Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ структуры гена 9 СЕ АТФазы митохондрий хлопчатника

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ структуры гена 9 СЕ АТФазы митохондрий хлопчатника"

АКАДЕМИЯ НАШ РЕСПУБЛИКИ УЗБШЮТАН Инотитут генетики

Р Г б од

1 2 СЕН Г''

На правах рукописи УДК 5Т7ДЗЗ»57аЖ7347:633.&1

ГУЗАЛОВА АНАЩА ГЕОРГИЕВНА

МОЛЕКУЛПРНО-ГЕНЕТИЧБСЖИЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ГЕНА 9 СБ АТФази МИТОХОНДРИЙ ХЛОПЧАТНИКА

Специальность 03,00.26 - Молекулярная генетика

Автореферат

диооертащ^ на соискание ученой степени ^анд^ата биологических наук

'Ташкент - 1994

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики хлопчатника НПО "Биолог" Института экспериментальной биологии растений АН Республики Узбекистан в 1988-1991 гг.

Научные руководители:

чл.-корр.АН РУз, заслуженный деятель Науки РУз) доктор биологических наук, 'Профессор А.П.ИБРАГИМОВ, кандидат биологических наук Т.Ю.ЮСУПОВ |

0$ид иа льны е опп онента:

доктор биологических наук А.С.РАСУЛОВ, каадвдат биологических наук А.ТА1ШШ1АТ0В

Ведущее учреждение: Казахский государственный университет

Защита состоится " ^" С&'Г^-грЛ 1994 г, в * часов на заседании Специализированного совета/д.015.70.21 по яриоувдению ученой степени доктора биологических наук яри Институте генетикй АН Республики Узбекистан по адресу: 702151, Ташкентская область, Кибрайский ра!!он, п/о Юкори-Юз).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института генетики АН РУз.

Автореферат разослан "{йл'1'-1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук /А^'/1'^ Ш.ЮНУОХАНОВ

и.»

. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Существование в клетках растений трех генетических систем - ядерной, хлоропластной и митохондриальной ставит вопрос об участии каждой из этих систем в формировании свойств и признаков организма в онтогенезе.

Изучение молекулярных механизмов экспрессии в митохондриях растительных организмов показало, что генетическая система митохоцд-г рий отличается как от ядерной, так и от хлоропластной своеобразием структуры генов, процессов репликации, транскрипции и процессинга первичных транскриптов. Помимо этого, в ходе изучения выяснилось, что митохондрии ответственны за целый ряд характеристик несут Гены устойчивости'к антибиотикам и патотоксинам, устойчивость к стресс-факторам, обладают генами адаптационной изменчивости, ЦМО (Dixon et al. ,1982; Levinga O.S. 111,1983; Menczel et al. ,l9bl).

В литературе встречаются работы, где представлены данные, что митохондриальный геном кодирует синтез всех митохоццриальных рРНК, ряд субъединиц цитохромоксидавы, тРНК, ферменты сплайсинга и ген- ■ АТФазного комплекса, обеспечивающие перенос электронов через мембрану, синтез и перераспределение энергии в клетке.

Кроме этого, гены ферментных систем, проклонировав, можно использовать в качестве молекулярно-генетических маркеров для выявления сложных перестроек в структуре генома, происходящих при отдаленной гибридизации на уровне геномов органелл. Однако геномы органелл не обладают в клетке абсолютной автономностью, а во многих случаях'между функциями генов органелл и ядра наблюдается явление кооперативное?^' Более того, обнаружена общность определенных нуклеотидных последовательностей между ядерной ДМ и ДНК органелл (Stern et amandes ,1982; Gellisaen G. , et al. ,1963; Handes H.G. f et el^i983), и с этой точки зрения, тем более ин-' тересно изучение гена 9 GE АТФазы, так как у одних организмов, животных, дрожжей он кодируется ядерным геномом, у высших растений - митохондриальным геномом. и.сгазва' имеет обе и ядерную и митоховдриальную копии гена 9 СЕ АТФазы.

Все перечисленные функции митохондрий важны и в практическом отношении. Для этого прежде всего необходимы сведения о структурной организации и принципах функционирования белоксинтезирую'щих ) генов митохондрий, чему и посвящается данная диссертация. 1

Цель и задачи исследований* Настоящая работа посвящена изучению структуры гена 9 СЕ АТФаэы митохондрий хлопчатника. Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

- синтез и клонирование к ДНК, получение банка генов транскрип-тов митохондриального генома хлопчатника, анализ банка ыитохондри-альными генами-зондами СОВ (апоцитохромов), 9 СЕ А'ГФазы и СОХ I;

- определение нуклеотидной последовательности гена У СЕ А'Йази Митохондрий и построение его рестрикционной карты;

- проведение сравнительного анализа нуклеотидной и аминокислотной последовательности гена У СЕ А'ГФаэы митохондрий хлопчатника

с аналогичными последовательностями про- и эукариот;

- определение копийности гена У СЕ А'Шазы митохондрий хлопчатника;

- изучение полиморфизма гена 9 СЕ АТФаэы митохондрий хлопчатника.

' Научная новизна. Впервые из библиотеки генов митохондрий хлопчатника были вьщелены транскрипты гена 9 СЕ АТФазы. Но результатам блот-гибрццизации рестрицированной кДНК, содержащей ген У СЕ А'Шазы Оыдо получено несколько транскриптов этого гена, различной молекулярной массы. Гибридизация транскриптов с мРНК подтвердила наличие 8 транскриптов гена 9ШЗ ЛХФаоы.

Изучение первичной структуры гена 9 СЕ АТФазы, показало наличие семи ОРС, каждая из которых синтезирует свою аминокислотную последовательность.

При анализе аминокислотой последовательности гена УСЕ АТФазы было обнаружено отклонение от митохондриального генетического яода.

При изучении нуклеотидной последовательности гена У СЕ А'1Фаэы была выявлена последовательность Шлйна-Дальгарно, необходимая для присоединения мРНК к рибосомам.

Полученные результаты имеют теоретическое'значение в изучении генетического кода митоховдрий хлопчатника. Изучение копийности Бе1 I- фрагмента гена У СЕ АТФазы митохондрий показало тандемкое расположение гена в митоховдриальном геноме хлопчатника. Какой-ли-Оо корреляции между количеством копий гена 9 СЕ А1£азы митохонд-(-ий и плоидностью хлопчатника не обнаружено.

Синтез и клонирование кДДК транскриптов митохондриального ге-

н{ма хлопчатника,выделение ц определение первичной структуры гена

9 СБ АТФазы,синтезируемого им белка позволил» получить полезную как в теоретическом,так и в практическом отношении информацию об особенностях структуры генетического кода митохондриалыюго ге~

■ нома высших растений.

Апробация работц..Материалы диссертации докладывались на УЛ Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов в г.Москве 11990 г.), 1 Республиканской конференции молодил ученых Узбекского общества генетиков АН УзССР в г.Ташкенте (1990 г.; на заседании лаборатории молекулярной генетики хлопчатника ИН31Р НПО "Биолог" АН РУз, на заседании научно-технического Совета по проблеме "Генетика и селекция хлопчатника" ИНЭНР Ш10 "Биолог" All РУз (1993 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 работу.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Рабата изложена на 1J26 страницах машинописного текста, содержит б таблиц, иллюстрирована 16 рисунками. Список цитируемо, литературы насчитывает '¿Ш ссыпок.

ЭКСНЬРШШ'ШЬНАЯ НАСТЬ

Объектом исследований служили самоопшенные семена сортов 108-&, АН-40У (G.hirsutum I. ) J С-9065 ( й.ЪааЪайепве L.) > гибридов 108-Ф х C-90&J Pj и G.raircondit: „а. thurberi i C-?u59 <G.arbo~ reum L. ); C-7090 (G.herbaceua ь. ). Клеточные органеллы выделяли согласно методике Т.Ю.Юсупова и др.(1985) и Hsu а.ь. tliullin (1988).

Выделение и очистка митохондриальной ИНК. Корешки 2-х дневных проростков, выращенных в термостате, предварительно промешали в .растворе 1% тритон х 100, измельчали жидким азотом в буфере G , . содержащем 1,2 M KaOii и 0,05 М трио-НСii , рН 8,0 (3 мл.буфера>Д I гр.ткани).

Гомогенат ^иьтровали через два слоя капрона и цещоилугисовали:

10 мни. 1000 об/мин.при -+4 С (К-23, Германия) для освобождения от клеточных обломков,ядер и хлоропластов.Ооадок митохоидрий суспендировали в буфере Р, содержащем 0,3 М иашшт, 0,05М tpuc—KOi.pII 7,2; '5М Mg Gig, 50 мг/мл. ДНКазц; и инкубировали I час при +4°С. К'суспензии добавляли буфер о и центрифугировали 12000 об/мин. I5 мир,

- б -

Промывку осадка осуществляли 3 раза. Полученные митохондрии суспендировали в буфере L , содержащем 50 мМ трис~НС1 , рН - 8,0;, 20 мМ ЭДТА, 2% саркозилат натрия и инкубировали 30 мин, при 37°С, затем 30 мин при 65°С. По окончании инкубации к раствору лизата добавляли равное количество сухого CeCl и инкубировали I час при +4°С. Лизат центрифугировали 12000 об/мин. 10 мин, добавляли раствор бромистого этвдия до конечной концентрации 20 икг/ил,и центрифугировали в течении 48 чаоов на ультрацентрифуге К-32 при 37000 об/мин, 18°С. По окончании центрифугирования флуоресцирующий в УФ области комплекс ДЖ- EthBr осторожно отбирали шприцем и удаляли EthBr от ДОС пятикратной экстракцией изопропанолом, насыщенным fed. Для удаления хлористого цезия, раствор ДНК диали-зиросалн в теченли 24 часов против ТЕ (10 мМ трис-Н& , рН 7,5; I мМ ЭДТА) буфера. ДИК осаждали 2,5 объемами этанола в присутствии 0,3 М ацетата натрия.

Определение молекулярного seca ДЖ осуществляли согласно Helling U974).

Введение ( H3Vd АТ$ в ДЖ с помощью ДЦС-полимеразы I проводили как отмечено в руководстве Маниатиса Т. и дрД19В4).

Молекулярная гибридизация ДВК-ДНК проводилась на мембранных фильтрах, по методу Gillespit^Spiegelmtm (1965), с некоторыми модификациями Denhardfc (1У66).

Вьщеление суммарной ГНК митохондрий хлопчатника осуществляли по методу,как описано в руководстве Маниатиса и др.(1984).

Получение меченных препаратов суммарной митохондриальной РНК проводили в системе, предложенной Константиновым Ю.Ы. и др.(1уШ).

Синтез ЩШ на матрице мктихондриальной РНК и клонирование в плазмидном векторе pTZ 16 К осуществляли, как описано в руководстве Маниатиса и др.(1984).

Вяот-гибридизанионный анализ полученной библиотеки генов митохондрии хлопчатника с индивидуальными ДНК-зоедами проводили по модифицированной методике Грюндаейна и Хогнесса (ürunsteia » Hogftee ,1976). * "

Мечение ДвК зоцца со статистической олигонуклеотидной затрав-' кой осуществляли по методу íeinberg A. iVopelatein В. •'

Определение кукяеотидной последовательности митохондриального гена 9СЕ АТФазы осуществляли с использованием терминаторов поли-меразной реакции, олигонуклеотидной затравки Шраимера) и фермента

Кленова JPI-полимеразы I по методу Bange г F. »Nicklen F. (1977).

Определение числа копий гена методом титрования осуществляли по результатам блоя-гибридизации ее геномной ДЩ и разведениями клона-зонда как описано Ананьевым Е.,Сошной Н. (1900),

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСиЩОВАНИИ

Клонирование транскриптов митохоодриального генома хлопчатника O.hlrsutum Ii. , сорт IQü-Ф.

Установлено, что мРНК ( Hieeel К. at al. ,196V; Хаэратов П., 1990; Юсупов Т.Ю. и др.,1990), митохондрий растений но полиадени-лирована на 3 -конце, поэтому ее невозможно ввделить стандартны* способом. Синтез нДНК в этой случае проводили на суммарной РНК митохондрий, применяя предварительное полиаденилирование 3 -конца ; РНК при помощи фермента поли /А/~полимеразы и синтезируя кДНК стандартным способом с использованием в качестве праймера для ревер-тазы олиго

Б реакции обратной транскрипции мтРНК достигался выход кДНК, равным 30-35%, размер синтезированных молекул лежал а пределах 3büü-iöUü нуклеотидов при среднем размере 850 нуклеотидов. Радиоавтограф Р^-кДЖ, синтезированный в оптимальных условиях и фракционированный в денатурирующем геле агарозы.приведен на рис.1.

Радиоавтограф денатурирующего щелочного геля агарозы после фракционирования Р^-

А - первая цель Р^-кДОС хлопчатника;

Б - положение маркеров

(фрагменты нш III№ фага А);

В - вторая цепь Р32-кДг1К хлопчатника.

А

Б В

*л г*

& ф, * & с

Ой, 3 » р О О о

о о , о О о «»

о ©

В

Рис.2.Скрининг1 тонов кДНК митохондрий хлопчатника

с Р -меченными митоховдриальными зондами кукурузы,

Д - апоцитохрома в (СОВ); Б - 9СЁ АТФазы; В-сох I.

Вторую цепь в молекулах кДНК синтезировали при помощи РНКазы л ДЧК-полимеразы . Клонирование кДЩ осуществляли в вта 1 сайт плазмидного вектора твй.

При клонировании 101,иг кДНК был получен банк 5x10^, число реко-мбинантов составило 80%.

Иа первоначальном этапе работы 1500 клонов кДШ митохондрий хлопчатника, полученных на основе суммарной РНК митохоедрий ги^ри-дизировали с меченной РНК митохондрий. Около 70% клонов, давших положительные сигналы гибридизации отбирали и опять гибридизиро-вали с ДОК митохондрий. Клоны, давшие интенсивный сигнал отбирали и использовали для дальнейшего анализа.

Идентификация клонов кДНК митохондрии зондами на индивидуальные гены митохондрий кукурузы aoxIf СОВ и 9СЕ АТФазы.

Полученную библиотеку мгтохоцдриальных генов хлопчатника анализировали эоццами на индивидуалы аде гены митохондрий сох1, СОВ ц 9СЕ АТФазы, любезно представленные нам Е.В.Кузьминым ШИИСБ, ' ВЛСХНШ1). Примерно 3500 клонов данной клоноТеки были скринированы меченными зондами, из них для дальнейшего анализа были отобраны клоны, дающие положительный сигнал с зондом 9СЕ А'ГФазы (рис.2).

Идентификация и выделение гена 9СЕ АТФазы митохондрий хлопчатника.

Из трех клонов отобранных гибрид-селекцией (рис.Н) была выделена кД1К, которую рестрицировали эндонуклеазами Н1ла ш, Pвt I »

фракционировали в 1% агарозном геле и переносили на нитроцеллюлоэ-ные фильтры { Schleicher Go Bchuell В.A.. ,I98b).

Елот-гибридиэация меченного Р^- Bam Н X фрагмента 9СЕ АТФаэы кукурузы с рестрицированной кДЖ митохондрий хлопчатника показала, что два клона кДЖ, реатрицированные Hind ill и Pst X содержат области транскриптов» гомологичные гену УСЕ АТФазы, молекулярной массой ÖÖÜÜ, Ь200, 470Ü, 380U, 3400 и ÜÖÜU т.п.н. для Hindlllи 5200, 47ÜU, 38UU, 34ÜU и 2ÖÜU т.п.н., соответственно для Pat I (рис.3).

Рис.3.Гибридизация Р^ -мёченного зоеда кукурузы 9СЕ АТФаэы митохондрий с фильтром, содержащим митохондриальную кДДК хлопчатника.

1,2-кДЩ£, рестрицированная Hlnd

III,Pst I.

Размер дан в т.п.н.

I

Область 5600 т.п.н. Hind III фрагменты клона ЗА, подвергли двойному рестрицирован'ш рестриициоиными звдонуклеазамиН1ш1<Х11 и Bel 1 . В результате рестрикции было получено три фрагмента ДМ: й,3 т,п.н. Egl - фрагмент и 1,9 т.п.н., 1,4 т.п.н. Hini3 щ- ~ Бе! I - концевые фрагменты. Затем - фрагмент был суоклони*

рован в плазмидный вектор рис.18 и назван 3S . Определение нукле(; отидной последовательности ДНК гена УСЕ АТФазы митохондрий хлопчатника было осуществлено^ 2,3 т.п.н. ggl -фрагмента клона. 38. Для этого <2,3 т.п.н. Egl I - фрагмент был переклонирован в фаг MI3 tg 12 и секвенирован.

Таким образом, из полученной библиотеки генов митохоцдрий хлопчатника были выделены транскрипты гена УСЕ .АТФаэы различно^/моХ лекулярной массы.

Анализ цуклеотиднои последовательности гена УСЕ АТйазы митохондрий хлопчатника

Определенная нуклеотвдная последовательность гена УСК АТФазы митохондрий хлопчатника равна 325 пар нуклеотидов (рис.4)-. Транскрипт гена начинается с 12 п.н. от 5'-конца шощиирувдего трансляции кодона.

Исследования последовательности ДШ£, находящейся в 5 - области

Гена, показало наличие 1 ¿¡-членного нуклеотида Г тсаФалтаМАА-З»

у которого 4 основания гомологичны консервативному нанонуклеотиду

5,--5Сат'МР1'А ~3*, очевидно участвующему в инициации транскрипции

8 миюхондриал^ном геноме ( ЯоШепЪеге Ы. et а1, ,.1979).

,,«' 1и^а1йСЬи1иА16егЬуа ,.т

ь — а'сатсАгастА^и.тасота^соАйгаи.ссА^стайТСАЕссмосгсттасАгссААА о!

Ие1С1уА1а1ув01тг!1!агА1аА1а11еа1иА1аБегА1вА1аЬеиМеЪРгоа1у11еС1и1й1

АтоаотссаАААааААссссгйССА.м'си.ссаА.отассссссттоссссалА'гтйАА

11еАВЯ01уУи1ВегВегЬеиН1ваег31еУа1А.1вЬеиРгоБегАвиА.геХ1еиА1а(Лу „

АОЖЛАГССАагАТССАСГСТАСГААйгА'ЕССгТССОСССТОСААОТАМСаАСТГ&САайА Щ

0111(у8Ьеиа'угРЬе11еа1уА1аХеи015гРЬеА1а1)ЬеЬех»ТЬгА1аЫеЪ1.1еБегУаХ

САААААтгсттагАтссйФссастАасАтгайСАгагстс^ссаАтоАтсдамтА^^

А1вРЬе1ТоА1аМеШе4РЬеЬеиРЬе8ега1пРЬеЬеи11еС1уУа1Аг8

йстаттссАСССАтоАГйтатса'АтсссААгао'сттсссАС'гсоаАа'АстсА'сос ¿01

ЖАсастоао'гасссАБйСАасА - з» 32Ь

Рис.4.Нуклеотидная последовательность гона 9 СЕ АТФазы митохондрий хлопчатника и синтезируемый ев белковый продукт.

Открытая рамка считывания гена 9СЕ АТФазы длиной 252 п.н. начинается с инициирующего А'1а кодона. Она перекрывается в свою очередь 6-ю небольшими по размеру рамками считывания (табл. 1), каждая ■ из которых синтезирует свою аминокислотную последовательность. Наличие семи СРС - это 7 стартов начала инициации транскрипции.

Исследования с помоцью Н озерн-гибридизации продуктов транскрипции митохондриальных белок-кодируюцих генов выявлено Наличие множественных транскргатов, так например, от трех до восьми различных. ШК гибридизируются с каждьм из генов сох I, СОВ и 9 СЕ АТФазы (Вгаип с. еЬ а1. ,1985; 1еаас Р.еЬ а1.' ,1УВ5).

В результате Саузерй-гибридизации нами было обнаружено восемь, транскриптов гена 9 СБ АТФазы митохондрий хлопчатника размером от

Таблица I

ОРС'последовательности гена 9 СЕ АТФазы митохондрий хлопчатника'

'Номер !|йнициироэ. •нукя. j| кодой ,|Номер нукл.. ¡Стоп-f ■ кодон¡Размер ОРС,Кол-во синтез, ¡аминокислот

41 АТо 292 TAg 252 84

62 ATg 292 ТА» :23I 77

Í07 ATg 292 TAG :Ití6 . 62

£30 ATg 292 TAG 63 21

254 'ATg 292 TAG 39 , 13

257 •ATg 292 •TAG 36 1 12

126 ATg 292 ;TAG 81 27

5700 кп.н, до 600-п«н. (рис.5).

57001;П.Н. . „ , „ ,

; Рис.Ь.Авторадиограмма олот-гиб-

i.H.it. ридизации меченной

•4700 гт.п.н. мтРНК с 2,3 т.п.н.ВД- X -

яЕрагментом, содержащим ген 9 СЕ A'1'Фазы митохондрий 3200 т.л.н. w хлопчатника.

2500 т.п.и.

В

I3C0 т.п.н. О 600 т.л.н.

Особый интерес вызывают не1 только множественные транскрипты, считываемые с одного гена, но и их большие размеры э 10-11 раз превышающие размеры кодирующей осласти гена. Возможно, это может быть связано с большими некодирушими, но транскрибируемыми 5 -и З-флаякмрушимн областями митохондриальных генов растения ■ .(. Dewey et al ,19®).

В результате сравнительного анализа нуклеотидной последовательности гена УСЕ АТФазы Раешп satuvum начинающегося с 114 нуклеотида в 5- фланкирующей области с аналогичным геном хлопчатника, начинающегося с 12 основания в 5 -фланкирующей последовательности, обнаружено, что 304 нуклеотида гомологичны между собой (табл.2, рис.6). При сравнении фрагмента, длиной 325 нуклеотидов гена 9 СЕ АТФазы митохоедрий хлопчатника о соответствующим геном P.hybrida Начинающегося с 520 основания, получено 54,4$ гомологии, с фрагментом нуклеотидной последовательности табака, длиной от 150 основания 5 -фланкирующей области до 460 нуклеотида, гомологичны 830 нуклеотидов, что составляет 54,2%, с фрагментом P.parodii (ЦМС) от 590 основания до 892 основания, гомологичны 247 нуклеотидов, или 58,3% гомологии (табл.2, рис.6).

Таблица 2

Гомология нуклеотидной последовательности гена 9 СЕ АТФазы митоховдрий хлопчатника с соответствующими генами про- и , эукариот

Название объекта 1 Изучаемый ген ¡Размер гомолог. ! 1 последовательности! Процент гомологии

I.P&sum satuvum 9 СЕ АТФазы 304 п.н. 49,7

2.F.hybride 9 СЕ АТшазы 331 п.н. 54,4

3.Табак 9 СЕ АТФазы 330 п.н. 54,2 «

4.Acetobularia /¡лаэмидная ДНК 131 п.н. 52,9

5. P.parodii 247 п.н. 58,3

6. N.tabacum ДНК хлоропл.(ЦЫС) 240 п.н. 47,1

7. P.hybrida .АТФ-синтетаза 315 п.н. 50,2 '

Трансляция гена СЕ АТФазы митохондрий хлопчатники в рибосомах

Анализ нуклеотидной последовательности гена 9 СЕ АТФазы мито-ховдрий хлопчатника продемонстрировал наличие двух семичленных цуклеотидных блоков в 5-области, в которой Три нуклеотида из семи комплементарны полипуриновой последовательности, обнаруженной на З'-конце 18&' рРНК кукурузы и энотеры (рис.7). Такие последовательности могут функционировать как участки, ответственные за связывание рибосом в митохоцдриальной мРНК. Два блок«, находятся на расстоянии - 18 и - II п.н. от инициирующего АТ& кодона. Удаленность от отого вероятного сайта взаимодействия мРНК с рибосомами

:;.Н1ПЗиТ1Ш ÍCOÍMTaOM.UrGCUX'GA.OGAGÍIAAGOAAAa'j;GQA'XOA'XGCMüGÍCTÍGCATaGAA СО

p.sAixvíffl тс51ШтолМа1&заШШс$да 170

p.HYBRim syc

vobacgq TCTCGÍAGAGAAMTCGÍ^ 200

p.moDii тоМойссЙАМАЁоотздсси 640

aatgggïgogaaacgiaoogctgccattg---&a gc ga gx go с gc gcï'iatgcc og gaa ï 120

HÎAGGÎGS---QS^G5IG6ÍAÍAÍÍÍSCTTCÍGOGGG4.G2IGOTGÍAGG3!ATIGGÍ1A 230

taga-л ggtgcîaaa tcaatgggtgca ggagctgcia—caaatgcîicag-cggga got 630 AW^GGiaC^MAICAAiœGTacloQAGOÏGC,iA--CAATTGOTTCAG-CGGGAGCTG 260

<t Л фф 4 фф ф ♦ Л je ф Л 4 ♦ ф dr ф rir ф фф ф

aatgggîgc---aggagctgkjïagaattgoito^goq-ggagoîgotatcggiamgga 700

tüuat'miogagt-4tcoagr~cncatagtatcg'j;cgcgctxocaao!buccgací 160 cslví5i(^aílcíttact3íítíocoigooaíülíutoxicaТ^ОоШлАоХаГтХ'Г^ 390 mïatoggiaragcaaîcgtocriagitrotaktïgaîlosa-tamgamîlïscîto 690 clátaggtíttgsaaacgtccttagttccícgaticattccg-tggwtíoí^ 320

ААСОТ0СТПСТ-теа1СаАТ1САТТСа5ГХтаАО-О1А1АВлААТААс1аАОТТАСА-- 760

tgoaggaoaaaaatrgïaiïftatcggîgcggatggat-xtgcatttoiaacagogaîga 240 cggtattgcaatcûrggckîtpî-g3ïcîaaccc4gck3iattgcoîïgriûgoariaaîgj 350

; amggcÍaíIcÍXÍíattÍggÍtatgogatittgggoiiigc—ïciaÎg—cgaÎgct 750 CTGGC.^AAciiïÎAïbGGî!SlGCCATITIGaGCTïTGC---ÎCîAAC--CGUGCr- 380 mOGATOTCTIxÍÍobcOíÍÍkGT-^TItlSaGÍTloÉrÍÍCATeaÍTOIiaGGTO 820

tcagtsiagaitmocagocaxaatgtotot-^ttraoocaatitoiaa-ioggagiccg 300

!----«асатйоАттетйттейда 410

MîœAlcaÏTT(KOTCAAÎGATGGCcïW 800

atîgcatoaiîîggcccaaïgaig30ctîlîtgaïgtcîlïogtalîccaag100îttag 440 gc GCTîsîggoatttcaactaï^amaaatcoaaîcocgcaaa ogatîqttcîlggaa 680

' ATAGîGArGCri'J^VCJGTGGGÏGOGGATGCAGGA • __ 325

XtlAGGAOGAGGCCOCCAG ■ ... 423

GTCA ÏOOTiiA CGGTGGGÏGÛGMAGCÀGQA ' 023

T/VAGAGI'ÏtacggtggoïggSÏÎAGÎIIGGA 467

GÎÎGÏ.M'CuAGAïTCTiCaGACOTTA 900

Puo.6.Сравнительным анализ нуклеотидной послздователгности гена 9 СЕ АТФазц ипохондрий хлопчатника P. sativum; , P.hybrida; табака и Р . parodü . Звездочкой обозначены совпадающие нуклеотиды, чертой - дэлеции.

E. coli I6s pPHK 3' . ' coucca.o

кукурузы 18 s МТ pPHK 3« CGUUGU

энотера 18S pPHK 3' CCUAAGU

atp А энотеры 5» АС1»Ш

Ц0 II кукурузы 5' сg (jtltjug

9 СЕ АГФазы кг. QUUGtioX хлопчатника 5'

9 СЕ АТФ азы мя &&U&U хлопчатника б*

UAGaUUGGGGUOCAAGGG

IIIII II I пищ I

Ш. GGUO GGUGUCCSAA GGS III 11 III UA.GGUCGGUG

AAA ГО GU UUGAA ШШ

ouao Ш.С mjatlGGUGC UGO CAAUG&

С GA. Ш. GA AAA Gi GAAA. UGA.'

* * * ** * *■■ A.3UUU.GCAAACUGCA ШЛШ

Рис.7.Участки связывания рибосом в нуклеотидной последовательности гена 9 СЕ АТФазы митохондрий хлопчатника. {Идентичность З'-концевых нуклеотидов для IB S ррня js.ooli кукурузы и энотеры показана вертикальными линиями. Звездочками отмечены нуклеотиды, расположенные у Ь'-конца от инициирующего кодона Сон : подчеркнут), способные образовывать комплементарные

пары с мРШС последовательностью митохондриальной рРЙК кукурузы.

от инициирующего кодона варьирует.

Последовательность Шайна-Дальгарно, необходимая дяя присоединения мРНК к рибосомам и трансляции в нуклеотидно1! последовательности гена 9 СЕ А'ГФазы митохондрий хлопчатника обнаружили путё^д способности образовывать комплементарные пары с мРНК-связывающей последовательностью митохондриальной рРНК кукурузы.

В настоящее время отсутствуют экспериментальные доказательства того, что последовательности мРНК, потенциально способные образовывать. комплементарные комплексы с митохондриальной 18 S рРНК, функционируют как участок связывания о рибосомой. Однако, их присутствие в одинаковом положении в исследованных митохондрмальных генах высших растений и сходство с последовательностью Шайна-Дальгарно к. coli предполагают, что они могут выполнять такую функции.

Аминокислотная: поплвтюватялт.нппть. оинтвгшруямяя геном 9 СК А'Шазы митохондрий хлопчатника

Аминокислотная последовательность,синтезируемая геном 9 СЕ АТФазы содержит 84 аминокислоты !рис.4). Генетический код митохондрий хлопчатника аналогичен митохондриальному генетическому коду высших растений.-

- -

- а 1

1!,отаааа ТУЯ а Л СЬИ аха 0x11 аха ¡иет) уах 0x4 уаь ИьЯ хуэ азн

S,oвгвviaiaв ЗЗоу1пв На 1г а С.))1гои1шг1

мег охи х1дг уах хш аха а5р их! лзг той аха

"хот охи вХУ

МВТ ПиТ

охи оху ъаи

хуз

хуз и!3

хуэ

Зи'П хуз'

ано оху сш| хви |рка тук аха х.ки оху рнз ах а ииз уах охи. аха

хуэ аэр тш{ их иш 1'йо ыь'т аха 1хв хйц оху иш аха хш бш схц аха хуз охи ил хки рне 8и1 т ли 1х£ ьш оху рнв аха хет зш охи аха

аха хи ахи'йен ни аха жь^ ьш ш газ аха хаи тт от аха

сы хуз хви пи гни 1ха аху аха хш оху гак

зт аэж адс| им |аха

оху

сху

1хй сху

•ли аы

х31) ищ азр хл' 1.1 ит уах аха 1ш мег аы хуз иы ТИК шмчь 01^ хли уах ¿¡¿а< иш хш-' ьы) хл~и иы охг улх 1ст сху хзи р1!а' суз хдц 1.ют уах аха }нй хви 1х£ х£ч }1ы аха идг

хш аы зшг пи^ли то нот ¡ш аха ш гш т зей иы уах тав

ив в-а уах аха ни ряо аха ш® 1ат ии

АХА

ли

аха и1д| ш1 [ст'-й N. огааоа S,ceгaviзiae ВоуХпа На 1га

о.ысослип 1н£ б^! сш иш хй1 1x2 аьч уах аяс

ии

х^и ii ит 0x1 зьа лха| ли | ххи йху хйц тип пху аха сху 1х-3 ахг 1хв

1x5 оху аха сху тип 1хй оху хш хки оху аха г.ху оху 1x11' 26

1x3 оху аха сх,у аха аха ит тах сху уах аи оху з^я 0x1' аха ох'-' ххй

1хв Ьху аха ¡оху аха лха и1» ни!. аха аха сху аха аха чах йху й4

мет оху аха ;хуз сху тто| аха)аха 1x15 сьи ^ли зля аха аха хйи рйо ¿4

~оху| х*ш уах р1ы аха лха х£1) х^и азн сху уах' аха ано а31! ряо аха х^и 41

аха[ 11в |уах иь1 аха А 1л 1лу аэп сху уах| йян |ано а 31! мо 8яп ш 43

ОХУ гт уах та сху ой! ьд/ хха сху гуя аха алц а 32) иго хьи 42

аъ<с ри УАХ &Я1 иен вся £¿1 1X14' Н12 Зйй уах аха лна азк иго заг хда 41

аху «л ix к азн аху уах зкй зш ь№ шаГ ¡1ХЬ' уах аха хъи рйо 41

5В

ш 5У ьв 58

73

76 75

74

75

Рис.8.Сравнительный анализ аминокислотной последовательности гена 9 СЕ АТФазы митохондрий хлопчатника с аналогичными последовательностями Н.сгавоа , з,сегеу1а1аа , быка, кукурузы. Гомологичные участки взяты в квадраты, в.огсвпи , и у быка ген 9 СЕ А'Шазы кодируется ядерным геномо«.

Сравнительный анализ аминокислотной последовательности гена 9 СЕ АТФазы и про- и зукариот представлен на рис.8. Синтез аминокислотной последовательности начинается с инициирующего лте кодо-на и прекращается в стон-кодоне тай.

Молекулярная масса аминокислотной последовательности синтезируемой геном 9 СЕ АТФазы митохондрий хлопчатника равна 87220 .

Копийность Бк1 I - фрагмента гена 9 СЕ АТФазы митохондрий хлопчатника

Гибридизация рестрикционных фрагментов митохондриальной Д1К хлопчатника а фрагментами гена У СЕ АТФазы митохондрий дает возможность определить число копи!| изучаемых фрагментов гена в митохонд-риальном геноме и сравнивать различные виды хлопчатников по этому показателю, а так же позволит вскрыть организацию этого гена: организован он в геноме митохондрий в виде тандеыных копий или же ген 9 СЕ АТФазы расположен нерегулярно внутри локуса.

Результаты блот-гибридизации рестрицлрованной митохондриальной ДНК хлопчатникаа.тгаиъшп Ь. (108-$), й.ЪагЪас1епве Ь. (С-9065) и их гибридов и Гг) поколения и разведения клона, содержащего Бб1 I - фрагмент гена 9 СЕ АТФазы митохондрий хлопчатника показывают, что гибридизационный сигнал исходных родительских форм ицеат одинаковую интенсивность и расположен в пределах 2,3 т.п.н. Сопоставляя интенсивность гибридизации с разведениями плазмиды содержащей £к1 1-фрагмент гена 9 СЕ АТФазы можно заключить, что содержание копий Се1 I - фрагмента гена в митохондриальных геномах исходных родительских форм й.Ыгз^иш Ь. (.ЮЙ-Ф), а.ЪагЪадепве Ь. ( (С-9065), составляет 1-5 тандемно расположенных копий, у гибридов

и поколения интенсивность сигнала значительно слабее, но интенсивность сигнала у Р^ поколения немного сильнее, чем сигнал у ^ поколения. Размеры фрагмента, гибридизирующегося с зондом одинаковы для обоих гибридов - примерно 2,6-2,7 т.п.н. Количество копий I - фрагмента 9 СЕ АТФазы в митохондриальном геноме гибридов Р^ и Р^ составляет 2 и I тандемных копий на. геном соответственно (рис.У).

Полиморфизм гена У СЕ АТФазы митохондрий ' •

хлопчатника

Использование клонированных генов митохондрий в качестве ыоле-кулярно-генетических зондов для характеристики геномов видов -и сор.

Рис.9.Блот-гибридизация меченного 2,3 т.п.н.Бвц-фрагмента гена 9 СЕ АТФазы митохондрий хлопчатника с рострициро-вашюй Б gl I митохондриатьной ДШ хлопчатника. 1,2 - Bgl - фрагмент гена 9 СЕ Л'Гйазы митохондрий ; хлопчатника в количестве I миг и 0,1 мкг;

3.4 - гибрида Pj И Fn п°и0%емя G.hlrsufcum ь.

. 108-Ф И G.barbabense^I. С-9065.

V 5,6 - G.bafbadense Ljü-9065, G.hirsutmn Ь. Ю8-Ф.

Размер дан в т.п.н.

тов семейства Мальвации, различающихся по хозяйственно-ценным ' признакам и устойчивостью к заболеваниям дает возможность создания метода отбора на ранних этапах селекция устойчивых к заболеваниям генотипов.

Результаты блот-гибридизации взятоговкачестве зонда, проклони-рованного в pTZ 322 гена 9 СЕ АТЗ>азы митохондрий кукурузы с рест-рицированнойБб1 X митохондриальной Д}Ш хлопчатника G.tjiurberi'» G.ralBondii показали наиболее сильную интенсивность и широ-

кий спектр у G.raimondii , чем G.thurberi и копийность гена' составляет 3-8 тандемно расположенных копий гена 9 СЕ АТФазы. Тетраплоиды , G.hlrsutum 1. АН-402, 108-Ф и G.barbadenso Ь. CÍ-9065 дагат ir arate интенсивные гибридиэационные сигналы в области 9,6 т.ц.н. с зондом 9 СЕ А'ГЙазы и содержат предположительно 1-5 копий tía митохондриальный геном Iрис. 10), (Табл.3).

ТакнЬ образом, нами было обнаружено, что количество копий гена 9 СЕ А'1'£азы митохондрий и количество повторяющихся последовательностей этого гена представлены в больше»* объеме у диких диплоидных

16,7 12,0 9,6 7,9 4,6

I 2

3 4

S 7

Рис.Ю.&гот-гибридиэьция P меченного Hind Hi - фрагмента гена 9 Cii АТФазы митохондрий кукурузы с рестрициро-ванной Bgl 2 митохоццрнальной ДЙК хлопчатника (мол.масса в т.п.н.).

1,2 - Hiad III- фрагмент гена 9 UK АТФазы митохондрий кукурузы в количестве I мкг и 0,5 мкг. 3»4 - G.raimondli,G.thuxberi

" - ------- ' G.herbaseum L. Cr7090.

- G.arboreum L. tvwUO 7,8 - G.hirsutum L М8-Ф 9

u.nirauium ь „G.hirsutumli AH-402.

G.barbadense L.C-УОоо. Размер дан в т.п.н.

I

Вид хлопчатника

Таблица 3

Полиморфизм гена 9 СЕ АТФазы хлопчатника

т

¡Кол-во ¡Мол.масса ¡хром, ¡фрагментов

¡Кол-во копий ¡гена 9 СЕ АТФазц

G.thurberi 2n=26 , 12,0 Т.п.н. 3-8

G.raimondii 2n=26 16,0 Л.П.Н. 3-8

G.arboreum C-7059 2n=26 7,9 т.п.н. 1-3

C.herbacewD C-7090 2n-26

G.hirsutum Ь.АН-402,Ю8-Ф 2л=5б 9,6 т.п.н. 1-5

G.barbadense C-9065 2п=5б 9,6 т.п.н. 1,Ь

ввдов хлопчатника G* raimondii,G.thurberi G.arboreum X. C-7059.

и.наименьшее у

} В У В О Д Ц

1.Из очищенных митохондрий ввделена функционально активная РЩ. На матрице суммарной РНК митохондрий хлопчатника синтезирована кДОК, которую переклонировали в плазмидный вектор РТ2Х8Е » получена библиотека генов, содержащая 5хЮ5 независимых рекомбинантных jj клонов.

2.Методом молекулярной гибридизации по Саузерну Р -меченного зонда 9 СЕ АТФазы митохондрий кукурузы с рестрицированной кДНя митохондрий хлопчатника, обнаружены б транскриптов Hind in - фрагмента клона 3 А, молекулярной маосой 5,6; 5,2; 4,7; 3,8; 3,"4 и 2,8 т.п.н. и 5 транскриптов Pat I - фрагмента клона 4А,молекулярной массой 5,3; 4,7; 3,8; 3,4 и 2,8 т.п.н., соответственно.

3;Рестрицирование Hind XII - фрагмента эндонуклеазами Hind их Bgl I дало три фрагмента молекулярной массой 2,3; 1,9 и 1,4 т.п.н. соответственно, 2,3 т.п.н, Bgl I - фрагмент был переклонирован в фаг MI3 серии tg 12 и была секвенирована нуклеотидная последовательность гена 9СЕ АТФазы митохондрий хлопчатника размером 325 п,;-Транскрипт гена начинается с 12 нуклеотида от 5'-конца инициирующего трансляцию кодона.

4.Ген 9 СЕ АТФазы имеет одну большую рамку считывания, начинающуюся в 41 основании àïg; кодоном и заканчивающуюся в 292 нуклеоти-де стоп-кодоном rid-. Она перекрывается в свою очередь 6 небольшими рамками считывания, синтезирующими аминокислотную последовательность, молекулярной массой 8722 Д.

5.Изучение гомологии нуклеотидной последовательности гена 9 СЕ АТФазы митохондрий хлопчатника показало, что наибольший процент Гомологии наблюдается с аналогичной последовательностью p.parodii

(ЦМС) - 58,3$, наименьшей с g.tabaeum - 47,1%. ;

б.Число копий Bgl ï - фрагмента гена 9 СЕ АТФазы в митохондрий альных геномах G.hireutum L. сорта 108-Ф и G.barbadense Ь. сорта С-9065 составляет 1-5 тендемно расположенных копий на геном. Гибриды Pj и Fg поколения имеют 2 и I копии соответственно.

/.Результаты блот-гибридизационного-анализа митохондриалыюй Д1К хлопчатника показали полиморфизм в области количества копий гена 9 СЕ АТФазы митохондрий: у диких диплоидных гидов G.raimpmjiï и G.thurberi" составляет 3-8 копий на геном, у татрйплойр

а.ыга^ил ь. и с.ъагъайепве ь. i"5 (сопий, наименьшее 1-3 копий у й. егЬогеит ь . Корреляции между копийностыо гена 9 СЕ АИазы и плоидностью хлопчатника не обнаружено,

С1ШС0К 0Г1УШИН0БАНШ РАЮ'Г 110 ТИШ ДИССЕРТАЦИИ

1. Юсупов Т.Ю., Гузалова А.Г.; Епишин С.М., Ибрагимов А.П. Клонирование кДШС транскриптов мигохондрпалыюго генома хлопчатника. // XXI Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов". Москва, 20-23 марта,-1990,-С.196.

2. Гузалова А.Г. Создание ¡библиотеки тенов митохондриалыздго генома хлопчатника // Тез. докладов I Республ.конференции молодых ученых " Теоретические и практические аспекты генетики и селекции животных, растений и микроорганизмов1*,Ташкент, 1990.-

_С.Б5-5б.

ai

S u m ma r y , Gusolova Anaida Georgievna

MOLEKULAR- GENETIC ANA LISIS OP STRUCTURE 9 CE ATP-ase OP THE COTTON MITOCHONDRION

The genes of ferments sistens are using in the quality molecular-genetic marker is allowing reveal compound reconatruc- . tion, determine copiety , place of the gene in structure mitochondrion genome.

In the gene librari or the cotton mitochondrion, Southern molecular hybridization analisi8 creating in the gene 9 CE ATP-ase different moleculad masse.

The gene 9 CE ATP-ase definition primery structure is showing presence seven ORS, it ia shifting one another and is coding 84 aminoacids of the masse 8722 D

Tha comparative analise series nucleotide gene 9 Ce ATP-ase was showed homology with the analogous series p.sativum- 49%7%, ,P. hybrida - 54,4JS, tobbaco - 54,2 % .

in the course investigation is dicovering polimorphisa in district copy quantity of the mitochondrion gene 9 CE ATP-ase t by, the wild diploidy species G. raimondii.G. thurberi 3-8 copy on the ppnome, tetraploid G. hirsutum L. and G. barbadenae 1-5 copy, smaller 1-3 copy by the G. arboreum.

Гуяалова Анаида Георгиевна

" ГйЗА ШТ0Х01ЩРШСИ АМазаси 9 СБ ГЕНИ СТРУКТУРАСИНИ ' МОЖСШР-ГЕЖТШ АНАЖ31Г.

Ферментлар генларининг снстемасини молекуляр-генетик маркер сифатида митохондрия геноми сгруктурасида генларнинг жойлашуви . мураккаб У'згаришларини ва ген копияларшш аниклаш имконини беради.

Саузернинг молекуляр-гибридизация методи ёрдамида г^занинг митохондриал генлар библиотекасида АТФаза 9 СБ турли молекуляр массали олтита ген транскриптти борлиги аницланди.

АТ^аза 9 СБ генинииг бйрлаычи структурасини урганиш еттита ОУР (очщ учулувчи рамка) бир-бирини крпловчи молекуляр массаси 8722 Д б^лган ва 84 аминокислотадан иборат т^лган оцсил структурам к^рсатилди.

АТФаза 9 СБ гени-нуклеотиц кетма-кетлигини нисбий анализи Р. рагос111 билан - 50,3^, мааЪассит билан-47,1% ?хшаш кет-макетлик борлиги аницланди.

Митохондриал ДШСнинг блот-гибридизация анализи нати^асцца АИгаза 9 СБ генининг голиморфизми к^йидаги микдорда топилди: Г^ЗвНИНГ ёВВОЙИ ДИПЛОИД а.гБ1топа11 Ва О.^игЪег!

турлари'да 3-8 копия бир гвномда, с.Шгзигиа ь. ва е. ЪагЪа-бепав ьуеграплоид гур л ар ада 1-5 копия, ва знг кам 1-3-та копия с. агЪогеит Турида.

Подписано к печати 3,08,94г.

Заказ № 163 . Тираж 100 экз. Объем X п/л.

!

Отпечатано иа ротапринте ФБАН Республика Узбекистан г.Тапкент ух.Муминова 13