Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и изучение экспрессии хлоропластного psbA гена хлопчатника Gossipium hirsutum

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и изучение экспрессии хлоропластного psbA гена хлопчатника Gossipium hirsutum"

МИНИСТЕРСТВО МЕДИПИНСКОЯ И МИКР0БИ0Л0ГИЧЗСК0Й ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧЮ-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

УЛЬМАСОВ Тимур Насырович

КЛОНИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ХЛОРОПЛАСТНОГО рбЬА ГЕНА ХЛОПЧАТНИКА Соззур1иш Ыгзи1шп.

03.00.03 Молекулярная биология.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

МОСКВА-1990

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики растений Института молекулярной генетики АН СССР

Научный руководитель: - доктор биологических наук,

профессор Э.С. ПИРУЗЯН

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук

М.С. ОДИНЦОВА - кандидат биологических наук Е.В. КУЗЬМИН

Ведущая организация: - Институт физиологии растений

ни. К. А.Тимирязева АН СССР

г/

Защита состоится °'20" 1990 г в " "Р * час. на за-

седании специализированного ученого совета Д.025.01.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-ый Дорохный проезд, Д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат,разослан " 19 ■ (>¿£¿^1990 г.

Ученный секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук В.И.Щербакова

Шщ/

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Развитие исследований в области генетики фотосинтеза связано с познанием структуры генома хлоропласта и его взаимодействия с основным наследственным аппаратом клетки - ядром. В настоящее время подробно охарактеризованы хло-ропластные ДНК многих растения, в том числе целиком секвенирова-кы хлоропластные ДНК табака, печеночника и риса. В то хе время организация хлоропластной ДНК такой агрономически важной культуры как хлопчатник практически не изучалась. Кроме того, изучение структуры клонированных генов является необходимым этапом в изучении механизма регуляции их экспрессии. Несмотря на обилие структурных данных по организации хлоропластных генов, общие закономерности механизма регуляции их экспрессии изучены недостаточно. В последнее время получены указания на ограниченную роль транскрипции в регуляции экспрессии генов хлоропластов, однако, подробности такого типа регуляции до сих пор не выяснены.

Хлоропластный ген рэЬА кодирует белок с молекулярным весом 32 кД - один из компонентов фотосистемы- II, выполняющий функцию переносчика вторичных электронов, в комплексе с пластохиноном. В литературе этот белок иногда называют гербицид-связывающим, поскольку он может связываться с гербицидами - ингибиторами фотосинтеза, в частности, с атразином. При этом нарушается его комплекс с пластохиноном и способность участвовать в фотосинтезе. Известны мутантные формы этого белка (вызванные точечной мутацией в гене), приводящие к неспособности к связыванию с гербицидом и, как следствие, к устойчивости растения к гербицидам этого класса. Поскольку гербицид-устойчивость является одним из основных направлений развития генетической инженерии растений, ген рбЬА может иметь значение и для биотехнологических целей.

Цель и конкретные задачи исследования. В связи с вышесказанным представляется актуальной работа по клонированию и характе-ризации гена рбЬА хлопчатника, кодирующего 32 кД гербицид-связы-вающий белок тилакоидной мембраны хлоропластов, и изучение его экспрессии на уровне продуктов транскрипции гена. Конкретной задачей работы являлись выделение и гибридиэационный анализ хлоропластной ДНК хлопчатника, клонирование гена рэЬА хлопчатника, определение нуклеотидной последовательности гена, картирование

его транскриптов, сравнительный анализ нуклеотидной последовательности рбЬА гена и его продукта с аналогичными последовательностями из других растений.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получена рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент хлоропласт-, ной ДНК хлопчатника, несущий гены рэЬА, _ЬчШ и ¿гдК. Также впервые определена полная нуклеотидная последовательность рэЬА и £гпН генов хлопчатника и регуляторных областей рэЬА гена, картированы 5'- и 3'-концы рэЬА транскрипта. Впервые обнаружена гетерогенность 5'-конца рэЬА транскрипта, что вероятнее всего является результатом посттранскрипционного процессинга и предположительно может иметь регуляторное значение. Впервые с помощью РНК-гибридизации было показано, что рбЬА ген хлопчатника экспресси-руется на уровне транскрипции с образованием трех транскриптов.

Полученные результаты в некоторой степени дополняют и конкретизируют представления об организации, структуре и экспрессии генов хпДНК у высших растений. Данные о степени консервативности в кодирующих областях гена могут быть рекомендованы для использования в геносистематике и молекулярной филогенетике. Данные по транскрипции р§ЬА гена хлопчатника могут служить моделью для изучения механизма регуляции экспрессии хлоропластных генов. Поскольку рбЬА ген кодирует гербицид-связывающий белок, клонированный ген может быть использован для получения мутантного гена с целью его введения обратно в растения для придания им признака гербицид-устойчивости (после разработки эффективной системы трансформации хлоропластов).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ. Результаты исследований докладывались на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (г.Пущино, 1988,1990), на IV Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Минск, 1990), на V международной молодежной конференции по генетике (Албена, Болгария, 1990), на ежегодной научной конференции молодых ученых ЙОГ АН СССР (Москва, 1990).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 179 наименований. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста и содержит 28 рисунков и 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и плазмиды. Штаммы E.coli TGI и К802 (Маниатис и др., 1984) и плазмидные векторы pUC19 (Yanish-Perron et.al., 1985), pTZ18R и pTZ19R (Mead et.al.. 1986) и pBS+ (Stra-tagene, США) использовались для работ по клонированию.

Трансформацию клеток Е.coli проводили по методу Ханнахана, описанному в руководстве ("Клонирование ДНК. Методы", 1988).

Объект исследования. В работе использовали растения хлопчатника сорта 108-f (Gossypium hirsutum).

Хлоропластную ДНК выделяли из молодых листьев растений по методу с высокой ионной силой, описанному в работе (Bookjans et. al., 1984).

Плазмидную ДНК выделяли щелочным методом (Birnboim, Doly, 1979). Гидролиз хлоропластной и плазмидной ДНК осуществляли 2-3-кратным избытком нуклеаз рестрикции. Большинство рестрикциоиных эндонуклеаз и других ферментов получены из ВНИИПЭ (г.Вильнюс), а также от фирм Boehringer Mannheim, Amersham, Pharmacia-LKB.

Электрофорез препаратов ДНК проводили в горизонтальном аппарате в агарозном геле в 1х трис-ацетатном буфере. Концентрация агарозы составляла 0,7%, 1% и 2% в зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК (Маниатис и др,. 1984).

Перенос ДНК на нитроцелюлозные фильтры (ВА 85, Schleicher-Schuell) проводили по методу (Маниатис и др,. 1984), на нейлоновые мембраны (Biodyne, Pall) перенос осуществляли 0,4 N раствором NaOH (Reed, Mann, 1985).

Предгибридизацию и гибридизацию проводили при 60°С с использованием гепарина вместо ДНК-носителя (Singh et.al., 1984). ДНК-зонды метили с помощью ник-трансляции (Rigby, 197?) в присутст-

32

вии меченых Ы- Р-трифосфатов (Ташкент) с последующей очисткой на колонке Sephadex G-50.

Получение одноцепочечной формы плазмидной ДНК проводили по методу (Analects, Pharmacia, 1986).

Секвенирование проводили по методу Сэнгера (Sanger et.al., 1977) по протоколу, предложенному в руководстве фирмы Amersham ("М13 cloning and sequencing handbook").

Выделение тотальной РНК из растений проводили в присутствии гуанидинизотиоцианата по методу, описанному в пособии ("Транск-