нм, а частицы ВМДХ имеют диаметр около 15-17 нм.

4. Найдены условия иммунизации кроликов о применением нового иммуногенного препарата /0,1$ водного раствора тимозина/

И получена специфическая антисыворотка к ВМХ. Разработаны способы индикации и установлена предельная чувствительность ВМХ иммунологическими методами.

5. На-основании поражаемости 87 различных сорто-образцов и линий хлопчатника выявлены иммунные к ВМХ и ВМЛХ растения, что составляет 57,4 и 96,4$ от общего количества исследованных.' Изучены вредоносность и влияние вирусной инфекции на рост и развитие растений хлопчатника, хлопковую продукцию и гидро-лизуемость волокна при искусственном заражении.

Основное содержанйе диссертации изложено в следующих работах:

1." Еураева У.М., Вахабов А.Х., Бекузин A.A. "Вирусные болезни" // "Хлопок", 1991, К2, С.40-41.

2. Жураева У.М., Дехканова З.Н., Вахабов А.Х. "Потенциально опасные вирусы для тонковолокнистого хлопчатника" // Респ. конф. "Актуальные проблемы комплекснЬго изучения природы и хозяйств южных районов Узбекистана" Тез.докл. Карши,1991, С.140.

3. Дехканова З.Н., Еураева У.М., Абдуллаев Г.А., Рахимов М.М,, Вахабов А.Х. "Применение виробактериальной агглютинации

для обнаружения фитопатогенных вирусов" // Всесоюз. конф. "Биотехнология и биофизика микробных популяций" Тез.докл. Алма-Ата, 1991, С.97.

4. Дехканова З.Н., Жураева У.М., Вахабов А.Х. "Капустная тля - переносчик вирусов крестоцветных" // Всесоюз. конф. "Экология тлей". Тез.докл. Андижан, 1991, С.42-43.

5. Дехканова З.Н., Нураева У.М., Вахабой А.Х., Рахимов М. М. "Почва - место обитания резерваторов вирусов, поражающих хлопчатник" // Всесоюз, конф. "Загрязнение почв и пути его предотвращения". Ташкент, 1992, С.17.

6.Кадирова З.Н., Жураева У.М., Мурадов М.М., Вахабов А.Х. "Выявление и изучение вируса мозаики хлопчатника" // Меж. конф.-"Проблемы экологии и биотехнологии в фитовирусологии". Тез.докл. Ялта, 1994, С.

7. Жураева У.М., Дехканова З.Н., Вахабов А.Х., Мурадов М.М. "Патогенностъ ШX и восприимчивость растений при искусственном заражении" // Узб. биол. ж., 1994, йб, СД4-17.

8. Дехканова З.Н., Жураева У.М., Вахабов А.Х., Мурадов М.М., Мурадов 0. "Выявление и некоторые характеристики вируса мозаики хлопчатника" // Узб.биол. ж., 1994, Кб, 0.9-11.

9. Жураева У.М., Кадирова З.Н., Вахабов А.Х., Новиков В.К. "Выяыление, очистка и электронная микроскопия сферического вируса хлопчатника" // В конф. "Биология ва экологиянинг хозирги за-мон муаммолари". Тез.докл. Ташкент, 1995, С.37.

10. Жураева У.М., Кадирова З.Н., Вахабов А.Х. "Гуза усимли-гининг вирусларини урганиш - уни мухофаза этшцдир" // В конф. "Экологические проблемы приамударьинского региона Средней Азии". Тез.докл. Бухара, 1995, С.35-36.

УЗБЕКИСТОН ФАНЛАР АКАДЕМИЯСИ МИКРОБИОЛОШ ИНСТИТУТИ

Кураэва Умида Миркамиловна

Биология фанлари нонзоди илмий даразасини олиш цучун

зршоя цилишга тавоия этилган » БУЗА ВИРУСЛАРИНИ А1РАТИШ, ТОЗАЛНШ ВА УЛАРНИНГ ИММУНОДЙАГНОСТЖАСИ" ыавзуидаги диосвртациянинг хулосалари

Узбэкистон Рвопублияаси экологии шароитида руза ыозаикаои вируси (FMB) ва гуза. йаргларининг буямайиши касаллиги вируои (РББКВ) ашщланган ва уларнинг хуаайин-усимликлари урганилган. Вируснинг сор усимликка касал усиылик шираси орцали юцииш аниц-ланган.

Тоза вируони препаратив нщдорда аяратио ва концентрация цилишнинг оптимал усуллари топилган. Электрон микроскоп ёрдами-да РМВ ва FBEKB нинг 2 хил таксономии гуру^га, яъни ипсиыон ва шарсимон вируслар rypypira кириши ашщланган. ИШ зарраларининг гиотограммаои тузилган. РББКВнинг ДНК тахминан 23,130 ыинг гуфт нуклеотиддан иборатлиги аницлангап.

Антизардоб олишда, антитело зрсил цилиш ^уоусиятини ошириш учун тимозин препарат цулланйлди. Олинган АЗ турли фитовирус-лар антизардоблари билан оолшц'тирилганда, ГМВнинг баъзи фитови-руолар билан оврологик ш$инлиги аницланган. РИВ турли иммунологии ыетодлар ёрдамида индикация цилинди.

Рузанинг 87 нав-намуна ва линияларииинг FMB ва FBEKB билан каоалланиш даражаяари, касалликка чидамли ва ута оезгирлари анщ-

Вируснинг гуза уругининг вазнига, тола узунлигига ва сифя-тига, унинг гидролизланиш дарааасига, уруг таркибидаги фосфо-ва нейтрал липидларнинг ми^дори ва сифатига таьсири урганилди.

ланди.

Ina£ituto of microbiology, Uzbekistan Academy of Soiencea, Taahkerit Juraeva Umida liircamilovna Isolation, purification cotton viral disease and their immunodiagnostics Thesis of dissertation for obtaining of candidate of biological sciences degree la terns of Republic of Usbekistan have been determined identified euch viruses of leaf curl and of mozaies in the leaves of cotton varieties. If has been determined both of viruses have too narrow spectre range in host plants. The virus infection is transferred fiom diseases groving plants to the strong ohes by means of mechanical inoculation or by secretion of juice from diseases plants.

Optimal conditions ware developed under eliminahiori, eon-' centration and receiving of the refined preparation of VMC in preparative quantities. A3 it ia purifiend the control has been established by means of electronics raicroscopial testing method and a scheme to obtain purified preparations was proposed. The histogram of VHC particles distribtion by lenght has been dram end it WTas established by msan3 of comparison of eléctropho-ratie nobility of DHA VLCC with linear marker fragments that aise of DBA VICO Qhbuld be approximately equal to 23.130 of i.p.n.

Then analysihg of the literature datum on preparation of the antiserum for the viruses of éotton plant, modification of the method ha3 been proposed preparation of antiserum using of pure viral preparation and with timaain to increase the ability of antibodies formation. Having used with different antiserums for pliytoviruaes, it vra.0 proved there had been a certant serologic relationship of cotton plant viruses with some other phutoviruses.

It was established affectability of YUC and VLCC 87 sources and lines plants accordingly and had been divided by groups dependent from viral sensibility,

Tha influence of viral lesion <Jn cotton production and both in that way on hydrolysis level ability of cotton fibras ware shonn. This, in that way such varuable cultuto as

cotton plant was revealed in itself were studied as objects in biotechology.