Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез белков теплового шока в проростках огурцов и куколя при гипертермии

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Синтез белков теплового шока в проростках огурцов и куколя при гипертермии"

московских государственный университет нменн и. а Ломоносова

ологический Факультет

/ . ■ •

на правах рукописи

СТАРОСТЕНКО НИНА ВАЛЕНТИЯОВНА

СИНТЕЗ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО 10КА В ПРОРОСТКАХ ОГНРЦОВ И КЗКОЛЯ ПРИ ГИПЕРТЕРМИИ

03.00.12,- Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

. Б. и

Москва - 1992'

Работа выполнена в Инс~чтуте физиологии растений киек К-А.^имирязева РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Вл.В. Кузнецов. Официальные оппоненты: доктор биологических наук

В.Н. Гллкевич;

кандидат биологических наук' Л.Г. Косулина. Ведущее учреждение: ГБС РАН.

/Я"

Защита диссертации состоится 1992 г.

часов на заседании Специализированного Ученого Совет К. 053.05.14 но присуждению ученой степени )сладвдата Сиологичосга наук ,¿p;: KírciíOBCKOi»! государственной университета имени Ы.В. JIomc иосопа ло адресу: 110830, г. Москва, Леишкншо гори, Биалогнчес raí? факультет.

С диссертацией шкко ознакомиться в библиотеке Биологически го Факуль^та МГУ. г7

Автореферат разослан

■_1092 г.

Ученый секретарь Споциалкг.ировашгого совета

к.б.и. О.Г. Полесаал

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Температура является иним из фа»?го-ров, определяющих траншда распростронеяия видов и типы воздев ч аемых в различных регионах сельскохозяйственных и технических культур (Levitt, 1956, 1972; Максимов, 1952; Туманов. 1957). Интерес к исследованию механизмов адаптации растений : высоким температурам . резко возрос в последние голы в связи с открытом универсального и консервативного ответа всех живых организмов на тепловой кок (ТШ). Этот ответ характерг~уетсн быстрой активаций гено теплового пока, новообразованием кодируемых 'Mi по.'.'нпепти-дов - белков теплового пока (БТШ), - бдоккро.. .аи^ч "нормального" метаболизма и развитием - термотолерантнистц. В настоящ?е время достигнуты значительные успехи в изучении молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов ТШ (Gurley, Key, 1991) и высказали гипотезы о возможных биологических 'функциях некоторых индит'дуагл-яых БТШ (Scii.'eslnser, 1990). Креме того, получены косвенные доводы в пользу протекторной роли этих белков при гипертермии (Llridqulst.1836). В частности показано, что термотодерантнссть растений связана с синтезом НМ БТШ (Key et al., 1983; K^tshnan et al., 1989; Vahala et al-. „ 19S0), с новосбразог"чиеи БМ БТШ (Heus-LaRosa et al.. 1987), с' болг -je»! качественным- разнообразием и количественным содерлигчиэм синтезируемых БТШ (Fgrinn. Christa. 1990; Vahala et al., 1900), Вопрос о синтезе BTlü в и;п-а:;г.;::х ¡-астениях при гипертермии оставался до сих пор открытым. В г....,:т>зу их новообразования свидетельствуют косвенные данные ло включению ченых амшюкислот в БТШ изолированных клеток л органов, а та:осв по накоплении транскриптов генов ТШ при гипертермии■ (L'lndqulst, Crals, ■ 1S38; Heumann et al.. 1989). Однако, первая группа данных позволяет говорить о синтезе БТШ лииь в изолировали:« органам и" клетках, но не в иитактных растениях, поскольку растения, глк известно, являются ограниченными гомеотермами, сг.особнкли пелда-лт:. температуру тканей, по сравнении с температурой окружающего гозду-ха (Mahan, Kpahurch, 1988). По этой причине нельзя исключать, что новообразование БТШ в изолированных клетках и тканях при - высокой температуре не адекватно отражает их синтез в целом вегетируювги» растении. Вторая группа данных лишена этого недостатка. Вместе о тем, увеличение уровней транскриптов генов ТШ позволяет говорить только о синтезе соответствующих ыРНК, но не о синтезе колируемых

ими белков. Изучение синтеза БТШ в интактных растениях имеет

принципиальное значение для исследования проблемы коррекции клеточных защитных систем со стороны целого организма и выяснения закономерностей адаптации растений к. высоким температурам. ' •

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Цель настоящей работы состояла в исследовании закономерностей синтеза БТШ в условиях кратковременной и длительной гипертермии в интактных растениях ог'рцд и куколя, обладав« различной устойчивостью к высокой температуре. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1.-Изучить особенности,температурной и временной зависимости синтеза БТШ у различных по теплоустойчивости видов и сортов.

2. Исследовать органоспецифичность новообразования БТШ у растений огурца.

3. Выявить особенности функционирования системы БТШ в условиях адаптации и гибели растений. '•

• 4. Исследовать системы транспирацим и БТИ как факторы вшивания растений при длительной гкпертерюш. ■ ; .

НАУЧНАЯ НОВИЗНА " ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Впервые получены прлчие доказательства -новообразовати? ВТШ не в иэделышх системах,' а б целых ттагтт растениях при гипертермии. Показано, что БТШ определяли устойчивость растений лись в начальный момент действия п;г,ср™С'р;.с:и, тогда при Солее длительном действии ^йктора ' определяющая' било функционирование систем организ-Ммнного уровня регуляции. Это позволяет по-новому ■ взглянуть на место ;; биологическую рол!> БТШ в системе целого растения.

Проведен обстоятельный качественный у. количественный аналий вакономерностей синтеза БТШ в различных по термоустойчивости сортах и видах растений в условиях длительной и кратковременной гипертермии. Г-окат ''.о, что менее устойчивые растения реагировали на внезапное повышение тежературы более быстрым новообразованием БТИ. Активация система БТШ у этих растений пчела место яри более низкой температуре по сравнению с устойчивыми сортами и видами. Аналогичные закономерности были характера также и для различных по теплоустойчивости органов растений. Установлено, что устойчи-пне растения характеризуются более богатым качественным набором <..'Н'газируемых БТШ в условиях гипертермии и их. большей стабильностью.

Установлены особенности Зункцконкрованяя ВТШ в условиях летальной гипертермия. Показано, что при этом синтез БТШ являлся быстрым, не был транзитным й не имел заметной со: 'оспец-^кчности.

Исследование временной и температурной, зависимости синтеза БШ. у различных по термотолерантнссти растений пол -;.ло выявить критерии, существенные для отбора устойчивых генс^.^оа в селекционном процессе.

• АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положен}';л работы были додоу.эх' 2й Республиканской конференции молодел ксслед^чател^й "У.а.эдехь и современная наука" (Кишинев, 1Q89), 4й ^се -оюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки' О'анск, 19S0). нз 5м международном симпозиуме по регуляи я растите.?: ного ые?г<"'олиз-ма (Варна, Болгария, 1990) и на 2м-съезде BOSP (Минск, 1900).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 5 работ. *

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из вводе- ■ ния, обзора литературы, описания объектов и методов чередования, результатов и их обсуждения, а так^е выводоз и списка литература.

Работа изложена на ¡Р^ страницах маетноппского текста, содержит/?^ рисунков. Список использованной литера^ры г -.лхчаот наименование, из которых /Zfr-на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В качество объектов исследования использовал;:: Sx s; S дневные проростки двух сортов огурца (Cucunis sativus L.) - Маргедхансж'.э м Муромские и куколя (A^rostona^eithago L.). Раетсткя Еурая-сал::-, на 0,5 H растворе Кнсла (pH 6,2-6.4) при 27°С, к;;углосутсчпсм сс-педотщ (10 ic;:-:) относительной влажности воздуха СО УОХ.агл*. проведения опытоз пророст}« растеши помечали в. ¡самгры искусс- ■ тленного климата с ?е.\лзратурой оЗ°л 47°С, отаосигашпЛ тупостью воздуха GO'"., а тачке с температурой S3°C оросительной вдпхностъ» воздуха 02%. При подборе температурный условий ¿...луба-, -ции Проростков огурца были использованы некоторое литератур;;^ данные (Дроздов, 1931).

Теплоустойчивость растений определяли методом прогрева высечек в водном термостате с последующей оценкой аинесйососкостй ■ клеток с помощью светового иикроскоаа (Агекеаядроа. 1S63). а так-

же электролитическим методом (Перепада, Ивакин, 1976).

Температуру поверхности семядольных листьев измеряли с помощью рН-метра модели SA 520 фирмы "Орион" (США) с использованием электрода N.017002 в решаю измерения температуры.

Включение меченой аминокислоты проводили путем инкубации от-л.них частей растений (кончики' горней длиной 1 см, семядольные листья Зх днешш этиолированных проростков or 'а, височки (диа-' метром б ш) 8 дневных пророспсов огурца и куко^л) в улътратер-.мостато типа 2219 KiULT ITEXiP II (фирмы LKB) при определенной температуре на среде, содержащей IX сахарозу, 1пЭД К-фосфатный буфер (рН 6,0), хлора),(феникол (50. мкг/ыл) и

35S

-метиошш (12,0

Г1БК/моль, 4,0 МВК на пробу). При исследовании синтеза белю в нн-тактных проростках меченую аминокислоту (35£-метношш, 0,4 МБК на пробу) наносили на п-зерхности семядолей в растворе 1 мМ К-фос-фатного буфера (pli 6,0) и хлорамфеникола (50 мкг/мл) методом аппликаций. Продолжительность инкубации зависела от цели опыта. Про-Ьи брались в Зх биологических повторностях.

Гомогенизацию тканей и экстракцию белгав проводили в растворе 50 Ш трис-nci буфера (р!1 8,8), содержавшего 2% додицилсудьфат натрия (ДСП), 2%у$-моркаптоэтансла (^-МЭ) и 1 тЫ фенилметилсулМю-нилфторид (<ШСФ) согласно Лин и др. (Lin et al.. 1984). Общее содержание белка в препарате определяли по окрашиванию с амидовым черным (Бузун и др., 1982).

Денатурирующий электрофорез полипептидов осуцествляли в градиентном (8-20 X) полиакриламидном геле согласно Леммли (Learrmll, 1970) с некоторыми модификациями. Во всех экспериментах на каждый слот геля наносили выравненное по радиоактивности количество бедка ( 20000 имп/мин). В качестве маркеров использовали набор стандартных белков фирмы "Pharmacia" (Швеция). Флюорографию гелей проводили сог-асно (Swanstron, Shank, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Теплоустойчивость растений огурца и кужыш оценивали различиями способами. 06 устойчивости 8 дневных проростков судили ' по реасцки ' паренхимных клеток семядолей на пятиминутный прогрев. В качестве критерия устойчивости использовали температуры, вызывавшие гибель KDÏ меток (ЛТ50). Идпользуемые нами в работе растения существенно различаюсь по реакции на краткосрочный прогрев. Небольшая относительная устойчивость была характерна для сорта

_ б -

огурцов Маргеллаяские (ЛТ50 - 52,8+- 0,08°С), несколько меньлал -для сорта Муромские <51,0+0,05°С) и самая низка.. - для кук'хля (48,5+0,04°С).

; Весьма информативном для сравнения резистентности растений оказалось изучение динамики устойчивости огурца и куколя при температуре 38°С. При этом использовался электролит. ;есккй ме-юд оценки устойчивости. В этих условиях наблюдалось увеличение.устойчивости огурца и гибель куколя (рис. 1). Причем, при переносе растений огурца На повкгенную температуру устойчивость обоих сортов в зрастала уже "в первые 30 мин инкубации. 8ате>' происходило дальнейиее ее увеличение с последующим укеньпе. ч стабилизацией. Следует, заметить, что теплоустойчивость -сорта Мпргедл&чскке в течение всего изученного периода была визе теплоустойчивости сор- . та Муромские. Теплоустойчивость проростков куколя в первьг* час инкубации при 38°С была несколько нг'-е контроля, затем она повышалась, и достигала максимальной величины к 12 ч, оставаясь при этом ниже уровня теплоустойчивости проростков огурца. Дальнейшее падение устойчивости сопровождалось гибелью куколя.

Помимо перечисленных методов использовался и прямо« способ оценки устойчивости. Было показано, что растения ог-рца пошали при 1 47°С, тогда как проростки ку-оля погибали при значительно более низкой температуре (38°С).

Прежде всего мы,попытались выяснить особенности температурной зависимости синтеза БТШ в различных органах растений ' огурца, т.е. исследовать органоспецифичность функционирования данной ^а-" вдтной системы.

Исследование синтеза БТШ в изолированных корнях и семядолях Зх дневных проростков огурцов при различных температурах (25°, 40°, 43°, 45°С) показало, что в ответ на увеличение техятературы л инкубации наблюдалось ингибирование синтеза "нормальных" клеточных белков и новообразование БТШ, Ьтносящкхся к трем различным пс молекулярным массам группам: высокомолекулярные БТШ (ВМ БТШ) -100-68 ко, среднемолекулярные (СМ) - 62-32 ко и ниэкомолекулярные (ИМ) - 30-15 кО, При этом ВМ БТШ были электрофоретически близки у всех исследованных растений. Более сложным был набор КМ БТШ. Однако, и в этом случае различия касались в основном количественных характеристик синтеза полипептидов. Не были обнаружены качественные различия в синтезе преобладающих БТШ такке и у двух линий хлопчатника, различающихся по термоустойчивости (Репйег,

I I

■ 0 0,5 1,0 1,5 2,0 .2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 Т,0 0 0,5 1,0 1,5

В р е м я , с у т к и

Рис.I . Изменение теплоустойчивости проростков -огурца и куколя при 38°С и 47°С'

Обозначения: проростки куколя (л-д) „ огурца сорта Маргелланские Соо) и ЦуромскиеСпчз)

O'Connell. 1989).

" Несмотря на консервативность БТШ, имела место некоторая ор-ганоспецнфичность синтеза соковых белков в корнях и семядолях ах дневных проростков огурцов. Так. при жестком ОТ (43°,45°С) более активный синтез БТШ имел место в семядолях. При этом БТШ 22,5 и 15,5 обнаруживались только в семядолях, тогда как БТШ 93 - только в корнях. Различия между сортами касались также температуры начала или прекращения синтеза индивидуальных.2ТП. Полученные данные показывает, что в корнях сорта Муромские БТШ 22-,Б начинал синтезироваться при 35°С, а в корнях сорта Маргелланскиз этот полипептид синтезировался при 40°С.' БТШ 22 прекращал синтез значительно раньие в корнях сорта Муромские по сравнению с корнями сорта мар-гелланские.

Количественная оценка синтеза основных БТШ показала (рис. 2), что в семядолях происходило более пол:»эе "переключение" синтеза "нормальных" клеточных белков на синтез БТШ. Так доля БТШ составляла 40-50Х от всех вновь синтезированных белков для семядолей по сравнения с 12-25Х для корней.

Из представленных данных можно сделать вывод, что оптимальная температура синтеза БТШ для семядолей составляла 40°С. а для корней 35-40°С. Это свидетельствует о бсиьшй теплоустойчивости надземных органов по сраваенио с подземными.

Для более детального изучения ответа различных по устойч*-. вости сортов огурца на высокую температуру мы исследовали изменение дифференциальной экспрессии^генов во времени. На основании результатов предыдущих опытов кинетику синтеза БТШ изучали при 38°С. В результате полученных экспериментальных данных была выявлена органная и сортовая специфика ответа проростков ва TQ.

Сравнение синтеза БТИ в различных органах двух сортов огурца при непродолжительном ТШ (38°С) позволяло установить качественные различия лшь среди минорных белков (например. БТШ 39,5). Различия касались также и времени появления отдельных БТИ, таких как БТШ 82. Ряд минорных БШ или/и их аналогов с м.ы. 4S, 4-1, 31.5 kD глнститутивко синтезировалась лила» з растениях более термоустойчивого сорта, что могло Суть связало с {.ушсциоиироватяш конститутивных механизмов устойчивости.

В результате сопоставления интенсивности накопления и скорости но?ссбразсвгшия Б!,! БШ были сделаны впволн (рис. '-): 1) У сорта Мурсуокпе ярсхсхолвгэ Г к:? í::c¿*pco fcicr-те-

Температура, °С

Рис.2. Температурная зависимость доли синтеза (ВЫ+НШ Б1Ш в суммарном белковом синтезе семядолей и корней огурца.

Обозначения: Зх дневные проростки огурца сорта Маргел ланские (о-о) и Муромские (сиз).

а

Еч 1Д

Й 05

<и

ж я о

к «

о <=1

40

30

20

10

20

10

(ВМ+НМ) БТШ

ВМ НПО

БТШ 70

--О

2 4 6 0 2

Время,часы

4

6

Рис.3

Изменения доли синтеза БТШ в суммарном белковом синтезе семядолей проростков огурца при 38°С. -

Метка присутствовала в течение последнего часа (---) или всего периода инкубации С—) семядолей Зх дневных проростков огурца сорта Маргелланские (о-о) и Муромские( п-а),

ну.с> процесса синч ЕМ БТШ, что. по-видимому, обусловлено боль-юей чувствительностью Селоксинт эируадей системы к данной температура; 2) ВМ БТШ у сорта Маргелланские имели, очевидно, большую продолжительность жизни по сравнению с сортом Муромские, что могло бить одной из причин большей теплоустойчивости данного сорта.

Среди других ВМ Б'Ш особое внимание привлекает БТШ 72-74. Из рис. 3 ¿здно. что кинетика скорости синтеза и накопления БТШ 72-74 идентична кинетике синтеза суммарной фракции ЕМ БТШ. Можно на этом основании полагать, что новообразование БТШ 74-72 является индика.орсм на^пления фракции ВМ БТШ в клетках растений.

Результаты изучения скорости синтеза и накопления НМ БТШ свидетельствуют также о' том, что при быстром повышении температуры у обоих сортов начинался интенсивный синтез НМ БТШ (рис. 3). У неустойчивого к высоко температуре сорта происходило более быстрое увеличение синтеза БТШ, макс1!мальная величина которого достигала в первый час инкубации. Синтез БТШ у теплоустойчивого сорта развивался, ¡йшротив, гсхгшенно и достигал максимума лишь к 4 ч гипертермии. ВТШ теплоустойчивого сорта в отличие от БТШ неустойчивого к высокой температуре сорта характеризовались большей стабильность». Эти данные также свидетельствуют о большей конститутивной устойчивости растений более теплоустойчивого сорта.

Таким образом, исследование синтеза В1ИЗ на различных по тер-мотолерантнс-гн сортах гпурца показало, что синтез БТШ носил кратковременный характер. Существует сорто- и органоспецифичность отпе/а проростков на ТШ, которая проявлялась в качественных и количественных различиях синтеза индивидуальных полипептидов. Обнаружена ^олее быстрая активация синтеза БТШ у неустойчивого сорта по сравнении с устойчивым в ответ на повышение температуры.

Мочно было полагать, что обнаруженные закономерности синтеза могут быть Солее четко выражены на видах растений, адаптированных к различным температурным условиям. С этой целью в качестве теплолюбивого вида был. пи-прежнему, взят огурец, тогда как в качестве чувствительного к высокой температуре вида был выбран куколь. С За вида растений принадлежали к классу двудольных.

Изучение синтеза индивидуальных полипе-тидов в 2х сортах огурца и куколя показало, что синтез БТШ для куколя начинался при 30°С, для огурцов - при 32,Б°С. БТШ становились преобладающими полипептидамг при температуре, соответствующей первому максимуму белкового синтеза (рис. 4). Для куколя эта температура равнялась

г s 2

с S s с: о

х

к о >ч ш о 2,4

со

й

s X о К Е* ы а 1,6

V) cum со ->» аз 0,8

с— 5 a' s о с; щ

с* >3 0

25 30 35 Температура,

35с"1

Рис. 4. Температурная зависимость удельного поючения UJS-Me-тионина в суммарный клеточный белок в семядолях растений .

Обозначения:.8 дневные проростки куколя (л-д) и огурца copra Маргелланские (о-о) и Муромские (d-d).

St,,5°C, для огурцов - 35°С.

Полученные нами результат.: по включению 353-метионина показали, что у более теплоустойчивого вида максимум включения меченой аминокислоты сдвинут в область больвглх температур (см. пис. ¿к>. Анализ этих данных, а также данных других авторов (Key et al., 1Э83) позволяет нам предложить в качестве критерия теплоустойчивости в5!да величины температур макс:а?ального синтеза белка при та (точга! перегиба). Однако, данный критерий, по-видимому, не MO.Y3T использоваться для сравнения устойчивости различных сортов растений.

SDS-рчектрофорез полипептидов позволил обнаружить большое сходство в наборе синтезируемых БТШ у обоих видов растений. Качественные же различия касались в основном минорных БТШ. Так, например, БТШ 64 и SL были характерны для Ьгурцов, но не для куколя. В отличие о"1 видовых различий, качественных сортовых различий в синтезе полипептидов ТШ нами обнаружено не было..

Чувствительность-"нор. иц>ного" белкового синтеза к высокой температуре у различных по термоустойчивости видов неодинакова. Температур? блокирования ""нормального" синтеза белка ыокет слу-г;ть критерием оценки устойчивости вида. Тел, в семядолях 8 днев-ш-п проростков куколя при высокой температу; наблюдалось большее подч^злеккэ синтеза "нормальных" клеточных белков по сравнению с семядолями 8 дневных прор:. ;тков огурцов.

Помимо качественных характеристик в работе исследовали также и "ъличестченныеИзменения ВМ и Н.М БТШ, суммарной фракции "шоковых" полипептидов v индивидуального БТШ 70. Из графиков видно (рис. Р). что" в условиях ТШ синтез (ВМ+НМ) БТШ, ВМ БТШ и БТШ 70 шел знач: :ельно гчтивнее у менее теплоустойчивого вида. Доля синтеза ВМ и НМ БТШ при температуре выше 35°С у куколя превышала таковую у огурца. В то же самое время доля синтеза БТШ у более теплоустойчивого сорта огурца была выае, чем у более чувствительного к высокой температуре сорта.

Тати образом, в ыене"* теплоустойчивом виде куколе, синтезируется больше БТШ, чем в более теплоустойчивом виде - огурце. Повышенный пул БТШ в клетке может достигаться за счет увеличения скорости синтеза новообразования белков или за, счет увеличения доли БТШ в обцем клеточном синтезе. В растениях куколя, очевидно, имели место сЗе эти возможности.

Сравнивая синтеа .БТШ в-семядолях Зх и 8 дневных проростков

при различных температурах.

Обозначения: семядоли 8 дневных проростков куколя (л-л) и огурца сорта Маргелланские (о-о) и Муромские С оп).

огурцов, необходимо отметить уменьшение доли синтезированных БТШ с возрсстом (рис. 2, 5), которая составляла 40-50% в молодых про-РиСТКсЛ и 20% в более зрелых проростках огурца.

В~иее ооъективную информацию о функционировании системы БТШ ь целом растении может дать изучение синтеза БТШ не при температур воздуха, . а чри температуре поверхности ассимшпгрующих органов . Поэтому в дальнейшем ш исследовали изменение, температуры поверхности -"«¡ста проростков в условиях гипертермии.

На рис,6 представлены данные по динамике температуры семядольна; листьев при зюспсзиции 8 дневных растений в камере с температурой воздуха 33°С и 47°С. Они показывают, что несмотря па различия - теплоустойчивости, температура поверхности семядолей двух сорто! огурца не различалась. В то же самое время существовала видовые различия в изменении температуры семядолей. Так, при 38°f в первые 20 n:HH тешератур? листьев огурца резко возрастала до ЪЗ,5°С, тогда как для куколя - до 32/4°С, после чего стремительно пг. .ала й стабилизировалась на одном уровне. Для огурцов температура составляла 32,5°С. для куколя - 31,0°С. При 47°С температура семядолей огурцов возрастала до 36,2°С, после чего она стабилизировалась на уровне 35,5°С.

Следует отметить некоторые особенности „зменеНмя температуры семядолей при.длительной гипертермии. В случае адаптации растений проксходла Солее быстрая стабилизация температуры семядолей (в течение 30 мин), ..тогда как в случае их гибели этот процесс носил бо„ее медленный характер (1 ч). Это означает, что в первые минуты Till не наблюдалось и тенсквкого охлаждения листьев. Одинаковая интенсивность ох^ддения семядольных листьев у различных по устойчивости сортов 01,-рца при ТШ позволяет предполагать, что эти различия генотипов обусловлены система,(и, функционирующий не на ор-га..изменном, а, по-видимому, на гаеточном уровне.

Из серчи этих опытов следует, что для изучения роли БТШ в растениях принципиально важным представляется исследовние их Функционирования не при те лературе воздуха, а при температуре поверхности листа, поскольку именно температура ассимилирующих органо: определяет в конечном счете характер ответа растений на ТШ.

Поэтому функционирование системы БТШ в условиях адаптации и гибели исследовали при температуре поверхности семядолей. С этой целью проростки двух видов растений инкубировали при температуре

- проростков огурца и куколя при гипертермии. Обозначения: 0-о - огурец, дд - куколь.

S?°C, при которой ¿алела место адаптация проростков огурца и ги-бе:') проростков куколя.

ьри внезапном повышении температуры у огурца и куколя сни-йолся ашточ нормальных клеточных белков и одновременно активировался синтез БТШ, достигавший максимального уровня к 2 ч гипертермии (рис. 7,8). Сравнивая синтез БТШ у.этих двух видов необходимо ответить, что у огурцов наблюдалось большее качественное разнообразие БТШ. Специфическими для огурцов были БШ 64,0; 36,0; 23,5; 21,5; 21,0. Отдельные БТШ (100, 98 kD) синтезировались у куколя в течение б: :ее короткого времени, (б ч) по сравнению с огурцом (24 и 48 ч). С другой стороны, синтез БТШ 94 и 84 у огурцов довольно быстро, прекращался или снижался до контрольного уровня, в то время как у куколя новообразование этих полипептидов не носило сраженного транзитного характера. В проростках огурцов обнаруживалось кратковременное образование так называемых "раи-к:а" БТШ (30,0; £,3,5; 21,5; 21,u kD). Можно предположить, что эти' белки выполняют судественрто, возмолсно, сигнальную функцию в первичной реакции растений огурца на экстремальные температуры. В ov..Mc:e от огурца у куколя синтез полипептидов с м.м. 80,0 и 28,5 kD носил конститутивный характер.

Чля количественной оценки синтеза БТШ в растениях было провес чно сканирование электрофшоорограмм (рис. 8). В ходе адаптации растений пгстепенно укеньиался или/и прекращался синтез БТШ и наблюдалось усиление синтеза нормальных клеточных белков. В то же время в проростках куколя, которые погибали при 38°С, синтез БТШ сохраняясь длительное время на достаточно высоком уровне, а синтез нормальных бе^юв не восстанавливался. Это делало целесообразным ипследсоать закономерности функционирования системы БТШ в различных по устойчивости сортах огурца в условиях гибели.

С этой целью 8 дневные проростки огурцов помещали в камеру с температурой -,7°С и нормальной влажностью. При этом температура поверхности листьев поддерживалась на уровне 35,5°С (рис. б). Именно при этой температуре и исследовали синтез БТШ.

Р целом наборы БТШ в условиях адаптации и гибели принципиально не различались. В то же самое время обнаруживались и ряд различай. Так, при гибели растений появлялись некоторые.минорные пештептиды (44 , 40, 38 kD) и одновременно исчезали другие. Помимо этого, имели также ыэсто и изменения в динамике синтеза БТШ. При этом реакция двух сортов огурца на летальный ТШ (47°С) была

0

Рис. ?.

12 24 36 48 60 Время, часы

Изменения во времени удельного включения 5-метионина

в белок при температуре воздуха 38°С.

Включение, меченой аминокислоты проводили при температуре поверхности листа (си.рис. б ).

Обозначения: А- селадоли 8 дневных пророскоа огурцу есу-та ЯаргедяанскиеС сх>) и Цурсшекие{ »о> Да-

Рис. 8. Доля синтеза БГЛ от общей суммы синтезированных полипептидов {%) в семядольных листьях проростков при 38°С во времени.

Обозначения: 8 дневные проростки куколя (д-д) и огурца сорта Марг'елданские (о-о) и Муромские (d-d),.

чрезвычайно быстрой. Наблюдалась более интенсивна:. чндукция сзш-теза НМ БТШ. .Группа полипептидов ТШ синтезировалась в теченге всего периода гипертермии вплоть до гибели пророст,юз. логичная картина имела место в условиях гибели проростков куколя • (38°С). Однако, в отличие от куколя проростки огурца сохраняли большее-качественное разнообразие синтезируемых БТШ. Существенной особенностью синтеза БТШ з двух сортах огурца в условиях гибели, в отличие от условий адаптации, являлось отсутствие качественных разл1Г'ий в наборе БТШ и. идентичность временных характерно: :к ответа растений на внезапное повышение 'хемператугч.

Поразительное сходство обнаруживал;, и поличественные характеристики синтеза суммарной фракции ВТИ!, фракции ЕМ И I М БТШ во времени. Это, пснвидимому, обменяете., тем, что условия; повреждающего действия''фактора происходит мобилизация и формирование всех имеющгхся защитных ыехаянзмоз, налрав...пших на вы:.;квак.:е организма, ¡1 по этой причине возрастает удельный вес з ответе нос-пецифических защитных реакций. Гибель растений з зтс:.; олучг.э ::о-жет происходить от истощения энергетеяееггк и структур:".?; ресурсов, несбглалагрозанности процессов асс:з.!::ляцки и • нарушения регулятерных механизмов.' 7ак>:м ейразем, в условиях гибели проростков'наблюдалось нарушение транзитное?;:' с::л?оза Б?!:.', неспособность растений восстанавливать•репрёссированьл: высокой температурой "нсрмалькый"_ белковый синтез и переходить з адаптированное состояние. Защитная роль БТШ» по-еидюло>.г', реализовал сь на начальных этапах гипертермии.

Исследование новообразования БТШ при температуре поверхности листа дает более объективное представление об их функционировании в целом'растении в условиях гипертермии. Однако зьгивалке рзсте-^ ний при высокой температуре определяется функционированием не только клеточных защитных механизмов, но и механизмов оргаяизмзн-пого уровня регуляции. Поэтому для дальнейшего исследования чтого ■ вопроса был применен метод аппликаций, который позволяет изучать новообразование БТШ в интактных растениях.

■ Для изучения вклада БТШ и других клеточных защитных систем в -вшивание растений было необходимо исследовать функционирование системы ТШ при подавленном процессе транспирации. С этой целью проростки огурца помещали в камеру с относительной влажностью воздуха около 922 и с температурой 23°С. На рис.9 предстазлепа динамика температу-ч семядс -..стьев огурца сорта "лргелланс-

Рис. 9. Изменение темг^ратуры семадольных листьев проростков огурца сорта Маргелланские при различных температурах и влажности воздуха.

Обозначения: о-о - 38°С, отн.влажн.возд.60%; <ь-® - 57? . отн.влажн.возд.бОй; - 38°С, огн.влажн.в'оэд.92%.

Маргелланские при различных температурах и влажности воздуха.

Обозначения: см. на рис.9.

кие во влажной камере при температуре воздуха 38?С. а таете в га-, мерах с "нормальной" влажностью воздуха (60-70%) и температурой 38° И 47°С.

. Как показывает полученные данные, высокая.влахнооть воздуха препятствовала транспйрацил. Это сопровождалось пог'таеннем температуры семядолен огурцов на 3° по сравнению с температурой семядолей, лоббированных при той же температуре и'"обычной' платности воздуха. На подавление процесса трапепирк .ли ' указывали, как слабое снижение температуры семядолей по сравнешпо с темп т-ат^.-ой воздуха при ТШ, так и наблюдаемый в э*-ом случг- процесс гугта-гл. Интересно, что семядоли огурца, иикуби. овьдные в каморе при С/0С имели идентичную температуру (35,5°С). В обоих "случаях г. мперату-ра была критической, что проявлялось в снижении устойчивости к гибели растений (рис. 10). Проростки огурца, ■ иясубпрозашпгс- в камере с вл-мадость» 60Z- и температурой воздуха 38°С, напротив, адаптировались.

При этом в обоих случаях наблюдался синтез характерного набора Б ПЛ. Но в интактных растениях, как в контрольных условиях., так и при гипертермии, не обнаруяагвался синтез BTIÜ <3,Ь, гсоторый синтезировался при TL'! в изолирован'"'х семядолях. Зтот белок, вероятно, не был индуцировал механическим повреждением тканей при изолировании дисков, поскольку он не синтезировался в контрольных условиях (27°С). Удадорь та;ске обнаружить некоторые колетоствен-ные различия функционирования систем БТШ- в ингэктном рлстекшк. Они касались, прежде всего двух высокомолекулярных полипептидов о м.ы. 94 и 74 kD, а также группы низкомолекулярных ВШ - 20.5; 19,0 и 15,5 kD. В растениях, инкубированных Во влагягой камере, БИЯ появлялись уже в первые 15 м:ш. При этом, набподалась болеет интенсивная индукция БТШ, особенно КМ БТЛ1. Перед гибелью растений имела место резкая стимуляция синтеза и накопления КМ БТи. Очевидно, это накопление КМ БТШ можно рассматривать в качества кри- • терия неустойчивости вида. Последнее хорошо согласуется с ранее полученными дачными, согласно которым в первые 30 мин ТШ доля синтеза !!U БТЕ1 была значительно вызе в семядолях термочувстви-, тельного сорта. Следует обратить внимание па тот факт, ч?о черет 12 ч TTJ у растений, инкубированных во влажной jcaMepe, устойчивость падала (рис.10), и это падение сопровождалось снижением доли синтеза Bívf БТШ (100; 93; S4; 84; 72 kD), хотя доля ИМ БТШ оставалась, по-прежнему, высокой. В это время имела место активация

- и -

синтеза фракций СМ ВТО (м.м. 40,0; 35,0; 34,0; 31,6 кО). В отличие от этих условий, при инкубации огурцов в камере с влажностью 60Х и температуре 38°С к 12 ч уменьшалась скорость синтеза и доля НМ БТШ. Через некоторое время наблюдалось восстановление "иорА мальнш" полипептидов, что может указывать на адаптацию растений к гипертермии.

Следовательно, частичное ингибирование процесса траспирации на фоне активного синтеза ВТШ препятствовало переходу растений в адаптированное состояние, несмотря на то, что температура воздуха 38 С не являлась для данного вида летальной (рио. 10). Существенно отметить, что если в условиях влажной камер« (92X) растения погибали через 24 ч гипертермии (38°С), то в условиях нормальной влажности воздуха (60-70Х) и той же температуре они не обнаруживали признаков повреждена даже через 20 дней экспозиции. Это означает, что не БТШ или другие клеточные системы, а охлаждение тканей путем транспнрации определяло способность растений адаптироваться к длительном^ действию высокой температуры.

Анализ полученных экспериментальных данных свидетельствует о том, что индукция синтеза БТШ но предотвращала гибель растений и не обеспечивала их переход в адаптированное состояние. .Тем не менее, активация системы ПИ, даже при летальной гипертермии сопровождалась кратковременным увеличением устойчивости. Это означало, что БТШ выполняли протекторную функцию, очевидно, лишь на начальном этапе ответа растений на ТШ, когда еще не сформированы специализированные механизмы устойчивости. Полученные данные та:ске дополнительно свидетельствуют о различном функционировали!* системы БТШ в условиях адаптации и гибели, что является важным для понимания роли БТШ в выживании растений в'.экстремальных условиях.

Таким образом, получены прямые' доказательства новообразования БТШ но в модальных системах, как зто делалось ранее, а в.целых иншшшх растениях при гипертермии. Это означает, .что синтез БТШ является одним из ггмпонентег '¿.т^ашгаго ответа растений на бистрое повышенно температуры, ¿; пользу этого положения.свидетельствуют также косвенные данные по способности растений хлопчатника (Бигке е1 а1',, 1885) И сои (¡\impel, Кеу, 1985) синтезировать БТШ в ответ на дневное повышение температуры в нолевых условиях. При атом было установлено, что в листьях неорошаемых растений происходило накопление новых полипептидов, которые, по мнению авторов, являлись ВТШ ( Витке & а!.. 1886). Кроме того, наблада-

лось присутствие мРНК некоторых ВОТ в листьях орошаемых и неорошаемых растений. Причем, в условиях водного дефици.а уровень чРНК БТШ в растениях был более высоким, что могло быть обусловленг солее высокой температурой ассимилирующей поверхности го сравнению с температурой контрольных растений (Kimpel, Key, 1985). • . Рядом исследователей были выявлены на кукуру^э, геаеняг'4 и ячмене "ранние" и "поздние" БТИ (Cooper, Но, 1983; Ссср-ггЧ .1., 1984; Necchi et al., 1987). Все эти растения относятся к классу однодольных. У растений сои, которая пр;:на,чле.у.пт к классу двудольных, происходил синтез ранних БТ1". после чего гч уровень снижался .и восстанавливался синтез нормальны* к..~*то"яых белксз чКеу et al., 19S5). Наши исследования были проведены на растениях, относящихся к классу двудольных. При это4' также, как и у сои ке бы-, ли обнаружены "поздние" БТШ. Нельзя исключать, Что закономерность ответа на ТШ связаны с принадлежи" стыо того или ;щого растения к классу двудольных или однодольных. Тем не у.енее данное утверждение нуждается в Дополнительном изучении.

Существенным является тачг-е вывод о том, что экспериментазгь-ныэ данные о новообразовании БТШ при гипертермии, • полеченные ка модельных системах, не учитива'с^их способность рас гний пснг -ать температуру ассимилирувщкх органов не могут безоговорочно интерполироваться на целое растение. ■

/ .образом,. .вьазжзпие целого растения при высокой'температуре определяется функционированием уточных и сргаь.г:.!епнкх систем устойчивости. При этом БШ определяют, очевидно усто.;чи-ъость растений д:еяь в первый момент действия t;'i, toit'i процесс транспирации, ответственный за гашхелио температуры ассимилирующих органов, обеспечивает вклеивание организма в условиях длительной гипертермии. Функционирование системы Ы'Ш зависит от* термотолерантности исследуемого растения или его органа, ти ТШ и продолзительпости его действия, а также интенсивност.1 функционирования систем .надклеточного уровня организации.

• вывода . •

■ 1. Установлены качественные и количественные особенности синтеза БТШ в различных по устойчивости видах и сортах растений в условиях кратковременной и длительной гипертермии. Установлена органоспецифичность новообразования БТШ при высокой температуре.

?. Неустойчивые оррта и виды растений быстрее отвечали на внезапное повышение температуры активацией системы "шоковых" белков но сравнению с устойчивыми. При этом установлено, что теплоустойчивые растения в свою очередь характеризовались более богатым качественным набором синтезируемых при высокой температуре КГUL Специфическими для проростков огурца по- сравнению с куколем являлись полипептиды Т" с м. м. -64,0; 36,0; 21,5; '21,0 kD. БТШ устойчивых к высокой температуре растений, -в отличие от неустойчивых, имели более высокую стабильность.

' 3. Синтез БТШ при адаптации и гибели растений носил различный характер, ' Это различие проявлялось в нарушения при летальной гипертермии транзнтности функционирования системы БТШ, а также в отсутствии сортоспецифичности ответа на TÜL

4. Вперше - получены прямые доказательства новообразованна КГШ в целых интактннх растениях в условиях гипертермии.

Ь. Представлены доводы в пользу того, что экспериментальные данные о новобраэовании БТШ при■гипертермии, полученные на модельных системах, не в полной мере отражают их синтез в целом ве-гетирующем растении. .

6. -Системы устойчивости клеточного (БТШ) и организменного СП ирации) уровней регуляции практически одновременно активируй.. .i ври внезапном повышении температуры.

7. БТШ не обеспечивают переход растений в адаптированное состояние при длительной гипертермии.' Их защитная функция реализуется лишь 'на начальных этапах ответа растений на TUL

- 25 -

_ Список работ, опубликовааных по материалам диссертации:

1. Старостенко Н. В. Особенности стрессорного ответа различных по устойчивости сортов огурца к повышенной температуре. - В сб.: Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов, Уфа 1089, т.2, с.10.

2. Старостенко Н.В. Стрессорный ответ различных по устойчивости сортов огурца к высокой и низкой температуре. -. 4 Всесоюзная конференция молодых ученых по физиологии растений клетки. Минск, 1990. Тезисы докл., М., 1990, с.141.

3. Starostenko N.V. Adaptation of different themoreslstant cucumber plants to the high temperature. - Abstracts V International youth symposium on plant metabolism regulation. 8-13 october, Varna, Bulgaria, 1990, p.13.

4. Starostenko H.V., Kuznatsov VI.V. Heat-shock proteins and thermotolerance of cucumber seedlings. - Plant metabolism regulation. Proceeding of the Vth International Young Symposium "Plant metabolism regulation", Varna, Bulgaria, October 8-13, 1990. Sofia, 1991, p.359-362.

5. Старостенко П.В. Кузнецов Вл.В. Синтез бед1кзв теплового шока и регуляция стрессорного ответа у различных по устойчивости растений огурца. - Второй съезд всесоюзного общества физиологов растений. Тезисы дошгадов, II часть, М., 1992, с.199.

Старостенко Кипа Валентиновне Синтез белков теплового пока в проростках огурпов и куколя при гипертермии Автореферат

Подписано з печать З.П.92г.Тир.5Л 150.Заказ 131. " . Костромской ордена Трудового Красного Знамени технологический институт.