Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляторные свойства аденозинтрифосфатазы митохондрий корней пшеницы, кукурузы и гороха

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Регуляторные свойства аденозинтрифосфатазы митохондрий корней пшеницы, кукурузы и гороха"

инстапт физйшшш и бшякши растений

АК4ДВШИ EÄJK ТАЛЛИНСКОЙ ССР

На правах руташ«я

ГВДДШ БШПШ1 БШСТАРСОЖ

7Ж 581.13:577.15

ШТХТТОИНЕ СВОЙСТВА. АДЕШЗИНГНЕОСатЗЫ

микшщдгап ЕОРНЕЯ шшш, шкгта и тороп 03.00.12 - фоаохопи рзсгеняЯ

АВТОРЕФЕРАТ

дасоергвцал на сшскзниа учаноЗ степ esa кандздвта блоигачвсках наук

Душанбе. 1990

Работе выпоянена на кафедре физиологии и бяохишк рэсге-ееё биологаческого факультета Казахского ордена Трудового Брьсного Зшгагни государственного университета имени С.ИЛ£а-posa и в лаборатории фгзиоаогическсй генетика Института бота-взги Ж ЕазССР

Научные руководители: доктор блоюгаческис наук, црофессор И.Р.Еахиы5аев,

доктор йЕоюшбсш ваук, црофеосор ЛеТеВващенко

Официальные пннонвнты: доктор биожогичеиких наук,

црофессср ИЯЯхуйова

ствдидят биологических наук, е.н.с. А.Абдуллпев

Ведудая оргвяизачкя - Сибирский институт физиологии в

бшшпдш растений АН СССР

Эшвда сосянгася ьШЩ^тд^ г. s

m »аосдвнш Специализированного «de» Д 013.08.01 при Вв-стзгауте физиохвгяи к биофизики растений АН ТадшмаоЗ ССР во адресу: 731063, г. Дупан5е, у)й£йни ju2S9/2.

С диссертацией мшэ ознакомитьos в библиотеке йнститу— та {яазгодщад ж биофкзют раез^ниа АН ТвдэшашВ СС?.

Азторефервг реяoeaœ J 'f-X^O года

Учешг секретарь одяраяащдтяняогр совет

ЯГПЬИДЮ бИОЯОЛГЧОСКЩС НВДХ

Р.ИЛершзр

Актуальность проблемы. Внутриклеточные системы регуляции занимают базисное положение в иерархии систем управления растительного организма (Либберт, 1976; Полевой, 1989) .Настоящая работа посвящена исследованию внутриклеточной системы регуляции на уровне ферментного комплекса - АТф-синтазы/эзы/ митохондрий, находящегося на "перекрестке" энергопреобразующих процессов (Скулачев, 1989) и ядерно-митохондриальных взаимодействий клеток растений (Кузьмин, Зайцева,1987). АТФЧгинтгзу митохондрий обратимо трансформируют энергии протонного градиента в энергии химической связи АТ<3?. Учитывая ключевое положение АТФНзинтазы в энергопреобразующих процессах, правомочно предположить ее участие в функциональной отзывчивости митохондрий на самые различные факторы окружающей среды. Так, известна зависимость интенсивности дыхания, окислительного фос-форилирования от условий кислородного обеспечения (Андреева и др., 1976), обработки фитогормонами (ЗГихолат и др., 1976; beonova е.а.,1985), ствдии развития растений (Андреева и др., 1976; Варакина и др., 1976), температуры (Бойников, 1988), минерального питания (Зайцева и др., 1970), генотипа (Нарий-чук, 1989). Литературных данных о регуляторных свойствах АТф-азы митохондрий высших растений крайне мало относительно АТФ-азы митохондрий животных, АТФазы хлоропластов и бактерий. 3 связи о этим, необходимым этапом в исследовании роли АТФ-син-тазы/азы/ в изменениях функциональной активности митохондрий служат работы, направленные на исследование ее регуляторных свойств^

Цель и задачи работы! Цепь работы заключалась в исследовании регуляторных свойств центрального фермента системы окислительного фосфорилирования - АТФазы митохондрий культур-

ных растений различных таксономических групп. В задачи исследований входило: I) выяснение оптимальных условий функциональной активности АТФазы субмитохондриальных частиц (СОТ) и растворимой АТфазы митохондрий пшеницы, кукурузы и гороха ; 2) изучение регуляторного влияния неорганических анионов, спиртов, двухвалентных катионов, температуры на функциональную активность АТФазы СМЧ и растворимой АТФазы митохондрий пшеницы, кукурузы и гороха; 3) .изучение возможности использования регулягорньгх свойств мигоховдриальной АТФазы в качестве маркеров сорта, вида и рода.

Научная новизна работы. Установлены оптимальные условия функционирования иитохондриальной АТФазы пшеницы, кукурузы и гороха. Максимум активности мембранной и растворимой АТФазы митохондрий пшеницы, кукурузы.и гороха наблюдается при отношении миллимолярных концентраций магния к АТФ близкому к единице и рН 8,0-8,5 (пшеница, торох), рН 7,0 (АТФаза СМЧ кукурузы), рН 7,5 (растворимая АТФаза митохондрий кукурузы*.

Показано, что сдвиги концентраций неорганических анионов, двухвалентных катионов, субстратных комплексов служат регуляторами функциональной активности митохондриальной 'АТФазы, определяют трансформацию АТФазы из одного функционального состояния в другое. Модифицирующее действие неорганических анионов на активность АТФвзы СМЧ корней пшеницы обусловлено кх гидрофильными взаимодействиями с ферментом.

Изучено ззаимозависимое влияние на активность митохондриальной АТФазы пшеницы, кукурузы и гороха неорганических анионов, спиртов, двухвалентных катионов, температуры, отношение концентраций компонентов субстрата, рН.

- з- -

Продемонстрированы особенности взаимодействий АТФазы СОТ злэкоз различных родов с неорганическими анионами, двухвалентными катионами и этанолом. Показана межродовая вариабельность удельной активности АТФазн СМЧ зерновке злаков. Установлено отсутствие изменчивости регуляторннх свойств мито-хондриальной- АТфззы ппеницы внутри вида.

Практическое значение. Установленные закономерности регуляции АТфазы митохондрий могут служить основой для разработки способов влияния на зчертопреобразушдее и энергозави-сише процессы клеток растений. Предлагается использовать особенности регуляторных свойств митохондриальвой АТФазы растений в качестзе маркера рода.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на 14-и Международном Конгрессе биохимиков (Прага, 1988)',сессии Научного совета, посвященной ГОО-летию Н.й.Вавилова (Алма-Ата, 1988), Конференции молодых ученых и специалистов Казахского государственного университета (Алма-Ата, 1989), 17 Всесоюзной Конференции, молодых ученых по физиологии растительной клетки (Минск,1990), Всесоюзном совещании "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пущино, 1990).

Публикации. По результатам исследований опубликовано ? работ отражающих основное содержание диссертации.

Объем работы. Диссертация написашГ на П9 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания результатов и их обсуждения, иллюстрирована 8 таблицами, 26 рисунками, I фотографией. Список литературы включает 46 отечественных и 77 зарубежных работ.

. -Ч -

МАТЕРИАЛЫ' И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Б работе использовались сорта мягкой пшеницы îriticum aeBti-теш L. ) - Безостая I, Целинная 21, Альбвдум 114-, Карлы-гаш, Комсомольская I, Кооператорка, Прогресс, Мироновская 808, Алма-Атинская попукарликовая, Саратовская 29; горох ( Pisna sativum L. ) сорте Карагандинский ; кукуруза ( Zea nays L. ) сорта Казахстанская 43; ячмень ( Hordeiaa vulgarf. L. ) сорте Черниговский 5; рожь ( Sécale eereale L. ) сорта Вятка; рис ( Orisa sativa L. ) сорта Кубань S.

Митохондрии получали из корней, измельчали с помощи гомогенизатора ют-302 в среде, содержащей 50 мМ трис-суль-фатный буфер (рН 7,2) ,'0,5 M сахарозу и 0,1% бычий сывороточный альбумин. Томогенат фильтровали через нейлон и центрифугировали при 1000 g s течение 10 кин. Супернатзнт центрифугировали при 13000 g в течение 10 мин. Полученные митохондрии отмывали. С помощью 10 ыМ трис-сульфатного буфера (рН 8,5) митохондрии подвергали осмотическому шоку. Суспензии центрифугировали■при 13000 g в течение 20 мин для получения ИРГ. Растворимую АТФэзу митохондрий получали из СМЧ по описанному методу Бичи с соавт. ('Beechy е.а., 1975).

■ Анализ чистоты препарата растворимой АТФвзы проводили с помощью электрофореза в 5# полиакрилвмидном геле по методу Uaypep (Ыэурер, 1971). Содержание АТФазы в препарате состав-пяло 75-8056. АТфаау идентифицировали в геле по описанному методу (Иващенко, Зтеулин, Л984).

АТфааную активность определяли по скорости отщепления от ATff фосфата неорганического (фд) и зырзгали в мкмоль 0Н на I иг белка в кин (ед.акт.). Среде инкубации содержала:

а) для препаратов АТФазы СМЧ - 50 мМ трис-сульфатный буфер, 1,5 мМ хлорида магния, 2 мМ АТф'. рН среды инкубации составляла для СМЧ" корней пшеницы, гороха - 8,0; кукурузы - 7,0';

б) для препаратов растворимой АТФазы митохондрий - 50 мМ трис-сульфатный буфер, 1,5 мМ хлорида магния, 2 мМ АТФ. рН среды инкубации составляла для растворимой АТФазы митохондрий корней пшеницы - 8,5; гороха - 8,0; кукурузы - 7,5.

АТФазную активность определяли следующим обраэоа: 0,1 мл препарата АТФазы помещали в О,Л мл прогретой среды инкубации и выдерживали при 37°G в течение 20 мин.АТфазнуа реакцию останавливали добавкой I мл холодного раствора 2,5 я серной кислоты с I,5jé молибдатом аммония.

Количественное определение неорганического фосфата проводили по известной методике ( Denigea , 1921). Еелок в препаратах измеряли методом Лоури с соавт. ( Ьоту е.а.,1951). Калибровочный график строили с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина (КСА).

Статистическая обработка материала проводилась на машине IBM PC/AT с вычисление« средней арифметической и стандартной ошибки (М+m). Достоверность различий определяли с помощью критерия Стьюдента. Доверительный уровень во всех опытах: Р4 0,5. я - коэффициент корреляции. Данные, представленные на рисунках и таблицах получены.по результатаи 6-9 опытов.

РЕЗУЛЬТАТЫ" И ИГ ОБСЛДВНЙЕ.

Г. Влияние рН и отношения миллимолярных" концентраций компонентов субстрата на функциональную активность митохондриальной АТФазы корней паеницы, кукурузы и гороха

Первоначально были выяснены оптимальные условия функнио-

- б -

нальной активности мембранной и растворимой АТФазы митохондрий пшеницы, кукурузы.и гороха. Известно, что максимальная активность АТФазы сопрягающей мембраны митохондрий, хлороплас-тов и бактерий (семейства АТФаз Рд!^) проявляется обычно при отношении ииппимопярных концентраций компонентов субстрата (магния к АТф) Слизкому к единице и в слабо щелочной области рН 8,0-8,5. Оптимальное гее отношение концентраций компонентов субстрата АТФаз семейства РдР^ зависит от рН ( к±тоайа е.а., 1989).

Максимальная активность мембранной АТФазы (Рд^) наблюдалась при отношениях магния к АТф равных 1,5 мМ к 2 мМ (пшеница, кукуруза), 2 мМ к 2 иМ (горох) (рис.1).

Рис.1. Зависимость АТФазной активности СМЧ корней пшеницы (О),гороха (А) и кукурузы (Р) от концентрации магния. По оси абсцисс - концентрация магния. ыМ; по оси ординат -АТФазная активность в процентах к контролю.

2 3 . 4Щ&1Л Используя установленные оптимальные отношения концентраций компонентов субстрате выявили оптимумы рН для мембранной АТфазы корней лшешщы - рН 8,0-8,5; для гороха - рН 7,5 (рис.2).

Лля растворимой АТОазы оптимальное отношение магния к

то

75

50

Рис.2. Зависимость АТФазной активности СМЧ корней пшеницы (О), гороха ( д) и кукурузы (о) от рН среды инкубации. По оси абсцисс - рй среды инкубации, по оси ординат -АТФазная активность в процентах к контроля.

X

7 8 9 р"

АТФ было одинаковым (близкое к единице) для всех изучаемых объектов. Оптимум рН же сдвинулся в щелочную область: рН 7,5 у кукурузы, незначительно у пшеницы - рН 8,5 и не изменился у гороха - рН 8,0. Как видно из представленных результатов митохондриэльная АТфаза пшеницы и гороха близка к другим АТФазам семейства однако, митохондриальная АТФаза кукурузы имеет заметные отличия по рй оптимуму. Продемонстрированная изменчивость этой зависимости, вероятно, обусловлена отличиями в структуре фермента кукурузы.

Изменение регуляторных характеристик при переходе АТФазы из растворимого в мембраносвязанное состояние свидетельствует о вкладе мембранных компонентов в изученные характеристики каталитического сектора.

2.Влияние двухвалентных катионов на функциональную активность митохопдриальной АТФазы корней пшеницы, кукурузы и гороха

Учитывая литературные данные о наличии в митохондриях

довольно широкого ряда двухвалентных катионов (Лениндкер, 1966), можно полагать, что изменения их природы и концентрации служит регуляторным фактором функциональной активности АТФазв митохондрий. В связи с этим, изучено регуяяторное влияние двухвалентных катионов как компонентов субстрата,на активность митохондриальной АТФазы пшеницы, кукурузы и гороха. В условиях замены магния в субстрате, в зквимояярных концентрациях, на другие двухвалентные катионы, активность мембранной АТФазы митохондрий уменьшалась в последовательности у пшеницы: цинк> магний > кальций > марганец > кобальт; у кукурузы: магний > кобальт > марганец > цинк > кальций; у гороха: марганец > цинк > магний > кальций > кобальт. Специфичность к двухвалентным катионам изменилась для АТФазы митохондрий кукурузы и гороха при,переводе ее из мембранного в растворимое состояние. По эффективности злияния на активность растворимой АТФазы митохондрий кукурузы и гороха двухвалентные катионы располагались соответственно в ряд: цинк > магний > кальций > марганец > кобальт и марганец > цинк > магний > кальций > кобальт. Установленные изменения указывают на значение мембранных компонентов в определении регуляторно-го дейстзия двухвалентных катионов кэ активность АТФазы. Вероятно, роль эпэс мембранных компонентов могут выполнять жирные кислоты. Так, для растворимой АТФазы сопрягающей мембраны бактерий, с помоасью добавок ненасыщенных кирных кислот было показано изменение ее чувствительности к магнию и кэльаию (' Бое е.а., 1989). Отметки особенности регуляции АТФззы митохондрий пшеницы: специфичность к двухвалентным катионам не взизЕяпась при переводе ее их мембранного в растворимое состояние.

Согласно полученным результатам растворимая АТФаза митохондрий пшеницы и кукурузы имеет одинаковую специфичность к двухвалентным катионам, но отличается по этой характеристике от растворимой АТФазы митохондрий гороха. В связи с этим,более подробно изучено влияние двухвалентных катионов различной природы на функциональную активность растворимой АТФазы . митохондрий у таксономически отдаленных растений (пшеницы и гороха). Изучена зависимость АТФазной активности от концентраций двухвалентных катионов при фиксированной концентрации АТф (Н мМ). Определены величины констант Михаэлиса (Ки). Величины, количество ¡Си и значения максимальной скорости реакции \ах зависят от природы двухвалентного катиона и источника АТФазы. Согласно литературным данным каадой Кт соответствуют различные функциональные состояния АТФазы митохондрий животных "(Иваненко и др., 1986). В связи с этим, можно полагать, что изменение природы двухвалентного катиона в субстрате выполняет роль переключателя фермента из одного функционального состояния в другое. Так, при исследовании растворимой АТФазы митохондрий пшеницы установлены две Кт для магния, кальции, цинка и одна Кп для марганца, кобальта. Однако, такое влияние двухвалентные катионы не обязательно оказывают для всех FqFj-АТФзз. Так, при изучении растворимой АТФазы митохондрий гороха для всех изученных двухвалентных катионов установлены две Кн . Как указывалось выше, представленные результаты получены в условиях избытка АТф над двухвалентными катионами. Реализацию такой ситуации можно предположить ia vivo , однако следовало изучить условия функционирования АТФазы митохондрий и при оптимальных отно-

шениях концентраций двухвалентных катионов к АТФ. Используя оптимальные рН, показано, что для растворимой АТФазы митохондрий изученных нами расгений (пшеница, кукуруза, горох) наблюдался максимум активности при отношении кальция к АТФ равном 5 мМ к 2 мМ, цинка или марганца к АТФ равном I мМ к 2 мМ и коб&тьта к АТФ равном 0,75 мМ к 2 мМ. То есть, независимо от источника АТф.азы, оптимальное отношение концентраций определенных двухвалентных катионов к АТФ одинаково, при условии соблюдения оптимальных рН. При рН 8,5 для растворимой АТФазы кукурузы (оптимум рН 7,5) максимум ее активности наблюдается при отношениях магния к АТФ равном 0,2 мМ к 2 мМ. Вероятно, изменчивость участков АТФазы митохондрий, ответственных за чувствительность к рН, вносит свой -вклад з изменчивость слецифичности АТФазы к двухвалентным к&тионэм.

3. Зависимость функциональной активности митохоздри-альной АТфазы корней пшеницы, кукурузы к гороха от концентраций субстрата

Истинным субстратом'для АТФаз семейства ся1'хкт комплекс двухвалентный катион - АТФ. Из широкого ряда двухвалентных катионов, магний принято считать адекватным компонентом субстрата (Козлов, Кононенко, 1975). В настоящей работе исследована зависимость АТфгзной активности от субстратных комплексов. Использовались установленные выше оптимальные рН и отношение концентраций компонентов субстрата.

Результаты исследований показвли, что мятохондриальная АТФаза исследованных растений, имеет варианты величин и числа Кв для субстратных комплексов. Используя, полученные данные построены ряды двухвалентных катионов в порядке уменьшения величия Ки . Ряд двухвалентных катионов по Кв1, для

растворимой АТФазы митохондрий пшеницы выглядел: магний> кальций > кобальт > марганец > цинк, по К _ : магний,» кальций> цинк> кобальт > марганец. Для растворимой АТфазы митохондрий гороха по К^ : магний > кальций > цинк > кобальт > марганец, по К^ : магний > цинк^ марганец > кобальт (К^ для кальция не определена). Для растворимой АТФазы митохондрий кукурузы по Ки1 : магний > кальций > цинк > марганец > ко-Залы, по К^ : магний > кальций> цинк кобальт> марганец.

Сопоставив, полученные ряды мы разделили двухвалентные катионы на две группы: группу непереходных (магний,кальций) и группу переходных катионов (кобальт, цинк, марганец).-Для катионов первой группы характерны большие, а для второй -меньше величины Кп . То есть, переходные двухвалентные катионы усиливают сродство митохондриальной АТФазы к субстратному комплексу. Это свойство АТФазы, вероятно, объясняется большим координационным числом переходных двухвалентных катионов в сравнении с непереходными. Анализ представленных выше данных доказал, что разные последовательности двухвалентные катионов наблюдаются лишь во второй группе. Этот результат позволяет предположить наличие довольно стабильных участков митохондриальной АТФазы, ответственных за связывание двухвалентных катионов.

В настоящей работе продемонстрировано, что в зависимости от условий постановки эксперимента наблюдается изменение специфичности к двухвалентным катионам митохондриальной АТФазы пшеницы, кукурузы и гороха. Так, в условиях замены магния в субстрате в эквимолярных концентрациях на другие двухвалентные катионы, активность растворимой АТФазы митохондрий

- 12 -

пшеницу уменьшалась.з ряду: цинк>. магний > кальций> марганец > кобальт, а ряд, построенный по величинам Кщ1 , для субстратных комплексов при оптимальном рН и отношении концентрации магния к АТФ, выглядел: магний > кальций > кобальт > марганец^ цинк. Такие изменения специфичности АТФааы к двухвалентным катионам свидетельствуют о тесном взаимозависимом функционировании участков фермента, ответственных за чувствительность к рН, за связывание АТФ, свободного от субстратного комплекса и за связывание двухвалентных катионов как компонентов субстрата. Соблюдая оптимальные условия среды инкубации и изучен, зависимость активности мембранной и растворимой АТФазы митохондрий пшеницы, кукурузы и гороха установлены несколько (1-3) Кд для субстратных комплексов. Как указывалось вше, отличающимся величинам Кд могут соответствовать различные функциональные состояния ферментной системы. Переключателем состояний в данной ситуации может служить изменение концентрации субстрата в митохондриях.

4. Влияние неорганических анионов на функциональную активность митоховдриальной АТФазы

В результате проведенных нами экспериментов установлено, что характер гидратации неорганических анионов определяет направление изменений функциональной активности митохондриаль-ной АТФазы использованных растений, что позволяет использовать неорганические анионы в качестве тестов на гидрофильные участки фермента. Используя зависимость активности митоховдриальной АТФазы пшеницы, кукурузы и тороха от концентраций неорганических анионов, показаны особенности ее -взаимодействия с сульфитом, бикарбонатом и тиоцианатом (рис.З). Величины К,, и % для анионов зависели от структурной организации

АТФззы (СОТ щи растворимой) и вида растения. Изменения характеристик взаимодействий митохондриальной АТФззы с неорганическими анионами при переводе ее из мембранного в растворимое состояние указывает на влияние мембранных компонентов на гидрофильные функционально значимые участки ее каталитического сектора. Для растворимой АТФазы митохондрий кукурузы установлены две К^ для тиоцианата (52 мМ и 3 мМ). Нам пока трудно дать объяснение этому результату. Бо-видимому, последующие исследования помогут понять функциональную роль участков АТФазы, ответственных за взаимодействие с неорганическими анионами и с субстратом.

§......

0,9

Рис.3. Зависимость АТФаэ-ной активности СМЧ корней пшеницы ( о ) и гороха

( д ) от концентрации сульфита, бикарбоната,

0.5

0,7

тиоцианэта, представленная в прямых координатах. По оси абсцисс - концентрация бо, ; ксо2~; бсн" (мМ);>по оси ординат - АТФазная активность (ед.ект.).

0,3

0,1

30

ю

- -

Наличие зависимости функциональной активности А^азы митохондрий пшеницы, кукурузы и гороха от концентраций неорганических анионов позволяет предположить, что сдвиги концентраций (например, бикарбоната в митохондриях) выполняют ре-гуляторную роль активности ключевой ферментной системы окислительного фосфорилирования. Установленные особенности взаимодействия АТфазы митохондрий растений с неорганическими анионами, вероятно, обусловлены лабильностью структуры фермента.

5. Влияние спиртов на функциональную активность мито-хондриальной АТфазы пшеницы и гороха

Определена зависимость между логарифмом коэффициентов распределения спиртов ( 1£Р ) в системе октанод-вода и логарифмом обратных концентраций спиртов, обеспечивающих максимальную активацию ( 1« Х/С]цах ) или ингибирования на 50# С 1/Сзд) активности мембранной и растворимой АТФазы митохондрий пшеницы' и гороха. Данная зависимость свидетельствует о взаимодействии спиртов с ферментным комплексом посредством их гидрофобных учасхкив. Вероятно, АТФаза СМТ и растворимая АТфаза митохондрий использованных растений имеет гидрофобные участки, модификация которых спиртами, обеспечивает изменение ее функциональной активности.

Зависимость между 1£р и 13 Г/Сэд для АТФазы СМЧ пшеницы в гороха описывалась отличающимися уравнениями, соответственно: 1/С50 » °»83мв Р-0,38 ( г -0,994);

1е «0,93 Р-0,Зб-( г - 0,995)

Взаимодействие спиртов с растворимой АТФазой митохондрий

.ч

пшеницы и гороха описывалась следующими уравнениями:

- 15 -

15 1/С50 1,26 1БР-0,31 ( г - 0,993);

15 1/С50 « 1,12 15 Р-0,38 ( г - 0,982) Го есть, перевод АТФазы пшеницы и гороха из СМЧ в растворимое состояние изменяет гидрофобные свойства фермента.

Зазисимостз мегду 15 для АТФазы СМЧ пшеницы и

^роха и растворимой АТФазы митохондрий пшеницы описывалась зднкм уравнением:

Г/С!аах " I.® 1«Р " 0,053 ( г =0,996)

Рис л. Зависимость между коэффициентами распределения спиртов в системе октанол-вода (Р) и концентрациями спиртов, обеспечивающих максимальную стимуляцию активности мембранной АТФазы митохондрий корней пшеница и гороха. Во оси абсцисс -логарифм коэффициента распределения спиртов в системе октанол-вода; по оси ординат - логарифм обратной концентрации спиртов,'обеспечивающих каксимваьнув

стимуляцию активное?*

I 2 АТ?азы.

Вероятно, гидрофобные участки ргстЕсртамЯ АТ'азв ииге-:0ЕдриК пшеницы и гороха, тестируешь сагрггмг е коггенгрецг-п Сдад имеет очень сходную структуру, Перевод АТ'азв яг генбранного в растьорииоз состояние усиливает вляяи-г спгртов га активность ферненга. цезгученнь-е 5акнь-е псзесзяет

. - 16 -

жить, что спирты в концентрациях С^^ влияют преимущественно на каталитический сектор АТФазы.

-6. Влияние анионов, спиртов, двухвалентных катионов и температуры на активность митохондриальной АТФазы корней пшеницы и гороха

На препаратах АТФазы1СМТ и растворимой АТФазы митохондрий печени была показана зависимость гидрофобных взаимодействий спиртов с ферментами от концентрации и природы двухвалентного катиона.в среде инкубации ( Ivashchenko е.а.,1987),

Подобные результаты получены в настоящей работе при исследовании свойств митохондриальной АТФазы корней гороха и пшеницы. Так, замена в эквимолярных концентрациях в субстрате растворимой АТФазы гороха (магния на кобальт) привела к уменьшении ингибирующего действия этанола и пентанола. Таким образом, показана зависимость гидрофобных свойств растворимой АТФазы гороха от природы двухвалентного катиона как компонента субстрата.

Изучена, зависимость гидрофобных свойств АТФазы'(Ж корней пшеницы при различных температурах. При 25°С и отношения магния к АТф, равному 3 мМ к 3 мМ, этанол, и пропанол икги-бировапи активность АТФазы на 50%, а другие спирты не обеспечивали этого уровня, ингибирования. Ингибирование бутанолом пенганолом и гептанолом АТфазной активности СМЧ на 50# наблюдалось при отношении магния к АТФ, равному 30 мМ к 3 мМ. Згим была показана зависимость гвдройобных взаимодействий спиртов с дТфазой СЫЧ пшеницы от отношения магния к АТф. При температуре 37°С ингибирующее на 50$ действие бутанола, пентанола и гептанола на АТФазную активность наблюдалось при меньшем отношении магния к АТФ, равному 12 мМ к 3 мМ. Таким

образом, было показано, взаимозависимое влияние температуры и свободного от субстратного комплекса магния на гидрофобные взаимодействия спиртов с АТФззой ^МЧ пшеницы.

Изучено влияние кобальта на активность растворимой АТФ-азы корней гороха при 2 мМ АТФ без добазок и в присутствии 10 и 15% этанола. Показано, что этанол в концентрации 10 и 15% ингибирует активность АТФазы, не изменяя величину К

а

для кобальта как компонента субстрата, что позволяет предположить дейстзие субстрата и спиртов на различные участки фермента.

Величина К, для кобальта, свободного от субстратного комплекса, изменялась в присутствии этанола в концентрациях 5 и 1056 и не изменялась в присутствии этанола з концентрации 15%. Значит, этанол в относительно малых концентрациях 5 и 10% регулирует взаимодействия участков растворимой АТС-азы митохондрий корней гороха с кобальтом, свободным от субстратного комплекса. Зганол в концентрации 15%, вероятно, влияет на другие участки.

Показано, что Кч для кобальта укеньвается з присутствии 10 мМ бикарбоната и увеличивается в присутствии 2 ¡Ш таопианата. Обнаруживается некоторое сходство регуляторного действия этанола з концентрациях 5 к 10£ и бикарбоната. Оба эффектора укеньсали К^ для кобальта, свободного от субстратного комплекса.

Результаты исследований, представленные в нзстояцен разделе, свидетельствует о взаимозависимом влиянкг слитое, двухвалентных катионов, неорганически ангсков и гешхературы на активность митохондриалькей АТСазы ргст^н?-.".

- 18 -

7. Изучение изменчивости регуляторных свойств митохондриальной АТФазы внутри вида и между родами зерновых злаков

Установленная вьше изменчивость регуляторных свойств АТФвзы митохондрий растений отдаленных таксонов и литературные данные о генетической детерминированности особенностей митохондриальной активности сортов пшеницы (Войников, 198?; Нарийчук, 1988) служили основанием для изучения возможности использования регуляторных свойств митохондриальной АТФазы в качестве маркера сорта.

В условиях замены в субстрате магния на другие двухвалентные катионы активность растворимой АТФазы различных сортов пвеюшы одинаково уменьшалась в ряду: цинк > магний > кальций > марганец > кобальт. Полученные результаты указывают на отсутствие изменчивости участков растворимой АТФазы, ответственных за связывание двухвалентных катионов как компонентов субстрата.

Тестом на гидрофильные участки растворимой АТФаЗы служили неорганические анионы. Сульфит (20 мМ) и бикарбонат (20 ыМ) стимулировали примерно на 70 и 30?;, соответственно, активность растворимой АТФазы из различных источников, а тио-цианат СЮ мМ) угнетал активность фермента примерно на 30%. Следовательно, отмечено отсутствие особенностей взаимодействий неорганических анионов с растворимой АТФазой, полученной из различных сортов пшеницы.

Тестом на гидрофобные участки растворимой АТФазы служил этанол, который одинаково модифицировал активность растворимой АТФазы митохондрий корней пшеницы всех использованных

- в -

сортов. Вероятно, внутри вида Тг1Исил1 аез11тил 1. отсутствует изменчивость гидрофобных участков растворимой АТфазы. Удельная активность препаратов растворимой АТФазы использованных сортов пшеницы составила примерно 3 ед.акт.

С целью установления роли мембраны в определении предполагаемых особенностей каталитических свойств ыитохондризпь-ной АТФазы пшеницы различных сортов изучено влияние неорганических анионов, этанола и двухвалентных катионов на активность АТфазы СМЧ.

Согласно полученным результатам, активность АТФазы СМЧ из различных источников в условиях замены магния в субстрате на другие двухвалентные катионы одинаково уменьшается в ряду: цинк > магний > кальций > марганец > кобальт. АТФзза СОТ испытанных сортов не имела особенностей взаимодействия с сульфитом, бикарбонатом, тиоциэнатом и этанолом. Полученные результаты свидетельствуют о высокой консервативности структур АТФазы, ответственных за изученные свойства внутри ветв ГгЗ.'Ысил аез-Ытиа Ь.

Далее изучена возможность, использования регуляторнкг звойств АТФазы митохондрий растений в качестве нзркера рода. Исследована активность АТФазы СМЧ корней кукурузы, ржи, риса, ячменя и пшеницы, которая соответственно составила: 0,20 + £ 0,01; 0,34 + 0,01; 0,37+0,02; 0,35+0,01; 0,47+0,01 ед.акт. Выявлены особенности взаимодействия АТФазы СНЧ использованных растений с гидрофильными соединениями. Сузь* кг стгауляро-зал активность АТФазы СМЧ риса, кукурузы, пленили, рхи я ячменя на 91+1,6; 62+5,3; 40+3,0; 59+3,3 г 13+4,3°. Тгсггакгт [20 и!1) внгвОироБва активность АТфазы С!П рк, Еаенкгз, ич-

- 20 -

меня и риса на 57+2,0; Л9+1,3; 36+3,0; 35+0,33#. Установлены особенности гидрофобных свойств АТФазы СИ испытанных злаков. Этанол (10#) повышал АТФазную активность СМЧ пшеницы, ржи и ячменя на 40+5,0; 39+16,3 и 13+6,0*;, у кукурузы не изменял ее и у риса угнетал на В условиях замены магния в субстрате в экзимолярных концентрациях на другие двухвалентные катионы активность АТФазы СМЧ ячменя уменьшалась в ряду: кальций > цинк > магний > марганец > кобальт, а АТФазы С .'Я других злаков - цинк > магний > кальций> марганец > кобальт.

Таким образом, установленные выше отличия регуляторных свойств АТфазы СМЧ корней зерновых злаков могут быть использованы в качестве.маркера рода.

ВЫВОДЫ

Г. Оптимальные условия для функционирования митохондри-альной АТФазы пшеницы, кукурузы и гороха соответствуют отношению ■ концентраций компонентов субстрата (магний к АТФ) близкому к единице (1,5-2 мМ к 2 мМ). При оптимальном отношении магния к АТФ максимум активности растворимой АТФазы и АТФазы СИ пшеницы и гороха наблюдается в слабо щелочной интервале рН (рН 8,0-8,5). Оптимум рН для АТФазы кукурузы лежит в нейтральной области - рН 7,5 для растворимой и рН 7,0 для мембранной АТфазы.

2". Двухвалентные катионы: цинк, кальций, марганец, кобальт с неодинаковой эффективностью заменяют магний в субстрате митохондриальной АТФазы пшеницы, кукурузы и гороха. Изменения концентраций и природы двухвалентных катионов как компонентов субстрата, могут иметь регуляторное значение для - АТФазы, определяя функциональное состояние ферментной системы.

3. Характер гидратации неорганических анионов определя-зт направление изменений активности митохондриальной АТФазы. Здвиги концентраций неорганических анионов служат регулятор-ным фактором функциональной активности митохондриальной АТф-ззы зерновых злаков и гороха.

4. Установлена зависимость между коэффициентами рзспре-зеления одноатокных спиртов в системе октанол-вода и концентрациями спиртов, в которых -они максимально активируют или ингибируют на 50% активность мембраносЕязанной и раствори-ной АТФазы митохондрий пшеницы и гороха. Модифицирупяее действие одноатомных спиртов на функциональную активность мито-сондрий АТФазы пшеницы и гороха обусловлено взаимодействием их гидрофобных структур с гидрофобными участками фермента.

5. Двухвалентные катионы (их концентрация, природе ), неорганические анионы, температура, спирты, компоненты кен-Зраны, взаимозависимо модифицируют активность митохондриальной АТФазы пшеницы, кукурузы и гороха.

6. Мембраносвязанная АТФзза митохондрий злаков, отвося-дихся к различным родам, отличается удельной активностью» имеет особенности взаимодействий с неорганическими анионами, этанолом л двухвалентными катионами, как компонентами субстрата. Регуляторные свойстве митохондриальной АТФазы могут служить своего рода биохимическим маркером в хемосистематкке злаков на уровне родов.

список работ, ошгаглаззшас по тзаз лзюсгршзга

I. Утеулин К .Р., Ивэгзнко АЛ., ГаЗзугхаевз Е.Б., Рвхгв-5аев Й.Р. Влияние неорганических гнгонов » спиртов кз

ную активность субмитохоидриальных частиц корней пшеницы // Физиолого-генетические основы устойчивости и продуктивности сельскохозяйственных растений. Алыа-Ата: Наука, I988.-C.90.

2. Хтеупин К.Е., Габдудхаева Б.Б., Рахимбаев И.Е., Никонов Г .К., Петелина Л.П., Артамонов А.Ф. Влияние неорганических анионов и стимулятора корнеобрэзозания (FC-I) на Н^-се-кретирующую способность корней этиолированных проростков пшеницы // Физиолого-генетические основы устойчивости и продуктивности сельскохозяйственных растений. - Алма-Ата: Наука, 1988. - С .91-92.

а. Ivashchenlco A., Uteulin К., Bzalcelova S., Gabdulhaeva В Hydrophobic properties of coupling factor of plant and aminol mitochondria Ц 14 International Congress of Biochemistry, Prague, Czechoclovakia, 1988. - P.JI. .-

4. Утеулин 1C.P.,. Иващенко А.Т., Габдулхаева Е.Б. Влияние неорганических анионов, спиртов и двухвалентных катионов на активность растворимой АТФазы митохондрий корней гороха // Физиология и биохимия'культурных растений. - 1989. - Т.21,

te 2. - С.Ю2-1В6.

5. Габдулхаева Б.5. Влияние двухвалентных, катионов на активность растворимой АТФазы митохондрий корней пшеницы и гороха // Тезисы конференции молодых ученых и специалистов Казахского государственного университета имени С.М.Кирова, посвященной 55-летию, университета. Естественные науки. -Часть I. - Алма-Ата, 1989. - С.152.

б. Габдулхаева Б.Б., Утеупин К.Р. Двухвалентные катионы как компоненты субстрата митохондриальной АТФазы корней пшеницы, кукурузы и гороха // Тезисы докладов 1У" Всесоюзной Кон-

- 23 -

ференции молодых ученых по физиологии растворимой клетки. -Минск, 1990. - СЛ.

7. Габдулхзева Б.Б. влияние неорганических анионов и спиртов на активность мембраносвязэнной и растворимой АТФазы митохондрий корней пшеницы, кукурузы и гороха // Тезисы докладов 1У Всесоюзной Конференции молодых ученых по йизиоло-гии растительной клетки. - Минск, 1990. - С.58.

8. Утеулин K.P., Габдулхаева Б.Б. Влияние температуры на активность «еыораносвязанной и растворимой АТФазы.митохондрий корней пшеницы, кукурузы и гороха // Физиология и оиохимия культурных растений (в печати).

9. Утеулин K.P., йваценко АЛ., Габдулхаева Б.Б., Рахим-баев ii.P. Свойства АТФазы субмитохондриальных частиц и растворимой АИ'Фазы митохондрий корней гороха и пшеницы // Биологические науки (.в печати).

lu. Габдулхаева 5.Б., Карпенск 'т.А., Утеулин К.?., Поно-уаренко C.B., Иващенко АЛ. 'Лзменчивссть свойств АТФазы хло-ропластов'и митохондрий злаков // проблема теоретической и прикладной генетики s Казахстане ( з печати).