Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности метаболизма глицина в высших растениях

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности метаболизма глицина в высших растениях"

Воронежский государственный университет

На правах рукописи

БЫКОВА

Наталия Вячеславовна

ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ГЛИЦИНА В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 1996

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии растений Воронежского государственного университета

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Ивлев А.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник Любимов В. Ю.,

доктор биологических наук, профессор Пашков А. II.

Ведущая организация: Санкт-Петербургский госуниверситет

Защита диссертации состоится 21 мая 1996 года в 1330 час. л заседании Диссертационного Совета К 063.48.14 при Воронежском го сударственном университете по адресу: 394693, г. Воронеж, Универси тетская площадь, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библио теке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан апреля 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук,

доцент

Ковалева Т.А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

метаболизм глицина в растениях до настоящего времени имеет ряд малоисследованных аспектов. Внимание к нему было привлечено в связи с исследованием фотодыхания. Фотодыхание - это идущий на свету процесс выделения С02 и поглощения 0г, связанный с оксиге-назной реакцией центрального фермента фотосинтеза рибулозобисфос-фаткарбоксилазы-оксигеназы. Он включает гликолатнь:й и глицератный пути и осуществляется в результате взаимодействия хлоропластов, пероксисом, митохондрий и цитозоля.

' После открытия фотодыхания появилось представление, что, поскольку этот процесс связан с выделением части ассимилированного С02, его ингибирование может способствоввать увеличению продуктивности растений. Эксперименты в этом направлении не дали положительных результатов. Более того, торможение гликолатного пути имело целый ряд негативных последствий для жизнедеятельности растений. Было также сделано предположение, что у высокопродуктивных сортов большая часть фотсдыхательнсго углерода возвращается в цикл Кальвина. Важным аспектом данной проблемы является осмысление роли конкретных звеньев окислительного метаболизма в характере использования ассимилятов и приросте биомассы в целом.

Повышение продуктивности растений возможно в результате изменения структуры и организации метаболических путей, развития взаимосвязей между различными процессами целостного организма. При этом эволюция культурных растений не обязательно сопровождается увеличением интенсивности фотосинтеза. Как указывает А.Т.Мскроно-сов (1983), высокая удельная активность фотосинтеза становится фактором высокого урожая лишь при условии, если этот признак сочетается с рядом других параметров, в частности с хорошим ассимиляционным потенциалом и оптимальной структурой ростовых процессов.

В эволюции типов фотосинтеткческого метаболизма пероксисо-мальное фотодыхание явилось основой, над которой как бы надстраивались другие метаболические пути. Энергетически неэффективное пе-роксисомальнсе окисление, приводящее к образованию пула органических кислот и аминокислот, стало важным условием объединения реакций энергетического и конструктивного обмена, протекающих в разных компартментах клетки, в единую целостную регулируемую систему. Но при этом фотодыхательный процесс генерирует возможность синтеза

новых продуктов метаболизма и осуществления новых путей биохимических превращений в растениях (Игамбердиев, 1990).

Узловым пунктом гликолатного метаболизма является реакция окислительного декарбоксилирования глицина - один из осноеных пунктов регуляции редокс-статуса и энергетики фотосинтезирующей клетки. Метаболизм глицина - это важное связующее звено в фотоды-'хательном процессе. Его организация и возможность возникновения разветвлений в разных точках путей превращений, связанная с тек, что гликолаткый цикл может быть не полностью замкнут, представляет особый интерес для исследователей.

Кроме того, процесс утилизации глицина монет рассматриваться как- один из центральных путей азотного метаболизма растения. Известно, что синтез аминокислот на свету связан прежде зсего с функционированием фотодыхательного-азотного цикла с участием аммиака, образуемого в реакции превращения глицина в серин, и ферментной системы глутамкнсинтетаза-глутаматсинтаза (Измайлов, 1986). Другая сторона участия этого процесса в азотном обмене - это поставка интермедиатов для синтеза аминокислот.

Исследование особенностей метаболизации глицина необходимо для изучения взаимодействия ассимиляции углекислоты и азота и длг понимания роли окислительных процессов в обеспечении продуктивности растений.

Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы явилось изучение особенностей метаболизма глицина в различных тканях высших растений.

Задачи работы предусматривали:

1. Исследование путей электронного транспорта при окислительном декарбоксилировании глицина в митохондриях высших растений с разным типом фотосиктетического метаболизма (С3-, С4-растения), \ в различных тканях (фотосинтезирующей, этиолированной и жирозапа-сающей).

2. Определение причин преимущественного окисления глицина пс сравнению с другими дыхательными субстратами в митохондриях фотосинтезирующей ткани.

3. Выявление роли глиоксилатного цикла в образовании глицине з жирозапасающей ткани, проверка наличия в ней глициндекарбокси-лазного комплекса.

4. Изучение возможности фракционирования стабильных изотопо*

углерода С12 С,13 С) в глициндекарбоксилазной реакции.

5. Исследование разветвлений на участке превращения глицина в серии (метаболизация глицина в глициноксидазной реакции; превращение серина в пируват под действием сериндегидратазы).

Научная новизна.

Проведенные комплексные исследования расширяют представления об организации метаболизма глицина в растительной клетке.

Утилизация глицина осуществляется с участием различных путей электронного транспорта, включающих ротенок- и цианидрезистентный пути переноса электронов. Установлено, что только в фотосинтезиру-юцей ткаки глицин имеет преимущество перед всеми другими дыхательными субстратами, включая сукцинат. Выявлена активность глипинде-карбоксилазного комплекса (ГНК) как в зеленых, так и в этиолированных тканях С3- и С4-растений, причем самая высокая - в зеленых листьях С3-растений, что соответствует интенсивности фотодыхательного потока.

3 жирозаласакцих тканях растений обнаружено функционирование ГДК (максимум его активности совпадает с таковым глиоксилатного никла), и в некоторых случаях его активность сравнима с активностью в фотосинтезирующей ткани.

Впервые показано, что в ходе фотодыхания имеет место фракционирование изотопов углерода в глициндекарбоксилазной реакции. Это обеспечивает изотопные эффекты при фотосинтезе, помимо уже известных эффектов рибулозобисфссфаткгрбоксилазнсй реакции.

Обнаружена утилизация глицина в цитоплазме в ходе глициноксидазной реакции, в которой происходит дезаминирсвание глицина с образованием глиоксилата, дальнейшая метаболизация которого возможна в синтазной реакции цитоплазматической изоцитратлиазы и других процессах.

Серин, в свою очередь, под действием выявленного нами фермента сериндегидратазы в цитозоле и хлоропластах может превращаться з пируват. который далее декарбоксилируется с образованием аце-тил-СоА, а ацетил-СоА вступает в цикл Кребса в митохондриях и в реакции вторичного метаболизма в хлоропластах. Это.играет существенную роль в поддержании работы ЦТК на свету, когда гликолиз подавлен, и в интеграции дыхательного и фотодыхательного метаболизма.

Практическая значимость.

Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о механизмах сопряжения фотосинтеза и дыхания, фотосинтеза и фотодыхания, фотодыхания и метаболизма азота и органических кислот, о роли окислительных процессов в обеспечении продуктивности растений.-

Представляется важным анализ изменений изотопных "характеристик углерода для оценки вклада в фотосинтетическую продукцию различных путей ассимиляции С02, изучения взаимодействия ассимиляции углекислоты и азота. Особый интерес приобретает вопрос о механизме изотопной дискриминации 13С и его связи с молекулярными механизмами фотосинтеза и фотсдыхания. Подобный комплексный изотопный анализ имеет большое значение для изучения корреляций изотопных характеристик с наследуемыми полезными свойствами растений и их вариациями у разных генотипов, а также с параметрами внешней среды в целях оптимизации условий выращивания растений.

Материалы работы используются в учебном процессе бизлого-печ-вс-нного факультета Воронежского госуниверситета (общих курсах -"Биохимия" и "Физиология растений''', спецкурсах - "Дыхание растений" и "Фотосинтез").

Апробация работы/

Материалы диссертации были представлены и обсуждены на VIII Конгрессе Федерации европейских обществ физиологов растений (Антверпен, 1992); XXII Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (Стокгольм, 1993); III Съезде Российского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993); Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронен, 1995); X Международном конгрессе по фотосинтезу (Мон-пелье, 1995); Международном совещании "Дыхание растений: физиологические и экологические аспекты" (Сыктывкар, 1995); Научной сессии Воронежского госуниверситета (1995); II ежегодном симпозиуме Общества физиологов растений РАН "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 статей и 5 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Метаболизация глицина в клетках высших растений осуществляется с участием различных путей электронного транспорта, вклв-

чающих ротенон- и цканидрезистентный пути переноса электронов. Только в фотосинтезирующей ткани глицин имеет преимущество перед всеми другими дыхательными субстратами, включая сукцинат.

2. Окисление глицина митохондриями зеленых листьев растений С4-типа фотссиктетической ассимиляции вдвое ниже, чем С3-типа; а в этиолированных тканях вдвое ниже, чем в фотосинтезирующих.

3. 3 жирозапасающих тканях растений работает глициндекарбок-силазньй комплекс, максимум его активности совпадает с таковым глиоксилатнсго цикла и в некоторых случаях (щитки кукурузы) сравним с активностью з 'фотосинтезирующей ткани.

4. При фотодыхании имеет место селекция стабильных изотопов углерода 12С и 13С в глициндекарбсксилазнсй реакции. Обогащение биомассы тяжелым или легким изотопами зависит от того, какой стадией (образования Пиффова основания или разрыва С-С-связи) лимитируется скорость реакции в целом.

5. Глицин дезаминируется с образованием глкоксилата под действием фермента глициноксидазы, являющегося FAD-зависимым ферментом, подверженным субстратному ингибированию.

6. Сериндегидратаза в цитозсле и хлсропластах превращает часть фотодыхательного углерода из серина в пируват. Для ферментативной активности необходим пиридсксальфосфат, отмечается субстратное ингибирование.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа включает 144 страницы машинописного текста, 12 таблиц, 27 рисунков. Состоит из введения, девяти глав, заключения и вызодов. Список литературы содержит 155 работ, из них 41 отечественная и 115 зарубежных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В опытах использовали листья зеленых и этиолированных проростков пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Се-версдонская) и кукурузы (Zea mays L., сорт Воронежская 76), листья зеленых проростков гороха (Pisum sati vim L.. сорт Рамонский) и щитки кукурузы (того не сорта). В некоторых исследованиях использовали другие видь: растений, которые будут приведены при описании результатов исследований. Растения выращивали гидропонным способом в течение 5-14 суток на свету с 16-ти часовым периодом освещения или в темноте при 20-25°С.

При выборе видов растений руководствовались различиями в типах фотосинтетического метаболизма (С3 и С4).

Выделение клеточных органелл. Разделение клеточных фракций (цитозоль, хлоропласты, митохондрии) осуществляли методом дифференциального центрифугирования (Lernmark et al.. 1991). Для идентификации органелл во всех фракциях определяли активности маркерных ферментов. Маркером хлоропластов была NADP-зависимая глице-ральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (Winter et al., 1982). Маркером митохондрий был фермент фумараза (Schnarrenberger et al., 1971). Маркером растворимой фракции цитоплазмы была фосфоенолпируваткар-боксилаза (Gardestrom, Edwards, 1983).

Определение активности Ферментов. Определение активности гли-циндекарбоксилазы (КФ 2.1.2.10) прозодили радиометрически (Peterson, 1982), используя поперечные высечки или суспензию митохондрий листьев и щитков. Об активности глициндекарбоксилазы судили по ин-тесивности включения метки из 1-14С-глицкна в выделяющийся 14С02. Радиоактивность просчитывали на сцинтилляциокном счетчике СБС-2.

Активность глициноксидазы измеряли по образованию глиоксилата спектрсфотсметрическим методом. Определение осуществлялось с лак-татдегидрогеназой (ЛДГ) и NADH, что сопровождается окислением ÎIADH, регистрируемым при 340 нм. т.к. ЛДГ может восстанавливать глиоксилат до гликолата (Giacîietti et al., 1984). Выделение перск-сида Еодорода в глициноксидазной реакции определяли с помощью гваякола и пероксидазы из хрена при длине волны 460 нм (Гавриленко и соавт., 1975). Выделение аммиака определяли с реактивом Несслера.

Активность серикдегидратазы устанавливали по образованию пи-рувата спектрофотометрически с применением ЛДГ в качестве вспомогательного фермента, использующего в обратной восстановительной реакции пирузат и окисляющего NADH с поглощением при 340 нм.

Определение количества белка. Определение общего ксличестза белка в гомогенатах и во фракциях после осаждения сульфатом аммония определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951). Концентрацию белка на всех остальных стадиях очистки ферментов определяли также по Калькару (Мешкова, Северин, 1979).

Выделение и очистка глициноксидазы и сериндегидратазы. Для получения препаратов глициноксидазы и сериндегидратазы использовали метод многостадийной очистки. После гомогенизации растительного материала проводили фракционирование сульфатом аммония. От низко-

молекулярных соединений фермент отделяли гель-фильтрацией на сефа-дексе G-25. Затем применяли ионообменную хроматографию на ДЗ-АЭ-целлюлозе (ДЕ-32, "Whatman"). Были определены и отработаны конкретные условия проведения каждой стадии и особенности ее протекания в зависимости от растительного объекта, из которого выделялся фермент. Все операции проводили при температуре 0-4°С.

Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментоз. Кинетические и регуляторные свойства ферментов изучали на очищенных препаратах. Параметры ферментативных реакций -константу Михаэлиса (Км) и максимальную скорость реакции (V) - определяли, снимая показания активности при различных концентрациях субстратов. Искомые величины находили графически по Лэнгмюру-Хейн-су, исходя из зависимости s/v от s (где v - скорость реакции, s -концентрация субстрата). Для обоих ферментов наблюдалось субстратное ингибирование, что на графике выглядело как параболическая зависимость. Чтобы рассчитать параметры этой зависимости, проводили параболическую аппроксимацию по методу наименьших квадратов. Константу субстратного ингибирования (KS1) определяли по графику зависимости 1/v от концентрации субстрата, использовав значения нисходящей ветви кривой V от s.

Кнгибкторный анализ. Для торможенля отдельных звеньев метаболизма использовали соответствующие ингибиторы ферментов: цианид калия - ингибитор цитохромоксидазы, ротенсн - ингибитор комплекса I ЗТЦ митохондрий, салицилгидрсксамозую кислоту (СГК) - ингибитор альтернативной оксидазы, аминоацетонитрил - ингибитор глишндекар-боксилазного комплекса.

Определение изменения соотношения стабильных изотопов углерода_13С/12С в глшшндекарбоксилазной реакции. В экспериментах использовали митохондрии листьев, а не счищенный фермент, в связи с тем, что мультиэнзимный комплекс ГДК легко распадается на субъединицы, и получить его в функциональном состоянии в настоящее время не представляется возможным (Walker, Oliver, 1986). Митохондрии инкубировали в соответствующей среде с субстратом и кофакторами. Выделяющийся С02 собирали 20% КОН в течение 2 часов реакции, а затем, после добавления того же количества глицина, з течение 12 последующих часов, и переводили в нерастворимую ферму (ВаС03).

В экспериментах в качестве субстрата реакции использовали глицин фирмы "Реанал" с изотопным составом -25,6 °/00. В реакции с

нингидрином осуществляли декарбоксилирование глицина и улавливали выделяющийся С0г. Изотопный состав карбоксила глицина оказался равен -26,8 °/00. Подготовку образцов карбонатов, полученных при свя зывании выделившегося в реакции С0£, проводили по стандартным методикам (Cnoilet, Ogren, 1975). Измерения изотопного состава углерода проводили на изотопном масс-спектрометре МН-1201 В. В качестве стандарта принято отношение f13С/12 С] в карбонате кальция окаменелости Belemnltella americana формации Пи-Ди (Южн.Каролина, США), равное 1123.10"5 (Craig, 1957).

Статистическая обработка результатов. Все опыты, описанные в данной работе, проводили ке менее 3-4 раз, аналитические определения для каждой пробы проводили в трех повторностях. В таблицах к на рисунках приведены данные типичного опыта. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизводимы в каждом опыте. Отличия в контрольных и опытных сериях экспериментов анализировали традиционными способами с использованием t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990). Статистическую обработку результатов исследований проводили на IBX PC/AT с помощью пакета прикладных статистических программ "Statgraphics".

ОСОБЕННОСТИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ДЕКАРБОКСКЛИРОВАНИЯ ГЛИЦИНА В ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ, ЭТИОЛИРОВАННЫХ И ЖИРОЗАПАСАЮЩИХ ТКАНЯХ РАСТЕНИЙ

Влияние ингибиторов электронного транспорта и интермедиатов цикла Кребса на декарбоксилирование глицина в высечках листьев растений

Использование 1-14С-глицина для изучения глициндекарбоксилаз-ной активнссти в высечках листьев показало, что выделение 14C0Z было в 2 раза интенсивнее в случае пшеницы, чем в случае кукурузы (рис.1). Это соответствует низкой интенсивности фотодыхательного потока углерода в кукурузе, являющейся С4-растением, по сравнению с пшеницей (С3-растение). Выделение 14С0г этиолированными листьями пшеницы и кукурузы было вдвое ниже, чем зелеными.

Полученные результаты позволяют говорить об относительно высокой активности глициндекарбоксилазного комплекса в С4-растении и дане в этиолированной ткани. Последнее согласуется с данными Lern-raark et al. (1991) о том, что способность митохондрий из этиолированных листьев окислять глицин только вдвое ниже, чем митохондрий

1 2 3 4 3 6 7

Рис. 1. Декарбоксилиропание1-1,С-глицина зелеными листьями пшеницы и кукурузы

пшеница; ¡ТЩ кукуруза;

1 - контроль; 2 - цианид; 3 - СГК; А • рогенон; 5 - сукцинаг; б - мапат; 7 - изоцитрат

Рис. 2. Декарбоксилирование 1-14С-глицина этиолированными листьями пшеницы и кукурузы

пшеница; рЩ кукуруза;

1 - контроль; 2 - цианид; 3 - СГК; 4 - ротенон; 5 - сукцинаг

из зеленых листьев ячменя, пшеницы, гороха.

Добавление KCN приводило к незначительному (около 15%) снижению интенсивности декарбоксилирования глицина высечками зеленых листьев пшеницы и не оказывало влияния в случае зеленых листьев кукурузы (рис.1). В этиолированных листьях действие KCN было гораздо более выраженным: для пшеницы - 60% ингибирования, для кукурузы - 335? (рис.2). Это свидетельствует о том, что при зеленении декарбоксилирование глицина становится менее связано с окислительным фосфорилированием и осуществляется преимущественно через альтернативную оксидазу. Действие СГК было более выражено в зеленых листьях: 52% торможения метаболизации глицина в пшенице и 3355 - в кукурузе; в то время как в этиолированных листьях ее эффект был несколько меньшим в пшенице - 31% ингибирования и незначительным в кукурузе - 6%. Ротенон тормозил декарбоксилирование глицина в зеленых листьях пшеницы ка 20% и кукурузы - лишь на 9%; но в этиолированных листьях его действие было более выражено: 45? ингибирования в пшенице и 30% - в кукурузе.

Добавление сукцината приводило к активации в 1.7 раза декарбоксилирования глицина в зеленых листьях кукурузы. 3 зеленых листьях пшеницы влияния сукцината отмечено не было. В этиолированных листьях пшеницы и кукурузы сукцикат снижал интенсивность декарбоксилирования глицина на 20-25%. Согласно нашим данным, преимущественное окисление глицина в ЭТЦ митохондрий (в сравнении с таких субстратом, как сукцинат) формируется только в зеленых листьях растений. В этиолированных листьях сукцинат тормозил мета-болизацию глицина.

Преимущественное окисление глицина, не ингибируемое сукцина-том и другими субстратами, может быть связано с тем, что оно более легко может быть сопряжено с ротеноннечувствительным и цианидре-зистентным путями электронного транспорта. Это не означает, что окисление глицина в зеленых листьях полностью цианид- и ротенонре-зистентно, поскольку известно, что оно может существенно влиять на соотношение ATP/ADP в митохондриях и цитозоле (Gardestrom, Wigge, 1988). Однако в условиях интенсивного поступления субстрата (что моделировалось и в наших экспериментах) глицин, очевидно, может легко окисляться без продукции АТР, при этом окисление других субстратов (например, сукцината) подавляется (Игамбердиев, Родионова, 1992). В данном исследовании показано, что сукцинат может

даже стимулировать превращение глицина.

Исследовались также особенности окислительного декарбоксили-рования глицина в водном покрытосеменном растении вольфия [Wolffia arrhiza Kork.), которое является представителем семейства рясковых, деградировавшего в процессе эволюции и приобретшего некоторые морфологические и биохимические черты водорослей, в частности, экскретирование гликолата в окружающую среду (Игамбердиев, Заб-ровская, 1994). Окисление экзогенного 1-14С-глкцина в вольфии происходило в 4 раза менее интенсивно, чем в зеленых листьях пшеницы, в 2 раза - чем в кукурузе (рис.3). Это, очевидно, связано с тем, что в исследуемом нами растении гликолатный фотодыхательнкй поток не является полностью замкнутым, и часть гликолата легко диссоциирует в окружающую среду. Цианидрезистентный и альтернативный пути примерно одинаково принимали участие в окислении восстановительных эквивалентов, образующихся в результате работы ГДК. Ротенон икги-бировал векарбсксилирование глицина на &8%. что свидетельствует о преимущественной работе ротенончузствительной NADK-дегидрогенгзы. Полученные данные позволяют сделать вывод об отсутствии приоритета глицина перед другими субстратами з ЭТЦ митохондрий вольфии: сук-цикат тормозил окисление глицина на 20%, а малат - на 30%.

Таким образом, вольфия имеет ряд особенностей в утилизации глицина, которые отличают ее от других исследованных нами фотосин-тезирующих растений С3- и С4-типа.

Окислительное декарбоксилирование глицина митохондриями зеленых листьев гороха

Изучение глицикдекарбоксилазной активности в интактных митохондриях 14-дневных листьев гороха показало, что при окислении глицина участвует как цианидчуЕствительный, так и цианидрезистентный пути ЭТЦ митохондрий (рис.4). Так, KCN снижал выделение 54С02 при инкубации с 1-14С-глицином на 55%, ОГК - на 4455. Ротенон инги-бировал выделение 14С0г незначительно (в большинстве вариантов не более 15%), т.е. отмечено преимущественное участие ротенонрезис-тентной NADH-дегидрогеназы.

Присутствие в среде инкубации 0,15 мМ ADP практически не влияло на декарбоксилирование глицина, тогда как внесение 0,15 мМ АТР приводило к его торможению на 30%. При • этом работа различных участков ЭТЦ оставалась в тех же пропорциях. Декарбоксилирование

Рис. 3. Декарбоксилирование1- С-глицина талломами вольфии 1 - контроль; 2 - цианид; 3 - СГК; 4 - ротенон; 5 - сукцинат; 6 - малат

4

2

Рис. 4. Декарбоксилирование1- С-глицина митохондриями зеленых листьев гороха в присутствии ингибиторов и метаболитов

1 - контроль; 2 - цианцц; 3 - СГК; 4 - ротенон; 5 • сукцинат; 6 - малат

глицина не зависело от изменения концентрации ADP от О,25 мМ до 3 мМ и несколько тормозилось при изменении концентрации АТР (при 0,25 мМ АТР 14%, при 3 мМ АТР 18% подавления). Это свидетельствует о том, что даже при относительно высоких концентрациях АТР в митохондриях поток окисления глицина может практически не лимитироваться.

Проведенные исследования показывают, что при декарбоксилиро-вании глицина в состоянии 3 митохондрий зеленых листьев гороха с увеличением концентрации ADP возрастает роль цитсхрокнсго пути, работает ротенонрезистентная NADK-дегидрогеназа. В состоянии 4 подавляется цианидчувствителъный путь ЭТЦ митохондрий, нечувствительность к ротенону сохраняется. Это позволяет говорить о том, что в митохондриях зеленых листьев гороха существует контроль окислениея глицина со стороны ADP и АТР. зыражающийся в переключении различных участков дыхательной цепи, сопряженных или не сопряженных с окислительным фосфорилированием. Однако при относительно высоких концентрациях АТР мощность дыхательной цепи достаточна для утилизации больших количеств глицина, так как ЭТЦ митохондрий блокируется незначительно.

Изучение глкциндекарбоксилазкой активности в интакткых митохондриях 14-дневных листьев гороха подтвердило полученные нами данные на высечках зеленых листьев пшеницы и кукурузы с преимущественном перед другими субстратами окислении глицина в ЗТЦ митохондрий (в сравнении с сукцинатом и малатом). Более того, добавление сукцината приводило к активации в 1,4 раза декарбоксилирозания глицина, малата - в 1,1 раза (рис.4).

Изучение особенностей утилизации глицина в зкирозапасающих тканях растений

Введение 1-14С-глицина в высечки 5-днезных щитков кукурузы позволило установить наличие глициндекарбоксилазкой активности в жирозапасающей ткани и показало, что активность ГДК в ней сравнима с активностью в фотосинтезирующей ткани С4-растения (кукурузы) (рис.5). В сухих щитках ее активность составляла 13% от 5-дневных и далее в ходе прорастания семян возрастала, а с 6-го дня снижалась. При введении 1-14С-глицина ингибитор ГДК аминоацетонитрил блокировал декарбоксилирование на 60%, что свидетельствует о мета-болизации глицина преимущественно через ГДК в 5-дневных щитках ку-

1Й1 ёя 1 в!я III

Рис. 5. Декарбоксилирование 1-1<С-глицина разными органами кукурузы

1 - зеленые листья; 2 - этиолированные листья; 3 - щитки; 4 - колеогттили; 5 - стебли

Рис. 6. Декарбоксилирование1- С-глицина митохондриями щитков в присутствии ингибиторов и метаболитов

1 - контроль; 2 - цианид; 3 - СГК; 4 - ротенон; 5 - сукцинаг; е - малат

курузы. Окисление меченого глицина митохондриями щитков (рис.6) шло как по цианидчувствительному пути (43% ингибирования KCN), так и с участием альтернативной оксидазы (СГК тормозил на 30%), но при этом отмечено функционирование только ротенонрезистентной NADH-де-гидрогеназы.

В присутствии 0,15 мМ ADP декарбоксилирование глицина несколько интенсифицировалось. При этом возрастала роль альтернативной оксидазы (55% ингибирования СГК), а цианидчувстзительный путь был подавлен (KCN тормозил на 10%)., и активно работала ротенон-чувствительная NASH-дегидрогеназа (ротенон ингибировал на 42%). AT? существенно не влиял на окисление глицина. В щитках кукурузы не наблюдалось преимущественного окисления глицина в присутствии других субстратов. Сукцинат тсрмозил декарбоксилирование на 60%, малат - на 50% (рис.6). В колеоптилях и стеблях 7-дневной кукурузы установлена незначительная активность ГДК (25% от такэзой в щитках) (рис.5).

В жирозапасаюшкх тканях других растений также обнаружена активность ГДК: в эндосперме клещевины - 25% от активности в щитках кукурузы; в семядолях подсолнечника - 22%. 3 эндосперме клещевины и семядолях подсолнечника происходит активная утилизация жирных кислот и синтез углеводов, на которые в основном и направлен гли-сксилатный цикл, поэтому активность ГДК здесь значительно ниже. Со щитками кукурузы при прорастании сзязан интенсивный синтез белков., для которого глиоксилатный цикл поставляет оксокислсты, превращающиеся в аминокислоты при аминировании (глиохсилат, оксалоацетат) (Игамбердиев, Родионова, 1991). Источником углеводов при прорастании кукурузы в значительной мере является эндосперм. Очевидно, это объясняет высокую активность ГДК в щитках кукурузы.

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ СТАБИЛЬНЫХ ИЗОТОПОВ УГЛЕРОДА В РЕАКЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЯ ГЛИЦИНА

Во всех случаях изотопный состав С02, выделившегося при де-карбоксилировании глицина, заметно отличался от изотопного состава субстрата. В исследованных растениях, кроме гороха, наблюдалось обогащение выделившегося С02 13С относительно углерода субстрата (рис.7). Наибольшие различия в большинстве случаев наблюдались в первые два часа инкубации, в последующие 12 часов эффект оказывался несколько меньше, а для вольфии сводился к нулю. Максимальные

Рис. 7. Фракционирование стабильных изотопов углерода в глициндекарбоксилазной реакции

1 - ячмень; 2 - пшеница; 3 - пшеница (без кофакторов); 4 - шпинат; 5 - шпинат (без кофакторов); 6 - капуста; 7 - вопьфия; 8 - люцерна; 9 - горох; 10 - горох (без кофакторов)

изотопные эффекты отмечены для шпината, ячменя (5 13С =15-16°/00), меньшие (6 13С = 5-10 °/00) - для пшеницы, капусты, вольфии. При декарбоксилировании глицина митохондриями гороха в эксперименте с добавлением ТГФК, МБ+, АБР С0г, выделившийся в течение первых двух часов, имел изотопный состав, близкий к изотопному составу углерода глицина (5 13С = 0,4 °/00). Углекислый газ, собранный в последующие 12 часов, оказался обогащенным изотопом 12С Сб 13С = -7.8 °/00).

Полученные данные дают основание утверждать, что в реакции ферментативного декарбоксилирования глицина происходит фракционирование изотопов углерода, которое в большинстве случаев сопровождается утяжелением углерода С02, но может сопровождаться изотопными эффектами и другого знака (в случае гороха).

Согласно теоретическим оценкам (Ивлев, 1993), знак изотопного эффекта в реакциях ферментативного декарбоксилирования зависит от стадии, лимитирующей скорость реакции. Учитывая знаки изотопных смещений в экспериментах с митохондриями из различных растений, можно заключить, что в случае гороха общая скорость декарбоксилирования лимитируется стадией разрыва С-С-связи, з остальных случаях - стадией фермент-субстратного связывания.

Таким образом, в ходе фотодыхания имеет место фракционирование изотопов углерода в глициндекарбоксилазной реакции, что обеспечивает изотопные эффекты при фотосинтезе, дополнительные к известным эффектам рибулозобисфосфаткарбоксилазнсй реакции. Полученные данные показывают принципиальную возможность возникновения изотопных эффектов по углероду обоих знаков в фотосинтезирующих организмах при фотодыхании.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ПУТИ МЕТАБОЛИЗАЦИИ ГЛИЦИНА И СЕРИНА Превращение 'глицина в глиоксилат под действием фермента глициноксидазы

В зеленых листьях пшеницы и кукурузы обнаружена активность фермента глициноксидазы, катализирующего превращение глицина в глиоксилат с выделением аммиака и образованием перекиси водорода. Выделение аммиака в глицинсксидазной реакции было показано с реактивом Несслера, а пероксида водорода - с гваяколом и пероксидазой. Предположения о возможном существовании в растениях фермента, окисляющего глицин до глиоксилата, были высказаны гиггуск! (1972)

и Карпилсвым с сотр. (1978). Активность фермента отсутствовала з этиолированных листьях, появлялась и развивалась при перенесении растений на свет и уменьшалась по мере старения листьев.

Глициноксидаза как в пшенице, так и в кукурузе локализована преимущественно в цитозольной фракции, некоторая часть была ассоциирована с фракцией хлоропластов (3-13%), в митохондриях она соответствовала перекрестному загрязнению органелл. Градиентное фракционирование сульфатом аммония показало, что большая часть активности фермента выпадала в 35-50% фракцию. Трудности в очистке глициноксидазы связаны с потерей активности этого фермента в присутствии сульфата аммония. В дальнейшем при очистке фермента высаливание сульфатом аммония не применяли, гомогенат непосредственно подвергали гель-фильтрации на колонке с сефадексом С-25, а затем ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. После этого удельная активность глициноксидазы возрастала в 7,4 раза в пшенице и в . 7,1 раза в кукурузе.

Фракции, полученные после ионообменной хроматографии на дз-АЭ-целлюлозе, были использованы для определения свойств фермента. Максимальное значение активности глициноксидазы наблюдалось при рН 8,0-8,5. Кинетика выявляла гиперболический характер, имело место субстратное ингибирование. Сродство фермента к субстрату в пшенице было выше, чем в кукурузе (табл.1).

Таблица 1

Физико-химические характеристики глициноксидазы зеленых листьев пшеницы и кукурузы

Растение Км, мМ KS1, мм рК оптимум Активация

FAD FMK

пшеница 0,78 ± 0,03 19, 2 + 3,2 8, 0 1.6 1, 3

кукуруза 1,49 ± 0,06 17,5 ± 2,9 8.0 1,7 1,5

В присутствии 5 мкМ FAD активность глициноксидазы возрастала в 1,6-1,7 раза. Таким образом, глициноксидаза - FAD-зависимык фермент, в качестве заменителя FAD может выступать FMK.

Глициноксидаза резко ингибировалась 1 мМ KCN, а ингибитор глициндекарбоксклазы аминоацетонитрил почти не влиял на ее активность. Это свидетельствует о том, что глициноксидазная активность

не является побочной активностью глициндекарбоксилазного комплекса, а представляет собой результат работы отдельного фермента. Установлено, что в ходе зеленения актиномицин В почти не оказывал влияния на синтез глициноксидазы. Это свидетельствует о том, что синтез фермента идет не на уровне транскрипции. Циклогексимид проявлял ингибирование активности глициноксидазы к седьмому часу зеленения. Вероятно, синтез глициноксидазы при перенесении растений на свет осуществляется на уровне трансляции.

Превращение серина в пируват под действием фермента сериндегидратазы

В зеленых листьях пшеницы и кукурузы выявлена активность фермента сериндегидратазы, катализирующего превращение серина в пируват с выделением аммиака. Выделение аммиака в сериндегидратазной реакции было показано с реактивом Несслера. Возможность существования фермента, преобразующего серии в пируват, высказывал Карпи-лов с сотр. (1978). Активность фермента отсутствовала в этиолированных листьях, появлялась и развивалась при перенесении растений на свет, уменьшалась по мере старения листьев. Значительная часть активности сериндегидратазы и в пшенице, и в кукурузе локализована в цитозоле (58-60%), 28-30% - в хлоропластах, некоторая часть (13-1555) ассоциирована с-фракцией митохондрий.

Градиентное фракционирование сериндегидратазы сульфатом аммония показало, что большая часть активности фермента выпадала в 35-50% фракцию. Трудности в очистке сериндегидратазы (как и в случае глициноксидазы) связаны с потерей активности этого фермента з присутствии сульфата аммония. Высоленную фракцию подвергали гель-фильтрации на колонке с сефадексом 0-25, после чего удельная активность сериндегидратазы возрастала в 1,92 раза в пшенице и в 2,64 в кукурузе. Фракции, полученные после гель-фильтрации на се-фадексе С-25, были использованы для определения свойств фермента.

Активность сериндегидратазы была наибольшей при рН 7, 0. Кинетика выявляла гиперболический характер, имело место субстратное ингибирование. В кукурузе было выше сродство фермента к субстрату и выше константа субстратного ингибирования (табл.2). Для ферментативной активности сериндегидратазы необходим пиридоксальфосфат.

Таблица 2

Физико-химические характеристики серикдегидратазы зеленых листьез пшеницы и кукурузы

Растение Км, мМ К3 ! , ММ рН-оптимум

пшеница 0,80 + 0,03 4,3 + 0,7 7,0

кукуруза 0,45 + 0,02 37,7 + 6,3 7, 0

Таким образом, проведенные исследования доказывают существование дополнительных к ранее известным путей превращений глицина и серина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Метаболизм глицина является важным связующим звеном в фотодыхательном процессе к вносит существенный вклад в регуляцию ре-докс-статуса и энергетики фотосинтезирующей клетки. Его организация и возможность возникновения разветвлений в разных течках путей превращений, связанная с тем, что гликолатный цикл может быть не полностью замкнут, представляла для нас особый интерес.

Проведенные исследования позволяют предположить возможную организацию метаболизма глицина в фотосинтезирующкх растительных клетках (рис.8). Глицин образуется в пероксиссмах на свету в ходе фотодыхания и транспортируется в митохондрии, где подвергается окислительному декарбоксилироЕанию с образованием серина. Поток образования глишна столь интенсивен, что выработались механизмы преимущественного окисления его е ЗТЦ митохондрий по сравнению с другими субстратами. Утилизация глицина осуществляется с участием различных путей электронного транспорта, включающих и ротенонре-зистентную МБН-дегидрогеказу. и альтернативную оксидазу. Проведенные исследования показали, что с метаболизмом глицина связано и фракционирование стабильных изотопов углерода 12С и 13С в реакции окислительного декарбоксилирования глицина, катализируемой глицин-декарбоксилазным комплексом.

Возможна утилизация глицина в цитоплазме. В ходе глицинокси-дазной реакции происходит дезаминирование глицина с образованием глиоксилата, дальнейшая метаболизация которого может осуществляться в синтазной реакции цитозольной изоцитратлиазы и в других процессах. серии, в свою очередь, под действием серикдегидратазы мо-

Хл

ибулозо-1, 5-бисфосфат

фосфоглицерат АТР-

3-\

фосфогликолат

£

г-лицерат

гликолат

Н,о -Р"

глицерат

гликолат

чшруват

.сукцинат^--

(цикл Кребса] ^—

■ ацетил-СоА

-йЗоцитрат ' -НАЭР+ ■?«.ВРН2

2-сксбглутарат *

глутамат

Рис. 8. Организация метаболизма глицина в растительных клетках

Хл - хлоропласт; Пер - пероксисома; Мтх - митохондрия; С1 - убихинон; Ц - цитохромный путь электронного транспорта; АО - альтернатизная оксидаза

кет превращаться в пируват, который в митохондриях декарбоксилиру-ется до ацетил-СоА, а ацетил-СоА вступает в цикл Кребса. Это, возможно, играет существенную роль в поддержании работы ЦТК на свету, когда гликолиз тормозится, и в интеграции дыхательного к фотодыхательного метаболизма.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что утилизация глицина в клетках высших растений осуществляется с участием различных путей электронного транспорта, включающих ротенон- и цианидрезистентный пути переноса электронов. Обнаружено, что только в фотосинтезирующей ткани глицин имеет преимущество при окислении образующегося в глициндекар-боксилазкой реакции NADK в ЭТЦ митохондрий перед всеми другими дыхательными субстратами, включая сукцинат.

2. Выявлена активность глициндекарбоксилазного комплекса каь в зеленых, так и в этиолированных тканях С3- и С4-растений, причек самая высокая - в зеленых листьях С3-растений, что соответствуем интенсивности фотодыхательного потока.

3. В митохондриях фотосинтезирующих тканей С3-растений существует контроль за окислением глицина со стороны ADP и АТР, выражающийся в переключении различных участков дыхательной цепи, сопряженных (состояние 3) или не сопряженных (состояние 4) с окислительным фосфсрилированием. Однако даже при относительно высоки) концентрациях АТР мощность дыхательной цепи достаточна для переработки больших количеств глицина.

4. В жирозапасающих тканях растений обнаружено функционирование ГДК, и максимум его активности совпадает с таковым глиоксилат-ного цикла. В некоторых случаях активность глициндекарбоксилазнои комплекса в жирозапасающих тканях сравнима с его активностью в фотосинтезирующей ткани (как, например, в щитках кукурузы).

5. Установлено, что в жирозапасающих тканях растений окисление глицина сопряжено с работой различных путей электронной транспорта, включающих ротенонрезистентную NADH-дегидрогеказу, альтернативную оксидазу, однако отмечена преимущественная активность вданидчувтвитехьного пути переноса электронов.

5. Впервые показано, что в ходе фотодыхания имеет место фракционирование стабильных изотопов углерода (12С и 13С) в глицинде-карбоксилазной реакции. Это обеспечивает изотопные эффекты при фо

тосинтезе, помимо уже известных эффектов рибулозобисфосфаткарбок-силазной реакции.

7. По сразнению с изотопным составом углерода карбоксильной группы свободного глицина углерод образующегося в глициндекарбок-силазной реакции С02 может быть обогащен как легким, так и тяжелым изотопом в зависимости от того, лимитируется общая скорость реакции стадией образования фермент-субстратного комплекса или стадией разрыва С-С-связи и выделения С02.

8. Обнаружена утилизация глицина в цитоплазме в ходе глици-ноксидазной реакции, в которой происходит дезаминирсвание глицина с образованием глиоксилата, выделением аммиака и персксида водорода. Максимальное значение активности глициноксидазы наблюдалось при рН 8,0; кинетика выявляла гиперболический характер, имело место субстратное ингибирозание. Глициноксидаза является FAD-зависи-мым ферментом, синтез которого индуцируется светом на уровне трансляции.

9. Серии под действием выявленного нами фермента сериндегид-ратазы в цитозоле и хлоропластах может превращаться в пируЕат с выделением аммиака. Активность сериндегидратазы была наибольшей при рН 7,0. Кинетика выявляла гиперболический характер, имело место субстратное ингибировакие, для ферментативной активности необходим пиридоксальфосфат.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Igamberdlev A.U., Bykova К.Y. The presence of glycine oxidase and serine dehydratase in wheat and maize leaves // Abstracts of the 8th FESPP Meeting. Physioiogia piantarum. 1992. Vol. 85. IJ 3. Part 2. Abstr. 292.

2. Игамбердиев А.У., Быкова H.E. Особенности фотодыхательного окисления глицина и его роль в обеспечении взаимосвязи фотосинтеза и дыхания // III Съезд Российского общества физиологов растений. Тез. докл. Санкт-Петербург. 1993. С. 116.

3. Igamberdiev A.U., Bykova N. V. Glycine oxidase and serine dehydratase in green leaves of wheat and maize ana their possible role in photosynthetic metabolism // Photosynthetica. 1993. Vol.29. N 4. P. 499-506.

4. Игамбердиев А.У., Быкова H.В. Влияние ингибиторов электронного транспорта и сукшшата па декарбоксилирование глицина в

листьях -пшеницы и кукурузы // Физиология растений. 1994. Т.41. Вып.З. С.395-398.

5. Igamberdiev A.U., Bykova N.V. Glycine metabolism in wheat and maize leaves // 22 Congress of FEBS. Book of Abstracts. Stockholm, 1993. Abstr. B23: 319.

6. Ивлев А. А., Быкова H. B.,' Игамбердкев А. У. Фракционирование стабильных изотопов углерода в глициндекарбоксилазной реакции // Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов. Материалы международного симпозиума, ВГУ, 29 мая-1 июня 1995 г. Воронеж, 1995. С.60-63.

7. Igamberdiev A.U., Bykova N.V. Metabolic pathways of glycine and serine conversion in photosynthetic plant cell // Photosynthesis: from Light to Biosphere, Vol.5 (P.Mathis, ea.). Proceedings of the 10th International Photosynthesis Congress, August 1995. Montpellier, France. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1995. P. 367-36S.

8. Быкова H.B., Игамбердкев А.У. Окисление глицина з фотосин-тезирующих и гетеротрофных тканях растений // Дыхание растений: физиологические и экологические аспекты. Международное совещание, 11-16 сентября 1995 г. Республика Коми, Сыктывкар, 1995. C.27-2S.

9. Ивлев А.А.. Быкова Н.В., Игамбердиев А.У. Фракционирование стабильных изотопов углерода (13C/1ZC) в ходе ферментативного де-карбоксилкрования глицина митохондриями листьев различных растени; /'/Физиология растений. 1996. Т. 43. Вып. 1. С. 43-48.

10. Bykova N.V.. Igamberdiev А.и. Oxidation of glycine by mitochondria of higher plants // Physical and Chemical Basis o: Plant Physiology. Annual Symposium, 5-8 February, 1996, Penza. Abstracts. Pushchino: Pushchino Research Centre, 1996. P.20.

11. Ivlev A.A., Bykova N.V., Igamberdiev A.U. Fractionatioi of carbon isotopes during photorespiration // Physical and Chemical Basis of Plant Physiology. Annual Symposium, 5-8 February,

1995, Penza. Abstracts. Pushchino: Pushchino Research Centre

1996. P. 26.

12. Ivlev A.A., Bykova N.V., Igamberdiev A.U. Fractionatio: of carbon isotopes in glycine decarboxylase reaction // FEBS Lett 1996 (принято к публикации).

Заказ Ц8 от 1996 г. Тир. 100. Лаборатория оперативной полиграфии ВГУ.