Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Карбоксилирующие ферменты и регуляция ассимиляции СО2 у высших растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Карбоксилирующие ферменты и регуляция ассимиляции СО2 у высших растений"

я

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи УДК 581.1:577.15

АБДУЛЛАЕВ Абдуманон

КАРБОКСИЛИРУЮЩИЕ ФЕРМЕНТЫ й РЕГУЛЯЦИЯ АССИМИЛЯЦИИ СО, У ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

03.00.12 — физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ДУШАНБЕ — 1933

Работа выполнена в Институте физиологии к биофизики растении ЛИ Рос публики Таджикистан.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член-корреспондент АН Республики Таджикистан, доктор биологических па ук, профессор М. М. Якубова,

доктор биологических паук, профессор С. Рахманкулов,

доктор биологических наук В. П. Беденко.

Ведущая организация — Институт физиологии растении им. К. А. Тнмнрн зева Российской Академии наук.

Защита состоится « » 199&| г. в \0 ~ ч. па засола

пии специализированного совета (Д 013.08.0!) по защите диссертации на соне канне ученой степени доктора паук в Институте физиологии и биофизики рае тений АН Республики Таджикистан (734063, г. Душанбе, ул. Ашш, 299/2).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотек им. Инднры Ганди АН Республики Таджикистан.

Автореферат разослан « 1 »

Ученый секретарь специализированного совета, / доктор биологических наук |

1993 г.

10. И. ЛЮЛО ГКО векш

Актуальность теми. Веб выедое растения по типу первичного карбоксилирования могут быть разделены га 3" основные группы: С3-, С4- и (Ж-растеыш (Calvin, Baoshnm, 1957; Hatch, Slack, I2G8; Spalding et al., 1999; Ku et al., 19Ш). £o всех группах растений ключевую роль в фиксации COg играет рибулозобис-фосфаткарбоксилаза. Именно с участием этого уникального по своей природе и функциям фермента происходят 2 важнейших процесса метаболизма растений: фотосинтез и фотодыхание.

Так как у всех без исключения высших растений основу фотосинтетического метаболизма углерода составляет цикл: Кальвина с РЕФ-карбоксилазой в качестве ключевого карбохеиликэдгго фермента, то для повышения :;нтенси:шсти фотосинтеза как вадного компонента проекционного процесса разрабатывается ряд подходов, связанных с повышением карбоксилааной активности фермента путем изменения его структуры ( loriner, Andrews, 1973; Еах-Ъег, 1981), содержания (Maklno et al., 1964; Cainдэиva, 1966), субстратной специфичности (Prierce, 1286) и оптимизации условий внешней среды (Эдварде, Уокер, 1966).

Факторы внешней среда, как известно, могут влиять на скорость реакций фотосинтетической ассимиляции углекислого газа у растеякй и, вследствие этого - та продуктивность фотосинтеза. Многими авторами показано влияние концентрации СС^, интенсивности и качественного состава света (Воскресенская, 1975), а также температуры (Андреева и др., 1979) на активность РБФ-карбок-силаэы. Однако опубликованные данные довольно противоречивы к страдают действие кавдого из исследованных факторов в отдельности, вне взаимосвязи друг с другом. Эффект совместного влияния внешиîx факторов на фотосинтетический аппарат изучен недостаточно .

В конце 70-х годов была предложена модель механизма концентрирования GOg в растительной клетке и реассиыиляции фо-тодилчння С^-растением (Насыров, 1982). Исследование реакций С, ^-метаболизма углерода в хлорошастах Сд-раетений важно для п оучения ответа на вопрос, возможно ли повышение продуятишос-•'-н с участием. ферментов синтеза й ыетаболизка Cj-дикарионовых :ислот, или их функция связана с проявлением чувствительности к воздействию неблагоприятных факторов среды.

0дн.;м из наиболее реальных подходов к активизации фикса-

а-

цйи 00^ является гекетико-селекционное повышение активности фо~ тосинтетаческого аппарата (Куиаков, IS77; Насыров, 1962). Гете-рсзисшо формы растений можно использовать как модель с улучшенными фотосинтетическиия свойствами, с помощью которой ыокно выявись механизмы оптимизации работа фотосинтетического аппарата и продукционного процесса в целоы.

Дня более глубокого изучения многообразия проявления фотосинтетического метаболизма углерода, его взаимосвязи с другими . метаболическими процессами, Еыяенеиия регуляторных механизмов »этих взаимодействий и выявления особенностей управления продукционным процессом в цздои в круг исследований вовлекается разнообразна ассортимент растений Шокроносов, 1963). В связи с этим представляет интерес хлопчатник - свето-теялолвбивое растение с очень продолхитезьшы вегетационным периодом, отдельные этапа которого в условиях резко континентального клииата Таджикистана совпадают с действием высоких близких х экстремальна*! температур и атмосферной засухи. Хлопчатник иожет служить моделью для исследования особенностей фотосинтетического иетабо-. лнзма углерода и дед-Лзльноети ферментов карбохеилировакия б процессе адаптации к этил условиям как ка уровне отдельных листьев, так и на уровне целого растения, с учетом донорно-акцап-торных взаиьоотксиений ыеаду его органами.

• Известно (Эдварде, Ускер, 1986), что основную роль в фотосинтетической фиксации COg играет ?Е$- и $ЕП-карбоксилаза, в ' свйз): с чем необходимо всестороннее изучение возиогшостм их уч?сшй в регуляции фиксации COg, выявление реальности функционирования тех или иных щ/тей фстасинтетичеокого метаболизма углерода у Сз-растений и возможного их физиологического значения • В sTcti плане изучение физико-ккикческих свойств карбокои-лиружзах ферментов и регуляция их активности, а также связи с олЗУемод«' (XV, nussi важнее "значение""для увравяеюйГ"фотосик' Tfi'KsüCKo?. деятельнзссьв выесих растений'.

Цель к оадади исследования. Основной целью работы было изучение регуляция активности кзрбокеилирув^х'ферместов, вы-гозыехке^тк-существования СОр-концекгрирувцзго механи-- зиа к роди Cj-i.w'äcioHOSiE кислот в хяоропласт&х Cg-pacieHiiii, а süsse регуялщга «егабецгчзма углерода...

Для '.достижения поставленной цели необхедшо было иссяедэ-

- 3 -

вать: '' • .

- влияние субстратов и эффекторов на активность нативной РБФ-карбоксилазы и ее больших субъединиц;

- влияние основных факторов среды и их взаимодействия, эффекта гетерозиса на"активность и содержание РЕ&- и ©П-карбоксялаэ;

- метаболизм углерода в онтогенезе листьев, хлопчатника и в це~ лом растении;

- метаболизм углерода а процессе зеленения &тиолированшх проростков;

- влияние основных фактороз среди я их здашодейсгадя, эффекта гетерозиса и миксталола ка распределений С в проектах фотосинтеза;

- влияние солевого стресса на физиологические параметры хлопчатника;

локализацию фермэитоз, участвующих з синтезе и ти&бслизне С^-дикарбононых кислот.2 хлорсглзетах

- метаболизм Сц-дикзрбсковых кислот в хяорсляаиазс С~~рзс:?егг/3 я влияние ФЕИ на фотоскптетичадкий ызтаболиьм углерода.

В работе

комплексно исследованы шлзкуляряо-шшеткчяеки'э ссойетза глрСо-ксялирущих ферментов, регуляция та шаявиости и фотсслн?-чс-еккй углерода, воэиоааае кехаиизиа фукхцисинрога«

нл;; злскок:з2 С^-у.етабояигма углерода в хяородагастах Сд-раете-тй. Конкретизирована -роль шлих суб»единяц РЁЗ-карбоксилазы з проявлении активности фермера. Бс»азана, «»о одна чз функций талых субъедикиц заклэчается в ¿техиченкн скорости образования иеталл-ферыекткого и/ияк £еруент-<у$5страт:!:<эга комплекса, з ускорении распада фзрмект-субетратного комплекса с образованной продуктов реакция. Ишвлсно, что фаахора гкввнрЯ соеды л,си кз-браг.-.о^х каик сроках воздействия оказивакт зляяние на кикс'тичвс-кие параметры К&чсарбозсита. '^сяедовзн &ф$ект сег-иесягого действия грея основных экоасгячесзих факторов (интенсивность света, температура и' «оедентрац^и СО^) га и«я5о;гиуее*уу охскэ-ность яарбойсилируюгряс ферментов и других ¡»леыектсз ^отоскнте-тического аппарата С-грастенкй. Гюзкхзениз температуря приводят . к 'увеличение ахтивкосуи феруеста, однако по его содержанию оп~ ределекной, закснсйернсст;: не сткечеко, высокая «скцеюряцря СО^ приводит к увеличении активности Ргй-кзрбоксетаза, у»!зньзая при

этом ее содержание, более высокая интенсивность света несколько подавляет активность фермента, ! > увеличивает его содержание. Бее эти факторы ерэды в отдельности несколько активизируют £ЕП-карбоксилазу. Совместное действие трех факторов на верхнем уровне увеличивает скорость фиксации СО^. Обнаружено, что г^кгйры среда как в отдельности, так и во взаимодействии по-раэно:-у влияют на соотношение продуктов фотосинтеза. Верхние уровни (¿акторов как в отдельности, так и в их сочетании акти-Б^лирую'; включение метки -в продукты д-карбоксилирования.

На основании изучения влияния повышенной концентрации С0»> ка мета5одизм углерода высказана предположение о нобоП функцпн РЕ5-«арбсксилазь*, связанной с ее оксигеназной активн-х.тыо, которая, вероятно, заключается в обеспечении при низкой концентрации ССо цикла Кальвина рлбулозобис^-осфатом.

Н?. осночангти исслсдогдния метаболизма углерода у зеленем-ц;:х проростков гороха подтверждено, что в отполированных пророс ткал функционирует РВ2-карбоксилаза с высокой окекгеназно,; активностью, £1!гиолсп:че"кая роль которой моз;ет заключаться в регуляции биосинтеткческих процессов в клетке.

Показано, что £К -группы в активном центре фермента ыогут участвовать в образовании промежуточных соединений в ходе кпта-лкоируекой реакция карбокеилкрованкя р;.Сулозсбисфос^ата.

!-1а уровне целого растения хлопчатника установлено, что синхронное изменение интенсивности фотосинтетической ассимиляции СО., и активности РБЗ-карбоксилазк по ярусам, кроме вьаниль-ногс листа сопровождается соответствующими изменениями в активности 5ЕП-кагбокси.-азы.

Показано- положительное влияние уиксталола на активность РЕ- и СЕП-карбоксил-аз и фотосинтетичес/су-о фиксацию СО^.

На основании иесгодовънкя локализации .'орыенто?, участвующее б синтезс и метаболизме С^-дикарбоновьзе кислот,в хлоре- -пластах Сч-раетений показана возможность нкциониро ».ання элементов С ¡-кетъСо:.изма углерода как дегдонительньго канала доставки к иентра*'кпрбоксиякров-ания у Сд-растениЯ..

Полученные данные иуедт значение для решения задач авсля-ьионноК бисхиь'ки и эволацкг'ниах аспектов фотосинтеза, ■ псн:.-к?нкя ^нэиояогичеекаЯ картины £отосинтстичес'кого усвоения 00-ькгздаки растениями. Полученные результату ко гут быть пеп о'.апа-■

- 5 - ,

ваны для разработки моделей усвоения COg в процессе фотосинтеза и решения ряда теоретических задач физиологии растений, а также при чтении спецкурсов по физиологии и биохимии растений в ВУЗах.

Апробация работа. Материалы исследований были долокены или представлены на Международном симпозиуме по фотосинтети^ес-кой ассимиляции COg и фотодкханк» (София, 1977); 13-м Международном научно-координационном совещании и симпозиуме по теме I-I8.I СЭВ "Изучение первичных и вторичных продуктов фотосинтеза и их метаболизма в растениях" (Душанбе, 1977); 4-м Всесогз-ном биохимическом съезде (Ленинград, 1979); на ресцубликанскнх конференциях молодых ученых и конкурсах научных работ АН Таджикской ССР (1976-1985); 1У конференции биохимиков Средней Алии и Казахстана (Дупанбе, 1981); на Круглом столе "Механизмы концентрирования СО2 в растительной клетке в связи с продуктивностью" (Душанбе, 1982); "Кинетика фотосинтетического метаболизма углерода в Cg-растениях" (Таллинн, 1983); 1б-й конференции Федерации европейских биохимлче^яих обществ (Москва, 1984); на Ыездународном симпозиуме "Фиксация 00¿> и фотосинтетическая продуктивность растений" (София, 1984); У Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986); У конференции биохимиков Средней Азии и K-13VX?- ■ (Атгс^ап. 1986); Всесоюзном симпозиуме "Фотосинтез :: г • :i;«cc" (Саратов, I9S9); П съезде Всесоюзного

обцества физиологов растений (Минск, 1990); на Всесоюзной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пущино, 199.Г); на совещании "Фиэиолого-генетичеекке основы создания высокопродуктивных форм тритикале" (Душанбе, I99X); на Международном совещании по метаболизму углерода и азота (Цущкно, 1991); m Международной конференции "Итоги и перспектива энэимологических исследований метаболизма углерода при фотосинтезе" (Душанбе, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 научная работа.

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, заводов. Общий объем работы 25>6 страниц машинописного текста, р-оота ыслочает 44 рисунка и 33 таблицы. Список литературы состоит из"490 наименований, из них 312 иностранных.

ЭКСИЕЙЩНГАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объекты, условия и методы исследований

Объектами исследований служили растения хлопчатника ( Cos-sypium hirsutum Ь. ) сорта 108-Ф, тритикале ( Triticale ) сорта Jáoce-I, пшеница ( Triticun aesti-vum L,) сорта Оьетте-Церрос, рожь ( Secale oereale L. ) сорта Захшская-Иб, кукуруза ( Zea mays L. ), шпинат ( Spinacia oleracea L. ) сорта Виктория и горох ( Pi sum sa-tivum L.) сорта Ыущунг. Для изучения влияния внешних факторов и эффекта их взаимодействия собрана специальная установка (Абдуллаев и др., 1992), автором конструкции которой был д.б.н. В.Л.Налер, за что выражаю ему глубокую благодарность.

Дня исследования отдельных фотосинтетических показателей разновозрастных листьев хлопчатника растения выращивали на экспериментальном участке Института физиологии и биофизики растений (г.Душанбе, 800 м над уровнем моря) до фазы бутонизации.

РЕФ-карбоксилазу ввделяли по модифицированным нами методикам ¡¡аулсена и Лейна ( Taulsen, Lane, 1966). Листья гомогенизировали в фарфоровой ступке в 0,1 М трис-НС1-буфере (pH 6,5 для хлопчатника, pH 8,2 для пшеницы, тритикале и ржи), содержащем 0,005 М ЭДТА, 0,01 №. MgCl2 , 0,001 И ß-меркаптоэтанола и PVP (поливинилшрроли.цон) - 1% для хлопчатника и 0,5% для злаковых культур. Очистку РБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника проводили дробным высаливанием сульфатом аммония с последующей гельхроматографией на сефадексе С-<Ь (грубый и тонкий) и ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлоэе.

Изоформы ФЕП-карбоксилазы Евделяли по разработанному нами методу,

Карбоксилазную активность РБФ- и Ш1-карбоксилаз определяли при 30°С радиометрическим кетодом (Романова, I9Ü0) по скорости включения СО^ в кислотоустойчивые продукты реакции в присутствии субстратов^ рибулозофосфата и фосфоенолпирувата соответственно. Радиоактивность просчитывали на жидкостном сцинтилляционном счетчике "Марк-П" (Nuclear Chicago, USA).

Дня определения содержания РБФ-карбоксилазы в работе использовали сыворотки против фермента, полученные по схеме £о-лодарскогэ (1971) с некоторыми модификациями (Фархаци, I9tf7). Сыворотка обладала титром 1:256. Иммуноэлектрофорез проводили по (jjíiurel, I9ób) fra приборе "Мультифор" (ЛКБ, Швеция), ис-

пользуя ставдартный трисбарбитуратный буфер рН 8,6, содержащий азид натрия.

Содержание белка определяли по Лоури и др. ( Ьотеу ег а1., 1951),

Молекулярную массу ферментов определяли с использованием гель-электрофореза в ПААГ (Вау1а. 1964).

Фотосинтетическую фиксация СО^ проводили по методу, описанному ранее (Эргашев и др., 1971), в одинаковых для всех вариантов условиях: интенсивное*!» света 40 ткс.лк, концентрация С0£ 0,055?, скорость потока воздуха через камеру 40-50 л/час при объеме камеры 0,05 я. Удельная активность тХ^ - I МБК' моль , экспозиция в СО^ - 15 сек. Исходную радиоактивность растительного материала просчитывали на пересчетном приборе ИСТ—10 с помощью торцового счетчика Т-25-БФЛ, анализ радиоактивности отдельных соединений проводили на сцинтилляционном счетчике Марк-2 в 10 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8.

Хлоропласта из листьев получали в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,8, содержавшем 0,3 М сахарозы, 0,01 М КС1. 50 г мелко измельченных листьев гомогенизировали в 200 мл буфера в измельчителе тканей РТ-1 при температуре +4°С в течение 10-15 сек при 8 тыс. об/мин. Гомогенат отжимали через два слоя капронового материала и центрифугировали в течение 2. мин при 100 § . Над-осадочную жидкость повторно центрифугировали в течение 2 мин при 1000 g . Полученный осадок ресуспендироьали в небольшом объеме сахарозно-фосфатного буфера и наносили на градиент плотности сахарозы (1,0; 1,5; 2,0; 2,5 М). После этого центрифугировали в течение 20 мин при 6000 g . Фракцию целых хлоропластов отбирали и промывали вновь сахарозно-фосфатным буфером.

Меченую ЩУК- С получали путем карбоксилирования ФЕД с и ввделяли хроматографическим способом. Яблочную -кислоту, образовавгцуюся при фотосинтезе, определяли хроматогра-фически в тонком слое целлюлозы. Исследования включения 4УК- ^С и яблочной кислоты - С проводили в реакционной смеси, содержащей 0,3 мл хлороплаетов, 0,2 мл ШУК- С или яблочной кислоты -14С, 0,5

мл Н^О. Инкубацию проводили в течение I минуты. Реакцию останавливали добавлением 0,5 мл 2И НС1, 6 листья хлопчатника (или высечки из них) яблочную кислоту - С вбодили путем вакуумной инфильтрации, радиоактивность - 0,003 МБК на

I ш раствора *4С-малата.

Результаты обрабатывали с использованием методов статистики (Лакин, 1973) и ферментативной кинетики (Корниш-Боуден, 1979).

КАРБ0КСШ1ИРУЩИЕ ШМЕНТЫ. СТРУКТУРА,

СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ о

К мокенту постановки наших исследований в литературе поя-ввились сведения о разных молекулярных формах РБФ-карбоксилазы ( Branden, 1978; Бусинова и др., 1981; Бободжанова, 1991).

Результаты ионообменной хроматографии РБФ-карбоксилазы из листьев шпината, полученной путей ступенчатой хроматографии, показали, что РБФ-карбоксидаэа выходит в одном пике при концентрации 0,35 М НаСХ (рис.1). При других концентрациях UaCl отсутствовали белковые фракции/обладающие ферментативной активностью. Эти результаты дают нам основание считать, что РБФ-кар-боксилаза существует в одной молекулярной форме. Отсутствие мноаества молекулярных форм фермента, по-видико«у, связано с уникальной функцией PBí-карбоксилазы - участием только в цикле Кальвина.

J Рис.1. Ионообменная хроматография РЕФ-карбоксилазн на ДЗАЭ-целлюлозе: а).линейный градиент; б) ступенчатый градиент,

Факты обнаружения при ионообменной хроматографии нескольких форм фермента можно объяснить либо недостаточно точным соблюдением техники вьделения фермента, либо тем, что процесс достижения максимальной активности может происходить через ряд промежуточных этапов, создающих видимость существования ра-о'.' форм фермента.

Установлено, что гены малых субъединиц фермента в ядерном геноме встречаются во множестве копий, не идентичных друг другу (Duncmuir et al.,1983 К Не исключено, что на определенном этапе развития растений может проявляться действие этих генов и это отражается на структуре фермента и молекулярной массе в целом. ,'

Кинетические свойства Р£Ф-карбоксилазы.-.из.|Гли.стьен. .хлопчатника . Изучение влияния концентрации рибулозобисфссфата на активность РБЭ-карбоксилазы показало, что зависимость описывается отрезком прямоугольной гиперболы, что характерно для кино-тини Михаэлиса-Ментен (рис.2). Полученные результаты были использованы длл определения ffy с применением координат Лайнуине-ра-Берка 1/V-1/S (Корниш-Боуден, 1979). Обработка экспериментальных данных в указанных координатах показала, что величина % для PES равна 2,6-КГ5 И.

Зависимость удельной активности РБФ-карбоксилазы от концентрации UaH^COj была подобна описанной suae г для РБФ (рис. 3). Найденная величина Ку для СО^ равна 1,2'ICT2 М (рис.3), т.е. фермент обладал неодинаковым сродством к PDJ и СО.,. Полученные наш результаты согласуются с литературными данным'/, для очищенных препаратов фермента из других раитений (Романова, I960), которые показывают, что значение Ну для^РЕФ варьирует от 0,3-Ю-4 U до 4,0'10 Ь\, а для С02 от О.Ь'НГ2 до 9,0'КГ* Г.. По-видимому, различия в значениях Кц по РШ и COg фермента из различных растений связаны не только с особенностями растения, но с условиями эксперимента.

Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) РИ-карбоко;-лазы хлопчатника, очищенной на ДЭАЭ-целлюлозв, выявил одну белковую полосу, обладающую ферментативной активность». Относительная электрсфореткческая подвикнееть РБй-карбохсилазы хлопчатника разна 0,2, молекулярная масса РБ5~кар5оксилазы, определенная на ее основе (рис.4), равна 560 кДз, что соотвзт-отвует величинам, получение в других работах ( ИсГаййоп,

Рке.2. Зависимость удельной активности РБЕ-карбоясилазы от концентрации РБ5: а) в прямых координатах; б) в координатах Лайцуивера-Берка.

Рис.3. Зависимость удельной активности РШ-карбоксилазы от комценттации КаНСС>3 : а) в прямых координатах; б) ^ ^орА'ДНРЛ^ оА ■ Ь*"^'-д,

- II -

-и, 1974; Мопе, Beneгiet, 1983).

и

5Л

' 4,0 р^

Рис.4, Определение молекулярной массы РШ-карбоксилазы.

© - РБФ-карбоксилаза из листьев хлопчатника. Белки-маркеры: I - ферритин - 460 кДа; £ - лактатдегвдро-геназа ~ тетрамер - НО кДа; 3 - лактатдегидрогенасхЬ димер - 70 кДа; 4 - сывороточный альбумин - 6Ъ г^Ца 5 - яичный альбумин - 40 кДа; 6 - химотрипсинсген -25 зфы,

Регулятошая р_оль.малых субъединиц_в проявлении актлчмое--РШ-карбоксилаз_ыл Исследование влияния субстратов и эффекторов т активность натнвного фермента и его больших субъединиц показало, что ход кривых активности для кативного ферментА и его больших субъединиц в зависимости от концентрации ри*ъ№-зобисфосфата одинаков , т.е. с увеличением концентрации субстрата активность вначале возрастала, достигая максимума, и ?<}-тем снижалась. Величина удельной активности больших суСьедмнил1, оказалась в 3-4 раза ниже, чем активность натизногс фермента (рис.Ь). Определение величины К« с применением линейной

фоэы Б-ЗЛ? показало, что величина ¡^ оказалась равной 1,33'10""* !.! для дативного фермента, а для его больших-субъедн-ниц Ь,Ь'10~^ Ы. Это свидетельствует о несколько бсльхем сродство больших субъедикиц фермента к рибулоэобисфосфату.'Каб.те- ' даекая более высокая активность катиеногл фермента по сравяе-с Солюямн суй-ьедикицани ыохет б ыт ъ. связана с более высоко'? скоростью образования фермент-субстратного комя-.екса и его гпсгл,гл с сбрчзовднмем,продуктов реакции у натиеного фермента.

Изучение эз!5!$с¡'.мести удельной активности фермента я его

больших субьединиц от концентрации ионов ьагния и ыарганца показало, что кривые имели практически одинаковый характер (•рис. б). Наивысшая активность в обоих случаях проявлялась при концентрации звонов магния около 7,5*10"^ М. Для нзтивного фермента Код ( мв + ) равна 1,68* М, а для больиих субъединиц - ' ■6,22*10"^ М. -Более высокая скорость реакции у нативного фермента по сравнению с его большими субъединицами- нокет быть объяснена тем, что ионы магния в нативНом ферменте» вероятно," приводят к ускорению образования фермент-субстратного комплексу. Обсуждая в этом аспекте роль малых субъ единиц, можно. предполагать, что роль малых субъединиц-заключается в'ускорении как'образования металл-ферментного и/или фер!ент-субстрзтного комплекса,, так и в ускорении распада феруентгсубстратногс комплекса с образованием продуктов реакции. Именно в ¿той, по кашену мнению, проявляется одна из рзгуляторных '-функций мзлнх субъеди-ниц-РБФ-карбоксилазы. • •

МолскулярНо-кйнетичеекйе свойства -изоформ ШЬ-ка'рбоксила^ зы из листьев кукуруен и хлогтурака.^ Использование - ступенчатого I радиента НаС1 показало, что .первая форма .фермента выходит при концентрации йаС1 0,1 Ы, .вторая- - при-0,16 М -ИаСХ, третья - при 0,2 Ы ИаС1 и четвертая - при 0¿25 М ,1{аС1 . Ь отличие от кукурузы в листьях хлопчатника эта форма отсутствовала. Изучение зависимости удельной активности изоформ Ш1-кар-боксилазы от концентрации §ЕП показало, что с увеличением концентрации субстрата активность фермента возрастала, а затем,по достижении макси;.«ума,г.в изменялась. Сравнение величины удельной активности у разных' форм фермента показало, что наибольшая активность фермента наблюдалась у формы 2, в 2,5-3 раза выше, чем у других форм ФЕП-ка-рбоксилазы (рис.7). Зависимость удельной активности форм ФЕИ-карбоксилазн от концентрации фосфо-еноляирувзга имеет форму кривых, подчиняющихся кинетике Ымхаэ- -лиса-Ментен. Это позволило расчитать константу Мйхаэлиса для фосфоенолпирувата из рис.7. Значения Н^для I и'4 форм феризн-' та оказались равными 1,8' Ч,- а.'для-2 'и 3 г- 2*1О М. Сравнивая значения К^ для фосфоено'лпирувата,. кокно сделать предположение о близком сродстве форм фермента'и. этому субстрату. Это позволяет в свою очередь предполагать-, что'у всех рассмотренных изоформ фермента скорость образования-фернент-субстрат-

Зависимость удельно!! активности изоформ ФЕП-карбоксила-эы от концентрации фосфоенолпирувата: I - 0,1 М КаС1; .2 - 0,16 и КаС1; 3 - 0,2 М НпС1; 4 - 0,25 М КаС1. а) кукуруза; б) хлопчатник.

■з-

35

£

10.5

04

сэ^

оэ **

о

5

—г--«-.....-Я-

2 6

£

ш ^o

ГнсоЗмМ

20 40

Рис.В. Зависимость удельной активности иаоформ ФЕП-карбоксида-зы от концентрации КаН^со^ : I -.0,1 Ы КаС1 ; 'с -0,16 М .\'аС1; 3 - 0,2 К ;.'йС1; .4 - 0,2Ь М • КаСЬ а) кукуруза; б) хлопчатник. .

кого комплекса одинакова. Наблюдаемые различия в значении К^, (Ш1), вероятно, обусловлены различной скоростью распада фермент-субстратного комплекса с образованием продуктов распада. Зависимость активности изоформ Ш1-карбоксилазы хлопчатника от концентрации ЗЭ5П аналогична ходу кривой изоформы <ИШ-карбо-ксияаэы'кукурузы, однако резкое увеличение и насыщение активности происходит при низких концентрациях ФЕП. Значение 1С; для изоформ фермента 1-3 меняется от 0,4-0,5*10~3 Ы, свидетельствуя

о том, что изоформы обладают почти одинаковым сродством к

ШП.

Зависимость удельной активности различных форм $ЕП карбо-ксилазы от концентрации НаН^'СО^ описывается сигмоидгдыми кривыми для форм I и 2, а кривьзз для форм 3 и 4 близки к кривил ¡'ихяэлиеа-Мептен (ркс.8). Найденные значения К^ из рис.6 для^ первой форми.фермента равны 1,4*10"^ !■!, для второй - 1,2*10~^М, для третьей - 1,0'Ю"^ М, а для четвертой формы фермента -0,8-Ю"2 и (табл.1).

Таблица I

Значения константы Михазлиса и молекулярной массы изофоры ФЕП-карбоксилазы

Изоформы

0,1 М'НаС1 0,16 М ГтС1 0,2 И ИаСХ 0,35 Ц ЛоС!

Кукуруза

% (СО

2''

К^ :Молеку-(ЖП), |ляРная ..А

1,4'Ю"2 1,8* Ю-3 310000 1,2'ИГ2 2,0'Ю-3 400000 1,0-Ю~2 2,МО"3 350000

' О ^

0,8*10 1,8*10-° 250000

Хлопчатник

К, :Молеху-

N к

(йй31),:ляРная

ц '.масса

2,0-ИГ* 0,5*Ю"3 310000 2,8*20~3 0,4'Ю"3 400000 2,4*10~3 0,4'Ю"3 0*0000

л ,

(со2),:

,-3

Зависимость активности форм фермера хлопчатника от концентрации субстрата отливается от зависимости активности изоформ фермента у кукурузы (рис.8), Для кукурузы ста зависимость описывается сигмоидккки кривыми для всех форм. Найденное зна-

чения й» по СО^ изоформ фермента равны 2,0*¿О"3 М, 2,8*10-* И и 2,4*10"" Ы для форм 1,2,3,соответственно (табл.1). Как видно, у этих форм значения % так же близки, как и у форм фермен-

1-3

та кукурузы.

Результаты сравнительного изучения изоформ фермента у кукурузы и хлопчатника указывают на то, что эти растения имеют неодинаковое количество изоформ. Полученные же изоформы не отличались мевду собой по сродству фермента к ФЫ1, однако отличались между собой по сродству изоформ.ШЕП-карбоксилазы к СО^ (табл.1). Сравнение полученных результатов с литературными данными показывает, что изоформы 4£Л-карбоксилазы близки по сродству к субстрату к изоформам, ввделенным из других растений ( ЬеЫоуа, 19ЬЬ). ¿еличины молекулярных масс форм фермента как у кукурузы, так и у хлопчатника примерно одинаковы, а величины йод для СОп и <Ш1 отличаются в пределах одного порядка. Таким образом, сравнение молекулярно-кинетических форм ФЕП-карбоксилазы показало, что у высших растений эти формы различаются по мсле-кулярно-кинетическим параметрам. Зти формы Ш1-карбоксилазы несут ответственность за обеспечение пула С^-кислот, выполняющих разнообразную функцию в метаболизме растений,,

Комплексное влияние факторов с'рецы на активность и содержание РЕФ-карбоксилазы. Исследования показали, что отдельные факторы внешней среды-каадый в отдельности и во взаимодействии друг с другом,неоднозначно влияли на. активности и содержание РЕФ-карбоксилаэы листьев хлопчатника (табл.2).

Поддержание интенсивности света'на высоком уровне, температуры и концентрации СО^ - та низком уровне ( Ъ = 2Б°С, СО^ = 0,031) приводило к уменьшению активности фермента как в семядольных,1 так и в настоящих листьях, хотя содержание РШ-карбо-ксилазы при этом увеличивалось (п.2). Повышение температуры воз-,цуха на Ю° увеличивало активность фермента почти в 2 раза в семядольных листьях-, но при этом содержание его уменьшалось, о настоящих листьях хлопчатника наблюдалось о,дновременкое увеличение активности и содержания РБФ-карбоксилазы. Увеличение концентрации С02 в 10 раз- при сохранении других факторов на низком уровне приводило к увеличению активности фермента и уменьшению его содержания в листьях в обоих вариантах (л.б). Сочетание всех факторов ка верхнем уровне привело к одноврег.ге^-'-чу увеличению как активности, так и содержания фермента [л.В). При повышении температуры на 10° при сохранении интенсивности света и концентрации СО-, .на низком уровне наблюдалось увеличение

(

Таблица 2

Влияние факторов внешней среды на активность и содержание РБЭ-карбоксилазы

Условия опыта Семядольные листья : • Настоящие листья

п/п свет :темпе-(люкс)|Ра®УРа» : °С '.концентра-:ция СОо, ; % активность, : ыкмоль С0р/ : г сыр.весатыин: содержание, : иг/г сыр.веса:г активность, мкыоль СОо/ сыр.веса"Вин : Содержание, :мг/г сыр.веса

I 1000 25 0,03 2,03*0,20 1,40*0,01 7,03*0,39 2,42*0,03

2 7000 25 0,03 1,88±0,1б 3,25*0,02 4,50*0,39 3,53*0,08

3 1000 35 0,03 2,85*0,29 3,30*0,01 5,10*0,44 2,31*0,06

4 7000 35 0,03 3,18+0,02 2,9010,04 8,41*0,34 4,93*0,04

5 1000 25 0,3 7,67*0,21 2,00*0,05 6,79*0,22 1,72*0,15

6 7000 25 0,3 3,21*0,40 2,30+0,03 7,53*0,86 2,94*0,02

7 1000 35 0,3 1,90*0,14 2,50*0,02 6,18*0,33 2,32*0,05

8 7000 35 0,3 3,67*0,34 3,00*0,06 11,26*0,27 4,79*0,09

I

У

I

активности фермента только в семядольных листьях. В настоящих листьях хлопчатника такое сочетание факторов правело к снижению уровня этих параметров (п.6). Поддержание тетературн и концентрация СО2 на верхнем уровне, а интенсивности света на низком уровне привело к уменьшению активности и содержания фермента только в семядольных листьях хлопчатника (п.7). У настоящих листьев это сочетание факторов привело к повышению только активности фермента.

Настояарш листья хлопчатника во всех сочетаниях факторов среда отличались довольно высокой активностью РБ5-карбоксила-зы.

Сопоставляя получонные данные по влиянию факторов внеш-нг]': срэдц, необходимо отметить, что поддержание интенсивности света на уровне 7000 люкс привело к повышению содержания фермента, однако при этом наблюдалось понижение активности РБФ-карбсксилазы ¿сак у селшдол^ых, так и у настоящих листьев хлопчатника'. Увеличение температуры до 35°С привело к росту ' активности, а содержание фермента изменялось при этом незначительно. Повышение концентрации С02 стимулирует активность РБЗ-карбоксилазы, но его содержанке уменьшилось. Как видно из вы-шепризеденяах даняах, повашекие уровня каздого.фактора в отдельности и во -взаимодействии на этом уровне.приводило к до-вавешхю активности фермента.

Следует отметить, что во многих случаях увеличение активности фзр:.сенга соЯровоздалось уменьшением его содержания. Аналогичные сведешь полученные" Эйхелъманоч и Лайском <1990)д листьев подсолнечника, свидегельствующт о том, что высокая активность, фермента в хлоропластах С^-растений не ьсъгда сопрс дастся повышением его содержания.

Как следует из табл.2, увеличение освещенности, температуры к концентрации С0/> при вкращташти растений в исследован-н^х пределах: ведет к росту удельной активности РБ*>-карбоксила-зн, что может б:;ть следствием конрормациошшх изменении в ро:<олакуле ■ фер:.:енга. Ранее полу ^ л на результаты, свиде-тедьстпуэдие о кон5орианиояном изменении г. молекуле фермента пре: увелачеюа: т^лкр^гурн (от 25 до 35°и) (Лзсмедон и др., 1078). , ■

Таким образом, праБедешл? вгле данные .показа»!, что. ак-

тивность и содержание фермента очень чувствительны к воздействию факторов среда и зависят от их сочетания.

Влияние внешних Факторов на активность ФЕП-карбоксилазы. Исследование влияния факторов внешней среды и их совместного действия на активность $ЕП-карбоксилазы показало (табл.3), что увеличение интенсивности света от 1,0 до 7,0 тыс.люкс приводило к увеличении активности фермента как в семядольных, так и настоящих листьях хлопчатника (п.2). Повышение температуры на 10° увеличивало активность ££П-карбоксилазы в 2 р;.эа у семядольных листьев (п.З). Увеличение концентрации СО^, б 10 раз также способствовало повышение активности фермента и у семядольных и настоящих листьев хлопчатника (п.5). Повышение интенсивности света и температуры при сохранении концентрации С0£ на низком уровне привело к узеличенио активности <5ЕП-карбоксилаэы (п.4). Подцерясаняе всех факторов на верхнем уровне способствовало также увеличению активности фермента семядольных листьев (п.8).

Таблица 3 влияние факторов вкезней среды на активность 2ЕД-карбоксилазы

^ : Условия опыта :Активность, икМояь С^/г сыр.веса

п/п: свет :темг.е~ ■."■ 11 ■1 В " !концект-: семядольные 3-4 на-тоя^е

1 (люкс) :ратура, ; °С ;рация ^ : : ш2, % : листья листья

I 1000 ■ 25 0,03 0,79±0,20 1,Ь7^0,2&

2 7000 25 0,03 2,бб±0,Г2 2,08^0,24

3 1000 35 . 0,03 1,60±0,16 1,48^0,07

4 7000 35 0,03 1,47^,02 1,52±0,06

5' 1000 25 0,3 1,72±0,09 1,83^0,25

6 г000 25 0,3 2,5р10,48 1,22±0,03

7 1000 35 0,3 2,46^0,45 0,52±0,13

в 7000 35 0,3 2,Х8£0,2о 0,25±0,03

Иак следует из табл.3, в некоторых вариантах эксперимента '.п.7,8) условия для настоявдх листьев хлопчатника являются недостаточно оптимальными н поэтому наблюдалась низкая актив-гость $ЕП-карбоксилаэы. Сопоставление данных по активности

- 20 -

ФЕП- и PHÍ-карбоксилазы у семядолвных и настоящих листьев показало, что во всех 8 вариантах опыта активность РБФ-карбокси-дазы настоящих листьев хяошштника в несколько раз превышала активность ФЕП-карбоксилазы. У семядольных листьев наблюдалась аналогичная картина, исключение составили растения 2- и 7-го вариантов опыта, когда отмечалась обратная картина. Это »iponc-ходило не только за счет роста активности ЗЕП-карбокеилазы,нои из-за уменьшения активности РБФ-карбоксияазы. По-видимоцу, такое сочетание факторов среды било не совсем благоприятным для функционирования РБФ-карбоксилазыШагоыедов и др., 1991).

Полученные результаты по влиянию факторов внешней среды и их совместного действия на активность фермента показали, что, изменяя уровень исследованных факторов среды в отдельности и их взаимодействие,можно увеличить активность $ЕП-харбоксилазы,

Таким образом, оптимально сочетанием факторов среды (в пределах выбранных нами уровней), способствующим активизации ФЕП-карбоксилазы, является сочетание высокой интенсивности света с пониженными температурой к концентрацией СО^.

ФОГОСИНГЕШЧЕСНИЗ МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕРОДА К ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ

Метаболизм углерода в онтогенезе листьев_хлопчатни_ка. Исследование метаболизма углерода у разновозрастных листьев хлопчатника показало, что в звенильных листьях в §ГК и SEC сосредотачивается существенная часть фиксированного углерода (табл. 4). Значительное количество метки включалось в глицин и серии, малят и ряд продуктов гетеротрофной ассимиляции. Обрап\ает на себя внимание тот факт, что ФЕП-карбоксилирование нз было главным путем фиксации углерода га свету.в ювенкльнсы листе хлопчатника, в отличие от картофеля и других растений (Мокроносов, 1983). Интенсивный синтез глицина и серина - показатель значительного места в метаболизме молодых листьев гликолатного пути углерода. Основная часть общего пула, глицина, ло-видиыоцу, синтезируется в процессе йотодыхательного пути ( Marek, Stewart, I9tí3). По мере развития листа наблюдалось увеличение метки в про.дуктах восстановительного пентозофосфатного цикла, в частности, Ф1У. Чроме того, в 8-9-дневных листьях увеличивалась в

14

сравнении с венидьнызли листьями доля включенного С в ыалате,

Таблкпа 4

в продукты фотосинтеза (в % от общей радиоактивности) и активность карбоксилирующих ферментов (мкмоль С02/мг белка'мин).

Метаболиты, : В о з р, а с г лис пев, дни

фэрианты .: 4-5 : 8-9 : 15-16 ! 22-23

Ятаяо понесения 10,0*1,0 5,2*0,5 2,0*0,01 2,5*0,2

Днфосфаты Сахаров 12,8*0,1 4,6*0,4 3,6*0,2 4,4*0,4

Гдакозомшофосфатн - - 4,2*0,3 9,7*0,9

Ш .10,5*0,1 10,1*1,0. 2Рг, 4*3,0 5,8*0,5

ФПС 14,5*0,1 36,4*3,1 63,6*6,0

Аедарга? 9.6*0,9 9,3*0,1 5,9*0,5 1,1*0,1

Глащв, серая 11,2*1,0 5,0*0,5 1,0*0,1 0,8*0,1

Аяаннн, глацерат 11,7*1,1 - 4,8*0,5 1,8*0,1 7,1*0,6

Мала? 7,6*0,8 14,1*1,1 9,2*0,1 2,8*0,2

Цитрат и изоштрат 8,5*0,7 . 5,6*0,4 - '

5Ш-карбоксшша 0Д1*0,'и1 0,16*0,01 0,29*0,01 0,31*0,03

©Ш-карбоксилаза 0,20*0,02 0,10*0,01 О",06*0,01 0,05*0,01

ó - 22 -

что моает быть связано со стимуляцией ÍEIl-карбокс кл;; р о ванн я, либо с двойным харбоксилированием, когда в малате метятся оба карбоксила, так как часть ЗЕП синтезируется из "^С-ФГК., В:<лечение метки в глицин и серкн при этом менее интенсивно, чем в молодых листьях, но сравнительно высоко.

¿ зрелых наиболее активно фотосшгтезирущих листьях более 60% фиксированного в течение Ю сек фотосинтеэатугдерода С сосредотачивалось в ФГК и &SC, существенна доля A'¿C -в ала-нине и глицерате. В незначительных количествах метка обнаружи-, валась в глииине и серине. Из таблицы видно, что по мере развития листьев удельная активность РЕФ-карбоксилазы возрастала, активность Ш1-карбоксилазы уменьшалась.

Таким образом, представленные данные указывают на совершенствование фотосинтетической функции по мере развития листа, что связано с формированием структурно-функциональных и энергетических факторов восстановительного пентозофосфат ного цикла углерода. Они согласуются с результатами анализа продуктов фотосинтеза, -содержания РБ2-карбоксилазк (Фархади, 1987) к соотношения карбоксилагной и окси.пеказной функций листа в онтоге- ' незе (Насыров и др., 1У83). ¡¿окно полагать, что сопряжение фо-тосиктетической ассимиляции COg, фотосинтетического и фотодыхательного метаболизма углерода и синтеза и активизации соответствующих ферментов с потребностями клетки осуществляется на уровне генома растения.

Метаболизм ССи в целом .растении. .Изучение активности и содержания карбоксилируюцих ферментов фотосинтеза и фотоскнтети-ческого метаболизма углерода в целом растери показало, что активность РБ5-карбоксилазы возрастала до максимального ьначе-кия в листьях третьего и четвертого ярусов и далее снижалась. Минимальная активность отмечалась в авекилышх листьях.-Активность SEll-нарбоксилаэы в листьях первого яруса была самой низкой. Максимальное значение активности этого фермента отметалось в шенильном листе (табл.5). Изучение фотосиктетического метаболизма углерода у листа с максимальной фотосгсгтезичэской активность» показало, что более 7055 ассимилироьак:го углерода включалось в продукты цикла Кальвина и 48,2 из них в ¿IK (табл.6).'С^-соедкнения составляли незначительную величину, малат и аспартат образовывались лишь в следовых количествах.

Табляпл 5

•£отос::нтетнческие хз^-^ерястикн раззовозрастоих :;яопчатника.

- ; ¡„„.rp.; рг* :гi Активность гИитвнскв---г:---«—......т.г--Kíi0 УБйС,:--гд--.---i--'.vocinrrésa,

(снлзу);уг белка мин :..г :г ;-;:?.веса* :c[.p#Becf, :мг белка мин: г сир.веса* :сухого

: Г ""*' I для I ' I - I шп :веса'ыия

, I ~ " 0,45*0,02 0,57-0,02 6,21-0,06 ,3,36¿0,26 0,09ÍQ,QI I,I9±0,0I 0,42±0,03 ^

2 0,54-0,01 2,¿7±0,0I 8,68¿0,0£ 3,G5±0,04 O.IliO.ÜÍ I,70ÍÜ,0I 0,52±D,03

3- 0,74-0,0Э 3,18*0,33 18,33-2,33 5,Í0±0,0S 0,11*0,02 2,84*0,40 0,74*0,07

4 0,73*0,01 ' . 2,84*0,Со 16,33*1,33 4,84*0,25 0,15*0,03 3,88*0,70 0,8Й±0,04

5 0,46-0,03 2,29*0,12 12,34*1,31 4,14*0,08 0,11*0,01 3,11*0,27 0,9I±0,09

6 0,14-0,02 1,36*0,14 2.IJÍ0.22 3,26*0,05 0,15*0,03 2,16*0,44 0.48ÍC.08

7 0,08*0,02 0,23-0,03. 0,84*0,07 3,90-0,1;; 0,24*0,02 3,98*0,26 0,02*0,01

к к ч _ m •о о са ь

ной

I 7

о »

g & О I—Ç

п о, m

M

t-l «

и о

m о И о V.

со

в ы

<у . И

»ч S

" ' я

I

о

»г*

13

<а съ о H

и я о о «о

'.«я о

s

о ?

о

H

а.

a

о

я

н «

H

о

H vi 8. m

н о

Ei

О

Ф

О

Ю

ь* о

fr"

о

СО

о

а

ч о

я

f->

о

>о «

О ^г со

+1 +1 +1

оо ç\j со

со" о

СМ M

Ю (S M1 t> СО CV

to со

N

«

M (M

+ 1 1 1 4-1

(N Ci

»

ы to

W M

LO OJ со

«* я

О Q о «

4-1 -ÍT с» 4-1 о

Oi СО ч

« M о

¡л м M

H 03 Ю ф

« * «I *

Ы О' M о +1 -И +1 +»

in ю о ^

,<о <л со со

a cf a §

<u -И о ©

Ч Ю ц ч

о - о о

(М

O«MO«wnn0JH

О W О О О О ООО +1 +1 +1 +1 +1 -и -и 41 -и к>»ой1йй01со«)0

ог

ДОПОИМ. HNN M ю

1псососо<д»~1м'#-ч<со

о о «f о" о о о" о о о +1 +1 4-1 4*! +1 +1 +1 +1 +1 +1 о со <о LO СО С- M M и

•«■íMOfHHWKN c\¡

i i

íD O W TJ (О

о со in о +1 +1 +r +1 . ^ .

£> co t> co <£> ^

Й H H N Щ H H

CO

H +? INJ «3

О -fl

mo s1 tí h id

» » в » я »

m ы со о q о

+1 4-1 +| +1 +Т +|

Ю О H О 05 <í

СО CVÎ со <41 с- -ч1 со

о -и

Cn!

oí

ю

о со

а . о

+i i +1

ю Ь

со 1л

я «

ф о

м

M

&

о &

il»

ю

a

о

я <3

Н-ч'

о

 о а: о.

Я M

Й

о о

(Ö « го

« в.

К « «iHtHO

£

О

{Го

Й is,

о,

CTÍ

a

о •о

о

t-< ь m crt

a; о,

S f

3 и-

«г ш ,<ч

«

о -i;

о • i +1 С-

i i i

inovniSHHtOHINH.

rao ü о о" о' о" о" о о" о Щ

+т +¡ +| +т +1 -и +1 +1 +í +! +1 а>

Hi СО M а S-1 а lo 1-1 ст> ю г- *ч

^(ОЙЧ^ПНИННО

■V? сО

о

4-1

LO

о

i 4-1

1 M СО

о

Mi

to

о

1 4-1

Ф

• Lió"

С< »1 О.

frf

Щ

о

i

-2.5-

Включение С~метки в ФПС у ювенильного листа по сравнении с четвертым листом было в 3,8 {»за ниже, а включение метки в продукты фотодыхания - глицин, серии - наоборот, в 2,8 раза выпе. Отмечалось также возрастание доли С, включенного в С^-соединения •%. малат и аспартат.

Стимуляцию ФЕП-карбоксилирования в ювенильных листьях „ мокко объяснить тем, что формирование поздних листьев хлопчатника совпадало с наиболее жесткими экологическими условиями (высокая температура, амшсферная засуха и др.) Повышение активности 5ЕП-карбоксилаз« и, соответственно, первичного синтеза на ранних этапах развития листа С^-ыетаболитов, по-видимому, проявляется как адаптивный признак при воздействии нз-благэприятных факторов среды. .

Фотосиктетический метаболнаи СОрв процессе зеленения отполированных проростков^ Исследование взаимосвязи между синтезом и содержанием РБФ-карбоксилазы и интенсивность?: фотосинтеза при переходе растений от гетеротрофного питания к авто-трофкому (Алиев и др., 1084) позволяет изучить функцию фермента в зависимости от состояния хлоропласта. Показано, что в первые часы развития хлорспластсв основная часть фиксированного углерода (более 80%) обнаруживалась в продуктах ФЕП-карбок-силирования (малат, аспартат, аспар&гик, аланин) (табл.7). Существенная доля ^СО^ включалась в глицин, серин. В Ф1К метка включалась в небольших количествах. В течениз 25 часов освещения происходит перестройка ыотаболизш углерода, уменьшалось включение ^ СО^ в продукты ^ЕП-карбоксилирования, хотя оно еще было существенно велико (30/5), и возрастала доля продуктов цикла Кальвина. Уменьшалось включение СС^ в глицин, серин.

3 зеленом сформированном листе доля метаболитов 5ЕД-кар-Соксидирования к гликолатного пути незначительна. По изменению включения в стабильные 'продукты. фотосинтеза, в частности,, в ОГК, глицин, серии ыокно предположить, что в процее- • се развития хлоропластов.происходит изменение функции ¿лэрмен-та. 'Это связано, по-видимому, с функционированием в этиолированных проростках РБ5- к арб с к ск л а о ы, которая обладает высокой сксигенагиой активностью (Фархади и др., 1990). Зизиологичес-кая роль этого фермента монет заключаться в обеспечении метаболитами, необходимыми для синтеза хлорофилла, а гакхе пополнения цикла Кальвина. Эта метаболиты интенсивно используются

- ас -

Таблица 7

Распределение продуктов ф*...сации ^"СО^ з процессе раз вотия хлоролластов проростков гориха {% от общей радиоактивности спирто-водной фраками, экспозиция в ^СС^ - 20 сек)

Соединение '. 5 чзс ... : 25 час ■ ^ ..... - , г ............. : 48 час

&ГК следы 4,4^0,6 , ....... 9,2*1,4

-гзс следи 14,6*2,2 . 24,0*3,6

Глицкн + серия 23,213,4 7,211,1 7,711,1

Аспарагн,': 1,730,2

Л?пантач ¿6,512,4 • 4,»¿0,7 ' 2,91с,4

Алании ■1,9-0,7 19,£¿2,9 13,0-2,0

Глицерчт 15,012,2 ' 23,013,4

1*1 лат 26,814,0 ь.ьго.а 2,&10,2

Цкграт-азоцитрдт - 4,8-0,7 4,НО,4

Cr.xc.pa следы 13,011,9 8,710,8

Другие соединения 2,2^0,3 9,711,4 5,110,5'

пластида:.:;: и «луж» основой для перехода к фотоавтогрофног/у ь'.стабслизц/. Поскольку глицин является одни:.', из прег^оствс-н-к;:;:с>2 горф«ринов, данные по накоплению, на. ранних этапах раз-гптия хлоролластов фиксированного з кем ^"'СО^, позволяют сделать сыеод о бозьо-шой роли оксигекг.зной функции фермента в регуляции биосиктетических процесс«1 в хлоропласте.

Ьгуляция ¿отс^гестичес^^^^ . углерода в лис-

тья;: средк. Э££ент комплексного

гсддеГ-стгия Бке^них факторов вырфв&до растений хлопчатника на скорость фотося:«е;<а к фотосинтетичеекого метаболлака углерода пекзз&л, • что увеличение интенсиячости г.?ета пегьшало фот с ■.■«•.теп (таб.*. .0), сти^/лиронздо включение з сахарозу, йГХ, дк^;>сф*1п; cnxir.cn, глнцерг? и кзхг»т и подавляло-? глк>к-'.-з'^-жфэсф-ат, ^ру.чтоэоконофос.'ат, глицин и серии. Повышенно теь'.яетлтурь' само го себе и в л&бюс сочетаниях с другими- ф-мсто-{,31;! на г-ер;тем уро1'Н>' увеличивало фотосинтез. При поаыенноЗ тянпоратуре увеличивалось, накопление мотки а дифсефато.ахлр<чх, ф;уктгзом^нофосфате, сахарозе и палате, но укеньзалось в гл:о-

Таблица 8

Распределение мел-иу фотоассяжлятами У адаптированных к разным с ловлям внешней среда растений хлопчатника

радиоактивности в % от радиоактивности спирго-водиой |ракшш

Условия опыта

свет :тем- гкоицент

'.Интенсив- : Доля ;ность фо- :

:тоеиктеза„ :-

:мг С02/г •сахару хой масса:^оза

ЗГК

дгс

ШФ

•3«

ала-:гли-нпн :перат

глпшн:ка-:ас- : прочие серин .лдт. ат :неШ1Я

1000 25 0,03 5,£±0,8 я с» о | v- 23,3 2,9 5,1 24,3 6,2 3,3 22,4 1,4 0,2 7,0 ,

7000 25 0,03 13,6*3,1 11,5 30,6 6,1 4,1 II.7 4,0 .С. 8 6,8 1,7 0,9 15,8 $

1000 35 0,03 3,6*0,8 9,0 24,6 3,7 4,6 27,3 2,6 2,7 11,2 2,4 1.4 10,0 1

7000 35 0,03 15,0*2,8 5,5 31,9 5,8 1,7 27,6 2,6 2,3 8,4 1,2 1,7 Ц,3

1000 25 0,3 7,4*1,6 5,9 27,0 5,3 8,0 23,9 2,8 2,8 13,2 1,4 1,8 7,9

7000 25 0,3 25,2*4,8 2,8 30,6 6,8 3,6 31,5 2,6 2,6 7,0 1,4 1,7 8,6,

1000 35 0,3 6,7*1,7 12,2 27,5 0,2 3,4 12,1 2,6 9,1 11,5 0,9 10,6 9,9

7000 35 0,3 17,4*3,0 4,6 29,2 9,1 3,6 26,8 4,6 1,5 .8,2 3,9 1,0 7,5

0 - 28 -

коэомонофосфате, глицерате, «танине, в глицине с сербом (табл.8). Повышенная концентрация СС^ приводила к росту фотосинтеза, повышению доли ^С в сахарозе,-ФПС, дифосфатсахарах, глюкозомонофосфате, аспартате и понижению его в аланине, гли-церате и глицине с серином. Повышение значения трех факторов как в отдельности, так и в сочетаниях активизировало включение метки в'продукты ФЕП карбоксилирования. Это свидетельствует о том» что выращивание растений хлопчатника при повышенных иктенсивноетях света,в избранных пределах, температуре и V концентрации СО-з должно приводить.к активизации ЗЕП-карбокси-лазы. Как следует из вышеприведенных данных, в основном активизация ФЕП-карбоксилирования происходит в экстремальных условиях среды, и, по-видиыому, имеет адаптивный характер. _

Влияние повышенной концентрации С0£ .на распределение__'Х

между продуктами фотосинтеза. Влияние высокой концентрации СО на фотосинтетическую ассимиляцию и распределение медцу фо тоассиыилятами показало, что скорость фотосинтетической фикса ции ^СО^ -стимулируется высокой концентрацией СО^. Анализ образовавшихся при это« продуктов фотосинтеза свидетельствует о том, что увеличение скорости ассимиляции углерода сопровождается резким увеличением как абсолютной, так и относительной радиоактйЕности ранних продуктов - ФГК и фосфорных эфиров Сахаров (табл.9). Отмечалось увеличение радиоактивности в листьях растений сль-тных вариантов -и в подавляющем большинстве обнаруженных меченых соединений. Исключение составили сахароза, триозофосфаты, радиоактивность которых заметно уменьшалас и. глицерат, у которого она почти не изменилась.

Интенсивность ассимиляции углерода при выбранной эксшз; ции (15 сек) отражает работоспособность и активность, прежде всего РЕФ-карбоксилазы, а также ферментов, участвующих в ранних реакциях .восстановительного цикла углерода, и обнаружен. ный .эффект влияния концентрации СОъ на ассимиляцию СО^, являе: с я показателе».« явной стимуляции функциональней активности эт: ферментов. . '

• иУрачаег ка сй)5я . внимание тот факт, что на фоне повышен сбщеЯ фотосинтгтучаской ассимиляции в листьях опытных ра' тенкй наблюдалось увеличение метки и в основных продуктах гл колатн<?го йв1габогизма - гликолате, глицине, серине, но в гл;:

Таблица 9

Влияние высокой концентрации СО^ на интенсивность фотосинтетической ассимиляции и распределение

С ыеяду отдельными фотоассимилятами. Экспозиция в - 15 сек.

1 Контроль : Опыт

Метаболиты !иып/минт : :имп/мин'г %

: сухой массы". % Гсухой массы

: -Ю"3 : 'Ю-3

Дифосфаты Сахаров 28,0*3,4 6,1 81,1*9,7 6,8

Монофосфаты Сахаров 73,4*8,0 15,8 4l6,lt4l,0 34,7

2ГК 141,5*14,1 30,6 368,0*37,0 30,6

Триозофосфаты 11,6*1,5 2,5 следа

Глицин, серии 31,5*3,8 6,8 93,5*11,2 7,8

Сахароза 53,1*6,4 11,5 33,8*4,0 2,8

Алании 18,7*2,4 4,0 31,8*3,6 2,6

Глицерат 31,5*4,8 6,8 31,8*3,2 2,6

Гликолат 8,4*1,2 1,8 16,5*2,1 1,4

Соединения, двизуащеся I0,8t2,4 2,3 28,0*3,4 2,4

с линией фронта

">чие I4,0i2,0 6,5 86,2*9,5 7,2

•лтенсивность общей фиксации ^^COg (имп/мин'г

сухой массы'10"^) 499,5-70,5 1501,8+153,2

церате, образуваемся на более поздних его этапах, содержание С сохранялось на уровне контроля.

Сопоставляя полученные данные, мошго допустить, что при высоких концентрациях СО^ в сравнении с контролем (0,03^) возрастала доля участки в биосинтезе глицина и серина других, помимо гликолатного, путей. При этом резко возрастало отношение глицина и серина к глицерату, за счет первых. По-видимому, при низких концентрациях COg более существенна роль гликолатного гут и углерода в качестве поставщика дополнительного источника PES.

Изучение метаболизма углерода у гетерозисных форм хлопчатника показало, что полученные гибриды и родительские формы, отличающиеся по активности я содержании РБФ-карбоксилазы,

имели идентичный набор продуктов фотосинтеза (Абдуллаев и др., 1990). Основная часть С включалась в метаболиты цикла Кальвина. При этом у сорта Ташкенг-1 включение метки в ФГК выше, чем у других исследованных форм хлопчатника. По включения 4С в сахарозу гибриды уступали исходному сорту С-6030 и обнаруживали отрицательный гетерозис. У гибридов значительно увеличивалась радиоактивность аминокислот и органических кислот и проявлялся гетерозисный эффект по зтиы соединениям. Положительный гетерозис наблюдался по величине фонда глицина и серина, а отрицательный -по гликолату, основное источнику синтеза глицина и серина, что свидетельствует об ускорении у гибрида реакций гликолатного метаболизма углерода (Абдуллаев и др.. 1992).

Отсутствие различий между исследованными формами по вкли-ченизз С в продукты ЗЁЙ-карбокеилнрованкй свидетельствует о том, что гетерозис не затронул фотосинтзткческий синтез про,цуктов 2ЕП~карбоксилироЕакия, хотя по интенсивности фотосинтеза он четко проявлялся. По-Еццимому, в данном случае ФЁП-карбоксили-рование не вносило какого-либо существенного вклада в проявление эффекта гетерозиса в фотосинтетической ассимиляции СО^. Подученные данные свидетельствуют о том, что гетерозис по фотосинтезу обусловлен превде всего повышением активности карбокси-лирувщих систем и ранних реакций фотоекнтетического метаболизма углерода.

Исследовано влияние физиологически активного соединения " миксталола на активность карбоксилирувэ!дях ферментов, интенсивность фотосинтеза и соотношение продуктов фотосинтеза. Установлено' положительное действие миксталола на активность РШ- и ЕЕП-карбоксилаз и показано двухкратное увеличение при згоы скорости фотосинтеза и ассимиляции С0^. Анализ образовавшихся при фотосинтезе продуктов показал, что у обработанных микста-лолом растений происходит более интенсивная мегаболиэация ФГК в цикле Кальвина и стимуляция синтеза метаболитов <Е£П-карбок~ сияирозания и гликолатного цуги углерода (Абдуллаез и др., 1090).

Вовьсожно, оказыгая воздействий на гориокальнуз систему растений и усилив?ч ростовые процессы, ыккетаяоя повышает активность РБ5>-карбохсилаэы, обусловливает более интенсивный. оборот цикла Кальвина, способствует активизации дополнительных каналов на пути углерода и обеспечивает танам образем болье

- 31 -

высокую фотосинтетичэскуга деятельность растений. '

• МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ЖХАШЗ.Ы ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ЭЛЕМЕНТОВ С4-:.'ЕТАБ0ЯИЗМА. УГЛЕРОДА В ХЛОРОПЛАСТА Сд-РАСТЕНИЙ

Проблема метаболизма С^-дикарбоновых кислот и локализации $ер.\:еятоз, связанных с ним, важны для выяснения физиологической роли С^-метаболизма углерода в хлоропластах Сд-растений.

Локализация некотопых ферментов метаболизма в хлопопластах р:зи. Исследование локализации некоторых ферментов С^-мета-болизма доказало, что.в хлоропластах ржи присутствуют такие фермента, как -Ш1-гарбоксг;паза, ЩГК-декарбоксилаза, НАДФ-ма-латдегидрогеяаза и НАДФ-малия-энзим (габл.Ю). Ферменты С¿-метаболизма углерода локализованы в различных фрагментах хлоро-яластов. ЕЛ- и РБФ-карбоксклазкг обнаружены в мембранах оболочек хлоропласта, а НАДФ-малатдегадрогеназа а НАДФ-малик-энзим в строив хлоропластов (табл.11).

Таблица 10

Активность ферментов С ..-метаболизма

'х

в хлорогхластах рли

Удельная активность, Е/мг белка

.. - , .¡лаза . 0,24^0,02

Ш-карбоксилаза ' 0,049^0,004

1\УК-де карбо ксклаз а 0,010*0,0012

КЛ-карбэкеахиназа О

НАЛ-малик-оязим ' "О -. '

НА^-малич-энзим 2,1-3,2

НАД1?-малат-егйдрогеназа - 1,5*0,1 - ;

Следуем отметить, что в хлоропластах активность ФЗЯ-карбокси-килазы не обнаружена и поэтому ее участке в превращении С^-яг.карбоковух кислот в хлоропластах рки оказшзается яевозмокяым. Таким образом, наличие активности этих ферментов указывает на воя .{о-х-гость метаболизма С„-дикарбоновнх кислот в хлоропластах С.^-рютегл!:. *

Лотаболпзэд С ¡-газагбоновых кислот в хлооояязсгах и листьях Исследование метаболизма С4-дакарбоповых гас-

Хаблица II

Активность ферментов С^-фотосинтеаа в субсгруктурах хюропластов ржи

Фракции

Удельная активность, Е/иг белка фракции

ЗЕЛ-карбок-: ЩУК-де кар-: -¿мр: НАЛФ-ГЛЭ: ^БФ-карбо-силаза '.боксилаза ¡"^^^гкошгаза

Строма О О

Мембраны .

оболочек 0,012-0,001 0,045*0,008 О хлоропласта

Ламеллн и тилакоиды

5,5-0,05 2,8*0,03 0,319*0,06 О О

О

О

Таблица 12

Метаболизм С4-дакарбоновых кислот (ЩУК-14С и яблочная кислога-^^С) в хяоропластах ржк (содержание соединений в % от радиоактивности спирто-водной фракши)

Метаболиты ЩПС-14С .'Яблочная та ; киолота-т!

I шн. I ЛИН »

Соединения на лиши старта 7,5*1,2 3,1*0,5

Фосфорные эфнры Сахаров - 3,2*0,7

¿ГК следа 3,3*0,9

Аспаратан 8,2*1,8 12,7*1,2

Соединения, движущиеся с фронтом 6,2*0,7 18,0*1,6

растворителя

Аспартат 17,6*1,3 3,7*0,4

Неидентифицированяое вещество, 8,5*0,9 4,2*0,3

близкое по гттку, серину

Сахароза 4,8*0,5 -

Глицерат, алаяин - 3,0*0,2

Яблочная кислота 15,5*1,0 10,3*0,8

Гликолат 4,5*0,3 3,1*0,4

Органические кислоты 4,2*0,1 4,4*0,6

Соединения на уровне моносахаров - 3,0*0,3

Неэкстрагируемая спиртом и водой фракция 23,0*1,4 27,7*1,1

лот (^-ЩУК и *^С-яблочзвй кислоты) в хлоронластах рки и хлопчатника л метаболизма ^-яблочной кислоты в разновозрастных листьях хлопчатника показали, что исследованные растения различаются по скорости н направленности метаболизаши указан- • ных кислот. 3 хлоропласта! ржи они метаболизирукзтся с большей скоростью, и метка обнаруживалась в больном наборе соединений . (табл.12). Отмечено более интенсивное поступление из яблочной кислоты в продукты цикла Кальвина, аспарагин; соединения, движущиеся с фронтом растворителя, по сравнению с 1ДУК, что может происходить в результате реассимиляши СО^, образовавшейся при декарбоксилировагши С^-дикарбонових кислот в'хлоро'плас-тах. Б опытах с ЩК-14С большая доля включалась з яблочную кислоту и аспартат.

В хлоропластах хлопчатника набор .образовавшихся меченых метаболитов был меньше и основную часть составляли яблочная кислота, аспартат и орг.^лческле кислоты (табл.13). а варианте с I¿*C-b'iyií метка обнаруживалась в набольших количествах в íI'K-и монофосфатах Сахаров,.тогда как в варианте с ^-яблочной кислотой включение мешси в эти соединения не отмечалось.

Исследование иетаболазма яблочной кислоты в листьях хлопчатника показало, что нз ранних этапах формирования 'листа и особенно на 9-10 дни яблочная кислота изтаболизировалась с большей скоростью, чем в зрелом листе. При этом метка ^С обнаруживалась преимущественно в органических кислотах и аминокис-' лотах (табл.I-i). Существенная часть мотки включалась в соеда-эния, неподвижные в ислсльзовашшх нами растворителях, и сое-,_.леняя, движущиеся с фонтом растворителя ("прочйе"). Совсем незначительная доля включения метки наблюдалась в ФГК и саха-рах. 3 отличие от ювенального в зрелом листе более 80,о яблочной кислотн оставалось неиспользованной, а среди меченых сое-- ' линений обнаруживалась а наиболее значительных количествах в соединениях, но подвижных в растворителях, в '¿ГК включалось больше метки, появилась мотка в ¡юсБорных эфирах Сахаров.

Полученные данные дают основание для предположения о воз-мо'кности лекарбоксилировачия С^-кислот, п частности, яблочной кислота, и реасснмнлянпи выделившегося ^Ог. карбоксилирующи-w системами С^-растениЛ (рис.9).

Габлипа 13

Метаболизм С^-дикарбоновых кислот (ЩУК-14С и яблочная кислота-*4!)) в хлоропластах хлоичатигка (содержание соединений в % от . радиоакгинЕости сшрто-водной фракшш)

Соединения

ДУК-14С -Яблочная кислота-14С

I мин

I мин

Соединения на линии старта Фосфорные эфиры сахароз

Асдартат

Яблочная кислота Органические кислот!' Неэкстрагируемая спиртом е водой фрагдая

15,9*1,2 11,0*0,7

2,9*0,1 -

1,1*0,2 - -20,3*1,140,9*1,4. 12,5*1,0

5,4*0,8

10,0*0,В 34,2*1,6 29,7*1,1

15,1*1,2

Таблица 14

Метаболизм яблочной кислоты-

]14с

в листьях "

хлопчатника разного возраста (содержание.соединений

в % ог радиоактивности спирто-водной фракции)

Яблочная кислота 63*4,8 50*1,0 и —■С у

Алания ■»• гдзцерат 9*1,3 " 26*4,3

Цитрат, Езошграт 9*1,3 • 22*5,2 ■'. 1*0,2

СГК 2*0,1 - .3*1,0

Фосфорные эфиру сахароз - 2*0,4

Аспартат 9*0,1 . следа- ^ ¿-о, о

Зрочзе 6*1,7 1*0,1 ' 10*1,0

Ф

СО а

тршздсросФ/а-

V

. I рбф НИКЛ

I КАЛЬВИНА I ^

I Ч А /с£

| Ш )?

ФЕПдаг Щ|К _

шнла I I *

£

ЯбЛОЦНЛЯ

™С-]0ТА | АСПДРТАТ

СОа-ИМТШВШЮ ЦМТОПЛАЗШ I ХЛОРОПЛАСТ

Рис.9. Возможный механизм использования ЩУК и яблочной кислоты в хлоропластах и листьях Од-растений.

Как следует из вышеприведенных данных по метаболизму яб-' лочной кислоты, ыеэду листьями и хяоропластами хлопчатника обнаруживается существенные различия.'В листьях наблюдалось вклю-• чение 15С ::з яблочной кислоты з продукты цикла Кальшка, в частности, <5ГК, тогда как з хлоропластах этого не происходило. Использование яблочной кислоты происходит в митохондриях. В цикле Кребса выделяется СО^, который первично »«ожет фиксироваться §Ей-карбоксилазой и через ЩУК или молекулярную диффузию проникать з центры карбоксилироваНия РБй~и таы реасскмилирова-тьсл Р£С-кярбоксилазой, в результате чего могут образоваться .ФГК и другие продукты цикла Кальвина (рис.9)Таким обозом,, для метаболкзации С--кислот, £ частности, яблочной кислоты, у .хлопчатника, по-видимому, необходимо участие других, помимо хлоропластоэ, органелл и целостной системы клетки.

Ь хлоропластах Сд~растекий функция С^-метаболизма, взроят-нс',. заключается в еледущем.- Образующаяся в результате карбох-•'силкрсгаггия Ш'"(в цитоплазме и хлоропластах) после про. никновенпя в хлоропласт кокет, во-первых, декарбоксилпроваться

' с помощь«? ЩУК-декарбоксилазы, во-вторых, восстанавливаться до яблочной кислоты НАДФ-малат-дегидрогеаазой. Дальнейшая судьба ■ яблочной ,кислоты у исследованных, растсняй, по-видимому, различна. В хлоропластах ржи часть еэ декарбоксшшруется с учас-. таем НАД'^малик-энзима, часть же ее используется для образования асдартата,.который -далее может принимать участие в синтезе 'белков. В хлоропластах' хлопчатдика яблочная, кислота использует-• ся, по-видимому, преимущественно на синтез других, органических. кислот и аминокислот. В отличие от-ржи в -хлопчатнике, по-видимому, отсутстгует двтрбахгилировашв я блочной кислоты, образовавшейся в результате' восстановительных реакций (рис.9).

Таким образом, особенности метаболизма С^-дакарбоновых кислот (ЩУК/ яблочная кислота) в хлоропластах ржи и хюачатни-•к ¿.указывают на. то, что С^-кислоты могут быть донорами СО^ для , никла Кальвина. Однако поток ОО2 через -эти ферментативные реакции очень слаб, и, .по-видимому, функция С^ метаболизма углерода в хлоропластах-Сд-растешй заключается.в том, чтобы синтезировать органические'кислоты и аминокислоты.

Влияние фосфоенолпирувата на фотосинтетический метаболизм углерода в-листьях хлопчатника. Исследование влияния ¡юсгоспод пиру вата (¿311). на фотосинтетиче'скую ассимиляцию С0£ и со. отношение продуктов фотосинтеза показали, что ЕЕП повышал кратковременную (10 се к/" глоток") общи -фиксацию С0^ почти в 4 раза, однако стимулировал выброс 00^ в атмосферу, особенно в первые-30 сек выдерживания после'"глотка" (табл.15). Обнаружены существенные различия в кинетике включения в ранние и вторичные продукты ассимиляции. Под влиянием -ШП сгамулирова-лись реакции превращения ранних продуктов фотосинтеза, в частности, 2ГК и образование сахарозы как основного продукта в течение 3 минут. Кроме того, 4ЕП подавлялось образование.мета-, болитов гликолатцого. пути: гллшна, серана, гдкперата. По $ включению "^^С в продукты С^-метаболизма существенных различии' не обнаружено. На основания анализа общей фиксации и продуктов фотосинтеза.можно предполагать, что активизирует РБг>-кар-боксилазу, подавляя .в то ж время.ее оксигеназиую активность.

Как следует из данных'табл. 15,.явного перехода у.егки из С^-соединений в С^-продукты Тютосинтзза на рашг.0; этапах угле-ро.пк<ж> метаболизма не отмечается. Раяаз Аояги и Бассемом показан у пшениш переход метки от С „-кислот в продукты цикла

С) ,5 мг на I ил г-

в лпстьяг. хлопчатника (в С* Уо О'А' С

Соединения

• Iis с i (I5i •

дн [ос ('ITH сахароз 12,4 ело;,; ;

Гсксозомоно1юс|ати II,в 19, о

i'py KT iTJ 0.*„0 HO tbc Jl'iTU 15,1

И'л 32,5 г, г,

Tp;t030toc{UTH 4,9 следы

ГЛИЦИН, copmi 7.6 9,7

Сахароза 3,1 5,5

Моносахариды следи 8,3

Алании 3,9 6,1

Глацорат " следы 4,6

Гликолат А,7 4,9

Малат ' сдоди 4,4

Цитрат (+изоцитрат) следы 8,9

Соединения на линии старта следы -

Соединения на линии фронта 4,2 5,6

Интенсивность йотосиитати-

ïïôckoë ассимиляции 0,03 0,014

(мг СОо на г сухого

веса}

Таблдиа 15

творз) на соотношение продуктов фотосинтеза чей радиоактивности). Концентрация 14С0~ - 0,05^.

■'ШТрОЛЪ' Опыт

:(15<-90)е:(15+180)с 15 с ;(15+30)с:(15+90)с:(15+180)с - » 1 ■ • ----- - • » •

следы 8,6 9,9 13,8 • 8,9 2,9

3,7 6,5 6,5 1,9

11.9 5,7 21,9 21,3 12,1 19,5

16,7 15,7 30,8 . 18,4 13,6 5.1

12,8 следы 5,2 следы следы

15,3 " 16,1 6,4 16,2 3,1 8,2

4,8 - 8,6 3,8 17,8 34,6

3,4 7,9 3,4 - 6,6 4,6

6,1 8,6 6,9 7,5 . 7,2 8,1

5,0 5,0 следа - следы следа

следи 4,3 следы - следы 3.7

5,2 3,3 следы 8,5 5,5 2,9

3,8 следы следы - следы следы

- - - - 6,1 -

7,6 5,6 5,1 8,2 13,5 6,4

0,016 0,027 0,084 0,018 0,017 0,068

- 38 -

Кальвина, что свидетельствует о функционировании в листьях этих растений концентрирующих систем с участием ферментов С4-метаболизна углерода. Однако в опытах с хлопчатником такой картины не наблюдалось. Причина может заключаться в том, что в листьях пшениш продукты р -карбоксилирования (малат и аспар-тат) составляют около 40%, в листьях же хлопчатника всего 5-6^ ( Aoyagi, Bassham, 1986).

Дричкнаии выброса С02. отмеченного наш, во-первых, монет быть недостаток восстановителя для образования яблочной кислоты, из-за чего Щуп не успевает восстановиться и декарбоксили-руется с участием ФНИ-карбоксикиназк. Во-вторых, в мембране хлоропластов существуют переносчики С^-кислот (¡ЛУК, малат) ( Hatch et ai., 1984), количество которых в хлоропластах хлопчатника, по-видимому, невелико, и образующаяся ЩГК не гложет интенсивно использоваться хлоропластами. Вьгделпвн/аяся СО^ может вновь ре ассимилироваться, что обнаруживается через более продолжительное выдерживание после"подкормки"(3 мин) и, как свидетельствуют образовавшиеся продукты, $иксашя СО^ осуществляется РЕф-карбоксилазной,

Таким образом, экзогенный ЗйЛ не вызывал активизацию ;ЙЗП-карбэксилирования, хотя повышение хотосинтетической активности происходило. Ло-видимому, для активизации ферментов синтеза я метаболизма С^-дикарбоновых кислот в процессах концентрирования GOg необходимы определенный комплекс условий.

Исследовано влияние солевого стресса на активность iep.vien-тов и соотношение продуктов фотосинтеза. У отобранных после солевого стресса растений выявлено повшдеяие активности КЗЛ-кап-боксилазы и стимуляция включения в органические кислоты. CtJcKT солевого стресса заметно проявлялся лишь в фазе бутонизации и сопровождался максимальной Тотосинтетической активностью растений (Насыров и др., 1989).

3 А К 3 Ю Ч Я Н И Е

Изучение кинетических свойств РЕ&-карбскеилазы показало, что для PEi; и СО-, у исследованных растений имеет неодинаковые значения. Сопоставление полученных результатов с литератур-тгли данными для очкдеиного препарата из других растений пока-i зало, чхо К.j для СОг. и PSJ? варьирует в пределах одного порядка, j £ти различия, по-видалому, связаны только с особенностями рас-

тения.

При исследовании ФЕП-карбонеилазы обнаружено несколько форм ферментов, различающихся по содержанию и молекулярно-кияе-гическим параметрам.

Возможно, они несут ответственность за обеспечение пула С4-кислот, пополняющих интермедиатн цикла трякарбоновых кислот, синтез аминокислот, поддержание рН в цитоплазме и др. Причины появления изо$орм фермента недостаточно ясны. Возможно, ®П-яарйоксядаза кодируется различны;® гена.'®, или, может быть, фермент подвергается сложной модификации, вызванной действием факторов внешней среде. Тем не менее, факт существования изо-форм ФЗЯ-карбоксилазы у высших растений может быть проявлением генетического потенциала, который при определенных условиях обуславливает функцию поддержания гомеостаза растений.

Анализируя результаты исследования влияния факторов внешней среда на интенсивность «фотосинтеза, активность и содержание РБ5-карбоксилазы, а также метаболизм углерода, можно отметить, что при определенных условиях постановки эксперимента максимальная интенсивность фотосинтеза, наблюдается при достаточно высокой активности и низком содержании фермента. Это свидетельствует о том, что для увеличения интенсивности фотосинтеза нет необходимости дополнительного увеличения содержания фермента в хлоропластах Сд-растений, как предполагал Самэдзима (1985), а достаточно подобрать соответствующее сочетание основных факторов среды.

Ряд исследователей предполагают использовать показатели активности и е^язрдггяя РБ$-карбоксилазы в качестве теста для отбора растений с повышенной интенсивностью фотосинтеза (й?еу, Кое«, 1975; Абдуллаев, 1990), что подтверждается полученными данными по исследованию этих параметров у гетерозисных форм хлопчатника. Однако наш исследования показали высокую чувствительность этих показателей к действию различных факторов среды и это дает основание считать, что они не всегда могут служить надежным показателем уровня и продуктивности фотосинтеза. Проявление его как теста для отбора определяется, со-виддоюму, физиологическим состоянием растения к тематическими факторами.

Исследование метаболизма углерода на примере хлопчатника еще раз подтвердило генетическую обусловь. 'ость основного типа

О - 40 -

г/.етаболизма углерода независимо ов условий осуществления фотосинтеза. Вместе с тем, соотношение основных путей превращения углерода (Сг>-, Сд- я С^-соединений) обусловлено воздействием факторов среда, как внутренней, так и внешней.

Изучение активности ШЕП-карбоксялазы в. метаболизма углерода позволило установить, что активизация ФЕП-карбоксилироваяпя листьев совпадает с наиболее жесткими экологическими условиями (высокая температура, атмосферная засуха и др.). Повышение активности фермента и, соответственно, первичного синтеза на оп-ределеншпс этапах развития листа С4-метаболитов, по-видимому, . лрсягляегся как адаптивная реакиия при неблагоприятных условиях среда, что в конечном итоге сяособствуег поддержанию на определенном уровне фотосинтетической продуктивности растений в этих условиях.

На основании полученных данных по локализации ферментов метаболизма С4~дякарбояовых кислот в хлоропластах Сд-растений можно сделать предположение о возможности переноса СО.- из цитоплазма в хдороплаоты через ферменты синтеза и метаболизма С^-дикарбоновых кислот.

Вышеприведенные результаты позволяют сформулировать новые представления не только о возможности, но к необходимости функционирования элементов С¿-метаболизма углерода в хлоропластах С3-растекий, которые пра нормальных условиях обеспечивают синтез оргаяачзсккс кислот, аминокислот, белков и липидов, а прл,-нееткнх условиях служат как дополнительный канак доставки СО^ к тантрам карбоксялзрования. В телом, актквиза-.хпя ¿ЗЛ-карбох-сплзроваэзш обнаруживается в экстремальных условиях среда как адаптивны!: признак, связанный с проявлением чувствительности к воздействии неблагоприятных факторов среды.

Проведенные исследования ао изучению некоторых Ьтзпг-а-х::-иическах свойств карбоксшпрукщдх ферментов регуд^.-^и таксации С&2 выспдх растений позволяют доставать ряд ногкх задач, репеняе которых представляется весьма дерспектгвнъ-.'. К яим от-дослтоя, з частности, вкяснбяде взз:о2яос7Д доягла.ггя лзз.^р:.: РБ^-ьсарбокеддазь' з стрессовых условиях, что арзддг.-.ггадось г. • работе Русд.-:овой и др. (1961), зыяндзнзе других дс.тз.-з-

Е2Е клл сгцзсгвовакгя аваккзадй части гчг;-

яекие физиологического зкачеягя высокого еодерхаягл '1ер:.:з;"Г" г. хлсрэддасгах С3-рагтек:2, исслздовадде эдгянзя ст;-. сооекг:

торов на активность и содержание (соотношение изоформ) 1>Ди-карбоксилазы и исследование фо т о с л -г т е х л че с но го метаболизма углерсда в связи с экологическими условиям среды.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено, что одна из регуляторяых функций малых суб-ье-диниц РБЗ-карбоксилазы проявляется в увеличении скорости образования металл-ферментного и/или фермент-субстратного комплекса и ускорении их распада с образованием продуктов реакции. Фермент, имеющий молекулярную массу около 560000 ;,дльтон, обладает сходками с другими растенглмя значениями для СО^ и РЕФ. Установлено, что основные факторы среды (температура, кояиект-рапня С02 и интенсивность света) при выбранных наш условиях воздействия оказывают влияние на сродство фермента к СО.-.

Показано, что исследованные растения (кукуруза и хлопчатник) различаются-по количеству изоформ ФЗП-карбоксилазн и их далекулярно-кинеткческии свойствам. У кукурузы обнаружено 4 изоформы фермента, молекулярная масса которых равна для форм.» I - 310 , 2 - 400 , 3 - 350 и 4 - 280 кДа, К,лдля СОг колеблются от

ДО 1,0'Ю"2 и, для ФЕИ - от 1,8*10"^ до 2,3'Ю"2 М. У "хлопчатника обнаружено 3 изоформы фермента, молекулярная масса которых равна 310 , 400 и 350 кДа, Км для СО. - от 2,0'Ю"3

О ом £)

до г.З'КГ1 для Ш - 0,4-0,5 •Ю'":\

2. Показано, что ФЕП- и РБФ-карбоксялазы прол'.-лягт равную чувствительность к изменениям условий внешней среды и влияние на их активность каждого фактора в отдельности существенно зависит от сочетания с другими факторами среды. Повышение интенсивности света приводит к увеличению содержания РБ'З-карбокск-лазы и уменьшению его активности. Увеличение температуры ;'•>; повышение концентрации С0£ приводит к росту активности фермента, одглао его содержание при этом снижается. Поддержание этих факторов на верхнем уровне в отдельности активизирует ФЗП-кар-боксилазу. Взаимодействие исследованных факторов среда на верхнем уровне оказывает неоднозначное влияние на активность и содержание РБ2-карбоксилазы, но несколько активизирует' ¿ЕП-карбо:<-силазу.

3. Исследование фотосинтетического'метаболизма ур^ереза в онтогенезе листа показало, что на всех зтапах развития лкс-

- 42 -

тьев хлопчатника функционирует С^-тип метаболизма углерода с ФГК в качестве основного продукта фотосинтеза. Отмечены изменения в соотношений отдельных групп метаболитов в зависимости от стадии развития листьев, которые касается более всего ранних С^-, Сд- к С^-продуктов и свидетельствуют о функционировании на ранних стадиях развития листа шкла Калышна и о существенной роли при этом гликояатного пути углерода. Выявлено, что по мере развития листа удельная активность РБФ-карбоксплазы возрастает, а активность аЗП-карбоксилазы уменьшается,

4. Изучена активность РШ>-карбоксилазы и метаболизм углерода при формировании фотосинтетического аппарата у зелекоххцкх проростков гороха. Показано, что в этиолированных проростках функционирует Ю-карбоксвлаза с высокой оксигеназяой активностью, физиологическая роль которой, вероятно, заключается в обеспечении метаболитами, необходимыми для синтеза хлорофилла, а такте пополнения и,ми чикла Кальвина, т.е. регуляции биосинтетических процессов в хлоролластах.

5. Сравнительный анализ исследуемых параметров на уровне ттелого растения хлопчатника показал, что самой высокой фото-синтетаческой активностью обладали листья среднего яруса. В них отчоченн самые высокие значения активности карбоксшшрукицях ферментов и соответствующие им высокие уровни интенсивности фотосинтеза.

Обнаружено, что ¿¿Л-карбоксилазная актичнэсть изменяется синхронно с изменением активности Р£ £-карбо ксилази и интенсивности фотосинтеза, что свидетельствует о взаимосвязи 53Л-кар-боксилирования с процессом фотосинтеза у хлопчатника.

Выявлены существенные различия в образовании первичных продуктов фотосинтеза. В ювенкльных листьях к листьях первых ярусов отмечен более интенсивный синтез метаболитов гликояатно-го пути (гликолат, глицин и серии), что дает основание говорить о важной роли фотодыхательного метаболизма углерода во взаимоотношениях листа и целого растения.

6. Исследовано влияние Факторов внешней среды на интенсивность фотосинтеза и метаболизм углерода. Установлено, что каж-

: дни фактор внешней среди в отдельности и во взаимодействии с другими яо-разному действует на интенсивность фотосинтеза и метаболизм углерода. Повышение интенсивности слета стимулирует включение метки в продукты цикла Калмвна, особенно дафосфатов

Сахаров при любых сочетаниях факторов. Высокая температура на фоне более высокой освещенности подавляет, а на фоне низкой освещенности стимулирует биосинтез сахарозы при фотосинтезе. Верхние уровни интенсивности света, температуры и коттентрэш:! СС>2 в любых сочетаниях друг с другом подавляют биосинтез метаболитов гликолатного пути - глиаша и серияа, тогда как на гли-церат их воздействие неоднозначно. При сочетании всех исследованных факторов на верхнем уровне наблюдается рост скорости синтеза С^-метаболитов - малата. Исследование метаболизма CCV у адаптированных к высокой коянентрапии COg растений показало, что npi низкой концентрация СО,- существенна роль гликолатного пути углерода в качества дополнительного источника для регенерации рябулозобисфосфата.

7. Исследована локализация ферментов, которые могли бы участвовать в обогащении COg» и метаболизма С^-кислот в хлоропластах Сд-растений. Показано, что в хлоропластах рта: и хлопчатника присутствуют Ферменты синтеза и метаболизма С^-дикар-боновых кислот, (^якийояирование которых зависит от Тизиологи-ческого состояния растений и действия факторов окружающей среды. При жестких ^азиологических условиях они могут служить каналом дополнительной доставят СОо к нектрам карбоксилирования.

Список основных работ, опубликованных по матер!алам диссертации

1. йасыров B.C., Абдуллаев I.A., Абдуллаев A., Be лая Н.Ф., Горенкова Л.Г., Фирус O.K. Генетическое улучшение активности сротосинтетического аппарата // Кинетика 'фотосинтетического метаболизма углерода в Со-растениях. - Таллинн: Валгус, 1985. -С.109. J

2. НасupoL B.C., Попова Л., Абдуллаев А., Горенкова Л.Г. Фосфо-енолпируваткарбоксилаза как ключевой фермент высших растений // Изв.Ali Тада.СОР. Отд.биол.наук. - 1987. - В 4(109)-. -

С.39-43.

3. Gorenkova L.G., Atdullaev A., Hasyrov ïu.S., Popova'E.P. Isolation and properties of the isoforms of the phospho-enolpyruvate carboxylase for maize leaves // Comptes rendua de I Academic Bulgare Des Sciensea. - 1987. - V.40, 15.-P. 123-126.

4. Хасанов И.К., Абдуллаев А. Некоторые кинетические характеристики НАДД-малик-энзима из С,- и С,,-растений // Докл.АН Тадж. ССР. - 1987. - T.3Ü, .4 4. -лЗ.L53-255.

5. diсыров Ю.С., Абдуллаев А., Абдуллаев Х.А., Горенкова Л.Г. Летаболизм углерода у форм хлопчатника, отобранных методом солевого стресса // Изв .АЛ Тадж.ССР. Отд.биол.наук. - 1969.

- К 1(114). - С.46-50.

6. Торзшсоъа Л.Г., Абдуллаев А.., Н.сыров И.О., Попова Л.П. Очистка и свойства молекулярных форм фос^оенолпируваткар-боксилазы из листьев кукурузы // Биохимия. - 1989. -Т.54, & 8. - С.1348-1353.

7. Насыроз Ю.С., Попова Л.П., Абдуллаев А., Кочеткова И.В., лваницев Б.В., Васильева В.З. Регуляторная роль малых субьединип в проявлении активности рибулозобисфосфаткар-бокеилазы // физиология растений. - 1939. - Т.36, Ун 2. -

С.256-261.

8. Абдуллаев Л., Абдурахмаяова З.Н., Горенкова Л.Г., Алиев •л./., метаболизм углерода в онтогенезе листа хлопчатника // -;отогл:нтба и поолуюгаонный процесс. - Саратов, 1990. -С. 4-7.

9. Абдуллаев А., Горенкова Л.Г., Иванищев В.В. 0 распределена некоторых 'ферментов метаболизма С«-кислот в хлоропластах гаи /Г -дзиология растений. - 1989. - Т.36, №4. - С.665-

663.

10. Дгумаез Б.В., Магомедог И.М., Абдуллаев А., Горенкова Л.Г. О некого^пх свойствах шбулозобисфосфаткарбоксилазы из листьев /лопчатника // Изв.АН Тадж.ССР. Отд.биол.наук. -1990. - & 3. - С.43.

11. Яархади З.Н., Абдуллаев А., Алиев К.А., Абдурахманова З.Н. С тру стурко-лу нкжональгоге изменения рибулозо-1,5-биссБос-■раткарбоксилазы-оксигеназы в биогенезе хлоропластов // Физиология и биохимия культурных растений. - 1990. - Т.22,

Ji 5. - С.433-438.

12. Абдурахманова З.Н., Алиев К.А., Абдуллаев А., &отоет:.чтет::-чеогаЗ метаболизм углерода и превращение гл/т.лдг.х х 0-хяслоты в онтогенезе листа хлопчатника (воы'урхи:-. ...rsutw-i

L.) // Ризиология растений. - 1990. - Т.37, 4. - С.675-662.

13. Abdullaev Л., ¿bdurachraanovo Z.K. Systerr.8 reassimilation о СП« respiration on the metabolism carbon of C^-plcnts. AsStrcictB 7-th Concress of the Federation of European Soc.i tieo oi plant phyaiology (Unea,Sweden, August 5-10 1990) /

Pfycioloeie plantarim. - 1990. - V.79, Part 2. - P.4.

14. Иванлцев В.В., Абдуллаев А., Горенкова Л.Г., Ибрагимова Г.Ь, Активность '[юсТсонолгатват-ка}х5оксикиназы в компарт-ментах листьев хлопчатника /7 Изв.АН Тадж.ССР. Отд.биол. наук. - 1930. - И 1(118). - С.53-55.

15. Абдуллаев Х.А., Джаиагоудар Б.С., Абдуллаев А., ¿арходи с.л., Абдутхманова b.ii., Нас.чров .WJ. Содержание к актив-ность 7 гетепозисяых гибридов хлопчатника // Докл. АН Тагу..ССР. - 1990. - Т.33, :г 5. - С.340.

16. Абдуллаев Л., Дбдуоахм адова З.Н., Горенкова Л.Г. »йпяште сг.".с:: szivv.nx. аг.'.игоъ т ?отосинтет!:чес:о:Г: мзтабадизч угл?-легюла листьев хлопчатника // докл.АН Tw-.CCP. - IO'jJ. -Т.33, * и. - С.695. ' ■

17. Абдуллаеп А., Гореякоза Л.Г., Лрусакова Л.Д., Каспароза И.О. Влияете смеси карних спиртов ка некоторые фязиолого-биохихичесхие характеристики хлопчатника // й;зиологяя растз.ч;:к. - IS9I. - Т.38, В 6. - C.II8I-II87.

16. Marone лов И..'.'., Горзякова Л.Г., Калер В .Л., Доти аев В.Б., Абдуллагз д. Влияние внешних факторов среди и их взалмо-'дейстгая на активность карбоксилируящзх ферментов // Вестник ЛГУ. - IS9I. - iM.. - С.73-77.

19. Абдуллг.ез Х.А., Абдурахманова З.Н., Лбдуллаев А., Наскров Ю.С. О гесерозисном эфрзктэ и генетячзском контроле ioTc-спятемчесаого метаболизма СО, у хлопчатника // Докл. АН Республика Таяшастак. - 199Й. - 1.35, Л 2. - С.145-148.

53. Абдуллг.зв А., ¿^у.мазв Б.Б., Абдурахманова З.Н., Кал ер В.Л. .'агаг/.ов В.Л. Комплексное влияние внэппих факторов осади на фстосинтетичзсгай -метаболизм углерода з листьях хлопчатника // Физиология растений. - 1992. - Т.39, 5 2. -

,1 <; о у • ■ о о

21. Абяудяаев А., Горзнкова Л .Т., Абдураггалова З.Н., Наскроз ¡O.G. :,:-зтабол:13м С ,-дикарбо>говых кислот з хлоропластах и листьях Со-растейп // Физиология растеиаЗ. - 1Э$Ь.„ -Т.3ö, 3. - C.Süü-906.