Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли низкомолекулярных белков теплового шока в адаптации растений к гипертермии

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли низкомолекулярных белков теплового шока в адаптации растений к гипертермии"

Ги-гсп- ' К) 9—3

?стэг:.:г.-

> л:; .стз; '

'"> - - РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК.

"" СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ

на правах рукописи УДК 581.12:577.112.083

Боровский Геннадий Борисович

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ НШКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА В АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ К ГИПЕРТЕРМИИ

03.СЮ.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

9 3

Иркутск, 1993

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, Иркутск

Научный руководитель: доктор биологических наук, В.К.Войников

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, А.С.Романонко,

кандидат биологических наук, доцент,

Р.М.Островская.

Ведущее учреждение: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита диссертации состоится " апреля 1993 г. в /Счас. на заседании специализированного совета по защитам кандидатских диссертаций при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и'биохимии растений СО РАН.

«ьтороферат разослан п!2 |,'аРта Т993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

.¿¿¿7 -- г.П.Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение процесса формирования устойчивости растений к неблагоприятным факторам среди имеет первостепенное значение для растениеводства. Приемлемая температура является определяющим условием в аязни растения. Это обстоятельство обусловливает актуальность исследования, направленных на определение физиолого-биохимических механизмов толерантности растений к жестким температурным условиям.

Особенный интерес у исследователей вызывает феномен ответа клетки на тепловой шок синтезом специфических белков, получивших название "белки теплового шока" (БТШ).

Синтез БТШ протекает в ответ не только на гипертермию, но и на самые разнообразные стрессирунцие воздействия. К сожалению большинство работ, направленных на изучение синтеза БТШ и организации соответствующих генов, выполнено не на растительных объектах. При этом особенно слабо изучены функции низкомолекулярных растительных БТШ, хотя их разнообразие и активный синтез в период шока наводят на мысль о важности этой группы белков. •

Кукуруза была выбрана в качестве основного объекта изучения функщш низкомолекулярных стрессовых белков при гипертермии, поскольку она хорошо изучена генетически, имеет важное значение в жизни человека й часто -подвергается перегревам при выращивании в естественных условиях. э

Цель и'задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение роли низкомолекулярных белков теплового шока в адаптации растений кукурузы к гипертермии, а также выяснение вероятных механизмов действия этих белков в клетке.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следувдие звдачи:

I Определять разнообразие низксколекулярных БТШ у линий кукурузы и установить существует ли свпаь между синтезом определенных белков и способностью организма адаптироваться к повышенной температура; '

2)исследовать протекторные свойства БТШ, их действие ни ферменты к митохондрии In vitro;

3)установить природу ассоциации низкомолокулярных БТШ с

митохондриями при стрессе;

4)выяснить продолжается ли синтез ВТШ у кукурузы при длительной гипертермии и какие изменения в низкомолекулярной части белкового спектра при этом происходят.

Научная новизна. В работе изучено разнообразие низкомолекулярных белков теплового шока у гомозиготных линий кукурузы. Выявлена коррелятивная связь между синтезом определенных БТШ и способностью растений кукурузы интенсивно расти при высокой температуре. Показана термостабильность ряда низкомолекулярных белков теплового шока и наличие их конститутивного синтеза низкой интенсивности. Впервые показано, что в клетках разных видов растений содержатся термостабильше низкомолекулярные белки сходной молекулярной массы. Установлено, что синтез большинства низкомолекулярных БТШ кукурузы поддерживается на первоначальном уровне в течение длительного времени действия гипертермии. Установлено, что БТШ кукурузы способны стабилизировать глгаозо-6-фосфат-дегидрогеназу при действии на нее высокой температуры In vitro. Впервые показано, что фосфорилирущая активность изолированных митохондрий может быть стабилизирована термостабильными белками разных видов растений. Причем, фракция термостабильных белков, вероятно, содержит низкомолекулярные БТШ ели их аналоги. Впервые показано, что при тепловом шоке низкомолекулярные БТШ локализуются, как на поверхности, так и внутри митохондрий. При е.том полипептиды массой 29 и 16,5-17,6 кД находятся на поверхности этих органвдл, а БТШ 25, 22 , 20 и 18 локализуются внутри, .где ВТШ 22 прочно связываетсяс мембранами. Выдвинута гипотетическая схема участия низкомолекулярных БТШ растений.в адаптации растения.

Практическая ценность работы. Настоящая работа направлена на изучение синтеза низкомолекулярных стрессовых белков под действием гипертермии и определение их биологической роли в клетках растений. Получена новая информация о связи синтеза низкомолекулярных белков теплового шока с формированием термотолерантного состояния растений, о их роли в адаптации кукурузы к гипертермии и о возможных путях их функционирования. Результаты," полученные при изучении корреляции синтеза определенных белков теплового шока и способностью растений кукурузы интенсивно расти при повышенной температуре, открывают

возможность для разработки методов диагностики различных генотипов на жароусгочивостъ.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, I работа находится в печати. Результаты исследований по теме диссертации были доложены на лабораторных семинарах лаборатории физиологической генетики Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (1989-1992 гг.), на научной сессии Института 1992 г.. Второй Всесоюзной конференции молодых ученых (г.Минск, 1990), Всесоюзной конференции по экологической генетике растений и животных (г. Кишинев, 1989. г.), Конференции "Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды" (г. Якутск, 1991 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, изложения экспериментальных данных с их обсуждением, .общего обсуадения, заключения, выводов и библиографии, включающей 144 наименования, из них 19 на русском языке; работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 12 рисунков.

объекты и метода исследования

В экспериментах использовали побеги и корни 3-х суточных этиолированных проростков кукурузы (Zea maya L., гибриды Краснодарский 303 и Вир Зв), побеги гомозиготных линий кукурузы AI66, А34, А334, AUG, I, Ыа21, H5I3, S54, SV56, Бессарабка. Также использовали побеги трехсуточных этиолированных проростков мягкой пшеницы (Triticum aeativum I.). твердой пшеницы (Tritlcum durum) и пшеницы однозернянки (Tritlcum monococcum), ржи (Seeale cereale) сорта Омка, гороха (Plsum aatlYum) сорта Марат.

Температурную обработку проростков . проводили следущим образом: срезанные побеги помещали в стеклянные колбочки и инкубировали в водном термостата при непрерывном встряхивании в течение 3-х часов при температуре 27°С (контроль), либо при 41°с (шок) в присутствии радиоактивной аминокислоты. При проведении длительной тепловой обработки растений этиолированные проростки на последние 18 часов проращивания помещали в воздушный термостат при 41°С, После этого побеги срезали и инкубировали 3 часа в

б

водном термостате.

При обработке белка кипячением суммарный водорастворимый белок, выделенный, как описано ранее хвойников и др., 1986), осаждали охлажденным ацетоном и снова растворяли в том же буфере. Пробирку с раствором белка инкубировали в течение 3-х минут в кипящей водяной бане. После чего денатурировавший белок отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 15 мин в угловом роторе на центрифуге К-24 (ГДР). 'Осадок отбрасывали, а термостабилыше белки использовали в работе.

Раствор глюкозо-6-фосфатдегвдрогеназы (Serva, ФРГ) (0,000X25 мкг/мл) инкубировали 10 минут в предварительно прогретом до выбранной температуры буфере из 'тест-набора фирмы Boeringer Mannheim (ФРГ) в присутствии белков, выделенных из проростков кукурузы или бычьего сывороточного альбумина, или без добавок. Использовали следующие температуры: 25, 35 и 45°С. После этого температуру быстро (около I мин) доводам до 25°С и проводили измерение активности фермента спектрофотометрическим методом, используя тест-набор, согласно прилагаемой инструкции.

Оценку адаптивной способности проростков и растений гомозиготных линий кукурузы к высокой температуре проращивания проводили в климатической камере фитотрона по следующей схема: трехсуточные проростки делили на два группы и перекосили' в климатическую камеру на сроду, содержащую раствор Кнопа. Первая группа растений находилась при- температуре 28°С, вторая - при 38°С. Каждые сутки, начиная с пятого дня прорастания, проводили измерение длини побега у 10-15 растений. Средние значения длины побега к определенному дню роста у первой и второй групп-сравнивали мавду собой.-Отношение длины побега при 38°С к длине побега при 28°С назвали "коэффициентом твшгаадаптации" (к).

В опытах использовали аминокислоты 14С-лейщш (20 мкКи/мл, -удельная радиоактивность 250 мКи/ммоль, Реахим, СССР) и 35S-m6tiiohhh (50 мКи/мл, удельная радиоактивность 357 мКи/ммоль, Реахим, СССР). Этиолированные побеги срезали и помещали в стерильные колбы объемом 5 мл, в которые было добавлено 150 шел водного раствора моченой аминокислоты.

Для вводе кия радиоактивной матки в митохондриалышй бзлок срезанные побеги (15 г) 3-х суточных проростков кукурузы помещали в колбу объемом 100 мл. и заливали водным раствором 358-М9тиошша

е

(50 мкКи/мл). Колбу инкубировали при 41°С, либо при 27°с при непрерывной встряхивании. После этого побеги отмывали водой и использовали для выделения митохондрий.

Выделение митохондрий для измерения окислительной и фосфорилирупцей активности проводили, как описано ранее (Войников и др., 1988). Определение окислительной и фосфорилирунцей активности митохондрий осуществляли полярографически, используя платиновый электрод закрытого типа (электрод Кларка) (Трушанов, 1973).

Выделение митохондрий для анализа белковых компонентов проводили по сходной методике (Войников и др., 1990) с некоторыми изменениями. Побега кукурузы (15 г) отмывали от невключившейся радиоактивной кеткп и гомогенизировали в 70 мл. 0,05 М Трис-НС1 буфера (рН 7,4), содераацем 250 мМ сахарозы, 2 мМ ЭДТА и 0,002 Н дптстотреятола в специальном прессе. Гомогенат фильтровали через капроновую ткань и центрифугировали при 4000 g в течение 3 мин. на центрифуге К-24 (ГДР). Осадок отбрасывали, митохондрии осаздали центрифугированием при 20000 g в течение 3 юш. Сугорнатаит сливали, митохондрии промывали средой выделения. После повторного осаздония центрифугированием при 20000 g в течение 3 шггохондрии наносили на ступенчатый градиент

концентраций сахарозы (0,3 М, 0,G И, 0,9 М), содержащей 0,1 % бычьего сывороточного альбумина (Техника биохимического исследования субклеточных структур и биополимеров, 1977), либо обрабатывали протеиназой К (Serva, ФРГ) (0,1 мг/мл) в течение 30 шш. при 37°С, (контролем служили митохондрии, инкубировавшиеся то яе время в отсутствии протеазы) и также наносили на описанный сахарозный градиент. После центрифугирования в баквт-ротора при 3000 g в течение 30 мин. на центрифуге К-23 (ГДР), митохондрии собирали с верхней границы 0,6 . И слоя сахарозы и осаждали цнтрифугированием при 20000 g в течение, 10.мин (там se).

Изолированные и очищенные митохондрии разрушали замораживанием - оттаиванием в 0,1 М Трис-HCl буфере (рН 7,6), содержащем 0,01 Ы дитиотреитола и 1% додецилсульфата натрия. Белок осаждали добавлением охлажденного ацетона и использовали для электрофореза.

Для анализа растворимых белков и белков мембранной фракции митохондрий, изолированные органеллы разрушали замораживанием -

оттаиванием и последующей обработкой ультразвуком в течение 3 мин (Веэ1ш1ез еЬ а1., 1988). Неразрушившиеся митохондрии осаждали центрифугированием при 20000 £ в течение 5 мин. Ооадок отбрасывали, а супернатант центрифугировали в бакет-роторе улътрацентрифуги УА0-602 (ГДР), при 150000 8 в течение 90 мин для осавдения мембран. Растворимый белок из супернатанта осаждали 10* трихлоруксусной кислотой и использовали для электрофореза.

Все операции по выделению белков из побегов проводили в холодной комнате при 4°0, и на центрифугах с охлаждением. Белок выделяли как описано ранее (Войников и др., 1986) с небольшими изменениями. Побеги, замороженные жидким азотом, растирали в фарфоровой ступке до порошкобразного состояния и экстрагировали белки в 0,1 М Трис-Н01 буфере (рН 7,6), содержащем 0,01 М дитиотреитола , 0,01 М ЭДТА и 0,001 М 4М0Ф (31£та, США). Полученный гомогенат центрифугировали 20 мин при 20000 ц на центрифуге К-24 (ГДР) для осаздения грубых клеточных компонентов. Белок супернатанта использовали для определения радиоактивности полипептидов, в качестве стабилизирующих добавок к ферменту, выделения термостабильных белков и для фракционирования электрофорезом.

Мембранную фракцию митохондрий получали, как описано вше. Мембраны делили на две части - одну из них инкубировали с 1М КС1 для экстракции электростатически присоединенных белков, другую с IЯ Тритоном Х-100 в течение 30 мин. при 0°С (ЬаГауеМе, Тгат1в, 1990). Мембраны отделяли центрифугированием, при 150000 g в течение 90 мин., а белок из .супернатанта "осаждали охлажденным ацетоном и использовали для электрофореза.

Электрофорез в проводили в блоках . полиакриламидаого геля размером 110x100x1 мм. в модифицированной системе Лэммли (ЬаеотпИ, 1970). Разделяющий гель, содержал полиакриламид в концентрации 12,5*, либо градиент (10-1556) концентрации полиакриламида.

Для определения концентрации белка использовали метод Гринберга и Крэддока (1982), основанный на определении белка с бромфеноловым синим.

Измерение радиоактивности образцов проводили с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика 1219 НасКВега (ЬКВ, Швеция). При этом использовали диоксановую сцинтилляционную

кпдкость Брея (Bray, I960).

1 Определение радиоактивности белков проводили на бумажных фильтрах, после удаления невключившейся аминокислотной метки с помощью буггакной хроматографии (Остерман, 1983).

Выявление на электрофореграмме зон полипептидов, содержащих радиоактивную аминокислоту, проводили флюорографически (Остерман, 1983). Для этого гели с импрегнировашшм ППО высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой РМ-В при -70°С.

Молекулярные массы полипептидов определяли, используя в качестве стандартов набор белков (Pharmacia, Швеция). В набор входят: фосфорнлаза Б (93 кД), бычий сывороточный альбумин (68 кД), овальбумин (43 кД), карбоангидраза (30 кД), соевый ингибитор трипсина (20,1 кД) и лактоальбумин (14,4).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Связь между синтезом определенных низкомолекулярных

белков теплового шока и способностью растений адаптироваться

к высокой температуре.

Проведенные исследования показали, что основные различия в белковых спектрах между разными видами пшеницы невелики, как при обычной температуре, так и при тепловом шоке. Эти различия связаны, в основном, с областью низких молекулярных масс. Отмечено, что синтез полипептидов с молекулярной массой 14 и 17 кД полностью прекращается при тепловом шоке у однозернянки и твердой пшеницы и продолжается у мягкой пшеницы, а белок с молекулярной массой 15 кД значительно сильнее выражен у твердой пшеницы.

Явные различия в составе белков между жароустойчивой (А 116) и нежароустойчивой (Бессарабка) линиями кукурузы также наблюдали только в области низких молекулярных масс. Так БТШ с молекулярной массой 24,5 и 22 кД синтезировались только у Бессарабии, а БТШ 21,5 - у А 116.

у гомозиготных линий кукурузы, различающихся по способности адаптироваться к высокой температуре, - таких различий больше, и местоположение их было также связано с низкомолекулярной частью полипептидного спектра. Была сделана попытка установить связь

мевду синтезом отдельных груш белков теплового шока низкой молекулярной массы и скоростью роста растений датой гомозиготной линии при повышенной (38°С) температуре и при "обычных" (28°С) условиях. Температура 38°С была выбрана поскольку при ней: а)наблюдается синтез БТШ; б)растения не погибают в течение длительного времени (десятки суток).

Синтезировавшиеся низкомолекулярные БТШ можно разделить на две группы: минорные - слабо заметные группы и мажорные -крупные, хорошо заметные группы белков, Иричом мажорные низкомолекуляряые БТШ синтезировались практически у всех исследованных линий, а минорные часто отсутствовали (Табл. I).

Была установлена корреляция между наличием синтеза при тепловом шоке БТШ с молекулярной массой 29 и 16 кД и способностью линии кукурузы расти при 38°С лучше, чем при 28°С. Растения всех линий росли при повышенной температуре десятки суток. Поэтому был сделан вывод, что синтез этих БТШ (29 и 16 кД), вероятно, способствует не столько перекиванию кратковременного теплового воздействия, сколько успешной адаптации к условиям высокой температуры. Было также обнаружено, что значительная часть низкомолекулярных БТШ кукурузы может синтезироваться в условиях "обычной" температуры, либо имеет "контрольные" аналоги с той ке молекулярной массой (Табл. I).

2. Изменения в составе БТШ кукурузы после длительного

действия гипертермии.

Было исследовано влияние длительности гипертермии на синтез БТШ, в том числе, на состав спектров БТШ в этих условиях. Оказалось, что в течение 18 часов гипертермии в проростках кукурузы синтезировались, в основном, те ке белки, что и при 3-х часовом тепловом шоке, однако имелись и некоторые различия. Так при длительной гипертермии синтез части белков (с молекулярной массой 31, 25 и 18 кД) сокращался до едва заметного уровня. В то ке время в этих условиях синтез других белков сохранялся неизменным. С другой стороны синтез части белков (с молекулярной массой 64, 34, 30, 29, 16, 15,5-15, 9-14 кД) значительно увеличивался при длительной гипертермии по сравнению с первыми часами теплового воздействия (Рис. I).

Таблица I. Оценка синтеза низкомолекулярных белков теплового шока у гомозиготных линий кукурузы.

V (кД гомозиготные линии

А 166 ь А 34 А 334 ¿4 56 Ма 21 Н 513 Б54

коэффициент теплоадаптащш "к"

) 1.39 1.58 1.39 1.24 1.31 0.75 0.77- 0.81

к ш к ш к а К и К ш к ш К ш К ш

32,5 (м) - г* - 1 * 1 - * * 1 - 1 -1 * 1

31 (м) * г ■ * 1 $ 1 * 1 г 1 * 1 * 1

30 • . * * * а * * — •« 1 * * *

29 - « - • • 1 - • * 1 —

28 (М) * $ * 1* I 1* * I» * 1* * I -1* «1*

27 (М) 1 I 1 1* - 1 - 1 - { 11 11* -1

26 1 t I I * * * * — t * $ * 1 г

25 (М) - 1 1 I* - 1 - I - * -1* «1*

23 - $ 1 V * ' - * - - I! * I —

22,5 - - - * - - - - — — —

22 - * - * * 1 * * г $ * (

21,5 * 1 * « I - — 1 ~ I 1 г 1

20 * » - 1 - 1 - 1 -1 - - - 1 -1

19,5 (м) 31 V г Г % !• г *• $ Г I 1* % . 1 г

19 (м) - * - * 1 * - Г - г - $*

18 (М) 5 1 г $ . * * » * '1 * 4 » {г 1 *

17 1 £ г 1 £ 1 1 " * - 1 % г*

16 - 1 % * * г $ 5 $ - - г * з *

14,5 ? « г £ * ш * 1 г - - .* - 1 г . г *

13 - 3 .1 1 1 {% - - * - % * $ -

9. а « а 1 « * * * - — * * * * - 8

- - синтез белка отсутствует; * - сиптез белка выражен слабо; | -белок Ясно внракен; - белок выряжен сильно.' К-температура инкубации 27°0; ш-твмпература ип'.убации 41°С; м - мажорные белки;

■ Сделано предположение, что белки, синтез которых после длительного теплового воздействия увеличивается, принимают участие в адаптации клетки растения к условиям гипертермии. Подтверждением тому служит то, что синтез обоих низкомолекулярных

Рис. I. Фтоорограмма белков трехсуточных проростков

кукурузы в контроле (27°С) и при тепловом шоке (4I°C). I -27°С, 3 часа;' 2 - 41°С, 3 часа; 3 - 41°С, 18 часов (3 последних часа в присутствии радиоактивной метки). Слева указаны молекулярные массы белков-стандартов (кД). Справа обозначены низкомолекулярные БТШ, синтез ■ которых

усиливается после 18 часов шока.

белков теплового шока (29 и 16 кД)> коррелирующий со способностью линии кукурузы расти при повышенной температуре быстрее, чем при "нормальной", увеличивался после длительного действия высокой температур!.

3. Действие БТШ на клеточные объекты In vitro.

3.1. Действие БТШ на глшозо-6-фосфзтдэгидрогеназу при

инкубации In vitro.

Клеточные ферменты легко уязвимы для действия . высокой температуры, и поэтому весьма вероятный объект, на который действуют БТШ.

Fhjto проведены исследования влияния кукурузных клеточных белков на активность фермента глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы после совместной инкубации in vitro в условиях различной температуры. Оказалось, что клеточные белки оказывали сильное стабилизирующее воздействие на последующую активность указанного фермента после 10 минут инкубации в условиях высокой (45°С) температуры. Оно было выше стабилизирующего действия бычьегс сывороточного альбумина, более чем в 2 раза• при равно? концентрации белка. Еще более сильное стабилизирующее действж оказывали белки, выделенные из • подвергнутых тепловому ejokj

г

17/: j

' '' ал*

pin.; ri ~ & **

tl

so —

114 —

di-л sdr-\>

проростков кукурузы, то есть содержащие БТШ. При более низкой (05°С) температуре "разница между действием "контрольных" и

Рис. 2. Активность глюкозо-6- фосфат-двгпдрогеназы после прогрева при различных температурах. А ($)-процент сохраняющейся после прогрева активности; t-температура инкубации фермента в присутствии БСА(2); "контрольных"(3) и "шоковых"(4) белков; I -без белков.

"шоковых" белков не регистрируется (Рис. 2). Поскольку известно, что фракция белков проростков сои, обогащенная БТШ с молекулярной массой 15-18 кД, оказывает стабилизирующее воздействие при нагревании суммарного соевого белка In vitro (Jinn et al., 1989), мы предполагаем, что в нашем эксперименте проявляют себя те же белки или их функциональные аналоги.

3.2. Термостабильность БТШ и "контрольных" белков кукурузы и

других видов растений.

С целью изучения свойств БТШ и "контрольных" белков по отношению к экстремально высокой температуре проводили опыты по определению териостабильности этих кукурузных белков. Оказалось, что ряд "контрольных" белков с молекулярной массой (94 , 80, 54 , 52 , 44 , 40, 34 , 29-28 , 26 . 22-16, 15-13 кД) не денатурируют при кипячении в течение 3 мин. Среди БТШ термостабильными оказались белки с молекулярной массой 72, 52-49, 44, 40, 29-28, 26, 22-16 кД. При кипячении "контрольных" и "шоковых" белков происходило накопление двух груш белков с

%А 100

50

молекулярной массой 29-28 и 22-16 кД обладающих особенно повышенной термостабильностью. Эти белки, слабо синтезирующиеся в контроле (Рис. 3; А), хорошо заметны среди термостабилышх "контрольных" белков (Рис. 3; Б), "шоковых" (Рио. 3; В) и

Рис. 3. Флюорограмма белков трехсуточных проростков кукурузы общей (А, Б) и термостабильной фракции (В, Г, кипячение 3 мин). Время включения метки - 3 часа, при температуре - 27°С (А, В) и 41°С (Б, Г). Справа указаны молекулярные массы белков-стандартов (кД). Слева отмечены „„ БТШ 28-29 и 16-22.

29-

термостабильных "шоковых" белков (Рис. 3; Г). Следовательно, синтез этих белков с низкой интенсивностью происходит конститутивно. При тепловом шоке он значительно увеличивается. С помощью кипячения "контрольных" и "шоковых" белков мокко получить фракцию, обогащенную БТШ с молекулярной массой 28-29 и 22-16 кД.

Сравнение спектров термостабилышх белков кукурузы, окрашенных Кумасси (Рис. 4; 2), с флюорограммой тех ate белков (Рис. 3; Г) позволяет заключить, что терлостабидыщо белки низкой молекулярной массы составляют большую часть термостабильной фракции белков и постоянно присутствуют в метках проростков кукурузы. Кроме того,-группы белков той же молекулярной массы были обнаружены в термостабильной фракции белка проростков гороха, пшеницы и ржи (Рис. . 4; I, 3, 4). Оказалось, что дата филогенетически далекие виды, принадлежащие к двудольным и однодольным растениям, имеют термостабильные полипептида практически одной и той же молекулярной массы. Это позволяет предположить эволюционную консервативность и важность этих белков.

3.3. Действие термостабильных низкомолекулярных белков разных видов растоний на энергетическую активность изолированных митохондрий.

Поскольку митохондрии - весьма вероятный объект действия процессов адаптации к гипертермии, было исследовано влияние термостабильных белков кукурузы, гороха, пшеницы и ряда на активность изолированных митохондрий кукурузы при совместной инкубации in vitro.

Митохондрии, выделенные из побегов кукурузы, имели хорошую энергетическую активность. Инкубация их при 26°С в течение 30-90 мин привела сначала к резкой инактивации, а затем и к полному

Рис. 4. Спектры полипептидов термостабильных белковых фракций побегов гороха (I), кукурузы (2), пшеницы (3) и ржи (4). Полипептиды разделены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (градиент концентраций от 10 до 15й) в присутствии додецилсульфата натрия и окрашены раствором кумасси С-250. Справа указаны молекулярные массы белков-стандартов (кД). Слева обозначены наиболее крупные группы белков.

прекращению функционирования. Инактивацию митохондрий можно предотвратить, если в суспензию добавить внутриклеточный термостабильный белковый фактор, выделенный из побегов кукурузы. Свежевыделенные митохондрии после добавления белкового фактора несколько увеличили окислительную активность и в течение всего . эксперимента сохраняли ее на высоком уровне. Добавление к изолированным митохондриям побегов кукурузы термостабильных

12 3 4

белков из корней кукурузы, побегов гороха, пшеницы и рзки имело тот же эффект, что и добавление белков побегов кукурузы кукурузы (Рис. 5). Присутствие каждого из указанных белков в митохондриальной суспензии всегда приводило к сохранению высокой энергетической активности "изолированных митохондрий кукурузы во время их инкубирования при 26°С. Использованные в.работе растения отличаются по филогенетическому положению. Однако их белки оказывают сходное влияние на функции митохондрий кукурузы. Поскольку сроди термостабильных белков разных видов наблмдается значительное сходство по двум крупным группам белков с массами

х Уз 100 1

ео

60

40

20

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 МИН. Т

Рис.5. Действие термостэбильных растительных белков на фосфорилирующую . активность митохондрий. %У3 - фосфоршшрупцее дыхание митохондрий в процентах от первоначального; Т- время инкубации митохондрий в присутствии белков выделенных из корней кукурузы (В), побегов кукурузы (Б), пшеницы (Г), гороха (Д) и ржи (Е); А - без растительных белков.

28-29 и 14-22 кД сделано "предположение, что на изолированные митохондрии действуют именно эти белки. Выше было показано, что у кукурузы эти белки синтезируются конститутивно.

3.4. Локализация низкомолекулярных БТШ кукурузы в митохондриях при гипертермии. -

Поскольку локализация низкомолекулярных БТШ в митохондриях,

вероятно, связана с их действием на энергетическую активность этих органелл был исследован вопрос о том, находятся ли ассоциирующие при тепловом шоке ln vivo с митохондриями низкомолекулярные белки теплового шока внутри этих органелл. Как оказалось, с митохондриями при тепловом шоке связываются низкомолекулярные БТШ с массой 29, 25, 22, 20, 18, 17,5-16,5 кД (Рис. 6; Б). Часть из них - 25 , 22 , 20, 18 кД - локализовалась

А Б В Г Д Е

Рис. 6. Локализация низкомолекулярных полипептидов в митохондриях после инкубации в течение 3 часов при 26°С (А) и 41°С (Б-Е) в присутствии 353-метионина. Низкомолекулярные белки, ассоциирующие с митохондриями при "контрольной" температуре (А) и тепловом шоке (Б); белки митохондрий после обработки протеазой в течение 30 мин.: общие белки (В), не связанные с мембранами белки митохондрий (Г), экстрагируемые 1М КС1 (Д) или 1% Тритоном Х-100 (Е) белки мембран митохондрий. Слева указаны молекулярные массы белков-стандартов в кД. Справа отмечены БТШ. •

внутри митохондрий,. что было показано - обработкой митохондрий протеиназой К (Рис. 6; В). При этом БТШ 22, вероятно, прочно связывался с мембранами внутри митохондрий, поскольку не обнаруживался среди растворимых белков и слабо экстрагировался с мембран 1М КС1 и 1% Тритоном Х-100 (Рис. 6; Г, Д. Е). БТШ 29 и

f^,5-16,5 кД, по-видимому, ассоциировали с наружной мембраной митохондрий (Рис.6; Б).

4. Гипотеза о роли низкомолекулярных БТШ растений при

гипертермии.

Результаты, представленные в данной работе, согласуются с существующим предположением о том, что низкомолекулярные БТШ участвуют в развитии индуцируемой теплом термотолерантности (Vieriing, 1991). На основании описанных экспериментов и литературных сведений была выдвинута гипотетическая схема детализирующая ото предполокение.

Согласно этой схеме участие низкомолекулярных БТШ растений в адаптации клетки к гипертермии можно обрисовать следующим образом. Низкомолекулярныэ белки, имеющие термопротекторниэ функции, присутствуют в платке постоянно (раздел 3.2.). При резком повышении температура эти белхн оказывают защитное действие на белки (раздел ЗЛ; Jlnn et al., 1939; Radln et al., 1989), нуклеиновые кислоты (ÎJover et al., t989) и вдмбранн клетки (Kloppstech, 1585; Helm, Vlerllng, J 990). Одновременно нх синтез увеличивается (раздел 3.2.). Начинается также синтез новых, низкомолекулярных белков (раздел I.; Vlerllng, 1991). Часть этих белков связывается с митохондриями (раздел 3.4.; Войников и др., 1988; Chou et al., 1989) и хлоропластами (Adamska, Kloppstech, 1991) клетки, предохраняя их от повреждений, остальные- БТШ осуществляют защиту, других компонентов клетки. При этом многие макромолекулы подвергаются, возможно, при помощи низкомолекулярных БТШ модификации неизвестной природы, ведущей к повышению термостабильности молекулы при сохранении ее функциональной активности (Александров, 1975; Клячко и др. 1992). С течением времени действия*повышенной температуры синтез белков, участвующих в адаптации клетки, усиливается (раздел 2.; Necchl et al., 1987). Растет и число молекул, подвергшихся перестройке. Всё эти события, включая ассоциацию низкомолекулярных БТШ о органеллами, приводят к росту термоустойчивости метки и всего организма и к успешной адаптации целого растения.

вывода.

1. При тепловом шоке в проростках кукурузы синтезируется большой набор низкомолекулярных белков теплового шока. Состав этих белков генетически детерминирован и, вероятно, связан с адаптивностью растений к условиям повышенной температуры. Важное значение для адаптации растения к повышенной температуре имеют БТШ с молекулярной массой 29 и 16 кД. При отсутствии синтеза этих низкомолекулярных БТШ растения тепловой шок перекивают, однако растут в условиях повышенной температуры хуже, чем те растения,, у которых синтез данных белков происходит.

2. Белки теплового шока проростков кукурузы оказывают стабилизирующее действие на фермент глюкозо-6-фосфатдегидрогена-зу, предотвращая его денатурации под действием высокой температуры In vitro. Активность фермента при этом сохраняется.

3. Белки теплового шока с молекулярной массой 28-29 и 16-22 кД являются термостабилышми. Белки с аналогичной молекулярной массой синтезируются в клетках растений разных видов конститутивно, но их синтез увеличивается при тепловом шоке.

4. В клетках растений разных видов имеются сходные термостабильные белковк^ компоненты, которые необходимы для нормального функционировал митохондрий, и существуют, вероятно, общие механизмы взаимодействия этих белков и митохондрий.

5. Низкомолекулярные белки теплового шока с молекулярной массой 29, 25, 22, 20, 18, 17,5-16,5 кД ассоциируют с ипохондриями, причем БТШ 25, 22, 20, 18 локализуется внутри этих органэлл, где БТШ 22, вероятно, прочно связывается с мембранами. БТИ 29 и 17,5-16,5, по-видимому, обратимо связываются с наружной мембраной митохондрий. Пр*..налагается, что ассоциация низкомолекулярных БТШ с митохондриями ведет к стабилизации функциональной активности этих органелл в условиях гипертермия.

6. Синтез большинства низкомолекулярных белков теплового шока кукурузы продолжается длительное время поел* начала •

воздействия. Причем синтез белков с молекулярными массами 34, 30, 29. 16, 15,5-15, 9-14 кД значительно увеличивается после 18 часов гипертермии. Возможно, они принимают участив в процессах адаптации к гипертермии.

7. Факты, приведенные в работе, поддерживают предположение о участии низкомолекулярных БТШ растений в формировании индуцируемой теплом термотолерантности. Выдвинута гипотетическая схема, описывающая роль этих белков при адаптации к гипертермии. Эта роль заключается в действии низкомолекулярных БТШ на органеллы и другие структуры клетки, что приводит к повышению их термостабильности и сохранению функциональной активности при высокой температуре.

Основные публикации! по тема диссертации

1. Боровский Г.Б., Рудиковский A.B.. Войников В.К.

. отсутствие качественных различий в наборе белков теплового шока у различных видов пшеницы // Экологическая генетика растений и животных, тезисы докладов Всесоюзной конференции.- Кишинев, 1989.- С.58.

2. Боровский Г.Б. Белки теплового шока не различаются у пшениц с разными геномами // Тезисы докладов 2 Всесоюзной конференции молодых ученых. - Минск, 1990. - С. 42.

3. Боровский Г.Б. Защитное действие белков теплового шока кукурузы при прогреве глюкозо-б-фосфат-дегидрогеназы in vitro // Дел. научная работа.- С1ШЕР СО АН СССР, Иркутск, 1991.- N 2596-B9I.- 9 С.

4. Войников В.К., Побежимова Т.П., Варакина H.H., Боровский Г.Б. Энергетическая активность изолированных митохондрий кукурузы в присутствии белковых факторов из клеток гороха, кукурузы, пшеницы и ржи // Физиология и биохимия культурных растений.-1991;- Т.23, N 2,- С.173-17?.

5. Боровский Г.Б. Белки 'теплового шока предотвращают потерю активности глшозо-6-фосфат-дегидрогеназы при прогреве in vitro // Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среда, тез. докладов.- Новосибирск, I99I.-C. 88.

6. Боровский Г.Б.' Предполагаемая роль белков теплового шока при адаптации растительной клетки к повышенной температуре // Там «е, С. 89.

7. Borovsky G., Vojnlkov V. Protection or glucoae-6-phosphate dehydrogenase from heat denaturation in vitro by maize HSPa // Maize Genet. Coop. Newslett.- 1992,- V.66.- P.48.

8. Боровский Г.Б., Войников B.K. Локализация низкомолекулярных белков теплового шока на поверхности и внутри митохондрий кукурузы. // Физиология растения.- в печати.