Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение некоторых структурных особенностей транскриптов митохондрального генома хлопчатника

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение некоторых структурных особенностей транскриптов митохондрального генома хлопчатника"

АКАДЕМИЯ НАУК УЗБЕКСКОЙ ССР

НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ «БИОЛОГ» ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ РАСТЕНИИ

На правах рукописи

ХАЗРАТОВ ПУЛАТ РАХИМОВИЧ

УДК 577.113:576.31.347:633.51

ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СТРУКТУРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ТРАНСКРИПТОВ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА ХЛОПЧАТНИКА

(03.00.04 — Биохимия) (03.00.15 — Генетика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТАШКЕНТ - 1990

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики хлопчатника Института экспериментальной биологии расте-

член-корреспондент АН УзССР, Заслуженный деятель науки УзССР, доктор биологических наук, профессор

ИБРАГИМОВ А. П.; кандидат биологических наук ЮСУПОВ Т. Ю.

1. Доктор биологических наук, профессор ТОДОРОВ И. Н.

2, Кандидат биологических наук УСМАНОВ Р. М.

Ведущее учреждение: Институт общей генетики АН СССР.

на заседании регионального Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте экспериментальной биологии растений АН УзССР (К 015.19.01) по адресу, 700143, г. Ташкент, ул. Ф. Ходжа-ева, 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНЭБР НПО «Биолог» АН УзССР.

ний АН УзССР.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

1990 г. в 9

часов

Автореферат разослан « 4

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

К. КОБЛОВ

ОВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проолемы. В последнее время наряду с исследованиями структурных и функциональных особенностей ядерного генома растении основное внимание исследователей привлекло изучение генетической системы хлоропластов и митохондрий.

Генетическая система митохондрий отличается как от ядерной,так и от хлоропластной своеобразием структуры генов, процессов репликации, транскрипции и процессинга первичных транскриптов. В ходе изучения молекулярных механизмов генной экспрессии и ее регуляции в митохондриях растительны* организмов выяснилось, что помимо обеспечения процессов генерации и перераспределения энергии в клетке она ответственна за целый ряд характеристик: устойчивость к антибиотикам и патотоксинам, общую продуктивность эукариотических организмов, устойчивость к стрессовым воздействиям, адаптационную изменчивость, цитоплазыатическую мужскую стерильность ( Uenczel et al. ,19Ы; Dixon et al. ,198^).

В литературе встречаются работы, где представлены данные по практическому применению видоспецифичных последовательностей кДНК транскриптов генома хлоропластов и митохондрий в качестве молеку-лярно-генетических маркеров. Широкий наоор молекулярных зондов,представляющих сооой отдельные клонированные последовательности кДНК, может служить удобным инструментом для выявления сложна перестроек в структуре генома, происходящих при отдаленной гибридизации на уровне геномоб органелл. Однако практически ничего не известно об изменениях на уровне отдельных транскриптов генома хлопчатника. Решение этих вопросов возможно путем клонирования и анализа соответствующих кДНК-копий. ' > ■

Все перечисленные функции митохондрий важны в практическом отношении, поэтому возможность контролирьвать деятельность внеядер-ных органелл растений имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение. Дяя этого прежде всего необходимы сведения о структурной организации генома и принципах функционирования отдельных компонентов оелоксинтезирупцих систем митохондрий, чему и посвящается данная диссертация.

Цель и задачи исследований. Настоящая работа посвящена изучению некоторых структурных особенностей транскриптов митохондриального генома хлопчатника. Исходя из поставленной целй были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

- изучить физико-химические свойства рибосом и р№К митохондрий хлопчатника;

- провести сравнительный анализ митохондриальной РНК двух видов хлопчатника и их гибридов по количественному содержанию, по элек-трофоретическому свойству, а также ил биосинтез на ранней стадии онтогенеза;

- изучить воздействие токсина гриба v.dahliae Kleb, на синтез митохондриальных РНК;

- синтез и клонирование кДНК, получение банка генов тргшскриптов митохондриального генома хлопчатника.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые из митохондрий хлопчатника выделены рибосомы и рРНК и даны их физико-химические характеристики. Но электрофог-етическому анализу митохондри-альной РНК хлопчатника выявлен^ несколько дискретных полос, которые не характерны для других РНК клеточных структур. Сравнительно изучены содержание и биосинтез митохондриальной РНК хлопчатника в норме и при заражении токсином V.dahliae К1еЪ . По включению меченных предшественников обнаружено, что усиление биосинтеза РНК в ми-тохоедриях на ранней стадии онтогенеза у поражаемых вилтом видов хлопчатника начинается раньше, чем у устойчивых форм, а у гибридных форм усиление биосинтеза проявляет промежуточный характер. Используя в качестве матрицы иитохондриальнуга РНК хлопчатника, был получен представительный банк клонов кДНК в фаговом векторе XgtlO, содержащих bxlu^ независимых рекомбинантных клонов.

Полученные результаты имеют теоретическое значение в изучении основных компонентов белоксинтезирующей системы митохондрии эука-риотической клетки.

Выявленные различия по физико-химическим свойствам рибосом и.' рРНК клеточных органоидов хлопчатника, видимо, имеют эволюционный смысл и отражают особенности аппарата трансляции субклеточных структур.

Данные по содержанию РНК и их биосинтез в митохондриях в норме и при заражении токсином гриба V.dahliae К1еЪ. могут, быть использованы для тестирования устойчивости сортов хлопчатника к вилту.

Синтез и клонирование кДНК транскриптов митохондрий хлопчатника позволили,получить полезную как в теоретическом, так и в практическом отношении информацию об особенностях структуры транскриптов митохондриального генома высших растений. В дальнейшем получен-

ные рекомбинантные клоны могут быть использованы в практике гибри-дизационных экспериментов в качестве эффективных зондов для анализа геномов эволюционно-отдаленньпс видов высших растений. Полученную клонетеку с успехом можно применять для выделения и определения первичной структуры различных индивидуальных генов митохондрий и анализа степени экспрессии этих генов на разных стадиях индивидуального развития хлопчатника и целого ряда других проблем.

Апробация работы. Материалы диссертации докле ывались на научно-теоретической конференции молодых ученых и специалистов АН УзССР в г.Ташкенте (1984 г.), У Всесоюзном биохимическом съезде в Киеве (1986 г.), 1У конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана в Ашхабаде (1986 г.), I конференции биохимиков УзССР в Ташкенте (1986 г.), I республиканской конференции молодых ученых Узбекского общества генетиков АН УзССР в Ташкенте (1990 г.), I и Ш научных конференциях молодых ученых ИНЭЕР АН УзССР в Ташкенте (1987,1990 гг.), П Всесоюзном совещании "Генетика развития" в Ташкенте (1990 г.), на расширенном заседаний лаборатории молекулярной генетики хлопчатника ИНЭЕР НЛО "Биолог" АН УзССР.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано II работы.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста,содержит 4 таблицы, иллюстрирована 13 рисунками. Список цитируемой литературы насчитывает 193 ссылки.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы 5

Объектом исследований служили самоопыленные семена сортов 108-Ф, Ташкент-I, С-4727 (G.hirsutum L. ); С-6030, С-6037 ( G.barbadense L. ) и их гибридов 108-Ф х С-6030; Ташкент-I х С-6037; С-6037 х х С-4727. Клеточные органеллы выделяли согласно методике М.С.Одинцовой (1972) в модификации Т.Юсупова и др.(1982).

Выделение митохондрий. Корешки 2х-дневных проростков, выращенных в термостате, предварительно промывали в растворе 1% тритон х 100, измельчали в буфере для гомогенизации следующего состава: 0,3 М сахароза, &U мМ трис-HCI, рН 7,8; 3 мМ ЭДТА, 0,1* БСА,0,1% 11Ш, 500 мкг/мл ге ;арин (буфер А) (4 мл среды на г г ткани), в течении 30 сек.на высокоскоростном гомогенизаторе MPW-302 (Poland ).

Гомогенат фильтровали через два слоя капрона и центрифугировали 10 мин, при 3000 об/мин. для освобождения от клеточных обломков, ядер и хлоропластов (центрифуга К-26). Митохондрии осаждали при 12000 об/мин. в течении 20 мин. Полученные митохондрии суспендировали в исходном буфере А и наслаивали на ступенчатый градиент сахарозы (0,6 М; 0,9 М; 1,6 М) и центрифугировали при 22000 оо/мин. в течении 60 мин. Митохондрии, располагавшиеся в слое между 1,6-и 0,9 М-ноЯ сахарозой, использовали для выделения рибосом.

Получение митохондриальной рибосом проводили в среде, содержащей 50 мМ трис-HCI, pH 7,8; 20 мМ MgCIg, ОД М KCl, I мМ УДТА. Митохондрии лизировали 2^-ным тритоном Х-100, лизат центрифугировали при 17000 об/мин. в течении '¿0 мин. Рибосомы осаждали из суперна-танта при 32000 об/мин.в течении мин. Очистку риОосом проводили в линейном 5-¿07o градиенте концентрации сахарозы в роторе SVI -¡¿5 ( VAC -60) при 38000 об/мин. в течении 120 мин.

Коэффициент седиментации и плавучую плотность рибосом определяли по О.М.Гуликовой и др.11976) и Н.В.Ьелицкой и др.(I960).

Выделение митохондриальной РНК осуществляли, как отмечено в руководстве Маниатиса и др.(1984), используя гуанидинизотиоцианат.

Определение молекулярной массы ННК проводили электрофоретическим методом по .Тренингу (Loening ,1967).

Нуклвотидный состав РНК после кислотного гидролиза определяли методом бумажной хроматографии (Венкстерн,1970).

Молекулярная гибридизация митохондриальной ДНК:рШК проводилась на мембранных фильтрах, по методу Gillespie ,'Spiegelman (1965) с некоторыми модификациями Denhardt (1966).

Содержание РНК и ДНК определяли спектрофотометрически по методу А.С.Спирина (1958).

Включение меченных предшественников на митохондриальную РНК в изолированных митохондриях проводили в системе, предложенной Константиновны ¡ü.M. и др. (1988). .

Получение бесклеточной системы синтеза белка из ретикулоцитов кролика и синтез белка в in vitro на матрице митохондриальной'РНК проводили согласно методике, описанной Хеймсом и Хиггинсом (1987). Анализ продуктов трансляции осуществляли электрофорезом в IOVhom llAAl'e с последующей радиоавтографией.

Синтез кДНК на матрице митохондриальной РНК и клонирование на фаговом векторе Xgt 10 проводили, как описано в руководстве Маниа-

тис и др.(1954).

Блотинг-гиОридиэационный анализ полученной клонотеки митохондрий хлопчатника с индивидуальными ДНК-эондами проводили по модифицированной методике 1'рюнатейна и Хогнесса (0гипвке1п , Но£пеаа , 1976).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБШДЕНИЕ

• Физико-химические свойства риоосом и рРНК митохондрий хлопчатника

Рибосомы, выделенные из очищенных митохондрий хлопчатника, имели типичные спектры поглощения в ультрафиолетовом свете с максимумом при гби юл, минимумом при ¿¡35 нм ■1,уи; ^бс/^ЗЬ3 1,6Ь). Выделенный препарат рибосом митохондрий, по данным аналитического ультрацентри^угирования, был гомогенен примерно на Уи% и содержал неседиментируодие ниэкомолекулярыые продукты деградации. Расчет коэффициента седиментации рибосом митохондрий дал величину 7/,4 Б (рис.и, что значительно отличается от риоосом хлороплас-тов, но оолее приближена к рибосомам цитоплазмы.

260

1.0 0.8

0,6 0,4

0.2

77.4 S 80S 70S

Рис.1.Ра лределение мито-риоосом хлопчатника в градиенте плотности сахарозы (5-20%).

ifl '¿ь за дд—

№ фракций

При низких концентрациях митохондриальные рибосомы (77,43 ) почти полностью диссоциируется на 58s (большая субьединица) и 373 {малая суоъединица), что хорошо согласуется с данными литературы длямктохондриальных риоосом ряда других высших растений (Leaver et al. ,1У72,1УЬЪ; Pring et al. ,Iy?4K

■ Для дальнейшей характеристики рибосом митохондрий проводилось определение их плавучей плотности в градиенте OoOl . Риоосомц митохондрий хлопчатника распределялись одним гомох'зннш пиком о •

члавучеИ плотностью 1,58 г/см3. Относительное содержание белка в них, рассчитанное на основании плавучей плотности, составляет около 48%, что соответствует соотношению РНК/белок равно 1,2.

Таким образом, по величине плавучей плотности и по весовому соотношению РШС/белок рибосом митохоидрий хлопчатника значительно отличаются от рибосом хлоропластов и цитоплазмы.

Из полученного препарата митохондриальных рибосом ввделпли РНК и анализировали некоторые их структурные особенности. Митохондриальнай рРНК при электрофорезе в 2,5% ПААГ распределяется в виде дискретных полос с молекулярной массой 1,54, 0,74 и 0,3 МД соответственно.' Согласно данным электрофоретического анализа, по размеру мт-рРНК близка к рРНК цитоплазмы, но существенно отличается от рРНК хлоропластов. Эти различия доказаны также методом центрифугирования мт-рРНК в линейном градиенте плотности сахарозы (рис.2).

2,0

i.o •

24,5s

Рис.2.Распределение мт- рРНК хлопчатника в градиенте плотности сахарозы (5 20%).

5 10 15 20 25 30 ' Л фракций

Дополнительные доказательства отличия рибосом митохоидрий от ри-. босом хлоропластов и цитоплазмы хлопчатника были получены путем анализа нуклетидного состава мт-рРНК. Сопоставление данных о нуклео-тидном составе.рРНК рибосом клеточных структур свидетельствует,что нуклеотвдный состав мт/рРНК (24,5 S -52,5% ПД-пар, I7S -53,7% ГЦ-пар) существенно не отличается от состава оснований рРНК хлоропластов (52,3% - Щ-пар) и цитоплазмы (55,4%-ГЦ-пар), что, вероятно, обусловлено какой-то структурной особенностью мт-рРНКЧтабл.1)./ При исследовании нуклеотидного состава митохондриальных рРНК двух видов хлопчатника и их гибридов выявили, что они неоразличаются по составу оснований и содержание ГЦ варьирует в очень узком интервале от 51,У до 52,5 моль 7а. Гомологичность нуклеотидных последовательностей ДНК и рРНК митохондрий изучали методом молекулярной гибридизации Д1К - ( ^ -^Р) рРНК. Большая и малая субъединицы мт-рРНК имеют 1,75 и 0,04% гомологии с mtJJJtIK (рис.3).

Рибосома

хаидпца X

Некоторые физико-химические характеристики рибосом и рРНК клеточных структур хлопчатника •

| Константа седиментации !рибосомы|субчастицы!

;Молекуляр-; Содержание нуклеотидов, % ! нйя масса : . ! п П ! . ,

рибосом

„ри^ная масса , субъедини !

цы рРНК.МД!

Цитоплазмы 80 г Ы Б 25 Б

40 Б 18 Б

Хлоропластов ?и 3 . 50 Б 23 Б

30 Б 16 Б

Митохоццрий 77,4 Б 58 Б 24,5 Б

37 Б 17 Б

.. 5 Б

1,58 0,78

1,30 0,70

I ,54 . 0,74 0,30

Иуклеотидный состав тотальной рРНК.

!' *

г+ц

22,3 28,4 27,0 22,3 55,4х

25,6 27,9 24,4 22,1 ¿2,3х

22,У 2о,1 27,4 • 22,2 52,5

22,3 28,4 25,3 24,0 53,7

I

«о

I

24,5s

Рис,3.Молекулярная гибридизация мт-ДНК-рРНК митохондрий хлопчатника.

гр

1,5

У

,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

_ мт-рР11К,мкг

В гибридных комплексах с обеими субъединицами рРНК участвовало '¿,Ь9/о мтДНК. Исходя из размера генома митохондрий и мт-рРНК было рассчитано, что молекула мтДНК хлопчатника содержит по одному цис-трону для каждой суоъединицы мт-pttlK. Ути величины хорошо согласуются с результатами изучения гомологии нуклеотидных последоватоль-носхей ДНК-рРНК митохондрий и других видов эукариотов (Aloni , Attardi ,1971).

Сравнительное исследование некоторых биохимических особенностей митохондриальной РНК двух видов хлопчатника и их гибридов

Сообщений об.эл<?ктрофоретичсзких свойствах мтРНК растительных организмов в современной литература не встречается, кроме одной работы на энотере ( Hiesol R. ,19Ь7). Улектрофорез мтРНК энотеры распределен в виде нескольких дискретных полос. В наших опытах по изучению электрофоретических свойств было показано, что митохонд-риальная РНК хлопчатника 6 денатурирующих условиях разделяется на II дискретных полос, 4 из которых относятся к рРНК (24,b S ,17.s и 5 s; и тРНК митохондрий, а остальные полосы, по-видимому, относятся к РНК информационного типа, (рис.4).

Электрофоретичоский анализ митоховдриальных И1К двух ведов хлоп чатника и их гибридов показал, что они не отличаются'по спектру злектрофореграьащ (рис.Ь).

Сравнительный анализ содержания нуклеиновых кислот в митохондриях двух видов хлопчатника и их гибридов представлен в таблице '¿. Из данных.таблицы видно, что максимальное содержаний РНК отшчоно в митохондриях гибридных 'форм хлопчатника IOd-Ф х С-6030, Ташкент-1 х С-6030, C-603U х 0-4727, а минимальное в митохондриях G.tar-

- и -

Узя

Й, Й-

и

ь

Рис.л.Картина электрофоретического разделения митохондриальной РНК хлопчатника в денатурирующем '¿,Хз% агарозном геле, содержащем Ь М мочевины,в цитратном оуфере.

й,-Г

Рис.о,Картина электрофоретического разделения митохондриальных ШК:

1 - сорт ШЬ-Ф ( );

2 - сорт С-ЬОЗО ( С.Ъах-Ьас1епзе Ь. );

3 - 1Ш-Ф х С-бОзО.

Ъайепве Ь.(О-бСЗО, С-6037), промежуточное количество имеют А.Ыг-аигиа Ташкент-!, 108-Ф, С 4727). Содержание ДНК митохондрий у всех изученных нами форм хлопчатника одинаково. Суша нуклеиновых кислот в митохондриях гибридов хлопчатника больше, чем у.родительских форм».Соотношение нуклеиновых кислот (РНК/ДНК) в митохондриях Гибридных "форм составляет почти 14:1, по сравнении с о.ьхга^шп Ь (13:1) и Я.ЪагЪайепае Ь. • (12,4:1).

Метаболизм митохоццрий хлопчатника в ходе интенсивного развития еще мало изучен. В связи с этим целью настоящей работы явилось изу-цен-е активности биосинтеза РНК митохондрий хлопчатника с помощью

Таблица 2

Содержание .нуклеинойых кислот в митохондриях двух видов хлопчатника и их гибридов (мг % на сухое вещество митохондрий)

Сорта и гибрида ! РНК ! . ДНК ! РНК/ДНК хлопчатника__ !_ I_

G.hireutum 1.

108-Ф 2960,5+6,4 228,9+0,2 12,93

С-4727 2920,017,0 229,2+0,3 12,74

Ташкент-I 2952,8+6,6 228,0+0,3 12,89

G.barbadense L.

С-6030 2780,0+6,8 229,2+0,3 ' 12,13

С-6037 2800,4+7,62 226,2+0,5 12,38

Гибриды:

IOS-Ф х С-6030 3100,0+8,6 228,4+0,4 13,57

Ташкент-1хС-б037 3050,0+7,4 227,5+0,5 13,40

С-б030хС-4727 3174,4+10,2 228,0+0,3 13,92

меченных предшественников на ранней стадии онтогенеза (до 30-дневного возраста).

Интенсивность включения в двухдневных растениях хлопчатника достигает максимума, синтез РНК становится почти постоянным в 5-ти, 7-ми, 14-дьевном возрасте. Затем с 21-го дня развития происходит его снижение (табл.3). По интенсивности включения гибриды превосходят родительские формы. Исходя из вышеизложенных даншвс можно предположить, что образование гибридных форы хлопчатника сопровождается изменениями активности РНК-полимераэной системы и функционирующих локусов митохондриального генома.

Известно, что митохондрии, помимо своего основного предназначения, участвуют в нормировании ряда хозяйственно-вашых характеристик, таких как устойчивость к фитопатогенам, антибиотикам, гербицидам, неблагоприятным условиям внешней среда (засуха,засоление) (Dixon et ai; ,1982; Mencsel et al. ,1981)1

Б связи с этим 6 сравнительном аспекте мы изучали воздействие токсина гриба V.dahliae Kleb. на синтез митохондриальных ШК различных по вилтоустойчивости форм хлопчатника O.hirsutum L. (сорт 108-Ф), С.ЪагЪааепве L. (сорт С-6030) и их гибрид 108-$ х х С-6030, Полученные результаты приведены в таблице 4. Опыты проводились на двухдневных корешках в различные промежутки времени

Таблица 3

Включение эН-Уридина в митохондриальную И1К двух видов хлопчатника на ранней стадий онтогенеза (имп/мин.на мкг РНК)

Сорта и {20 } гибриды |мин.; хл-ка 1 | 40 мин. ! 60 | Лмин.! ! ! 2 дн.| 1 5 дн. \7 дн. ! !l4 дн. | ! 1 21 дн. J 30 дн 1

O.hirsutun L.

108-Ф 380 530 890 1303 1522 I5II I4Q3 1234 1097

Ташкент-! 393 575 И73 1412 1590 1599 1530 1263 1083

O.barbadenoo L,

С-6030 310 534 783 1236 1375 1393 1276 II3I 993

С-6037 297 555 797 1217 1364 13э5 1268 иоа 976

Гибриды:

108-Ф х

С 6030 502 622 1005 1629 1690 1698 1643 1312 1126

Ташкент-1х

С-6037 495 633 974 1692 1725 1749 1775 1474 1233

в течение суток. Установлено, что усиление включения происходит в промежутке от 50 до 64 часов после начала прорастания у G.hirmi-turab. (Ю8-Ф), на 58-66 часе у G.barbadense L. (С-6030) и на 5464 час. у гибрида.

По включению меченных предшественников обнаружено, что усиление биосинтеза РНК в митохондриях на ранней стадии онтогенеза у поражаемых вилтсм видов хлопчатника начинается раньше, чем у уотойчи-вых форм, а у гибридных форм усиление биосинтеза РНК проявляет промежуточный характер.

Таким образом, характер протекания синтеза митохоцдриалькых РШ\ зависит от сортовых и видовых особенностей хлопчатника.

Митохондриальная РНК и продукты трансляции

Проведение детального анализа митохондриального генома растений. затрудняет отсутствие четких генетических маркеров, а также невозможность изолировать дискретные ввды митоховдриальшх РНК, т.е. индивидуальные мРНК для картирования продуктов трансляции. Удобнш методом изучения трансляционных продуктов митохондриального генома является анализ белков, синтезируемых in vitro интактными митохондриями, изолированными на различных тканях растений. В основе'

Таблица 4

Воздействие токсина гриба У.йаЫ1ае К1еЪ. на синтез митохондриалышх Рг1К двух видов хлопчатника и их гибрида в разные промежутки времени (имп/мин.на мкг РНК)

Вариант

¡Время,час.! 108-Ф

С-6030

Т

Гибрид 108-Ф X х С-6030

Контроль Токсин

Контроль Токсин

Контроль Токсин

Контроль Токпин

Контроль Токсин

Контроль Токсин

Контроль Токсин

*

4 8 12 16 20 24

JU7 J6i

1370 167U

1340 1760

1280 179*

1107 l07o

6o3 462

6U5 418

26U 230

601 t>t>7

8U4 62У

973 1238

1032 1240

742 794

704 727

446 47*

1126 1311

1198 I486

13*3 13У1

1247 1*ОУ

804 78*

043 432

его лежит предположение, что м№К не импортируется в митохондрии из цитоплазмы, а транслируются на органеллы в рибосомах. При таком подходе удалось обнаружить среди продуктов митохондриальной трансляции 20-22 белков с молекулярной массой 8-70 кД. ьелки с молекулярной массой &8 кД идентифицирорчны, как одна иэ субъединицы АТФазы, 44 кД - как рибосомальный белок, 38-33 кД - как 1 и 11 суОъе-диницы цитохромоксидазы, 8 кД эквивалентны одной из субъединиц Ах:.-азы ( Leaver C.J. et al. ,1УВ*,1983).

1ьы провели опыты, используя мтРНК хлопчатника в бесклеточной системе синтеза белка в лизатах ретикулоцитов кролика. Результаты эксперимента представлены на рис.6. Как видно из электрофореграымы, продукты трансляции мРНК митохоедрий в 10$ 11АА1' разделяются на 21 дискретную полосу. С наибольшей интенсивностью включение меченной аминокислоты набладается в полипептидах с молекулярной массой 57, 03, 46, 43, 41, 30 и 11 кД.

Рис.6.Радиоавтограф 1Ш> 11/Ш' после разде-о-нил меченных ^ 3 - метионином продуктов трансляции мтРНК хлопчатника,синтезированный в оесклеточной системе синтеза оелка: 1 - трансляционная про-Оа оез мтРНК; а - трансляционная проса при доиаьлении ктГНК (50 мкг/мл). Отмочены молекулярные веса (кД) полипептидов с наибольшой интенсивностью включения меченной аминокислоты.

Выявленную матричную активность мРНК митохондрий хлопчатника в бесклеточной белоксинтеэируюдей системе можно с успехом применять для картирования отдельных белковых молекул и выделения индивидуальных транскриптов митохондриального генома, а также изучения их структурно-функциональных характеристик.

Клонирование транскриптов митохондриального генома хлопчатника

Возможность получения методами генной инженерии болысих количеств кДНК имеет важноо значение и для решения таких задач, как определения первичной структуры мРНК и соответственно, белка, структуры генов, изучение механизма синтэза прэ-мРНЯ, активности гена на разных стадиях индивидуального развития и целого ряда других проблем. Однако, в структурно-функциональном аспекте транскрипта митохондриального генома высших растений мало изучены (Н1озе1 et аХ, ,1987), в частности на хлопчатнике такка работы на проводились.

В данном исследовании мы провели синтез и клонирование транскриптов митохондриального гэнока хлопчатника вида <}.Мгои1;ит Ь. (108-Ф).

Нами установлено, что мРНК митохондрий нэ полкаденияиров&на на З'-конце, поэтов/ ее невозможно вццелиаь стандартным мэтодом. Синтез кДНК в этом случае приходится проводить на суммарной РНК митохондрий, применяя предварительное полиадонилированне 3'- конца РНК при помощи фермента поли/А-полимеразы^«синтезируя ;сДНК стандартным методом с использованием в качестве праймера для ревергазы раосеянную затравку (синтетические гексануклеотиды со случайной последовательностью нук-леотидов).

03-07 46

:з 43

41

30 17

1 г

а

Рис.7.Радиоавтограф денатурирующего щелочного геля агарозы после

фракционирования Р-кДНК.А -первая цель ^Р-кДНК хлопчатника; Б - положение маркеров (фрагменты Н1л<1 Ш ДНК фага X.); Б - вторая цепь ^Р-кДДК хлопчатника.

•Н

А Б * *

> «■ ©

© @

»

О © о «

к*«.

в

32

Р-

Рис.8.Скрининг клонов кДЩ митохондрий хлопчатника с меченными митохондриппьными зондами энотеры:

А - апоцнтохром Ь (.СОВ); Б - У субъединица А1*-азы,

В - йЗ-Э + 4,53 рРНК.

В реакции обратной транскрипции мтРНК достигался выход 1.ДНК, равный 30-35$, размер синтезированных молекул лежал в пределах 360 и 1800 нуклеотидов при среднем размере 850 нуклеотидов. Радиоавтограф Р-кДНК, синтезированный в оптимальных условиях и фракционированный з денатурирующем щелочном геле агарозы, приведен на рис. 7).

Вторую цепь в мол°кул к кДНК синтезировали при помощи ферментов РНКаза Н и ДЦК-полимераза I после присоединения ЕсоИ I линкеров кДНК била клонирована в фаговом векторб Лgt Ю.Лолучен представи-

тельный банк клонов кДНК в фаговом векторе AgtlO, содеряапшй 5x10 независимых рэкомбннантных клонов.

Для идентификации клонов кДНК митохондрий хлопчатника были использованы ДНК-эондм индивидуальных генов митохондрий энотеры (СОХ I, СОХ П, СОХ Ш; 6,9 А - субъэдиницы АТФазы; СОВ, iJ3s + 4,53 рйШ), лпбээно представленные нам Е.В.Кузьминым (НИИСБ,ВАСХН11Л). В зонды вносили радиоактивнуо метку с помошьи Кленовского фрагмента ДШС-по-лкмеразн I Е.coli , которая присоединяла к концу рестриктных фрагментов ДНК несколько dît хР.

Примерно 1500 клонов данной библиотеки оыли скршшрованы с помощь» И0Ч01И0Й пробы (рас.В). Из mu для дальнейшего анализа оыло выбрано несколько клонов, датаих положительный гиориднзациошшй curium.

Полученная нами биолиотека кДНК митохондрий хлопчатника кожзт быть разделена на несколько классов в соответствии с их ввдоспаци-фичностыэ с применением индивидуальных молекулярных зондов, которые в перспективе дадут возможность раскрыть молекулярные механизмы ге-нотико-биохимических процессов, связанных с митоховдриальнш геномом

ВЫВОДЫ

1.Из митохондрий хлопчатника вццелены рибосомы и изучены физико-химические свойства. Коэффициент седиментации митохондриальных рибосом составляет 77,4 3 , а плавучая плотность в градиенте 0о CI , равна 1,ЬВ г/см3, что существенно отличается от рибосом цитоплазмы и хлоропластов хлопчатника.

'¿.Изучена структурная характеристика рРНК митохондрий хлопчатника. Показано, что pPrilt митохондрий хлопчатника имеет коэффициент содщенгации 24,53 , 17S и 5S с молекулярной массой 1,54; 0,74; 0,3 ЭДД. Содеряанпз 1Ц-пар в рРНК митохондрий различных видов хлопчатника варьирует от Ы,У до 52,b иояь%,

3.Методом молекулярной гпбр.чдкзации установлено, что большая.и малая субъедтшцтл pPIlli митохондрий хлопчатника имевт 1,75 и 0,84% гогголопш с митохондриальной ДНК.

4.При злектрофоретическом анализе суммарной РНК митохондрий хлоп-чь.тнина в денатурирующем '4,0% агарозном геле выявлено II дискротнш полос, характерных для РНК митохондрий растительных организмов.

Ь.Сравнительное изучение содержания и биосинтеза мптохоццриаль-НОЙ РШ ДВУХ культивируемых ( G.hirnutum Ь. , G.barbadense L. ) ВИДОВ хлопчатника и их гибридных форм показало, что по этому показа-

телю межвидовые гибриды хлопчатника превосходят родительские формы.

6.По включении 3Н-уридина было изучено воздействие токсина гриба V.dahliae Klob. на счнтеэ митохондриальных РНК хлопчатника. Обнаружено, что усиление биосинтеза РНК в митохондриях на ранней стадии онтогенеза у поражаемых вилтом видов хлопчатника G.h'lroutura Ь, (50-60 ч) начинается раньше, чем у устойчивых форм G.barbadenoe L. (60-64 ч). У гибридных форм усиление биосинтеза РНК митохондрий промежуточного характера, т.е. на 0'J-b4 часе.

7.Выявлена матричная активность мШК митохондрий хлопчатника в бесклеточной белоксинтезирупдей системе ретикулоцитов кролика. При электрофооетическом анализе установлено, что продукт синтеза распределяется в iüft-ном HAAl'e в виде 21 дискретных полос.

«.Установлено, что мШК митохондрий не содержит поли-(А) на 3'-конце. На матрице суммарной mi митохондрий хлопчатника синтезирована «ДНй. и проклонировано на базе фагового вектора Agt Ю, получена клонетека содержащих t>xiUö независимых клонов.

ÜlrtCUK PAiaUr.OiiyEüulKUBAHlitiA ЙО IELUE дИССКРгАЦМ

i.UcynoB Т.О. .Аазратов 11.Р. .Ирисметов A.A. ,'1'леуоз P.A. Исследование некоторых свойств риоосом митохондрий хлопчатника // Тез.дскл.научно-теор.конф.мол.ученых и спец.АН УзССР. Ташкент: £ан,1984.-С.11-1*. ¿.Иорагимов А.П. .Р&лм&тэв H.A. ,исупов Т.К. .Ирисметов A.A. .Хазратов IUP. Структурная организация хлоропластной и митоховдри-• ■ альной Д1К разноплоидных ведов хлопчатника и их гибридов // 5-Всесоюзн.биохим.съезд. Тез.докл.18-23 января 1986 г.-Киев.-Т.2.-С.Ь4-Зоо.

3.Юсупов Т.Ю.,Хазратов П.Р..Ибрагимов А.П. Выделение и анализ не-

которых структурных особенностей рРНК митохондрий хлопчатника // ДАН УзССР.-1986.-# 5.-С.40-41.

4.Хазратов П.Р.,Юсупов T.Ü)..Рахыатов H.A..Алимова М.А. Выделение

и характеристика двух классов митохондриальной РНК хлопчатника // 4 конф.биохимиков Ср.Азии и Казахстана.Тез. докл.-Ашхабад.-1986.-44 с. б.Юсулов Т.Ю. .Хазратов П.Р. .Ирисметов A.A. .Ибрагимов A.Ji. Геном

митохоцдрий хлопчатника // I кон|.биохимиков УзССР.Тез. докл.-Ташкент.-1.985.-151 с.

6.Рахметов Н.А.,Тлеуов А.Р..Юсупов Т.й..Хазратов П.Р..Ибрагимов А.и., Ирисметов А.А. Изучение физико-химических и функциональных свойств рибосом митохондрий хлопчатника // Узб.биол. дурн.-1987.-№ 2.-С.5-8.

7.Хазратов П.Р. Клонирование транскриптов ыитохоцдриального гоноыа хлопчатника // I респ.конф.молодых ученых.-Ташкент.-.. 1990,-С.57-58.

8.Хазратов П.Р. Биосинтез митохондриальных РНК двух видов хлопчатника и их гибридов // П Всес.совещ."Генетика развития".-Ташкент.-1990.-ТЛ.,ч.2.-С Л76-177.

9.Хазратов П.Р..Юсупов Т.Ю..Ибрагимов А.П. Клонирование кДНК транскриптов митохоццриального генома хлопчатника // Там же.-C.I78.

10.Khazratov P.R., Yucupov T.Yu., Jnyashankar П., Ibraglmov A.P. Characterization of cotton mitochondrial transcripts // Abstr.Gold.Jub.Synip.Ind.Soo.Genet.Plant breed. IV/1.-

Peb. 12-15.- 1991. В печати.

H.Khazratov P.П., Yusupov T.Yu., Jaytishanknr R. Cloning of cotton mitochondrial genome tranacipta // Abstr.Gold. Jub.Sjinp. Ind.Soc.Genet.Plant breed. III/2.- Peb.12-15.- 1991. В печати.