Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры митохондриального генома хлопчатника

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры митохондриального генома хлопчатника"

РГ5 Л)й

\ г дьл М'-

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИК^ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи ЮСУПОВ Тахир

УДК: 577.113 : 576.31.347 : 633.51

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА ХЛОПЧАТНИКА

03.00.26 — молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ташкент — 1994

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики хлопчатника Института экспериментальной биологии растений НПО «Биолог» АН РУз.

Научный консультант — член-корреспондент АН РУз,

Заслуженный деятель науки РУз, доктор биологических наук, профессор Ибрагимов А. П.

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук

А. С. Расулов

Доктор биологических наук, профессор Азимова Ш. С.

Доктор биологических наук, профессор Атаханова Б. А.

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии и

генетики АН Украины

Защита диссертации состоится «^^\одд г,

в ___ часов на заседании Специализированного совета

Д 015.70.21 по присуждению ученой степени доктора биологических наук при Институте генетики Академии Наук Республики Узбекистан (702151, Ташкентская область, Киб-райский район, п/о Юкори-Юз).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института генетики АН РУз.

Автореферат разослан « .1994 г.

Ученый секретарь .! '/ /и?^

Специализированного совета, /// ■

доктор биологических наук /// А/ / Ш. ЮНУСХАНОВ

АН 'А" *

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Выяснение моле!<улярных механизмов взаимодействия ядерно-цитоплаэматических генетических систем в развитии зукариотической клетки является одной ив фундаментальны* проблем современной молекулярной генетики.

В последние годы наряду с исследованиями по структуре и фушсционированию ядерных геномов растений достигнуты значительные успехи в изучении экспрессии я организации геномов митохондрий и хлоропластов высших растений.

Проблема биогенеза этих органелл все еще далека от своего решения и это прежде всего связано с тем, что существенную роль в биогенезе внутриклеточных органелл играет ядерный генетический аппарат, в связи с чем, вся проблема в значительной степени сводится к исследованию Функционального взаимодействия различных существующих в зукариотической клетке геномов. Для понимания механизмов таких взаимодействий необходимо в первую очередь детальное ивучение структуры генома каждой генетической системы по отдельности.

Генетические системы органелл обеспечивают наибольшую гибкость в процессе развития клетки и ее функционирования и имеют большое значение для непосредственной реакции хлороплаетов и митохондрии на воздействие окружающей среду. С ними связаны шогю хозяйственно ценные признаки растений, такие как устойчивость к антибиотикам и патотоксинам, общая продуктивность эукариотичесгаи организмов, устойчивость к стрессовым воздействиям, цитоплазмати-ческая мужская стерильность.

Уке сейчас получено «кого данных по структурной организации и особенностях Функционирования хлоропласткых геномов различи!« еысп'их растений и водорослей. Хорошо изучены шггохондриальные геномы ряда млекопитающих и грибов. По сравнению.с ними мггохонлри-альные геисмы растении изучены гораздо слабее. Однако, знание особенностей их структурной организации и функционирования чрезвычайно важно с теоретической и практической точек зрения. В теоретическом отношении митсхондриашиэ геномы растений по рагморам и по принципам организации отличаотся от геномов ядер и хлороплаетов, а также, митохондрий животных и грибов. Естественно, что основные принципы организации различных генетических систем, представляют собой фундаментальную проблему. В практическом отношении с геномами митохондрий растений связаны ряд хозяйственно

данних признаков растений. Особое внимание в последнее время привлекают плаэмидоподобные ДНК (ппДНЮ митохондрий в качестве потенциальных векторов для генетической инженерии растений.

Новые перспективы открываются с связи с возможностью лсполь-вования в качестве молекулярно-генетических маркеров клонированных последовательностей митохондриальной ДНК (мтДНК) и ДНК, полученной при обратной транскрипции мРНК (кДНК), с помощью которых исошо научать филогенетическое родство организмов, а также, идентификацию сортов к родительских линий в генетических экспериментах и селекционных программах.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования явилось изучение основных п; инципов структурной организации митохондриального генома хлопчатник и некоторых компонентов его Ое-доксиптевируюцей системы, что определило направление дальнейшей работа по анализу функциональных перестроек генетического аппарата митохондрий и получение молекулярно-генетических маркеров.

Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие ьадачи:

- выделение и идентификация ДНК клеточных органоидов хлопчатника;

- изучение структурной организации мтДНК;

- определение и анализ нуклеотиднш последовательностей ми-тохондриалъных ппДИК;

- поиск гомологичных последовательностей мемду ппДНК основной мтДНК, ДНК ядер (яДИК) и хлоропластов (хпДНК);

- исследование структурной характеристики рибосом и рРШ митохондрий хлопчатника; .

- определение и анализ нуклеотидной последовательности кДНК транскриптов, генов БЭрРИН митохондрий хлопчатника;

- синтез и клонирование кДНК, получение 'библиотеки генов транскриптов митохондриального генома;

- анализ изменчивости митохондриального генома разных видов хлопчатника с использованием «ДНК-зондов.

Научная новизна работы. Впервые обнаружены и проклонир'Званы ппДНК, локализованные в митохондриях хлопчатника. Определены их иуклеотидкые последовательности и с помощью компьютерного анализа построены фиайческие карты. В структуре ппДНК выявлены многочисленные прямые, обращенные повтори и палиндромы, охватывающие „-практически всю последовательность. Показано наличие гомологичных последовательностей ппДИК с основной мтДНК и нДНК. Определен раз-

wop ммтохондриялъного генома и кон/йностъ ппДНК.

В бесклеточной системе синтеза бел)«, полученной из лиаата митохондрий пшеницы с последующим электрофорезом в ПЛАТ идентифицированы продукты трансляции митохондриального генома хлопчатника.

Рпсрви? получена библиотека генов кД11К траискриптов митохондриального генома.

Синтезирована кДШ на основе 24,5S, 17S и 6SpPiíK митохондрий. определена нуклеотидная последовательность кДНК для 5SpPH4. С помощью компьютерного анализа построена Фиэичссютя гарта и модель вторичной структуры.

Елот-гибридиэационннм анализом показана возможность использования генов СЕ 9 ЛТФазм, 24,5S и 17S-5SpPH!í митохондрий в качестве молекулярно-генетических маркеров при анализе гибридного генетического материала, а тшсже, решения некоторых вопросов систематики и эволюции хлопчатника.

Науч н о- п рпкт i гч е с кая значимость работы. Обнаружение, клонирование, физическое картирование и выявление открытых рамок считывания (ОРС) в ппДНК митохондрий хлопчатника позволили получить полезную как в теоретическом, так и в практическом отношении информацию об особенностях структурной организации ппДНК высших растений. Такая информация в перспективе монет бить использована при конструировании векторных систем, необходимых для трансформации митохондрий растений.

Полученную библиотеку кДНК можно использовать для выделения и определения первичной структуры различных индивидуальных генов митохондрий и анализа экспрессии этих генов на разных стадиях индивидуального развития хлопчатника, и целого ряда других проблем. Немаловажным является и то, что изучение клонированных последовательностей «ДНК представляет интерес в плане расширения знаний о молекулярной организации генома митохондрий и создания lía их основе молекулярно-генетических маркеров. Вероятно, именно молеку-лярно-генетические маркеры поздолят осуществить наведение мостов ыежду событиями, происходящими на молекулярном уровне и изменчивостью признаков, свойств организма и популяции. С их помощью, например, можно картировать индивидуальные гены, исследовать закономерности Функционирования генома эукариот, изучить процесс ассоциаций генов и т.д.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на I Республиканской конференции молодых ученых "Вопросы ботанических исследований в Узбекистане" (Ташкент,1977); на IV и VII Веессюз-

«ых симпозиумах "Иолекуларниэ механизмы генетических процессов" (Москва, 1979,1920); на IV и V съездз ВОГИС (КишшеЕ,1982;Моааза, 1937)-, на Всесоюзной конференции молодых ученцх к специалистов (Махарадее~Лнасеули,1985); на конкуренции молодых ученых и специалистов АЛ УвССР (Ташкент,1984); на V Всесоюзном биохимическом съезде (Москва,1986); на V съезде УвОГИС (Талант, 1985); на III и V конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (Ашхабад,1985; Тбскокт,1901); на II Всесоюзном симпозиуме "Генетика развития" (Ташкент,1090); на Юбилейном генетическом симпозиуме (Индия, 1991); на II конференции биохимиков Узбекистана (Ташкент, 1993): на Международной конференции по биотехнологии в селъ-сга; и леской хозяйстве (Индия,1993).

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании Ученого совета Института . экспериментальной биологии растений АН РУв (протокол N 10 от 29.12.93г.).

Структура и обгем диссертации. Диссертация наложена на 264 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, излохокия погу-чешшх результатов и их обсуждения, ваюночещш, выводов и реко-= ¡¡»зндаций. Иллюстративный материал включает ■ 40 рисунков и 20 ?абл::ц. Список литературы содержит 522 источника, в том числе 477 иностранных. . .

МАТЕРИАЛЫ И НЕТ ОДЫ.

Растительный материал. В качестве основного объекта исследований был выбран хлопчатник вида 6.ЫгзиЬит I. (АОг, сорт 108-ф). Для осуществления отдельных экспериментов были исполвованы и ряд других видов хлопчатника: в.ЫгзиЬит гзр. ¡рех1сапил (АБх), в.ЬагЬаг1епзе (АОг)> сорт С-6037, в.ЬагЬзс}впзе 2зр.с1аг1*1п11 (АВг). в.МгвиЬит I. х в. ЬагЬа(1епзе L. (Ра, Рг, Рз - 108-Ф X С-6037); £?.Ъ&гЬасеит I. (А}), С-7090, б. ЬегЬасвип ззр.аГг1сапит (А1), в.агЬогеш Ь. (А2), 0-7059, вЛЬигЬег! (Ох), в.гаШгкШ гр5), 0. Ьг11оЬц/п (йа). Семена хлопчатника получены из коллекции УаНИМ селекции и сеие^ьодзтв хлопчатника им.Г.0.Зайцева УзАСХН и ШЗБР АН РУз.

Ыитохондриальнуя и ядерную ДНК ведедяли из двухдневных этиолированных проростксч, выращенных в термостате при температуре 22°С. Хлоропластнуя ДНК выделяли да листьев 14-дневных проростков, выращенных на свету при температуре 22°С. Корешки и листья,

выращенные га оголенных серной кислотой семян хлопчатника, сл. v бативали 1£-ш>< раствором тритона Х-100 для удаления Оакторналь-ных загрязнений. После тадтельной промывки д<?нончвирова:;псЛ водой, нэтериалн стерилизовали 70%-шйг! этанолом.

Вселение ядерной и хлоропластной ДНК проводят по рввзд использование^ методу (DcynoB Т., 1302). Митохоидриольиу» ДГС? пуделяли с щ>К191!еи;:'ЭМ рагчовесиого ультрацептрифугироранич в градиенте ipo-tiIoctk CcCl-! loschst к ссотлэтстг.г.ч с ютодтсск -п* рекомендации;! опи?в«инчн о р-5от$ Одг.шдог-дгл и др. (1970) с ш'.о-торыми кгапгш !иод!!ф:-:к0:илмм.

Шделегггз' vMToxovnpimbtm р'«5ссои я Pí"í проводили согласи яэтодике, использование:"! в работ» Хеэратоаа П.Р. (1970).

йгучеикэ $."эико-тчг!гскйх сзо;';отв нуглетюпых кислот клеточных органоидов хдопчатан'-са проводили по методу, гпясачнсу ? работе Т.Юсупова Л П.Р.Хвзрзтова (1902,1990).

Трансформацию теток E.coll гатамма JM ЮЗ плазмидакгл pUC 19 и выделение плазмидцой ДНК, обработку ДНК рестрикцион.чьми эндснук-леаземи, электрофорез, молекулярную гибридизацию на нейлоновых мембранах и нитроцеллюлозкых фильтрам, мечение и лигирование ДКК проводили по стандартным методикам (Manlatls et al.,1932).

Рестрикционные эндонукле&зы и препараты лигазы были получены из НПО "Фермент"- (г.Вильнюс) и ИВМ РАН (г.Пушкино-на-Оке).

Секвенкрование кДНК проводили по методу; предложенному Сеп-гером и сотр. (1977), с использованием универсального прантера для полимеразной реакции. Реакционные смеси и реагенты для cckeö-иированкя (набор "Джин-i") били получены из НИКТИ БЛВ ШО "Вектор" (г.Вэрдск").

Все остальные .ферментные препараты получены из НПО "-Фермент" (г«Вильнюс) и НИКТИ ВДВ (г.Бердск).

Фрагменты ДНИ и шянкольцзвые ыодегсулы, а такпз отдедыпя-з субъеднницы рРНК аллкровали нэ агарезныу гелей с помощью метода (Manlatls et al. ,1SS2), с некоторыми иаскмк модификациям».

Электронную микроскопия митохендриальиой ДНК хлопчатника проводили по методике, использованной з работе В.й.Негрук (1987).

Денситометрию электрсфореграмм проводили на микрофотометре ("Карл-Црйсс", Германия) или г.е на лазерном денентометрз (ЬКВ.Щвеция) с-негативных пленок равмэрсп 1я»лра 24x36 км. ' ' Синтез и клонирование кДНК па основе нрэлгзрительио полиаде-ннлированиой с 3'-конца суммарной митохондриакьной PEI проводили по стандартным методигач (Manlatls et al.,1982). Продукт трансля-

Uim ммтоховдрмалъной кРНК, полученный в бесклеточной системе син-теоа белка, анализировали электрофорезом в 10% ПЛАТ, содержащем О,IX ДСН, используя трис-глициновую буферную систему и концзнтри-руюдий 4% ПААГ. После электрофореза гели высушивали б гельдрайере на листах PI lt.rai-.-10 и радиоавтографировали на рентгеновской пленке НЗ-11 (Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.Отличительные особенностн физико-химических свойств клеточных органоидов.

Ив литературы известно, что хпДНК и мтДИК растительных opra-лнамов, в большинстве случаев, отличаются по среднему нуклеотид-nouiy составу от «ДНК, ь связи с чем их можно легко разделить в градиенте плотности хлористого цезия (Bartels P-G.,Hyde А.,1970; Boret P.,197Й;Kolodoer R..Tewari K.K.,1975;Kool A.J. et ai.,1985; Rung S.D. ,Wi 1 Hans J.F., 1068). Препараты ДНК выделенные иа "больших гранул" хлопчатника в градиенте плотности CsCl разделяются на три фракции (рис.1,в). Величина плавучей плотности основной фракции составляет 1,692 г-см~3, а двух минорных 1,697 и 1,706 г-см-3 соответственно. Как показали наши последующие исследования, препараты ДИК, выделенные из очищенных митохондрий, распределяются В градиенте Csöl в виде симметричного рика с плотностью 1,700 г-см"3, аналогично плавучей плотности третьего компонента ДИК фракции "больших гранул" (рис.1,а).- Сходный характер распределения проявляет комплекс мтДНК-Ht (рис.1,6). Данная закономерность находит свое подтверждение if на других растительных объектах (Га-уве Г.Г., 1977;Одинцова М.С..1976).

По нуклеотидному составу ДНК, изученных нами клеточных органоидов, относятся к АТ-типу. Содержание ГЦ-пар оснований яДНЧ составляет 37,0 мол%, тогда как хпДШ и мтДИК содержат, соответственно, 37,9 и 47,5 мол% ГЦ-пар. Следует отметить, что по содержанию ГЦ-пар оснований хпДНК очень близка к яДНК, но в то »■■ время существенно различается по содержанию метилированных оснований. Аналогичные результаты были получены при сравнительном изучении яД11К и > хпДНК других вистах растеши (Kolodner R. .ïewarl K.K.,1972,1070; Kool A. J. et al.,1086; Kung S.D., Williams J.P. ,1968). Ha ocivœamw подученных шшперимепталъных данных эти авторы полагают, чао отсутствие Б -Щ в препаратах ДНК хлоропласта является кадежьш критерием ее чиототи. Отсутствие 5-Ш1 в ми-

Рис.1. Денсктограша УФ-снимков распределения препаратов митохондриалъной ДНК (А), комплекса митохондриальной ДКК- Hoechst (В) и тотальной ДНК (В) хлопчатника в градиенте плотности CsCl. В качестве реперного образца был использован препарат gHK Sarclna lutea плотностью 1,731 г-см J при 25 С.

Рис.2. Кривые плавления ДНК ядер (1), хлоропластов (2) и митохондрии (3) хлопчатника.

тохондриалыюй ДНК является характерным признаком отличия ДНК митохондрий растительных органивмов от животных (Ванюшин В.Ф.,Кир-нос Ц.Д., lSr''6;Одинцова Ы.С. ,1976). Данные по содержанию ГЦ-пар оснований в ДНК клеточных органоидов хлопчатника, полученные путей намерения плавучей плотности и температуры плавления ДНК, такие, свидетельствуют о рначительном различии их нуклеотвдного состава. Установлено, что мтДНК хлопчатника более стабильна к термической денатурации, чем яДНК и хпДШ (рис. 2). Однако, шири-па интервала плавления (ДТ) ядерной ДНК на 4,1 и 4,9°С выше, чем у соответствующих ДНК хлоропластов и митохондрий. Причина увеличении ДТ связана, видимо, с большей слоишостыо и гетерогенностью ядерной ДНК по сравнении с ДНК цитоплазматических органоидов.

Данные по организации нукяеотидкых последовательностей ДНК клеточных органоидов хлопчатника получены при изучении кинетики реассоциации (рис.3).

Данные рисунка 3 указывают на то, ч-ro по форме кривые кинетики реассоциации хпДНК и мтДНК хлопчатника близки к кривой реакции второго порядка (Bartels P-G., Hyde А.,1970; Kolodnar R..Towarl К.К.,1972; Vedel F., Quetler f.,1974;Wells R.,Birnstlel M. ,1969).

Сопоставление кривых кинетики реассоциации хпДНК, мтДНК и ДНК E.coli подтверждает структурное сходство- генома прокариот и геномов" хлоропластов и 'ыитохондрий. Раамеры геномов хлоропластов и митохондрий, рассчитанные на основании кинетики реассоциации ДНК. составляют 150 т.п.н. и 2071 т.п.н. соответственно. Полученные результаты хорошо согласуются с данными ряда авторов, изучавши размеры и структуры .геноиов клеточных органоидов других разновидностей хлопчатника (Hsu C.L..Mullln B.C.,1989;Wendel J.F., 1089).

Известно, что рестрикционная эндонуклеаза но разному расщепляет ДНК клеточных органоидов, что указывает на существование в них значительных структурных различий (Негрук В.И.,1987; Агауа А. et al.,1984; Hsu C.L., Mullln B.C., 1988; Rose R.J. et al.,1986; Wendel J.F.1089). 0

В связи с этим мы изучали, в сравнительном аспекте, рестрик-ционные картинй. ДНК изолированных хлоропластов и митохондрий хлопчатника, полученные при помощи рестрикционной эндонуклеазы EcoRI. Анализируя фотографии электрофоретического геля и денси-,-тограммы негатива мы обнаружили 21 и 52 полосы с различной интенсивностью свечения для хдорояластной и митохондриальной ДНК. со-

40

1сг3 кг3 кг1

ID2 ItP Cot

r a

Рис.3. Кривые кинетики реассоциации ДНК ядер хлоропластов (-»-) и митохондрий (-"-) хлопчатника.

В качестве маркера использовали ДНК E.coll (размер генома 5-1Сг т.п.н).

Рис.4. Электрофоретическое разделение

EcoRI-фрагментов ДНК митохондрии (1) и хлоропластов (2) хлопчатника в 1£-ном агарозном геле (А) и денситограммы негатива геля (Б).

сктстствеыю (рис.4).

Тага:! сбрааон, яамшо фиэико-хишческого акалиса яДШ>, зл^ЦЯ п шДНК хлопчатника пэдтворлчаят виачитедькыз различия с струк-организация » отн различия, следовательно, ;.:огут служить од к им кз калежкыл критериев 'их идентификации.

сгру!:тур-;ля характеристика щтю<щршьнсй днк хлопчатника.

2. 1.га:з;:?р икгсхондрлаяьцого генома хлопчатника.

Кал известно, pasmpu матояоядриальных т'ено^ов раЬ гений ва-ипнз ноешшот равырц геномов хлоропластов (Одинцова U.C. i; ;,p.,lii?0,lW6;Wa)d B.L. et al. ,1981;V.'olls R. .Blrnstiel m. ,1963). С;:':.ытг£Л1>шй рестрикциашый акалиа хпДНК и мтДНК хлопчатника игз.тч, тоугй, виачятедыше р.чзыери генома митохондрий (рис.4). При а;оу рестрикциокиш фрагменты мгДНК оСраз;:стсл в не &квшо-xi-iriiLi-; количествах. Следовательно, для более точной оценки размеров генома необходимо учитывать не только длину, но г. число фраг-13!»тоь Д»1К в |-2ид\ой воле. Поэтому, определяя размер митохондри-оььиого генома хлопчатник с помощью рестрикционного алалива, nais: бшо проведено дзнентомегркрование электрофореграын. В экспериментах были использованы три крулнощипящие рестрикционные зндо-нуклеаеы: BamHI, EcoRI и SalGI (рис/б). Анализ'фотографий гелей и денситограш негативов, ' выявил наличие более 50 дискретных полос с различной интенсивностью свечения. Молекулярные массы BamHI, EcoRI и SalGI-фрагментов рестрикции мтДНК хлопчатника, установлению на основании их электрофоретическои подвижности, находились в пределах 13,827 -.0,277, 12,951 - 0,057 и 14,867 - 0,176 т.п.и. соответственно. Однако, перемещение рестрикционных фрагментов, имеющих незначительные различия по молекулярным массам, а такта последовательностей, многократно повторяющихся в' геноме в одной воне, затруднило определение относительной стехиометрии к индивидуальным группам, что уменьшало нашу уверенность в оценках размера митохондриального генома хлопчатки!«а. Поэтому, для Солее точного определения размера митохондриального генома, был исьоль-еозан метод кинете!« реассоциащш, который повволяет количественно охарактеризовать степень слад ¡ости генома. Для построения кривых кппетикн ре'ассодашда ДНК были использованы меченые препараты мтДНК (3Н-ДНК), в сряви с тем, что чувствительность радиоизотоп-.ного мэтода определения количества ДНК значительно превосходила таковую полученную по сравнению со гпектрофотонетричееккм мето-

'не.5.Злектрофоретическое разделение рестриктных Фрагментов митохондрнальной ДНК хлопчатника вида О. hlrsiitun L. .сорт 100-í>. ДКК обрабатывали рестрнк-тяр^-чи РсотН! (B).SalGi (Г) и Ec-cRI (Л). В качестве маркера использовали Hindi 11 (A), EcoRf (Б) фрагменты ДНК фага А.

дом. Кривые кинетики ро ассоциации мтДНК четырех ещоз хлопчатника изобразит на рисунках 6-7.

Величина размера иптоло-ндриаяьного re нош, ивучешпп нами видов хлопчатника, рассчитанная на основании кинетики реассоциацик составляет около 2,070-2.071 10б п.н. к значительно отличается от размеров^ геномов мигохоядрнй других видов высеих растении (Негрук В.Я. ,1987-, Bailey S. J. et al., 1987; Lonsdalo D.M. ,1.984; Paltrer J.D. .Herbon L.A. ,1986,Ward В.L., 1981), это дает нам право для прсдполотония, что китохондриальный геном хлопчатника по своим размерам очевидно превосходит соответствующий геном ляороллае-тов з 13,8 раз. Эта закономерность хорошо согласуется с даннц>.*и ряда авторов, изучав-их размеры геномов хлоропластов к кктохснд-ркй большего количества разнообразных видов ?»сших растений (Негрук D.H. ,1987; Bailey S.J. et al.,1937; Lpn.<?dai3 D.M. ,1934; Palmer J.D. .Iterbon L.A. ,1386; Ward B.L.,1981; Wendel J.F. ,1989).

2-Й.Нуютеотид/шй состав митохондриальной ДНК.

Нуклеотидннй состав митохондриальной ДНК различных видов хлопчатника изучен нами впервые. Сравните лышй анализ содержгмл ГЦ-пар нуклеотидов показал, что мтДНК всех исследованных видов хлопчатника относится, к АТ-типу (47,1-47,6 моЛ ГЦ), (табл. 1).

' Чг

Ч—-V

•

I

-к з

д.

'»aßt-

Vrfá

'счг-.'т; t ;- " i

P

i?' f tM^Jjt^^^JJii^ität^uii. .5

tSJ А Б В Г ¿l <

1сг3 itr2 иг1 1 10 1с2 irf3 ont

ГО

I

Ри°'6'^^^ййвсс0циацни митох°ВДРигш>к°й ДНК Рис.7.Кинетика реассоциации шггохондриальной ДНК лдончатника. хлопчатника.

"Г g-Wrso:.". L., сорт 108-®; -а- е. herbsceum L., сорт 7090;

- B.arborewn L., сорт 7059: -о- Е.coll.

G.barbaaense L.j сорт 6037; -a- E.coJi.

- 13 -

i ГвСлтю 1

Нуклеотидиый состав китохондризльной ДНК хдопчв?и;$ка

Сорт хлопчатника : Содержание! азотистых оснований, ноль% (Mim)

А : Т : Г : Ц : Г+Ц

G.arboreum L.,

C-7Ó59 26, £Ю,3 Кв, 4Ю, 5 24,110,4 23,310,7 47,4

G.herbaceum L., !

С-7090 26,210,4 26,610,6 23,8Ю,4 23,410,6 47,2

G.herbaceum L.

ssp.atrlcanum 26,510,3 26,110,1 23,810,4 23,610,6 47,4

S.hirsutum L.,

108-Ф 26,610,6 26,010,3 23,710,4 23,ЭЮ,б 47,6

G.hirsutum L.

ssp.mexlcanun 26,410,4 26,710,6 23,9±0,5 23,410,3 47,3

G.barbadense L.,

C-6030 26,210,6 26,7Ю,3 23,410,3 23,710,7 47,1

Показатель специфичности состава мтДНК хлопчатника т.е. отношение Г+Ц/А+;Т -• варьирует в незначительном интервале от 0,82 до 0,87 мол%. Незначительная вариабельность нутаеотидяого состава мтДНК кв}', диплоидных (G.herbaceum L., G.arboreum L.), так и тет-рапловдяыя (G.hirsutm L., S.barbadsnse L.) видев хлопчатника ус-, тановлена при определении содержания ГЦ-пар оснований по плавучей плотности. Аналогичные данные получены рядом исследователей при исследовании мтДНК других растительных объектов (Ectístíís J.C. et al.,1983;Quotler F. et al.,1985;№>lls R.,Ingle J.,1970).

златохшдримышв ПЛАЗВДЮПЮДОБИЫЕ ДНК ХЛОПЧАТНИКА.

3.1. Обнаружение н характеристика митохондриальныя плазмидоподобних ДНК,

Другой отличительной особенность» препаратов мтДНК хлопчатника по сравнению с яДПК н хпДНК является надтке з них плазмидо-подобннх молекул. Плазмидоподобные молекулы легко выявлялись при злектрофоретическом анализе мтДШ в качестве двух основных дискретных .вон в ншшей области 1-1,5% агарознсго геля (рис.8,г). Сравнением электрофоретической подвиглостл нтакомолекулярных ДНК

w

I

» i ;fit.' t to*'- i

к

••'?». A1;

*

u, Щ

V

p".

^ \c4

,<„Я i -VN

4 J.

"«¡Mijisi Wi^ «fc-■ >f-.t'.i; iia^tJfe . i 'i

i А Б В Г

Pi.o.8. Эдектрсфоретический анализ Д1Б1 ¡глоточных органоидов хлопчатника вида (J. hirsutum L., сорт 103-Ф. Л - тотальный препарат ДНК, , .

Б - ядерная ДИК, В - хлсропластная ДНК, Г - шггохондриальная ДНК.

Рко.О. азектрофорстический анализ ДНК клеточных органоидов хлопчатника вида S.barbadense L., сорт О6037. В - ядерная ДИК, Г - хлоропластная ДНК, Д - митохондрмадьная- ДНК.

В качестве маркеров использовали продукты расщепления да рестриктааами Hindi 11 (А) и Pstl (Б) фага X.

с таковой линейных маркерных фрагментов известной длины установлено, что размеры ппДНК хлопчатника составляют приблизительно 6,6 и 2,4 т.п.н. В препаратах ядерной и хдорогошетной ДНК хлопчатника отсутствуют медленно мигрирующие фракции ДНК (рис.8,б,в).

Сравнительный элзктрофоретический анализ тотальных препаратов итДНК двух' культнвируешх видов хлопчатника в.МгзиЬит £,. (сорт 108-0) и в. Ьаг^впБв Ь. (сорт С-6037), не выявил сущест-вэнпих различий по спектрам распределены; ппДНК. Оба вида хлоп-чатннка содержали шЩНК, с размерами 6,5 и 2,4 т.п.н. (рис.8,9). ГЩНК митохондрий хлопчатника вида б.МгзиШ I. была обозначена

Рис.10. Электронно-микроскопические фотографии иитохсндриалыюй ДНК. Л - мииикольцевие митохондриальнне ДНК, В - слояноорганиоозанная высокомолекулярная

митохопдпиальная ДИК. Увеличение 30000-45000.-

нсми так pGHml п pGiim2 (Gossypium ffirsutum mitochondrial), а у тча G.h-rbodense L. - pGBml К pOBm2 (Gossyplum Barbederiso ml tochoixlrlal) соответственно.

Ппднгг элшровалн- из агарозтк гелей и анализировали под электрон ни.! микроскопом. Электронно-кикроскопическио фотографин основной геномной и ппДНК митохондрий хлопчатник'представлены па рис.10. Датше рисунка указывают на то, что мтДИК хлопчатника имеет рмсокомолекуларную и слояноорганиэованную структуру. Оба типа ппДНК, выделенных из тотальных препаратов .мтДНК хлопчатнике злгцией ид агярозннх гелей, ¡мели кольцевую форму.

3.2.Определение числа копий■плазкидоподобння ДНК на митоховдриальннй геном хлопчатник.

Для определения числа копий. ппДНК проводили сравнительные

адвк»рс$оретнчес!Я1о анализы кяальшк препаратов Ш'ДНЧ хлопчатника вида в.Мгзикю I. (сор? 108-Ф) и в.Ьаг'оайспзо I. (сорт С-6037) б 1,6% агароэнш; гелях. По окончании злектрофорева гела окрашивал» ершистый эткдвеы' н фотографировали при разных выдержках. Негативы деиентометрировака л сравнивали данеитогрсьва оо-коокой и ппДНК иитохепдрпй. Результаты эти;: сразиеккЗ покавади, что при одкнокових условиях денситометркровапия, высоты пмноз, соотсетствовапшюс Дй р6Нгг,1 ц рбКсЙ, составляли 12,14 и 8,4 условных единиц (у.е.), соответственно, а у ДНИ р55аг! и рсвай -16,оЗ и 9,8 у.е, , в-сравнении с основной «ктохоэдрлальной ДНК.. На основании эти*; данных нами Сило вычислено, что, количество ДНН в зона:: рбНвЧ и рйЧвй в 155,31 и £'¿5,74.' раз иен'ле, соответственно, чём в зоне основной ктДНК, что соответствует 2070/166,34-13,24 т.п.н. и 2070/ 225,74-9,1? т. п.н. Эти величин; для ДИК рШ»1 ц рбВпй равны 20,21 т.п.н. и 12,09 т.п.н. соответственно. Основываясь на полученных раемврах стало вовможки:» определение чисда копий их молекул в пересчета на га.'ем.

Таким ей разе,.!, число ют.га ппДНК 8 расчете на матохондриаль-кый геном хлопчатника размером около 2070 т.п.н. составляет для р0Ы - не менее двух, для рШт1 - не менее трех, а дли рБНай и рОВгдС - не менее четырех и пяти соответственно. Данные о различиях в числе копий пиДНН в основном митоховдрйалыюы геноме да»? основание для предиодомния того, что изученные нами молекулы ДНК способны к автономной репликации.

3.3. Определение и анализ нуклеотедных последовательностей №!Токондриапь:шх* плазмидоподобиых ДНК.

ИлаэиидоподсхЗныз молекулы рШп1 и рСЯтй для копирования выделяли из тотальных препаратов ытДНК хлопчатник эгацнек кз ага-ровных гелей и анализировали с комощыс рестрикционкых зэдонуклэ-аз. В результате обработки пцДНК рОНггй ферменгш 5а1Щ образовывалась линейная ДНК длиной 2,4 т.п.н. Отсутствие коротких фрагментов предопределил над выбор эндонуклеазы БаШ!, в связи ¿'чем фрагмент и бал использован для клонирования ппДНК р6!1д2 в глаз-мидном векторе рОС19. Схема клонирования полных последовательностей ДНК р0№м2 мйтохондрда хлопчатника приведена на рис.11. В ре-

Эта часть работы выполнена согкестно с А.Э.Аваковш (МВА им.Г.К.Скрябина) и Р.М.Наурузбаевой

(2r501)S»i>1

Ж>ч(йя

/ Sf.lt VI

П.в'З)

BcoBI (J9ö) i aiBdin («7)

/йрип (eos)

t'/tr

icw У<з

Рис.11. Схема клонирования полных последовательностей ДИК pGHuß митохондрий хлопчатника.

вультате клонирования и последующего скрининга было получено несколько клопов, содержат« рекоШтяитиые ДШ, Для датьиейзяк исследований било отобрано лазь три ¡тона клеток Е. coli содержащих рокомбикаптиие ДНК с ооответстпуясими встагкг.Щ! полной псс;.";-довательностя ппДНК.

Нам не удалось проклоиировать полные посгедсйательасчзти ппДНК р©М в омой с уем, что в ходе кзоякроваггея 6t ка утрачена часть последовательности Гк Поэтому, дальнейа^е исследогаикя по структурной ортиивации г.пдшс мггог.оядркй глопчатяп® Сиг.' ограничены лип;?» ппДНК рОНтй.

В результате секвеиировмшч по методу Сет-ера били определе-пн нукяеотщнме последоаательиостя ДНК pGlbfl. Длина сестенировиших ДНК pGHm2 доставила 2215 п.н. Содержите ГН-нпр оснований ДИК рбНлЙ, расечятаяиое лч осnct? секвенирова-ш«я шл%), э!Клител*л.о отличаетец с? <*сс««ва оснований »«к

оснонной ге.иомяой мтДНВ Ш мсмЖ), так и ядер (37 мслЯ) ir

ялоропластов (37,0 молХ) хлопчатника. Аналогичные результаты подучены при сопоставлении содержания ГЦ-пар оснований плаамид S1 и S2 с основной мтДНК (Shan D.M., Levlngs III С.S.,1974). На основании этих результатов, выдвинуто предположение об экзогенном происхождении плазмид S1 и S2 (Sederoff R.R. et al.,1981,1985).

Более детальное изучение первичной структуры ДНК pGHrrß проведено с помощью компьютерного анализа, используя пакеты программ DNASYS и PC/Gene.

Рестрикционная карта ДНК рОНпй, построенная на основании первичной структуры, представлена на рисунке 12. ДНК pGHr«2 имеет уникальные сайты для рестриктаа Accl, BssHIl, EcoRI, Kpnl, Pvul и Xbal. Выявлены также по два сайта узнавания для рестриктаз BamHI, Pstl, Saol и три сайта для рестриктаэы Hindi11.

5'U

ÍV

X 3

Я fe Ре К В? I ,Щ1 I

Рис.12. Физическая карта ппДНК pGHm2 митохондрий хлопчатника. Условные обозначения:

Ас- Accl; В- BamHl; Bs- BssHI; R- EcoRI; H- Hindi II-; K- Kpnl; Pv- Pvul; Ps- Pstl; Sa- SacI; X- Xbal.

Компьютерный анализ последовательности ДЩ рШт£ выявил ыно- . гочисленные прямые, обращенные повторы и палиндромы, охватывающие практически всо последовательность. СбиарухенсГ 31 различных прямых повтора длиной от 10 до 38 п.н., причем, 6 иэ них представлены двумя или же тремя копиями. Обращает на себя внимание присутствие двух прямых повторов в 14 и 20 п.н. (положения 1226-1о65 и 1240-1677 п.н. соответственно), последовательность которых представлена следующим образом:

б'-стсттсастАттаа-з* и Б'-оаттААепшэтААсаосА-з'. Зги повторы ' содержат полную последовательность повтора б'-СТСТТС6СТА-3' (положения 1391-1665 и'1665-1762 п.нЛ и повтора -Б'-ТГМбТТбазТА-З' (положения 1242-1603 п.н.). Компьютерной обработкой установлено, что ДНК рВНяй помимо пряшх повторов содержит

два обращенных повтора и четыре палкндромкнх последовательностей.

Обращенные повторы длиной 10 п.н. '(б'-ССТТОООССС-З'), расположенные- в положениях от 43, по '579 п.н. и длиной 12 п.н. (й'-сстостазсб-з') в положениях от 1588 по 1841 п.н.," локализованы в ГЦ богатой области ДНК р6Ня2. Обнаруженные нами палиндром-ные последовательности локализованы, такяе, в ГЦ богатых участках ДЩ рСНтй и имеют строго комплементарные ппилечпке струшури.

При анализе последовательности нуклеотидов ДНК рИЬтй нвйдено пять ОРС, кодирующих з общей сложности,, около 237 аминокислот. Все пять ОРС в качестве инициирующего кодона используют триплет АТй, з то время как тержлнруйщего - триплет ТАА. ОРС з положениях 1038-1209 п.н. и 1558-1639 п.н. кмегт По два близко располо-¡¡ккних кодона инициации трансляция.

3.4.Гибридизация рекомбинаитннх плазмйд рбНМ и раЬ2 с

ядерной, хлоропластной и мито;{ондриальной ДйК хлопчатника.

Одной из возможных Функций пяДНК растений, является :п: перемещение, наподобие мобильных диспергированных генетических элементов, не только внутри одной из генетических систем клетки, по и мевду геномами органелл. В связи с этим мы попытались выяснить, существует ли гомология мекду обнаруженными нами в митохондриях хлопчатника плавмидоподобными' гшекуламя и-ДНК, выделегшшш из ядер, хлоропластов и митохондрий того ке хлопчатника? В результате проведенных, исследований было обнаружено, что ппДНК р(ЗМ и рйНтг содержат последовательности, обладввпяв заметней гомологией с яДИК хлопчатника.

■ Количество копий ппДКК в расчете на геном' ядер составляет: для р<2Нт1 - не менее 5 и для рбНтй - не менее 7. ПпДКК гкбридизо-вали, тшсте, н с хпДНК. Прозедентй эксперимент такте удазывал ее отсутствие эаметной гомологии меяду последовательностями хпДЕл 55 ппДНК митохондрий хлопчатника.

Нами было обнаружено, что' ппДКК гкбридизукзтсгт и с основной мтДШ. Количество копий ДНК рйНт1 и рЕНш2 з расчете на геном митохондрий составляет не менее 2 -я не менее 4 соответственно. Для более детальной характеристики последовательностей яДНК и мтДНК, гомологичных ДИК р6Нт1 и р(3№п2, необходимы дополнительные исследования, связанные с определением и анализом первичной структуры их участков, имеющих гомологичные последовательности.

С помощью компьютерного анализа нами была изучена гомология

- го -

pSHm2 со структурными элементами генома ядер, хлоропластов и митохондрий различных организмов, а также SI, S2 плаамидными и Ми трансгюзошшми элементами кукурузы для выяснения некоторых вопросов, связанных с происуоддением и биологической ролью плазмидопо-добной ДНК pGHm2. ПлДНК pGHm2 имеет 43,1% гомологии с геном запасного белка хлопчатника вида G.hlrsutum L., имеицкм размер 662 п.н. Выявлена, такие, гомология между ДНК р(ЗНт2 с мтДНК Human (43,1 X) и X.laevls (43,1%). Среди проанализированных структурных генов высокая степень гомологии была выявлена меаду ДНК рбНяй и геном СБ! цитохромоксидаэы (49,5%), а такта геном SSBI (52,5%). Ыятохондриальные плазмвды кукурузы S1 и S2 имеют почти одинаковую степень гомологии куклеотидных последовательностей (41 и 41,2%) с рбНггй. Последовательности Mu трансповонных элементов кукурузы, размером 1484 п.н., иаеют более высокую степень гомологии (47,0%) с рОНшй в сравнении с плазмидами кукурузы S1 и S2.

Большое количество неполных и разнотипных гомологии со. многими разнородными структурными элементами генома представляет собой, насколько нем известно, достаточно редкое явление. Оно исжет указывать на древность появления ппДНК pGtb2, как компонента иитохондриального генома.

На основе атих результатов, мы не смогли сделать какого-либо удовлетворительного вывода о происхождении и биологической роли пловмидоподобных ДНК митохондрий хлопчатника pGHm2. Выяснение данного вопроса требует, по-видимому, детального исследования продукта транскрипции и трансляции пяазмидоподобной ДНК митохондрий хлопчатника in vivo.

4-ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ РНК МИТОХОНДРИЙ ХЛОПЧАТНИКА.

4.1.Структурная характеристика рибосом и рРНК.

Исследованиями последних лет установлена органоидная специфичность аппарата трансляции митохондрий и структурно-функциональное своеобравие его компонентов, центральным звеном которого являются рибосомы.

Рибосомы, выделенные иэ очищенных митохондрий хлопчатника, имели типичные сйектры поглощения в УФ-свете с максимумом при 260 км и минимумом при 235 им (Ё2бо^2во -1,00; Е2бо/Егзо -1,65). Количественное соотношение РНК/Оелок в митохондриальных рибосомах поставляет около 1,2. Эти результаты хорошо согласуются с данными ряда авторов, изучавших рибосомы митохондрий различных раститель-

ных организмов (Одинцова M.С. .Юрина Н.Г., 1977¡Гуликона ОЛ!. ,1982; Хаэратов П.Р.,1990). ' Препарата миторибоеом в градиенте плотности сахарозы проявляют унимодальный характер распределения с константой седиментации 77,4S (рис.13). Оказалось, что миторибосомы, по константе седиментации, значительно отличаются от рибосом хлороп-ластов и более близки к рибосомам цитоплазмы.

Рибосомы митохондрий распределялись одним гомогенным пиком, с плавучей плотностью 1,58 г-см~3 (рис.14). Относительное содержание в них белка, вычисленное на основании оначения плавучей плотности, составляло A8Z. Плавучая ке плотность цитоплазматкчес-ких рибосом хлопчатника -1,53 г.см"3 соответственно (Хааратов П. Р.,1990), что дает величину относительного содержания белка равного 49%.

Таким образом, по величине плавучей плотности в градиенте плотности CsCl рибосомы митохондрий хлопчатника заметно отличаются от рибосом цитоплазмы, но близки к хлоропластным - 1,57 г-см-3. Следовательно, относительное содержание белка в рибосомах митохондрий больше, чем в рибосомах 70S типа, что справедливо и для рибосом митохондрий хлопчатника. Препараты РНК выделенные из очищенных миторибоеом в градиенте плотности сахарозы распределяются в виде симметричного пика с молекулярными массами 1,54, 0,74 н 0,3 MD (рис.15).

Сопоставление данных по -нуклеотидному.составу рРНК рибосом клеточных структур свидетельствует о том, что нуклеотидьие составы мт-рРНК (24,5 S -52,5 мол%, 17S - 53,7 молХ и 5S - 50,8 мол% ГЦ-пар), .намного отличаются от состава оснований рРНК хлороплас-тов (52,3 мол% ГЦ -пар) и цитоплеамы (55,4 молХ ГЦ-пар), что обусловлено, вероятно, какой-либо структурной особенностью мт-рРНК.

На основании вышеизложенных результатов можно сделать следующий вывод. Ыитохондриальные рибосомы и рРНК хлопчатника но свош физико-химическим свойствам отличатся от рибосом и рРШ'. хлороп-ластов и цитоплазмы, что свидетельствует об их оргэнойдной специфичности.

4.2.Определение и анализ нуклеотидной последовательности кД1М транскриптов, генов OSpPHK митохондрий хлопчатника.

В отличие от рибосом животных, грабов и драттеп, миторибосомы ви':тх растений, такяе как цитотосматичоеки3 и хлерошгсетнш,

260 1.0

0,8

0,6

0,4 0,2

77,4 S ВС S 70 S

Рис.13. Распределение ыиторибосом хлопчатника в градиенте плотности сахарозы (15-30Х). Маркеры — рибосомы цитоплазмы (80S) и хлсропластов (70S) хлопчатника.

10 20 30 40 номер фракшШ

чгсо

0.15

0,10

о, (г

J?( SCB-3)

ID 20 30 40 Взвар франка

260

2,0

1.0

24,55

¿W

I?S

23 S

Г

» л

I6S 5S 45

Г ¡Г.

Рис.14. Распределение ниторибосом хлопчатника в линейном градиенте плотности хлористого цезия.

Б качестве маркера использовали рибо-. сомы цитоплазмы (р-1,53 Г'см -3) и -хлоропластов „ (р-1,57 Г'СМ ) хлопчатника.

Рис.16. Распределение РЖ ниторибосом хлопчатника в линейном градиенте плотности сахарозы (15-30%).

Маркеры.- pPtjo. и тРЩ E.coll.

5 /10 15 20 25 30

- n¡x!2p фрэдзЭ

содержат уникальные ESpPïîIl (Jene K.P., Sinclair J.H., 1982; Wallace D.C;, 1982; Ifcsse C.R., 1977). Важная функциональная рогь BSpPHR при . обрааовлаии фушвдкЬнально-аюттных миторкбосом обуславливает интерес к определен® ее первичной структуры у различных оргашюмоч.

В .частоясее время изучена иуклеотидяьзе последовательности UT-6SpPffii у небольшого количества высших растений (Brennlcke А. et el.,iS85i!fcrgens Р.Н. et al.,1984; Spencer D.F. ot al.,1931, 1984). Хлопчатник 3 чтом отноаения ивляется неизученным объектом.

Синтез кДШ на матрице BSpPHK, предварительно полиаденилкро-вашшх на З'-концешх участках осуществляли стандартным методом (Мел 1st is T. et al., 1G82). Двухцепочечмые кДШ с "тупыми" концами были прокдонированы n Е.coll в составе SmaT сайта плавмидного вектора püC 19. отбор клонов вели по сигналу гибридизации колонет с 5S[ï-3?'PJpPHK митохондрий хлопчатника (рис. 16,а). В результате . были выявлены ¡«оны, в разной степени гкбридизующиеся с рРНК. Из

Рис.16.Гибридизация колоний рекомОйнантных клонов (А) к выделенной im них пдаз-мидной ДИК (В) с Сг-^^РЗ 5SpPHK митохондрий хлопчатника.

этих клонов были выделены плаэмидные ДНК, которые анализировали дот-гибридизацией с 6Str-32P]pPHK иитохондрий ' хлопчатника (рис.16,б).

На основании результатов дот-гг.бридизвцин рекомбинантных шшзмид с БЗ[г-32?]рРНК бил осуществлен выбор плаамад • для дальнейшего секвенирования. Дада.уе по саквепированкз последовательностей нукле-отидов 53кДНК приведены на р:ю.17.

Одним из уникальных свойств мт-БЭрИй :глспчатнкка является иалячке на 5'- и 3'-концах оста:-коз аденш;а. Последовательность СПАЛО, участвующая. го взаимодействии с е>,«шоавдл-тРНК прсшриоти-

CpQ-ß

_ oä ©'"

Q О il

ъ О О' о

О. О ; О '

О О; ■• , '

töi'rj

Л

В."

-о

■■•'О ' ■ А ^

О- «S

чееких организмов, у мт-5БрРНК хлопчатника заменена последовательностью CGACC (45-49н.). В районе 53-бОн. обнаружена последовательность AUAUAUCU, которая отличается от последовательности AUAUAUAU мт-53рРНК пшеницы заменой одного . нуклеотида (Spencer D.F.,1981).

1 AAACCGGGCA CTAGGQTGAG ACSTQTCTAC ACCTGATCCC ATTCCQACCT

51 CGATATATCT GTffiAATCGT CTTGCGCCAT ATGTACTAAQ ATCGTTCGG3 101 AGACATGSTC AAAGCCCGQA TGAA

Рис.17. Еуклеотидная последовательность öSpPHK митохондрий хлопчатника.

Первичная структура мт-55рРНК хлопчатника характеризуется значительной гомологией (93,3%) с mt-5SpPHK пшениц» (рис.18). Имеющиеся отличия обусловлены исключительно 9 нуклеотидными вамэ-нэдш, которые распределены неравномерно и сгруппированы, в основном, в районе 26-34 и 88-93н. Обнаружены, также, единичные нукле-отвдные веменн в районе 59 и 121- 122н. В отличие от BSpPHK пке -шщы, мт~5БрРНК хлопчатника имеет слабую гомология с цитоплавма-тическими 5SpPHK некоторых бактериальных клеток (50,5- 64,9%). иоввдимому, это свпвано с органоидной специфичностью MT-5SpPHK высших растений.

Для локализации сайтов еачен нуклеотидоп во вторичной структуре молекулы mt-5SpPHK хлопчатника ш воспользовались ранее известной нам моделью 5SpPHK пшеницы (Spencer D.F. et al.,1981). Модель вторичной структуры 5SpPHK пшеницы содержит шесть спиралей, которые обозначены авторами АА', ВВ', СО', ЕЕ', FF*. GG'. Спираль АА' мтББрРНК хлопчатника по структуре аналогична АА' спирали mt-5SpPHK пшеницы, которая содержит весть ГЦ-пар оснований (рис.19). Все остальные обнаруженные спирали mt-5SpPffii хлопчатника имеют как сходные, так и отличительные блоки в структуре. Обнаруженные различия связаны, по-видимому, с эволюционным проис-хоидением 5SpPHR в митохондриях растительных организмов.

Физическая гарта, построенная с помощью компьютерного знали-ез на основании первичной структуры бБкДНК, представлена на рисунке 20. Как вудаю ив данных рисунка, мт-БЭкДПК хлопчатника имеет более простую организацию рестрикциониой карты по сравнению с основной геномной рДНК высших растений (Гилязе.тдинов , Ш.Я. к Др. ,1076).

10 20 30 40 50 60

S. hirsutwa L. AAACCSœCACTACQSTSAGACQTGTCTACACCTGATCCCATTCCSACCTCGATATATCT X:::::::::::::: ::::::::':: ::::: :::::::::::::::::::::::: : Wheat AAACCQQGOACTACSsTGAGACGTGAAAACACCCGATCCCATICGQACCICSATATATAT

10 20 30 40 50 60

70 80 90 100 110 120

QTQGMTCGTCTTGCGCCATATQTACTMM№TTCK3GAGACATeGTCAAAKXX}GGA

GTG3AATCGTCTTQCQCCATATQTACTGAAATTSTTCQGGAQACATGGTCAAAGCCCGGA 70 80 90 100 110 120

TS AA

Ркс.18. Гомологии в нуклеотидных последовательностях SSpPHK митохондрий хлопчатника и пшеницы

- se -

Рис.19. Модель вторичной структуры 5SpPHR митохондрий хлопчатника.

Представленшэ нами результаты могут слу;,оть для выяснения некоторых вопросов, связанных с органоадвсй спэ-цифтаность», а' тагеяе. с эао-лидионвш происхождением мт-55рРНК вь-сеях растений.

В'

Вр В

На Dp ей На

Нр So Ао Еь g» Ир

5' I Р5,-РМ0. fi fo № W,, ît . tîa |

Рис.80. Физическая карта б£ЗДНК ыитохондрий хлопчатника. Условные обозначения:

Ао- AccI; В- Boni; Dd- Ddol; Dp- Dpnl: Na- NapII; Hh- flhaî; Hn- Hlnfl; Hp-Hpall; Mb- ftboi; Ms- Mspl; R- Rsal; Sa- Sau3Al; Se- SacIH; Ss-SstUI; Ta- TagI; Tt- Tthlill.

4.3.Митохондриальные мРНК и продукты их трансляции.

Из литературы известно, что мт-м?НК высших раетений не поли-аденилированы на 3-'конце, в связи с чем их невозможно выделить стандартным методом, используя для колоночной хроматографии по-

ли(и)- или олигоШ)-сод8ржащие сорбенты (Hlesel R.,Brennlcke А., 1987). Поэтом/, изучение структуры и функционирования мт-мРНК растительных клеток представляет известные затруднения. Напротив, мт-мРНК кивотных. и дрожжевых клеток на З'-конце содержат поли (А) последовательность, что облегчает их выделение общепринятым методом- Число типов мРНК, синтезирующихся в митохондриях, составляет не менее восьми для митохондрий животных и, вероятно, не менее десяти у дро«ей (Battey J. .Clayton ■ D. A. ,1980;Clayton D.A.,1984;Edwards. J.С et al.,1983;Lang B.F et al.,1983). В наших опытах по »¿учению электрофоретических свойств мтРШ хлопчатника было показано, что они разделяются в денатурирующих условиях на И дискретных полос, 4 из которых относятся к рРНН и тРНК митохондрий, а остальные полосы соответствуют, по-видимому, PIffi информационного типа (рис.21). Проведение тщательного анализа мито-хондриального генома растений затрудняет отсутствие четких генетических маркеров, а тага® отсутствие возможности изолировать дискретные виды индивидуальных мт-мРНК для картирования продуктов трансляции. Удобным методом изучения продуктов трансляции мито-хондрияльного генома является анализ белков, синтезируемых в опытах In vitro интактными митохондриями, изолированными из различных тканей растений. В основе этого леиит предположение, что мРНК не импортируются в митохондрии из цитоплазмы, а транслируются на собственных рибосомах. Исходя из такого предположения удается обнаружить среди продуктов митохондриальной трансляции 20-22 белка с молекулярными массами 8 - 70 кД и они били идентифицированы как: с молекулярной массой 58 кД - одна ив субъедшшц АТФ-аэы, 44 кД - рибосомалышй белок, 38 - 33 кД - I и 11 субъединицы цитохро-моксидазы, 8 кД - эквивалентна одной из субъединиц АТФаэы (Leaver C.J. et al.,1982, 1983).

Для анализа продуктов трансляции мт-мРНК хлопчатника была использована бесклеточная система сиптева белков лизата митохондрий пщеницы. Результаты проведенных экспериментов представлены на рисунке 22. Как видно из данных эдектрофореграмм«, продукты трансляции мтмРНК в 10Z ПААГ распределяются на 21 дискретную полосу. Наибольшая интенсивность включения меченой амкнсадслотн отмечена в полипептидах с молекулярными массами 57,53,46,43,41,30 и 17 кД,

Выявленная матричная активность мт-мР1Ш хлопчатника в бесклеточной бедоксинтезирующен системё дает всзмодиость для успешного ее применения при картировании отдеяьь»* белковых молекул и выделении индивидуальных урэяскрнптоо шиожшчртш-пого генома, а

Рис.21. Электрсфоретичеекое разделение тотального препарата мнтоховдриа-лыюй РНК хлопчатника в денатурирующем 2,5Х-ном агароаном геле, содержащем 6М Мочевины в' цитратиом буфере (А) и денситограмма негатива геля (Б).

Ркс.22. Радиоавтограф 10% ПМГ разделения меченых [ э5Ьметионином продуктов трансляции митсхонд-риальлой РНК хлопчатника, синтезированных в бесгае-точпой системе.

1- трансляционнач пэоба без мтРНК;

2- трансляционная проба при добавлении мтРНК (Шмкг/мл).

Отмечены молекулярные массы (ИД) полгагепгидов с наибольшей интенсивностью включения меченой аминокислоты.

. - 2Э -

..ткта яри и&учеюш их структурно-фуикдаональных характеристик.

Воегмтость получения методами генной инженерии больших ко-г,:г-:$стг ,;ДШ5 те&? ввяаов значение и для решения таких задач, как определение кервичкоЯ структуры в и, соответственно, белка, сэдчсгурн генов, изучение механизма синтеза пре-мРНК, активности гена ва рэьшх стадиях индивидуального развития и целого ряда других проблеа. Однако, троггекрияты митохондрнального генока висни* растени:"! в структурно-функционально!,1 аспекте мало изучены Цоачог 0.3. еЬ а1., 1683) и, в частности, на хлопчатнике работы на проводились, В сявзи с.чем, нами ( лл проведен синтез и клонирование нДНН тракскряптоз мнтохондриаяьного генома хлопчатника вида б. МгвиЬип I. (сорт 108-Ф).

Синтез к^ЦЯС на матрицах ктРНК, предварительно полкаделилпро-ваниых на 3'-концевых участках, осуществляли стандартны?! методом

<1.4.Синтез и клонирование кДШ транскркптов митохондрнального генома.

Рис.23.Радиоавтограф денатурирующего щелочного геля агапдзц после

гЬптптигшмппттииа Гы-Р1 иТШК

фракционирования кДНК.

А- пояснение маркеров (Н1пс1Ш-

Фрагменты ДНК фага я);,„ В- вторая цепь [а-^Р] транскркптов мктохондои генома хлопчатника.

[а-^р] кДНК митохондрнального

А Б

(Мап1аиз Т. оЪ а1.,1982). Размеры синтезированных кслекул варьировали в пределах 350-1000 нуклеотидов. Радиоавтограф 32Р-кЩСС, синтезированных в оптимальных условиях и фракционированных в денатурирующем щелочном геле агарозы, приведен на рисунке 23. Выход кДШ при синтезе второй цепи составил 20%. и было синтезировано 0,05 мкг кДНК. Полученные кДНК были проклонированы в

32,

F.. coli в составе плаэмидного вектора pUC 19 и получена представительная библиотек клонов кДПК, содерзказзя 2 -104 рекомбинаятньгк клонов.

Для идентификации ионов иДНК митохондрий хлопчатника были кспользовшш ДШ-ооида индивидуальных reíros' митохондрий энотеру' (COMI, C0XII, СОХ III; «,6,9-СЕ АТФаон; СОВ и генов PPÍÍK), любезно предстааяенше лам Е.В.Кувьмшш ОШСВ, РАСХН). Вдот-пйридива-адоиный анализ под} "Нкои библиотеки кДНК поглеивает, что число клояов, содеряэдга геиы pPIlR, несколько прсвьшзг чксло клонов, полученкчх из кРНК (COI! - 0, CE I ЦО - 6, CE II ЦО - 3, СБ Ш ДО - 7, сг-СЕ АТФази - 0,.6-СС АТФазн 5,9-05 AT-Sacu - 3, рРНГ. -30).

Полученная наш библиотека кДШ ичтохоядрий Хлопчатника может Сыть разделена, в соответствий с ия вадоопешгфйшюзтьв, па несколько классов с применением иядиоидуавьяг: молекулярных еоя-доз.

5.АШаЗ даЖНЧМВОСТИ СТОХОфГРКаШЮГО ГЕНОМА РАЧККХ ВИДОВ .ХЛОПЧАТНИК?, С КСПОДЪЗОЗАНИЕ» кД?К-3(Щ0В.

изученье молег^ляряо-генетическик механизмов эволюции н филогении высших растений является одной из актуальных оацзч генетики. Трудности при решении этой задачи связаны, в основном, с высокой суесеныо сложости организации генома выссик растений п с недостаточны;.! числом маркеров.

Новые перспектив« открываются в связи с возможностью использования клонированных последовательностей геномной ДНК и кДКК в. качестве нолокулярно-генетических маркеров, с помощью которых могло выявлять различия между генотипами.

В настоящей работе используя клонированные последовательности иДНК транскриптов генов СЁ 6 АТФаеы и рРНК (24,5S; 17S-5S) митохондрий хлопчатника наш была изучена-изменчивость его мято-' жондриаиыюго генома.

МтДНК разных видов хлопчатника (ß. herbece um L., G.arboreuro L., S.W rsu tum L., G. barbafdense L., 6. thurberl., 0. ral mondl 1.,

G.trllobum) переваривались рестрикционныш ферментами EcoRI и PstI. Фракционированные в 12-ном агарозиом геле рестриктные фрагменты ДНК переносили на нейлоновые мембраны и гибридизовьли с печеным («-32Р)кДНК-зондом. МтДНК всех изученных нами видов хлопчатника имела при гибридизации с зондом ?А,öS 3-4 Pst I-фрагмента и во всех видах данный зонд гибркдивовался с фрагментами имеющими

рввнери 4,05 и 2,84 т.п.п. При игг.н Pst Мш'гкяига да рвдсв ü,hortx~cíim L., G.hírsutum L. и e.raiv.ondii re гели ндентичнно структуры гибридизации. Сходные картин» р-.орицигшти наблюдался, также, ме:иу зидши O.barbsdensa L. и ß. thurtsrl. Вядо в.згЬогеип L. и 6. tri Icbum в отличие от остальных йзучовшас нами видов хлопчатника вивли ?ра"фрагментрние структуры гкйр'ддаз'щки. Однако ёолэе крупные фрагменты не были похож:».

Меявядоиой тмкморфиеи по длине рестрикцконных ^рапсентоа нт-рДКК таюсо выявляется при нспопьповашш зонда 17S-5S. pstl-^ipaf:.-»!!'..! да различных видов хлопчвгника ккео? от двух до трех nono свгкт гчбр-лдизоцян. Несмотря fía dui'-oy раснооброз*:; по размерам полос гибрлдппсции некоторым из дрионстряг-ую? илонтичкь» структуры пй;.'.:дизш»г.!. Так, "иди ü.teri>acc>:,it L., в. М mu tun L. к ü.rainc-ndll имели отадаговые т{охфрнп:-?асарша» структуры гкСрядиаагзт с размерами 0,С8, 1,56 п 2,34 т.п.и. i¡pn исследовании их с помогаю га.да 17S-E5.

Идентичный характер гибрядисапии лабжэдается, nnwo, мелду видами S. arboreum L. и G.thurberí. При исследовании с участием зонда 173-bs они имели по два одинаковых Pst 1-фрагмепта гибридизации с размерами 4,51 и 2,34 т.п.н. Сравнение структуры гибридизации вида fí. trlicbum с другими изученными нами видами хлопчатника с применением зонда 17s-6s показало, что этот вид глее? два одинаковых PstI-фрагмента с длинам! 6,68 и 4,54 т.п.н. характерными для видов Q.herbaceum L., G.hlrsutum L. и в. raitmndll, однако, фрагмент длиной 3,13 т.п.н. демонстрировал структуры гибридизации не похожие на любой другой вид.

EcoRI-фрагменты мтДНН различных видов хлопчатника демонстрировали с войдем СЕ 9 АТФагы трех- и четырехфрагментарные структуры гибридизации и во всех случаях данный зонд гибридизовался с EcoRI-фрагментом длиной 20,5 т.п.н. Диплоидные виды Q.harbacsua L., и в.arboreum L.имели по три EcoRI-фрагмента гибридизации, два ив которых имели одинаковые структуры гибридизации (20,6 и 11,82 т.п.н.), а их третий фрагмент был другим (tí.herbaceum L. - 4,92 т.п.н., G.arboreum L. - 5,2 т.п.н.). Гетраплоидпые виды G.hlrsutum L. и в.bar-badensa L. шел» по тр.: идентичных фрагмента гибридизации с размерами 20,5, 11,82 и 1,92 т.п.н., которые различались между собой по одному сигналу гибридизации. Если сравнивать структуры гибридизации диплоидных и тотраллоидннх видов, полученное с помощью зонда 03 9 АТ-Тачц, то г/тру ливавтев, что

дипловды имеют по три ЕссЛ1-фрагмента гибридизации, тогда как тетраплоиды по четыре.

Исключением является вид С.Ьг11оЬит I, , наряду с гетраплоид-ными видами он имеет четыре ЕсоМ-фрагменга гибридизации.

Фрагменты мтДНК семи разновидностей хлопчатника, гибридизую-щиеся с вышеукаванными кДНК-вонд&чи, представлены в табл'.2. Как видно из табличных данных они имеют от 8 до 11 гибридизующихся фрагментов. Анализ гибридивующихся фрагментов ДНК показал, что тетрапловдный вид в.МгБиЬит £,. по структуре гибридизации близок

Таблица 2

Количество фрагментов митохондриальной ДНК семи разновидностей хлопчатника, имеющих гомологию с индивидуальными кДНК-транскриптами митохондриального генома ' (СЕ 9 АТФаэы, 24,53 и 17Б-Б3 рРНК)

Виды Ghe Ваг Ohl Gba Gth Ora Gtr

ehe 10 5 10 7 6 g 7

Gar 8 5 5 8 4 4

г .1 11 7 6 10 8

Qba 11 7 6 7

Gth 9 5 5

Gra 10 8

Gtr 10

Ghe - G.berbacem L., Gar - G.arboreum L.,

Shl - Q.hlrsutum L., Gba - G. barbadense L.,

Gth - G.thurberl. Ora - G.ralmondll, Gtr - G.trilobum.

к диплоидным видам G.herbacoum L., G.ralmondll и G.trilobum L. Другой тетрапловдный вид ß.barbadense L. по структуре гибридизации оказался более близким к видам G.thurberl L. к G.trilobum L. Сопоставление данных по гибридизации видов G.hirsutum L. и G.barbadense L.показывает, что в происхождении митохондриального генома тетраплоидов в качестве цнтоплазматического донора участвуют, по-видимому, митохондриальные геномы разных диплоидных видов. К аналогичному выводу пришел Wendel J.F. (1989), изучавший блот-глбрндизационным анализом происхождение хлоропластного генома тетраплоидных видов хлопчатника.

Известно, что цитоплазматический геном большинства высших

растений наследуется однородитэльски через яйцеклетку, и только в исключительных случаях осуществляется генетическая передача по отцовской линии или от обоих родителей. Как осуществляется данный широко используемый в генетических экспериментах процесс у тет-раплоидных видов хлопчатника?

Для выяснения этого вопроса нами были изучены, в сравнительном аспекте, структуры гибридизации ытДНК тетрапловдных гибридов хлопчатника ((3, МгзШит I., 103-Ф к в.ЬаЬ&Зепзе I., С-6037) и та родительских форм при помощи зонда СЕ 9 АТФазы. Во всех изученных нами гибридных поколениях Рг и Рз) структуры гибридизации

были идентичны материнскому родите.то (в. hlr.suЬит I., 108-Ф). Это подтверждает тот факт, что у изученных гибридов хлопчатника мито-хондриальный геном наследуется строго по материнской линии.

Из вышепредставленных данных можно сделать заключение о том, что геном митохондрий хлопчатника, несмотря на консервативность среднего нуклеотидного состава и сходства з структурной организации, претерпел независимую межвидовую дивергенцию нуклеотвдннх последовательностей. В целом, степень гомологии мтДНК коррелирует с систематическим положением изученных видов хлопчатника, установленному по цитологическим данным (Абдуллаев А.А.,1974).

Обнаруженный нами полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов на уровне генов рРНК и СЕ 9 АТФазы открывает возможность использования этих явлений в качестве молекулярно-генетических маркеров при анализе гибридных генетических материалов и решения, также, некоторых вопросоз систематики и-эволюции хлопчатника.

ВЫВОДЫ

1.МтД!Е хлопчатника по размеру и ряду физико-химических характеристик существенно отличается от ДНК ядер и хлороиластов, что свидетельствует о наличии органоид,ной специфичности в структуре ее /ЦК.

2.Электронно-микроскопические исследования препаратов мтДНК хлопчатника показали, что митохондриальный'геном, пак и геномы других растений, представлен гетерогенной популяцией субгеномных ДЖ с размерами от 2,4 до 2071 т. п.п.

3.ЫтДПК изученных на-.ш шести разновидностей хлопчатника проявляет ущр,гадальный характер распределения в градиенте плотности хлористого цезия с плавучий плотностью от 1,705 до 1,703 г-см"3, что соответствует 45,0 и 45,0 мол% ГЦ-пар.

4.Анализ кривых плавления л кинетики реасссциации митохондриаль-ной ДНК показывает кинетическую однородность структурных компонентов, составляющих митохондриальный геном. Размер генома, рассчитанный на этой основе, равен 20?1 т.п.к.

Б.Кроме основной ДНК в митохондриях хлопчатника обнаружены две миникодъцевые ДНК с размерами 6,5 и 2,4 т.и.н. На митохондриальный геном размером около 2071 т.п.н. приходилось 2-3 кепки р6№п1 и рШяЛ, 4-6 копий рбНяй к рЗйт.Е. Мииикольцевая ДНК, рй'яй была прокдонирована, определена ее нунлеотидная последовательность и построена физическая карта. Компьютерный анализ последовательности рбНп2 выявил многочисленные прямые, обращенные повторы и палиндромные последовательности. Молекулярной гибридизацией р6№г.2 с ДНК ядер, хлороиластов и митохондрий установлено, что яДНК и мтДНК хлопчатника содержат последовательности, обладающие заметной гомологией с рОНт2, тогда как в хпДНК такие последовательности отсутствуют, Сравнение нуклеотидиых последовательностей р0№п2 с банком генов не выявил определенной корреляции, связанной с возможной функцией ппДНК.

6.Выделены рибосомы и рРНК митохондрий хлопчатника и изучены их фивико-химические свойства. Установлена органоидная специфичность рибосом и рРНК методами физико-химического анализа. На основе отдельных субъединиц БЗрРНК синтезирована кДНК, определена ее нуклеотидная последовательность, построена физическая карта и .модель вторичной структуры. При сравнении, нуклеотидной последовательности мт-5БрРНК хлопчатника с банком генов выяеле-

ка ЕЫ^окаа гсмолсглл (.93,31) с бЗ;РНК п с^ад

рил (СО,£>-63,С.) с итголлас{.:8Т1{чес!П!:ш бЗрР121 лекоп-рга бпкто-рдахьгдо клеток, что сг-.аано, во-вщт'оуу, с орггоодшоЛ (.-¡.'лщ-«¡•ичноетю К>р?Н:< митохондрий ьнсшпг растений.

7. агэстрсфорегрйег*.*« шатка су>?®рисй мтРШ1 илоз^атиипа а д-мм-яуригтзд&и ргароокс:« гелл шявпз 11 год ос, .та-

ректэргих п;>з яг'ЛШ рпо штельнш: оргатшмоэ. Матричная акгиз-кссть }тг-м?1К хлопчатника вшв.'.с:и* с использование:! йееклетсч-нсл :злслс::нтез:;ру:;г?л скст?ш лнвап З'тохоидрий пг.оннг:;. ?тектро'М-?'г:*,ч'Ский а;!ь.теэ полцзлл, что продукт синтеза р. ^ ц^-ЛЛвтся на п ллекретпул полосу л 10'£-ком ШАГ.

Э.На матриц" оуучарясА шРКИ «скчмчпта сгмтеиплчапа кПТК л прскдоаироваиа ка бозл плаемцдясго ьекторл НЮ 19; ¡млул-ла кдэ~ нотека, содерлл:цая 2« 1С4 лесавлолкчх кяонол. Ввделояы рекс;:«'.:1-яанткиэ клони, содор:\чггэ пуклеотидшо яоолидовг.ттаисктти гопа 02 б АТСазы митохондрий хлопчатника.

9.Анализ структуры блот-гибридизации РзИ- и ЕсоШ-фрагментоа мтДНК диплоидных и тетраплопдных видов хлопчатника с ¡гДИК-л; садами генов пв 9 АТФази и рРКК позволпет заключить, что ци'гоц-лазматическии донором при происхождении тетраплоидпых видов являются митохондриальнне геномы разных диплоидных видов.

' Выявлено также, что митохондрнальный геном в гибридных поколениях хлопчатника наследуется строго по материнской линии.

10.Выявленные структурные и функциональные особенности мигохонд-риадьного генома хлопчатника позволят проводить дальнейшие, более глубокие исследования механизмов перестроек и функциональные взаимосвязи этих перестроек с процессами реализация генетической информации, кодирования и координпрованностл в работе ядра, жлоропластов ,ч митохондрий »слеток растений.

РЕКОМЕНДАЦИЙ

1.Разработанные нами методы выделения митохондрий из проростков хлопчатника, полностью лишенных примесей ядер и хлоропластов, можно рекомендовать для получения митохондрий других растений, богатых как и хлопчатник фенольными соединениями, полисахаридами, пигментами, крахмальными зернами и т.д.

2,Охарактеризованные нами полностью миникольцевые ппДНК хлопчатника можно использовать для конструирования векторных систем, необходимых при трансформации растительных организмов.

3.Полученные рекомбинантные клоны кДНК, генов СЕ 9 АТФазы, 24,63 и 173-53рРНК могут быть предлодены для использования в генети-ко-селекционной практике в качестве молекулярно-генетических маркеров.

4.Модифицированные нэлш методы получения функционально-активных, дискретно разделяющихся при электрофорезе в агарозном геле мРНК "итохондрий хлопчатника и способ получения бесклеточной системы синтеза белка ив лизата митохондрий пшеницы, дают возможность■ для картирования продуктов трансляции митохондриального генома. Это может, также, быть использовано в качестве модельной системы при изучения экспрессии популяции мРНК в митохондриях высших растений в онтогенезе, а также воздействия различных биологически активных веществ и экстремальных факторов среды.

Список работ, опубликованных по томе диссертации

- 1. Юсупов Т. Сравнительное исследовадие ЛИС клеточных структур хлопчатника методом ультрацентрифугирования.//Тез.докл. I респ.кокф.МУ "Вопр.бот-их исследований в Узбекистане".-Ташкент ,"Фан",1977,с.160-161.

2. Ибрагимов А.П..Исмаилов Э..Усыанов Т. А. .Ибрагимова Э.А., Рахметов Н.,Юсупов Т. Некоторые физико-химические свойства ДНК при развитии и росте хлопчатника.//Узб.биол.s.-1977,1,с.64 -65.

3. Юсупов Т..Ибрагимов А.П..Рахматов Н.,Юсупов М.И. Исследование ДИК хлопчатника в градиенте плотности хлористого цезия.//Узб. биол.ж.-1977,5, с. 01-82.

4. Юсупов Т..Ибрагимов А.П..Рахматов Н. Исследование некоторых свойств ркбосомальных генов хлопчатника.//Гез.докл.Всес. симп. "Мол.мех-ш ген-их нроцессоа".-Москва, 1979, с. 38.

6. Юсупов Т..Рахматов Н..Хамидова 3..Ибрагимов А.П. Распределение ДНК хлоропластов хлопчатника п градиенте плотности CsCl и EthBr-CsCl.//Узб. биол.и.-1900,6,с.63-64.

6. Юсупов Т..Ибрагимов А.П..Рахматов H.A. Некоторые физико-химические свойства ядерной и хлоропластной ДНК хлопчатника. // Узб.биол.м.-1980,4,с.6-7.

7. Юсупов Т..Ибрагимов А.П..Рахматов H.A. Изучение структурной организации ДНК митохондрий хлопчатника.//Тев. докл. IV съезда ВОГИС,ч.5,с.65.-Кишинев,1982.

Ö. Юсупов Т. .Рахматов H.A. .Ибрагимов А.П. Рестршщнонный анализ хлоропластов ДНК хлопчатника.//ДАН УзССР.-1983,2,с.46-4В.

9. Юсупов Т.,Ирисметов А.А..Рахматов H.A., Ибрагимов А.П. Получение чистых препаратов митохондриалыюй ДНК из проростков хлопчатника и некоторые данные о ее структурной организации .//Узб.биол.н.-1984,с.6-8.

10. Рахматов H.A..Юсупов Т..Ибрагимов А.П. Рестрикционный анализ хлоропластной ДНК хлопчатника.//Физиология растений.-1984, 31,2,с.312-316.

11. Юсупов Т..Ибрагимов А.П.,Рахматов H.A..Тлеуов Х.Р.,Хаз-ратов П.Р..Ирисметов A.A. Исследование некоторых свойств рибосом митохондрий хлопчатника.//Тез.докл. конф.ЫУ и Сп.АН УзССР.-1984,0.11-12.

12. Юсупов Т..Ибрагимов А.П..Рахматов H.A..Ирисметов A.A., Хазратов П.Р. Некоторые физико-химические свойства митохондриаль-

- 53 -

ной ДНК хлопчатника.//Там ;::е, с. 9.

13. Юсупов Т..Ирксметов A.A. .Xaspa-roti П.Р.Дгвров Б.Р.Анализ структурной организации ядерной и митохондриальной ДНК каллусов пыльников хлопчатника. //Всес.'конф.ЫУ к Ся.г.Махарадве-Анасеу-ли.-1985,0.114.

14. Юсупов Т. .Ибрагимов А.П. .Мувычешсо Н. Клонирование реком-Оинантных плазмвд, содержащих структурные последовательности ДНК митохондрии хлопчатника.//Кокф.биохим.Ср. Азии и Кае. - Ашхабад, 1985, 20-21.

16. Юсупов Т..Ирксмстов А.А..Рахматов H.A..Ибрагимов А.П. ' Получение чистых препаратов ДНК клеточных органоидов хлопчатника и некоторые данные об н:с структурной организации. //Физиология и биохимия культ.раст.-1985,17,с.157-162.

16. Ибрагимов А.П..Рахматов H.A..Юсупов Т..Ирисметов А.А., Хавратов П.Р. Структурная организация хлорппластиой и митохондри-альной ДНК разноплоидных видов хлопчатника к их гибридов.// Тез. V-ВБС.-Москва,1986,с. 355-356.

17. Юсупов Т.Дазратов П.Р. .Ибрагимов А.П. Выделение и анализ некоторых структурных особенностей рРНК митохондрий хлопчат-йика.//ДАН УвССР.-1986,5,с.40-41.

18. Рахматов H.A..Юсупов Т..Ибрагимов А.П. Изучение структурной организации хлоропластной ДНК у различных видов хлопчатника. //Пригчад.бнохим. и микробиология.-1986,22,1,с. 118-125.

19. Юсупов Т. .Рахметов H.A.,Ирисметов A.A. .Камалов Н..Хазра-тов П. Р. Организация генома митохондрий хлопчатника.//Тез.V съезда УзОГИС.-Ташкент,1986,с.42,

20. Рахматов H.A..Тлеуов А.Р..Юсупов Т.,Ибрагимов А.П..Хавратов П.Р..Ирисметов A.A. Изучение физико-химических и функциональных свойств рибосом митохондрий хлопчатника.//Узб.би-ол.ж.-1987,2.с.5-8.

21. Юсупов Т..Ирисметов A.A..Усманоэ P.M..Камалов Н. Молекулярные подходы к геномному анализу хлопчатника вида G.hirsvtum и его мутантов.//V сьевд ВОГИС.-Москва,1987,с.324-325.

22. Юсупов Т.,Гузалова А.Г..Ибрагимов А.П. Обнаружение и характеристика митохондриальных плаомвдоподобных ДНК хлопчатника. //VII Всес.симп.Мол.мех-мы ген-их процессов.-Москва, 1990,с. 187.

23. Юсупов Т. .Гуаалова A.F. .Егашкн С.М. .Ибрагимов А.П. Клонирование кДНК транскриптов митохондриального генома хлопчатника. //Там же, с.188.

24. Юсупов Т..Камалов Н..Ибрагимов А.П. Молекулярное клони-

- о9 -

рованке китохоидриалыюй Ш хлопчатника.//Всее.оимп. "Геио'Ж'Л развития".-Ташкент,1990,о.167-168.

25.Khazratov P.R..Yusupov Т.,Jayashaikar R. Cloning of cotton mitochondrial gsnoma transcript s.//Abstr.of th& Svw.on (ion.Roscarch.-Hew DohH,1990,p.761.

26.Khazratov P.R. .Yusupov T.,Jayashankar R., Ibragimv A,P. Characterization of cotton mitochondrial gonc^e transcripts. //Abstr.or the Symp.on Gon.Research.-New nehll,1990,p.740.

27. Юеупст; Г.,Каналов К. .Ибрагимов Л. П. Структурно-фу шодп> -•налънэя характеристика иигохондриалыюй ДНК радио.чутантг-з хлопчатника и Hi исходник форм./'/Тев. V конф.Снохим-оо Ср.Ааии и Кал. -Таисент,Фан, 1991 ,с. 108.

28. Юсупов Т. .Наурузбавва Р. .Ибрагимов "..П. Быстрый н эффективный метод выделения митохсядриальноя ДИК из хлопчатника.//Там де. с.207.

29. Юсупов Т..Курбанов А. Клонирование последовательностей митохондриалъной рДНК хлопчатника././Там же, с.259.

30. Юсупов Т. .Наурузбоева Р.Дазратов П.Р. .Ибрагиыов Л.П. Обнаружение и характеристика шгохондриальиых плазмидоподобш« ДШС хлопчатника.//Биополимеры и клетка.-1992,8,3,с.19-23.

31 Юсупов Т..Камалов II. .Ибрагимов А.П. Изучение структурных особенностей 5SpPHli митохондрий хлопчатника.//Тез. 2 конф.био-хим-ов Узбекистана.-Ташкент,1993,с.172.

32.Yusupov T.,Kamalov H.,Yuldashev F.S.,Jayashankar R.,Ibra-glraov A.P. Primary structure or cotton mitochondrial iiSrM.'A. //Abstr.of the Inter.Corn", on Biotech, in Agrlcul. and Forest.-New Pehll,1993,p.6.

33.Yusupov Т.,Mauruzbaeva R. .Yuldashev F.S..Jayashankar R. Nucleotide sequence analysis of cotton pGltai? mitochondrial plasmid-like D!IA.//Ahstr.cf the Inter. Ccnf. on Biotech, in Agrlcul. and Forest.-New Dshli,1993,p.6.

Юсупов Тахпр

ÍK3A ЪМТОЖЩРИЛСИ ГЕНОШНИНГ СТРУКТУРА©®! УРГА1Ш

Ыазкур шда гуза митохондриясининг ДНКси ва о^сил синтез ки-лусчн тивкминипг асосий таркнбий кисмларини структуравий хоссала-рн ургшшлди.

Fyoa митохондрисидаги ДНК увитшг фиэик-кшовий ва структуравий харвктерисгикасн Оплан ядро ва хлоропласт ДНКсидан анчагнна $арк килади. У ¡¿071 м.к.н. улчсмга, 47 мол2 ГЦ-куфт асссга зга булиб, узида йулдош ДЖни ^исыяариип сшмамайди. Хар хил турли гуоанинг митохондриасидаги ДНКнинг сузка тириолиги (1,705-1,708 г-сы3) ва spun томператураси (68,1-63,4°С) нуде киста оркалшущ уогаради. Ушбу ДШнкнг кьнетик реаесоииация эгря чизири ва нуклеотидлар кетыа-кетлиги гомологилсн урганилгалда митохондрия гено-ыкнинг структуравий тузилишк за генотипик гомогенлипши Gosi'yplUR авлоди доирасида куда я^инлигл ьрайд ышинди.'

Шунинг билан бирга асосий ДНКдан таакари Fysa митохондркяси-. улчаылари 6,6 ва 2,4 м.я.н. зга булган иккита кичик хал^асимон ДНК борлигн акгамаиди. pGHm2 плавмидасимон ДНКсини нуклеотидлар кетма-кетлиги атпушнди ва компьютер тахлили ердамида уиинг ту лик физик харктаси тувилди. pGHm'2 ДНКси 68,2 ыол% ГЦ-жуфт асосга зга булиб, Fysa ядроси (37,0 мол%), хлоропласт (37,9 мол%) ва ыито-яондрияси (46,0 молХ) ДНКсининг нуклеотид асосларвдап катта фарк гаыади.

Руза митохондру.яси рибосомасининг физик- кимёвий хусусизтла-рини урганиа мараёнвда унинг седиментация коэффициенти - 77,4S ва. сувиш тири8лиги (1,Б8 г ■ см3) эванлиги аникланди. Электрофорез■ тахлили рува митохондрияси рРНКсининг 1,54; 0,74 ва 0,3 ВД моле-кулпр никдсрга эга булган холда дискрет чизиксимон таксимяанмзмии курсатди. Митохондрия рРНКсининг нуклеотид туэюшши хшуэдаги маъ-лумот, унинг цитоплазма ва хлоропласт рРНКсидан гкуда кам фарк t^í-лишини курсатади.

ББрРНК асосвда кДНК синтез 1$илинди. Хамда унинг нуклеотидлар кетма-кетлиги аникланди, физик харитаси ва иккиламчи структура-синмиг модели тувилди.

Митохондрия МРНКсининг трансляция маз^сулоти 10%ли ПААГ электрофорезвда 21 та дискрет кисмга булинди. Нишонли аминокисло-таларнинг асосий кисми молекуляр мш^дори 57,53,46,43,36 ва 17 кД

булгвн полкпептидяарга урнаикш кайд фшшди. й -1Ü4 та узаро бор-лик булмаган рекомбинант клонлар' сакловчи кичрри дара-кали банк олннди. Улардан кейииги ензливларга 24,ES, 17S-5SpPHK ва ATSasami 9-чи кичик булагн генларияи сагровчп клонлар оаралалди. Бу кДШС-аоидларн ¡jap хил тува турлари ва гпбридларида уибу генлар-нш:г РБУП-ни тахлил килгавда МРЫ сифатида нялатилди. Гузашшг дип-лоид ва тетраплойд турлари митохондриаси ДНКсининг Pstl ва EcoRl булииаринм кДНК-зоидгарм, яъни АТФазанн 9-чи кичик булагн ва pPlffi билан олкнган блот-гкбридиологик структурасини тахлид |<илкш тетраплойд турларинн келиб чиюшида донорлик вазифасини >рр >:пл диплоид турлар бвяаргашшгшш курсатди. Шушшгдек ?узаиинг гибрид овлодларида митохондрия генеми есатъкй оиалкк яагасий йуналиши буй-лаб боргсга аннадандц.

фикнган млмий г.вланкшлзр натигасида фгйидаги музрм нл-мий-амалий ахамнятга зга Сулган тавсиялар берилди:

- Руза уснмтасидан ядро ва хлоропласт ^олдикларидан з^оли булгап митохондрия ачратиб опт усулкни гуэа сингари фенол бирпк-малари, полисахаридлар, пигментлар ва бошка шунга ухшаз моддалар-га Сой булган усимликлардан митохондрия олиига тавсия гашш мум-кин.

- Рузанинг тулик^ структурам таърифлаб берилган плавмчдаси-мои ДННсини усимлик организми митояондриясини трансформация кн-лишга зарур буладкган тивимни я^атишда ишлатиш мумккн.

- АТФазаки 9-чн кичик булагн, 24,6S ва 17S-5SpPKK геиларидан олингаи кДНН рекомбинаит кяоиларидан генетика ва селекция -амалкй-тида молекуляр-генетик маркер скфатида фойдалаииш мумкин.

- Руза митохондриясидан функционал актив мРНК олишнинг тако-«иллаштирилган усули ва бурдой митохолдриясид&ч хуканрасиз океил синтез (риии тизимини аиратиб олиа митохондрия геноминииг трансляция маз{сулотлврини хариталаатиркига имкон беради. Бу ускмлкк йРНКси популяцияси экспрессиясини онтогенез жараёнида, шункнгдек турли биологик актив моддадар ва мухитнинг экстремал ошьяларц таъсирида.уртнтага модель тивши Сулиб хизмат 1Шдкеи мумкин.

Yusupov I.

STUDY OF COTTOM MITOCHONDRIAL GENOME.STRUCTURE

The special features of DMA structure and main components of proteinsyntheslslng system of cotton mitochondria have been studied. DNA of cotton mitochondria on Its physical and chemical and structural characteristics significantly differed from DMA of nuolea and chloroplasts. It h'vi a size of 2071 bases, 47% GC-palr base end hadn't satellite DNA components in the composition. Buoyant density (1,705 - 1,706 g-cm"3) and melting temperature (88,1-83,4°C) of mitochondrial DMA of different cotton species varied in very limited intervals. Analysis of kinetics cf reassociation and homoLcgy of nucleotide"sequences of mDNA of different cotton species indicated to the close structural organization and significant genotyplo homology of mitochondrial genome within Gossyplum genus.

Besides the main DNA in cotton mitochondria there were founded two mlnlcircular DNA types with sizes 6,5 and 2,4. Initial structure of plasmld-llke DNA p6Hm2 was determined and was rr^do by the computer analysis.

• pGHm2 DNA has 58,2 rnol% GC-pairs of sequences, which greatly diiffered from the composition DNA sequences of nucleus (37.OX), chloroplasts (37.9 mol%) and mitochondria (4.6.0 mol%).

While studying physical end chemical characteristics of cotton mitochondria ribosomes their coefficient of sedimentation (77,4S) and melting density (1,58 g-crrf3) were evaluated, it was revealed by electrophoretic analysis that mitochondrial cotton sRHA were spread on discrete bands with nolecular weight 1,54; 0,74 and 0,30 №.

Data of nucleotide rRNA composition of mitochondria were testified to insignificant unessential differences in the composition of rRNA bases of cytoplasm and chloroplast.

On the basis of 5SrRNA cDNA was synthesized, its nucleotide sequence was determined and the physical map and model of secondary structure was made.

Mitochondria's translation products in Rf!A was divided by electrophoresis in 10% PAAG into 21 discrete bands. The largest of targed aminoacld was noted In polypeptides with molecular

t3s58s d7, £3, 46, 43, 41, 30 & 17 v.d.

There was obtained representative bank containing 2 •iO'1' independent recombinant clones." There v;oro chosen tha clones for tha further analysis for detecting insertions of genes 24,53, 17S-6S and ATPsse 9 CE. Those cDNA-prcbes »ere used as IO for the FDRF enalysls of these genes of different cotton species end tholr • hybrides. Analysis of the structure, of Pst-I end EcoRI-fragments by h 1 c:-hybr 1 d 1 sat 1 on of. mitochondrial DMA of diploid end tetraploid cotton species with cDNA-probes of AT Pas-.) CE 9 and rRHA allows to conclude that tho cytoplasmic donors in the origin cf tetraploid species wero the mitochondrial gcnc?»s of different diploid spades. It was also revealed that mitochondrial gencme in hybrid cotton generations Is inherited strictly on maternal lino.

On tho basis of our conducted scientific Investigations sane rocoirnvsndations wero suggested '«?hlch have important fundamental and applied significance:

- carried out method for extracting the mitochondrll from cotton seedlings contpetoly without admixtures nuolaa and chloroplasts which may be recommended for the obtaining mitochondria of ether plants, which are as rich in phenol compounds, polysaccharide, pigments as cotton plant. •

1 characterized fully mDNAs of cottcn may to applied for constructing cf vector 'systems, which are necessary for transformation of mitochondrll of vegetable organisms.

- experimentally obtained recombinant cDNA clon&s, CE 9 genes of ATPase, 24,5S and 17S-53 rRHA may be proposed for application In genetic and selection practices as molecular and genetlcal marker.

- modlficated methods for obtaining functional and active mRNA of cotton mitochondrll and the way for receiving unclustering system of protein synthesis from lysate of wheat mltochondrii give a possibility for mapInj the mitochondrial genome translation products. This may be also applied as ti.s model system for study of expression of raRNA population in nitochcndril of higher plants during the ontcgenesls end influonci* cf various biologically

active substances end extreme.environmental factors, too.

~_____