Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная характеристика генов халконсинтетазы двух видов хлопчатника, Gossypium hirsutum 108F и Gossypium herbaceum

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная характеристика генов халконсинтетазы двух видов хлопчатника, Gossypium hirsutum 108F и Gossypium herbaceum"

-3^391

академия наук ссср институт молекулярной биологии ии.3.А.ЭНГ ельгардтА

На правах рукописи УДК 577.214.622

БЫЗСША Марина Владимировна

Молекулярная характеристика генов халхонсинтетазы двух видов хлопчатника, Соэзуршт Ыгг^иш 108Я и Боззуршш

(гегЬасеит.

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических наук

Москва 1992 г.

Работа выполнена в лаборатории Молекулярной биологии растений Центра "Биоинхенеркя".

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук, профессор, член-корр.БАСХКИЛ К.Г.Скрябин

кандидат биологических наук А.С.Краев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологический наук., профессор Э.С.Пирузян. доктор биологических наук, профессор П.Н.Рубцов.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт об^ей генетики им. Н.И.Вавилова АН СССР.

Защита состоится 1992 г. в /Ужасов на заседании

специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР по адресу: 117384, Носква, ул. Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомиться з библиотеке Института молекулярной биологии им, 3.А.Энгельгардта АН СССР.

Автореферат разослан " .Ш^А&.^Л992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук

V » t5 i 1

. 2. if, Леей i

Отдел ' | ОЕШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТИ.

ссергдций I Д;гу»|ьяось рпбогн . К роду Gossrpiura относится большое количество разнообразны?. йидос хлопчатника, часть из которых уже около трех тысяч лет используется челевечестпом в качестве селекционного иетегнялв. для выведения сортов пригодных для получения целлюлозного волокна. Этим об1яснгется большое , количество генетических исследований,

проводимых на ;>аэкых видах хлопчатника и создание больакх коллекций мутантов .этих растений. Однако саецнеическай состав тканей х долчатнака, наличие в них большого количества различных пигментов п о л и<}е но л ь к о г о про чех ояден и я , госсипола и

о л v. го с ахар и до в , делает это растение достаточно трудным для проведения биохимических и молекулярно-биологических исследований. К началу каикх

исследований в научной литературе практически не было работ по изучению генома хлопчатника »а молекулярной у р о в н 2 .

Широко культивируемый в СССР до недавнего времени тетраплоидный сорт хлопчатника Gossypium hirsutum 108F к диплоидный вид Gossypium herbaceuro были нами выбраны для изучения молекулярной организации генов халконсинтетазц (CHS).

Иа наш взгляд гены CHS, как об'ект исследования, представляют интерес с нескольких точек зрения. Во-лероых, CIIS является одним из центральных Ферментов биосинтеза различных классов олавонондов а

растительной клетке. Ок осу а.е с т а л я ет реакцию синтеза яариигеякикал кона - основного предоественника в биосинтезы jлаво нелов , флавоков, аэофлавоноидов и антоцлаи ос. Во-вторых, показано, что синтез CHS, регулируется иа уровне транскрипции СНЗ-генов, иоторые яогут Зыть яндуцирооаим системой -жтохроиа, ультрафнол атоаым светом, а также яри обработке рястаняй компонентами клеточных стенок грибоп-к т о si a Yoi-e н о а . 3 третьих, недавно установлено, что у

растений, в геноме которых CHS кодируется семействен генов, экспресс»* отдельных членов этого семейства тканеспецифична , зависит от стадии развития растения и специфически отвечает на различные стимулы* Все перечисленные выше свойства сделали гены CHS интересной модельной системой для изучения регуляции экспрессии генов высших растений. Кроме того изучение молекулярной организации CHS-генов вероятно позволит понять биологический смысл существования нескольких генов яля копирования фермента, выполняющего вполне специализированную функцию.

Цель и задачи исследования. 1.Определение состава семейств CHS-генов в геномах G.hirsutum 10SF и G.herbaceum. 2. Изучение аволюционных взаимоотношений CHS-генов исследуемых видов хлопчатника.

3.Идентифихация CHS-генов, активно экспре ссируюцнс я в тканях лепестков G.hirsutum 108F и G.herbaceum. 4. Клонирование одного из CHS-генов G.hirsutum 108F.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены данные о молекулярной организации генов халконсинтетазы в геномах двух видов хлопчатника G.hirsutura 108F и G.herbaceum.

Установлено эволюционное взаимоотноиение генов халконсинтетазы в геномах G.hirsutun 1 0 8 F и G.herbaceum. Индентифицировакы CHS гены специфически экспрессирующиеся в тканях лепестков G.hirsutum 108F и G.herbaceum. Клонирована почти полная копия одного из генов халконсинтетазы G.hirsutum 108F. Результаты ванной работы составляют фундаментальную основу для дальнейших исследований регуляции транскрипции специфически »кспрессируюиихся генов и клонирования их регуляторных элементов, которые, в свою очередь, могут найти широкое применение при экспрессии чужеродных генов в трансгенных растениях.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзнны]: конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пущине, 1Э8Е и 1990 г.),

на 1 В с е с о оз н о м Симпозиуме * Ноо ие методы

биотехнологии растений" (Пуцино, 1 Я 9 1 г • > > на заседаниях коолокзиума Центра " Б и о инженерия" и Ученого Совета ИНБ АН СССР.

Структура__if об 1 ем_д иссертпцни. Диссертация

состоит* из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Она изложена на страницах, содержит

рисунков и библиографический список из названий.

Автор благодарен Г.Е.Поэиоговой, синтезировавичй для этой работы пр&йиеру общей длиной около 250 звен ь е в .

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Клонирование З'-Фрагмента гена халконсинтетааы из генома хлопчатника G. hirsutun 108F. К началу няней работы гены хал к онсингетазы (CHS) были клонированы- из нескольких видов растений. Сравкителвный анализ нухлеотидных последовательностей CHS генов из растений, относящихся х различным семейстьам обнаружил васокуо степень топологии между ними (Nieshach-Klosgen et. al). Мы использовали выявленную хонсервативнооть этих генов, применив кДНК CKS львиного зева (Antirrhinum majus) для клонирования аналогичных последовательностей из генома хлопчатника Gossypium hirsutun 108F. Клон кДНК, содержащий CHS ген A.majus, был нам любезно предоставлен доктором Сэдлером из Махс-Планк Института г.Кельна.

СубФрагменты ДНК этого хлона: 5'-Фрагмент, охватывающий область первого и второго эхзонов и 3'-Фрагмент, охватываюиий только третий эхзон, были переклонированы в фаговый вектор М13 mplO и использовались для синтеза одноцепочечных зондов (рис.1).

! V:<30Ï! 2 адзин ; 3 экэон

J__l—l_

A Г

5 -аоид

3 -зонд

H

Hind!«. . Eco Rj _ . Hindi«__________

Рис.1 Схема соотношения последовательностей кДНК CHS A.majus, используемых зондов и клонированного фрагмента CHS-ггна G.hirsutum 108F. А.- кДКК CHS A.majus; В.- фрагменты кДНК CHS A.majus, используемые для субкл онировавия в вектор М13 mplO; С.- цепи ДНК, синтезируемые при получении меченных зондов; D.-клонированный фрагмент CHS гена G.hiгsuturc 108F.

A. В. С.

1 I 3 S 1 2 3 4 1

vj „ -^^z^cz

j-r-^'-ia?.,

Ч-f-Z • w •■.. t

" * ч

. • • Ч "Я i < г- Ч '

> 4 •vf

s. * v^'-v-;*.

J* •.

'•S-t

A*

A 3

ЩХ-1 ifc.j

Рис.2 Идентификация» |>аг»ентов генома хлопчатника G.hirsutuin 108F, гottoaar»чних CHS гену. А.Блот-гибридизация ДНК G.hirsùture с использованием 5'-зонда кДНК CHS A.iaajus. В. Разделение ДНК G.hirsutum в IX агарозноы геле. С. Бл от-гибридизацкя ДНК G.hirsutum с использованием 3 * — зонда кПНК A.majus (рис.1). 1.ДНК G.hirsutum, расцепленная HindIII. 2.- BaniHI. 3.-EcoRI. 4.ДНК вдазпиды pCAl, содержащей кДНК CHS A.raajus -4ûnr. 5.ДНК бактериофага лямбда,

расщепленная HindIII.

На основе картины б л от-гибриаизааяи геномной ДНК, расщепленной несколькими редкодепяцинк рестр«к тазами с 5'- и З'-зондами (рис.2) было сделано прецио л охенне о наличия в геноме этого растения семейства генов халконсинтетазы, состоящего из нескольких членов.

Геномная Фрикция ЛНК G.hirsutum 108F,

расцепленной ресгриктаэой Hind III, размером около 4000п.н., была отобрана для гонструирования обогащенной библиотеки в лямбда векторе MN1149, после скрининга которой с З'-зондом львиного зева был отобран геномный клон CGKj. Сравнительный анализ н ук л е о т мдной последовательности Hind111-EcoRI

субфрагмента размером 804п.н.из CGHj с кДНК CHS львиного зева выявил 70S гомологи« между ними, локализованной в третьем экзоне. Вило установлено, что клон CGH3 содеряиг З'-фрагиент гена СИ S, 329п.н. которого приходится на транслируенуо область (рио.З).

S L У Е A F о _Р L 6 I Т D Ц Я S L F И I М6СШ6П6АЕЕСАШСАЕССАП£5СААТСАСТЕАСТЕ6ААСТСССТТТТСТ£ЕАТ

ю го . зо 40: 5Г"~ 60

¿t.

* " Р G S Р Д I L D q А X L Л i J Р

ifi£3ïâÛtCA66T6iTCCAGCCATAnG6ACCAG6T£SAAECCAASTtA&CCCnAACCC 70 80 SO 100 ПО 120

Е К L R А Т R H У I S Е Г S К Я S S А С TGAAAAGCTACGAGCCACAAGGCACGTTCTTTCAGAETATGEGAACATGTCGAGTGCCTG 130 140 150 160 170 180

V L F I L D E H R H К S RE06VQTT TGT6CT6TTCATTTT66ATSA6ATEA6BAATAAAICAA6ABAA6ATSMGTTCAGACCAC 190 200 210 220 230 240

5 E s 1 E tf6VLF6F6PSLTYET Г 280

GST^CTCat/JcATCCCSSCTTAAACATGECCCTGCGrCGCASTCGTCGTCATCAT ___310 320 330 340 350 360

Рис.3 Нуха«откдная последовательность 3'-концевой части CHS-re на и выведенная из нее аминокислотная последовательносьт CHS G.hirsutu» 108F. На

аминокислотной последовательности отмечены консенсус-пептиды, указанные в работа (N iesbec h-Klo sgep. et. al. , 1987 ! и нук леотпБные последовательности праймеров N1 и N2.

В результате сравнительного анализа

аминокислотной последовательности, . кодируемой

исследуемым Фрагментом ДНК, с аналогичными областями CHS других растений были обнаружены блоки консенсус-пептидов (рис.З).

Таким образом, применение кДНК CHS из A.majus в качестве гетерологичного зонда позволило нам сделать предположение о кодировании CHS в геноме G.hirsutun 1 0 8 F семейством генов и проклонировать 3'-область одного из этих генов.

Дальнейшие исследования развивались по двум направлениям: 1. молекулярная характеристика и сравнительный анализ семейств генов двух видов хлопчатника G.hirsutujo 10SF и G.herbaceum. 2. клонирование одного из СКВ-генов G.hirsututa 108F..

Молекулярная_характеристика_ семейств_пеяов

хасконсянтетазн G.hirsutum 108F и G . hg г b aceusi. На данном этапе работа в качестве об'ектов исследования нами были выбраны два видь хлопчатника: один из наиболее близких к дихкы - вид G.herbaceun и широко распространенный в СССР - до недавнего времени культурный сорт G.hirsutusa 108F. G.herbaceun является диплоидным видом, произраставшим в наии дни в труднодоступных зонах тропической Африки. G.hirsutun - это естественный амфидиплоид, который образовался путем скрещивания двух диплоидных видов хлопчатника: G.herbaceun, вфро-азиетокого происхо»дения, и

G.гаiraondii, южно-американского происхождения.

Генетическая характеристика геномов, данные о происхождении выбранных видов хлопчатника, а тажне полученный нами геиоиный кяоя CGH3, содержаний Фрагмент гена. CHS из G.hirsutun 108F, послувили отправной точкой в исследованиях молекулярной организации этих генов.

г.

hirsutiur. G. йегЪасешг.

Г?1»?1'

■»--У

Ь-rJs

II. А.

3 r 1 ^Ц'З 4

• / - -'V tx ■

■J i

6

С..Э

G. hirsutiiT. G. iierbaceum

1 2 3 1 2 3 'f

4

■ КЗ

ij

-i- -4

/l-'p-« ' 'f

Vw/

Г

! ' Л

V'/ /

Б.

hixsut-ar. G. hertaceum

12 3 12 3 4 .......... jgrfWOg?'*^'

G. hirsutum G. ЬегЪаоеиш

•gfj-^i-■'fei-M v-

ЩШЩ

i . V'

I

; V.i

a

2 3.1

tJmx

" ■ i ••'йёг

Рис.4. Блот-гибридизация геномной ДНК G.hirsutum 108F и G.herbaceum. I - зонд 1 (см.рис.5). II - зонд 2 (см.рис.5). А. Мягкие условия отмывки: ЮОмМ Na_ фосфатный буфер, рН-7.2, 0,1* SDS, 60°С; В. Жесткие условия отмывки фильтра: 40мМ Na-фосфатный буфер, рН-7,2, 0,1% SDS, 60° 1 - геномная ДНК, расщепленная рестрикт&эой Hind III; 2 - Bam HI; 3 -Eco HI; 4 - ЯНК фага лямбда paсмел *eнная рестриктазой Hind III.

1

На рисунке 4 представлены радиоавтографу блот-гибридизации ДНК G.hirsutum 108F и G.heгbacеun, расщепленной рестркктазами HindIII, BamHI, EcoRI. Для гибридизации использовали два гомологичных зонда, синтезированных на хлонах М13 mplO, содержащих 3 ' -область гена CHS G.hirsutum 108F и отличающихся расположением внутри гена CHS (рис.5).

3<НЛ2 Hind III

ЗОНД!

240

Рис.5 Взаимное расположение зондов, используемых при блот-гибридизации геномной ДНК G.hirsutum 108F и G.herbaceum. НindiII-ЕеoRI - структура М13шр10, содержащего Фрагмент геномного клона cgh3 .G.hirsutum 108F. * - З'-конец кодирующей последовательности.

Сравнительный анализ полученных картин выявил, что все полосы гибридизации, проявляющиеся в геноме G. herbaceum, обнаруживаются и в геноме G.hirsutum. Однако в ДНК G.hirsutum 108F кроме полос, совпадающих с полосами гибридизации G.herbaceum, выявляются дополнительные полосы. Так, в случае расщепления ДНК рестриктазой HindIII и гибридизации ее с зондом 1 в геноме G. hirsutum 108F в мягких условиях отмывки Фильтра обнаруживается 7 полос (рис4,1,А), а в жестких - 5 (рис.4,1,В); в геноме G.herbaceum в любых условиях отмывки проявляется четыре полосы. При использовании зонда 2 количество полос у G.herbaceum в любых условиях равно ■ 5 (рис.4,II), а у G.hirsutum 108F - в мягких условиях отмывки Фильтра равно 10 (рис.4,II,А), а в жестких - 8 (рис.4,II,В). Полученные результаты позволили сделать предположение о том, что в геноме дикого вида G.herbaceum семейство генов CHS представлено 4-6 различными

пос ледовательиостямк. В геноме тетpan лоидного сорта

G.hirsutum 10SF аналогичное сейЯство состоит из 8 — J О p-^h^l' , честь которых 5 л ко г л 5 генам G, hcrbp ceum.

У ч т и и an дпинчп о ироисхож^^иии G.hirsutum, было предположено, что семейство CifS генов ятоги вида хлопчатника cocroifT нгз двух групп генов, один из которых ведет начало от G.herboceun, другой - от генома G.raimondij.

Для подтеерйдсния .этих предположений нами была выбрана стратегия клоииропанип »»рагкентов генов CHS. предварительно а и п л к Ф и ц и р о в а н н u х с поночья метода полкмерязкой цепной реакции (Г/ЦF>} , в двух вариантах. Один из,- нк состоял в амплификации всего семействе, непосредственно и а геномной ДНК, во втором геномнуо ДНК предварительно разделяли на фракции,

соответствующие основным полосам, наблюдаемым при блот-гибридизации ДНК, расщепленной Hind III (рис.4).

Последовательности олигонук леотидов для ПЦР выбирали на основе расположения консенсус-nептидов, выведенных из последовательностей аналогичныг генов других видов растений {Ni е sbach-Klо sgen et.al., 1987), и на основе нуклеотидной последовательности полученного нами неполного геномного клона CGHg < рис. 3 ) : GGAACTCCCTTTTCTGGATASCTCACC (праймер N1 ) и CCTGGTCCGAACCCAAACAGGACGCCCC (праймер N2). Расстояние между выбранными олигонуклеотидам» составляло 190 п.к., этот Фрагмзьт охватывает 3 ' -транслируемув область исследуемых генов. При амплификации был получен электрофоретически гомогенный продукт, который бил разделен на соста вляюиие с помочью клонирования в Ml 3 - векторе. Полученные клоны были проанализированны секвеииров анием» Всего было проанализировано: для G.hecb&ceun - 24 клона, а для G.hirsutum 108F - 45. Из них были отброшены последовательности, содержание замену только одного иуклеотида относительно какой-ллбо из других полученных последовательностей, поскольку такие варианты считаются артефактами полимераэной реакция- '

В обеих группах клонов были найдены шесть разных послеповательностей нуклеотидов генов CHS (рис.6).

A. G.Kirsuu» ICaf.

1 ID 20 JO <0 50 60 TO SO 90

l стмксгсслссллшт/иатсмстлшислштлссдетсисод г ccGCTGsTCttcaaTmoMTUGOTGAiraxMcmGccenjuucc^^

3 ш£т<лтсслоссшт1смтс*ссттм2сссллит«шсттхлло:с^^

4 стютсЕтсслссмтшдогсштлсмосомттлшстидосл^

5 исстютсисздтлттюшиятаалосслштАСсссттыга^

6 CTCGTAGTCCACCAATATTAMTCAWTACAAGCCAAATTAGakCTCJUUUXACA&AAGCTACSACCCACAACGCACOTCTITCAC^

* •• »»»»»»» ►•**« ******** •« *. *.*• ********* »• ........ »*»»•*• .*".. .....

100 110 120 130 U0 150 140 170 180

1 AACATGTCAAGTGCTTGTGTTCTATnAYTTTCCATCAGAT&AGGAAGAAATCMCGGAAGATGGGCTTCAGACCACAGGAGAACGATTGGACT

2 AACATGTCAAGTGCTTGTCT<CTCT7CATATTGGATCAGATGAGGAATAAATCAA£AGAAGATCGG£TTCAGACCACGGGTGAAGGGCACGAGT

3 AACATGTCAAGTf^TGTGTGCTSTTCATATTGGATGAGAlGAGAJAGAAMCAA^GAA^TGGACYI&GMCCACGGGIGAAGGGCTCGAGT

4 AACATCTCAAGTCCTTCTGrTCTAnTATnTGCATMCATGAGCA^GAMTUAGGGAAGATCGGCTTUGACCA^

5 AACATClCGAGTGCCTGrCTGCTGTTCArTTTCCArCAGAIGACOAATAAATCAAGAGAAGATGGGGTTCAGACCACGGGTGAAGCGCTCGAGT

6 AACATCTCAGGTGCnGTCTTCTATTTATTTTGGATGAGATGAGGAAGAAATCAAGGGAAGATGGGCTTCAGACCACAGGGGAAGGATTCGAGT »*.*«•»» ...» ..... »» «. .......»....»■».. ******** ******** ** ***** ** ***** ...*

0. G.herbacetm.

1 10 20 30 «0 50 60 70 80 90

1. CTGGTGGTCCAGCAATAT1A&A?CAAG7ACAAG£CAAATTAGCACTGAAGCCAGAGAAGCTACGAGCCACAAG£CACGTTCTTTCAGAGTATGGr

2. CAGGTGGTCCAGCCATATTGGACCAGGTGCAAGCCAAGTTAGCCCTIAAGCCTGAAAAGCTACGAGCCACAAGGCACSTTCTTTCAGAOTATGGG

3. CCTGTGGTCCAGCAATATTACATCAAGTAGAAGCCAAATTAGCACTGAAGCGAGAGAAGCTACCACCCACAAGCCACGTTCTTTCAGAGTATGGG

4. CCAGTGSTCCAGCCATATTGCACCACGTGGAAGCCAAGTTAGCCCTTAAGCCTGAAAAGCTACGAGCCACAACGCACGTTCTTTCAGAGTAIGGG

5. CCAGTGGTCCAGCCATArTCCATCAGGTTGACGCGAACCTACCCCrTAAACCCGAAAAACTCCGAGCCACGAGGCACGTGCTTTCAGAATATSCG

■S. CCAGTGGTCCAGCCATATTGGATCAGGnGAGGCGAAGCTAGCCCTTAAACCCGAAAAACTCCCAGCCACCACGCACGTGCTTTCAGAATATGGG * ********** ***** ******** •* *• **** ************ ******** ******** ******** *****

100 110 120 130 140 150 160 170 180

1. MCATGTCMGrGCTTGTCTTCTArnArTTTGGATGAWTGAGGAJU^MTCAAGGGAAGATGGGCTTCAGACCACAGGAIiAAGGATTGGAGT

2. AACAT&TCGAGTCCCTGTGTGCTGITCMTITCGATGA&ATGAGGAA&AAAICMGGG&AGATGGGCTTCAGACCACA&GAGMGuMluU&T

3. AACATGTCGAGTCGCTGTG7GCTC7TCATTTTCGArGAGATGACGAAGAAATCAAGGGAAGATGuGCTTCAGACCACAGGAGAAGGATTGGAGT

4. AACATG7CGIGTGCCTG1C7GC7£7TCA7T77GGATGAGATGACGAATAAATCAAGAGAAGA7GGGGTTCAGA£CACGGG7CAAGGGC7CGAGT

5. MCATGTCGAGTGCCTGTGTGCIGTTUTTTTGGATGAGATGAGGAAGAAATCAAAGCAAGATGGACTTGGAACCAC&GGTGAAGGGCTCGAGr

6. AACATG7CAAGTGCTTGTGTGCTGTTCATATTGGA1GAGATGAG!1AAGAAATCAAAGGAAGATGGACTTGGAACCACGGGTGAAGGGCTGGAGT ******** ***** *.»». ** ** *« ***************** ******* ******** •* ***** ** ***** * ....

Piic . .о .Сравнительный анализ ь у х л еоти д н и х

■I ос л едовате л ь н остей ДНК исследуемых клонов,

содериацих Фрагменты генов CHS G.hirsutum 108F (А) и G.herbaceum (В). * - консервативные нуклеотияные основания над последовательностями указаны номера нуклеотидов от начала клонированных фрагментов; -цифрами слева указаны условные номера генов

При анализе клонов G.hirsutua 108F было обнаружено, что максимальное ко*ичество замен оснований содержит фрагмент типа chs6, причем нуклеотиды в положениях 3, а, 126 уникальны для данной последовательности. Хотя наши

экспериментальные данные не позволяют с

достоверностью утверждать, что семейство генов CHS тетраплоидного сорта хлопчатника G.hirsutun 108F состоит из двух классов, однако клонирование последовательности chs6, отличавиейоя от всех остальных, а также данные о а м ф и диплоидном происхождении этого вида хлопчатника. яаЬт нам возможность сделать такое предположение.

Предпочтительное клонирование только одного из двух классов генов CHS данного семейства обгоняется, по-видимому, структурой олигонухлеотидов, используемых нами в ПЦР.

Сравнительный анализ структуры ДНК исследуемых клонов показал, что характер распределения

консервативных участков в единичных замен в нуклеотидных последовательностях внутри каждого семейства генов очень близок. Это свидетельствует о высокой степени гомологии между генами CHS G. herbaceu« и G.hirsutun 108F. При дальнейшем сравнении клонов одного вида хлоп чатпика с другим было обнаружено, что два хлона G. herb'aceue идентичны двум клонам G.hirsutun 108F, приче-н одна кз этих пар (клон chs5 G.hirsutun 108F и хлон ch»4 O.herbaceun) идентична геномному клону CGHj.

На рис.7 прсдставлемы двидрограммы, отрлжаювие эволюционное соотношение генов CHS у исследуемых видов хлопчатника.

. 1 А G 2 5 3 1. Goasyplua hirsutism 1033?.

1 3 2 .45 Б. Gosaypivua herbaseùai

Рис.7.Дек программы структур клонов, соцержавия Фрагменты генов CHS, G.hirsutum 108F !а) и О . herbaceua (В), построенные на основе н у к_л е о т и д м ы х чослглооателыюотей; - цифрами обозначены комара к .1 j;;oa .

Лматиз деидрограмя аыяоил сходное развитие ггнов обоих семейств, которое ноано представить как ряд с. с л е д о з а т е л ь н u х дупликаций исходной

последовательности с накоплением, э дуг. лицнрованных копиях точловш мутаций.

Нуклеотндные последовательности исследуемых

кяоноа были транслированы (рис.В).

Л). fi.hir*Ltu* ICSF.

1 10 20 30 to 50 М

1 CCP»UDOVti.lCUL>CPE:i;lSAt!iHyiSETCliMS5iCVLMlSER:«lCiarCSl5T7itC!.E г CCPAiLDC'/E,,.;rMlK?ErLWC;!VIS£rt)lMSiACVl.mEa'Sli£S»ECMITCrCHE 3 CSPAUaaVDia'AUKPEXISAIRllVl.SErO.'KSIXr.imSESSniSSEDaCIICECLE i !:£if»!LO!l'.T»JClJ4!CPiaM[!!HVi;Er«.«S»CWfIlOE|ir.fXS8:OCl.;iTCEClE 3 ecp*ll00V1»xul>cfeltli«SaVliErUMSSACVl.mDE>!S»tiaEDCVorTt;EGlE 6 iSPAHD0yEAXlUKPEK«ATaiWtSEY№!55ACVLFUDEra«St;EDCUITGECFE

*»*•««*»* ••■»V KtAIKItK *.*.*> ***** •

3).5.herfc«e«jni.

1 10 20 30 40 50 ¿0"

1 ggp»ILOO\'ea>:ul)j>ea»ateilvlsetck>issacvlmldemro:s!£dclattcegle

2 wiipailpoveaxlalx^ttlsatrüvt-eycwkssacvlfildemrocikfdglqttcccle

3 CCPAILDayEAItLALrPEin.ü>.IRmsEYCHHSSACYl.F!LOEI«lCXSREDn.OTTtJEGLE

4 SGPAIlDOVEAÜULB'EaiATÜlIVLSETISMSSACVlFWa.iSk'KSSEDGiranCEGLE

5 SCPAILDO'.'EASULIPElCLll.ATRaVLSErCaHSSACVlFHOEHRClCSKCCLCIIOESlE 4 SCPAHD3VEAiXALKPE!CLilATRHVlCEYCHHSSACVLF JLOEMRICKSJCEDGLGTTCEGLE

*******«***к***«**********************т******* *• »*» •»•*•«*

Pnc.8. Сравнение аминокислотных

последовательностей, выведенных на основе структуры ДНК фрагментов генов CHS G.hirsutua 103? (А) и G.herbaceun (В). * - хонсерватмвпне аминокислоты; нал последовательностями указаны номера аминокислот о т н а ч а л а клонируемых фрагментов; - цифрами сю за указаны номера йлоноз.

Сравнительный анализ получанных б е л к о з t; х

фрагментов CHS { рис .3 ) показал, что за? и а бе л ь ;■] ос т ь знутри каждого семейства на уровне белка, х а х -л следовало ожидать, значительно ниже, чел на урозне ДНК. Так процент з ар яа 5 а л ь иостя пос я е д о в а г о л ь и о сЛ ЦНК CHS у G . herbaceun составляет 2 1%, а у G.hirsucujn 103? -2155. На уровне белхозого продукта .ipnusr-вариабельности / G. harbacsura снизился до 7%, л у O.Hirs'Jtum 103F до IIS. Как ранее отмечено аря анализе ДНЯ, У S. hirsutum 108F г? я «л I. зариабельных аминокислот отличают клон с'г.чб остальных.

На рисунке 10(A) представлено сравнение

аыаеденных консенсусных последовательностей G hirsutura 108F и G . herbaceum, из которого видно, что данные Фрагменты CHS дзух аияов хлопчатника отличаются только по лести положениям. Замени аминохне лог, находящихся з положениях 1, 47 и 5t, характерны для белкоэ обоих семейств, что говорит о их Функционально.! нейтральности.

Дендрограммы (рис.9), полученные путем сравнения основе исследуемых аминокислотных последовательностей CHS G.hirsutum 108F и G.herbaceum, иллюстрируют сделанные нами предположения о ходе эволюции исследуемых CHS, о ответвление после первой дупликации исходной последовательности клона 6 G.hirsutum 108F снова указывает в пользу того, что в его геноме есть вторая группа генов CHS, по-видимому,

про ксIо дящая G.raimondii.

о т

второй

2 б

родительской

Формы

4 5 6.

A. Gossypium hirsutua' 10S В. G.oesypium ЦгЪасеша.

Рис.9. Дендрогранкы клонов, содержащих фрагменты генов CKS, G.hirsutua 108F (А) и G.herbaceum (В), построенные ^ на основе аминокислотных

последовательностей. '

Недавно из генома арахиса, Arachis hypogaea, бил клонирован ген ресверагролсхнтетазы (RS), ключевого Фермента биосинтеза стклбеноа. Так же как и CHS , RS использует в качестве субстратов три молекулы малонил-КоА и одну молекулу кумаромл-КоА, однако продукты реакции у этих ферментов разные: у CHS нарингенинхалкон, у RS - ресаератрол. Известно, что структура обоях «ермантоа очень близка, поэтому считается, что доказать кодируют ли исследуамыс гены

CHS или RS можно только посредством выделения соответствующих им белковых продуктов и проверхи их Ферментативной активности (Schroder et.al., 1988). Не располагая еце тагчми данными, мы на данном этапе исследований сравнили выведенные консенсусные

аминокислотные последовательности G.hirsutum 103F и G.herbaceum, с аналогичными последовательностями П S арахиса и CHS сои (Glyci'ne max ) (Akada et.a.l. 19Э1) (рис.10), то есть для сравнения был« выбраны гены US и CHS из растений одного семейства Как видно иг5 приведенных данных (рис.10.В,С), клонированное н а м и последовательности по количеству, расположение и характеру аминокислотных замен ближе к CHS сои, чем к RS арахиса. Эти результаты позволяют нам утвержцать, что клонированные нами фрагменты генов кодируют Фермент CHS.

л.

Gotsypiu» hirsutua (CHS) GGPMLDQVM--ALKPEia.l¡*TBHVUErC»MSSÍCVl.fIlCEHR-ÍSREDG-OrrCECLE

Gossypius herbácea« (CHS) -CPÍILDQVEAJUlLICPEiaSATRHVTSErGKKSSACVLFILDEHBWS-EDCLOTTCEülE ********** ********************************* ** *** ********

3.

Glycine max (CHS) CCPARDCVEACIGICTEWEATÍHVLSETGraSSACV.fILOOHRWSIEHGLCrTGtGlO

Gossypiui hf rKLti/Я (CHS) GGPAILDQVEA--ALKPEKLRATRHVLSEYGHMSSACVLFILDEMRIC-SREOG-QTTGEGI.E Gossypivn herbecen! (CHS) -GPAUDQVE*ia*LKPEIXR»Tll«VlSErGHHSS»CVUFILBEHRO:S-EDGt.OT7G£GlE

********** ***** ********************** <

Arechfl hlpogaea (RS) GGPAILDQVEOIO/HUCPEKHMATROVLSHYGXIISSACVFFIHDLHRKKSLE'fGLlCTTGEGLD Sossypim hirsuto» (CHS) CGPAILDQVEA-"AIKPEKLRATRHVLSEYGHHSSACVIFILDEHR-KSREDG-QT7G£GI.E Gossypfun herbecen« <CHS) -GPAILDOVEAJCLALB'EKLRATRHVLSEYGNHSSACVtFILDEKRKJÍS-EDGl.aTTGEGLE ********* _..... «• »_» _.*».»._

Рис.10.А.Сравнение консенсусных аминокислстнкл последовательностей фрагментов клонов халконсинтетаз^ (CHS) G.hirsutura 108F и G.herbaceum, выведенных на основе полученных клонов. В. Сравнение аминокислотной последовательности фрагмента гена халконсинтетазы CHS1 Glycine max (Akada et. al., 1991) и консенсусных аминокислотных последовательностей G.hirsutum 108F G.herbaceum. С. Сравнение аминокислотных

последовательностей Фрагмента - гена

ресвератролсинтетазы (RS) Arachis hypogaea (Schroder et.al., 1988) и консенсусных последовательностей G.hirsutum 108F и G.herbaceum. * - консервативные аминокислоты; . - эквивалентные замены аминокислот.

Таким образом, применение методе полкиеразной цепной реакции, о л и г о н у к л е о т и а ы для которого о т б к р а ¡. и на основе денных о консервативности re hoe. CKS и структуре геномного клона хлопчатника G. hi risu t.ure 108 F. позволило клонировать по ¡лесть фрагментов генов С Н S из д fs у х. видов хлопчатника. Анализ структуры Д К К и аминокислотных последовательностей полученных клоков позволил у с т t. к о в к т ь характер эволюции CUS-гсное и их белковыпродуктов внутри исследуемых семейств.

И д с н т и g> к к а ц и я_генов о лконеянтетазы ,_активно

экспресс и рурмух с я в тканях лепестков G « h 1 г s тг t u m 1 0 8 F и G.herbaceura. Как у ке отмечалось во введении, в растениях, у которых CKS кодируется семейством генов, наблюдается тонкая регуляция экспрессии этих генов. Е норке только отдельные CHS-гены экспрессируются в пигментированных частях растения, транскрипция других индуцируется различными внешними факторам»

(облучением ультрафиолетовым светом, заражением патогенами, механическим повреждением растения). Исходя из этих данных, нам было "интересно исследовать, какие выявленные нами CHS-гены зкспрессирувтсг в тканях цветков G.hirsutum 108F и G.herbaceum.

Ка рис.11 представлена радиоавтограмма

гибридизации РНК, выделенной иэ лег.естков цветка хлопчатника G.hirsutum 108F и G.herbaceum й тканей зрелых листьев G.hirsutum 108F. В качестве зонда использовали одноцепочечный фрагмент размером 150-200п.н, охватывающий 3 ' -конец транслируемой области-гена CHS G.hirsutum 108F клона CGHg, так как его последовательность представлена в обоих видах исследуемых растений.

н

Рис.11. Блот-гибридиз ация РНК, выделенной из тканей G.hirsutum 108F и G.herbaceum.1- и 7 -ДНК фага лямбда, расщепленная Hind III; 2- ДНК клона М13 mplO, содержаиего З'-Фрагмент гена CHS G.hirsutum 108F¡ 3 -РНК, выделенная из тканей цветков G.hirsutum 108F; 4 - РНК, выделенная из тканей цветков G.herbaceum; 5 и 6 - РНК, выделенная из зрелых листьев G.herbaceum.

Блот-гибридизация РНК обнаружила наличие во всех

V

исследуемых тканях единственного транскрипта размером около 1200н, что соответствует длине мРНК CHS известных растений. Однако в . тканях лепестков G.hirsutum 108F уровень экспрессии гена CHS значительно выше, чей в лепестках G.herbaceum и в листьях G.hirsutum 108F.

При исследовании состава семейств генов CHS у G.hirsutum 108F и G.herbaceum нами было показано, что в 3'-транокрибируемой области степень гомологии между членами одного семейства составляет 92-97% и, следовательно, идентифицировать активно

транскрибируемые гены, среди ранее

охарактеризованных, можно только путем их

клонирования и се квеннрования. '

Для решения этой проблемы нами был выбран метод ревертазной ПЦР на препаратах суммарной РНК лепестков G.hirsutum 108F и G.herbaceum. Принцип этого метода закл»чается в последовательном проведении реакций синтеза хПНК и амплификации в одной реакционной смеси.

В качестве затравки л л я обрати oil транскриптази мы использовали ri р «х й м е р , гомологичный 3 ' - к о и и у

к о д и р у ю ц е f; последовательности гена CHS G.hirsutum 108F. Олигонуклеотиды для ПИ? использовали те же, что п и л я it с с л е до в a a u si молекулярной организации CHS генов этих двух в и а о в .хлопчатника ( праймеры N1 и N 2 ) ( Р \\ с . 2 ) , Для контроля качества используемых нами препаратов тотальной РНК G.hirsutum IOS F и G.herbaceuin на отсутс те не D них загрязнении молекулами геномной ДНК ревертазнье ПЦР проводили параллельно с добавлением и без добавления обратной транскриптазьг ( Рис.12) .

1 2 3 4 5 6

г.. ■ • ..->-■' ■ • ..;„ ■ «•»'у

jWt tltf i - v ■

Рис.12 Элeктpoфррегр&вма продуктов ревертазной п о л и м е р а з н о it цепной р"е а к ц и 15. 1 — контрольная ПЦР на ДИК клона М13 mplO, содержащего з'-фрагмент гена CHS G.hirsutum 108F. 2 и 3 суммарная РНК лепестков

G.hirsutum 108F. 2 - реакция ревертазной ПЦР без добавления обратной транскриптазы. 3 - реакция ревертазной ПЦР в присутствии обратной транскриптазы. 4 и 5 - суммарная РНК лепестков G.herbaceum. 4 реакция ревертазной ПЦР в присутствии обратной транскриптазы. 5 - реакция ревертазной ПЦР без добавления обратной -транс криптазы. 6 ДНК бактериофага лямбда, растепленная рестриктазой Hindlll.

Как видно на рис.12, после реакции амплификации с добавлением к РНК обоих видов хлопчатника обратной транскриптазы были получены электрофоретически гомогенные продукты ожидаемого размера. Контрольные реакции амплификации на тех же препаратах РНК в тех же условиях, но в отсутствии обратной транскриптазы не выявили каких-либо продуктов синтеза.

Фрагменты ДНК, полученные после ревертааной П U Р, были клонированы в шаговый вектор И13 m р 1 0 . Клоны анализировали секвенированием, и их

последовательности сравнивали с последовательностями генов CHS G.hirsutura 1 0 8 F и G.heгЬасеun. Анализ полученных результатов показал, что в тканях лепестков обоих видов хлопчатника экспресс цруегся один идентичный ген CHS (у G.hirsutum 108F - это последовательность chs5, для G.herbaceum - с h з 4 ) . Интересно отметить, что этот не ген содержится и в геномном клоне CGH3.

Таким образом, примененный нами метод ревертазной ПЦР на препаратах суммарной РНК, выделенной из лепестков' G.hirsutum 10 8 F и G.herbaceum, позволил похазать что в этих тканях экспрес сируется лишь один ген С И S , входящий и состав пульт игенного семейства

Эти результаты не противоречат данным о экспрессии генов CHS наблюдаемой з других растгнях. Одной из характерной черт всех исследованных генов CHS является зависимость их экспрессии от стадии развития растения и от вида ткани. Так у пе?ун:гл нз'З генов CHS лишь два, CHS-A и CHS-J, экспрессируютсл а «ветках. Причем экспрессия CHS-J составляет вссго 10% от экспрессии CÏÏS-A (Коes et.al., 193ЭЬ). Кроме того, установлено, что на ранних стадиях развития цветка гены CHS эк спрессируотся только в тканях пыльников. По мере развития уровень экспрессии CHS генов в пыльниках падает, в тканях к е лепестков быстро возрастает и остается на одном уровне зплоть до увядания цветка. Аналогичные данные получены и цля других растений. Не исключено, что у исследуемых нами эядоз хлопчатника, экспрессия индивидуальных членов семейства CHS такяе зависит от стадий развития цветков. Кроме того есть вероятность, что s лепеотхах G.hirsutun 103F, который является естестзенным амФидиплоидом, образовааиийся путем скренивания G.herbaceum и G.raimondii, и для которого мы

предполагаем наличие двух классов г е н о d CHS в составе этого семейства, хроме гена с h s 5 , идентичного гену chs4 G.herbaceum, экспресс ируются гени, происходящие из генома G.гairaondii, выявить которые пока не удалось.

Клонирование одного к з генов халконсинтетазы G.hirsutum 108F. Параллельно с исследованиями по изучение молекулярной организации CHS генов G.hirsutum 108F и G.herbaceum мы пытались

клонировать полноразмерную копию одного из генов G.hirsutum 108F из обогащенной геномной библиотеки. На основе картин блот-гибридизации ЛИК G.hirsutum 108F, расцепленной различными редкощепящими

рестриктазами былы отобрана геномная Фракция PstRI-EcoRI, размером около 8000л.н., для клонирования в лямбда векторе MN1149. Учитывая различные параметры: 1. размер гаплоидного генома хлопчатника, равный 780.О 00т.п.н. ; 2. размер клонируемой фракции; 3. обогащение библиотеки клонируемой последовательностью при использовании геномной Фракции, дающей при блот-гибридизации положительный сигнал, било рассчитано, что для хлонирования уникальной последовательностл из G.hirsutum 108F необходимо получить библиотеку, содержащую 5.0x10** рекомбин ан тов на штамме- E.coli без селекции и, соответственно, в 10 раз меньше -на селективном штамме. Однако при скрининге библиотеки, содержащей 1.2x10® рекомбинантов на штамме E.coli L87 и, соответственно, 5.4x10^ рекомбинантов при посеве на селективный штамм NM514 не было выявлено ни одного положительного клона. Аналогичные данные были получены при клонировании геномной фракции EcoRI, размером 3500п.н. в лямбда векторе gtlO. На основе этих результатов было предположено, что фрагменты ДНК G.hirsutum 108F, содержащие последовательности CHS-генов, дают в использованных нами векторах и штаммах нежизнеспособные фаговые бляшки. Это предположение было подтверждено следующим* экспериментами. С

нескольких чашек геномной библиотеки фракции Р s t R I -Е с о Я I , била виделсна суммарная ЛИК ляяЬлп-р е к о м б и н а и -г о в . На получениях препарата к 61; л i\ проэеденз ПЦР, с использованием праймеров N1 и ( р и с . 3 ) . .Анализ полученных результатов знязнл налнме электрофоретически гомогенного продукта ожидаемого размера практически э каждом образце. Несколько П Ц Р -продуктов было клонировано и проанализировано с е к в е н и р о в а н и е м . При этом било обнаружено, что о ка ж д о Л из отобранных ча и е к геномной библиотеки содержится от 1 до 3 CHS послгдоэательностец, структура которых совпадает с выявленными яаии ранее.

Для контроля отсутствия загрязнении и с с л е з У е м i¿ х препаратоз последовательностями СИЗ с гех :«е чавек , с которых -.„б ил сделан смыв Фаговых б л л а е х и ДНК регсомбинантиых клонов которых анализировалась Л П Р , вновь были сделаны реплики на мембранные фильтры. Гибридизация с зондом на 3'-область С H S ген од G.hirsuturn 1 0 3 F выявила наличие слабых положительных сигналов, которые были практически не з*лдны при пзраом скрининге библиотеки. 'А з зон положите льк=»х сигналов были злокроваии рекомбинантньге фаги и после карацивания их в se к д к о it среде была -акаечена ДНК лямбда и проведена повторная ПЦР. Продукты ЛЦР анализировали клонированием и саквенированием . Анализ полученных данных выявил, что почти .каждый из слабых точечных поло» и тельных сигналов содержит одну мз уест и CHS последовательностей G.hirsuturn 10SF. lîce попытки нарастить и раститровать лямбда клоны оказались безуспешными.

Применение__метода однонаправленной ПНР_д л я

клон и рояания_одного__генов_х д.ио н с и н т

G . h i г s u t uro 10BF. Основываясь на том факте, что степень гомологии м е :х д у С H S генами различных растений составляет от 65 до 35%, мы выбрали стратеги» клонирования полноразмерной С H S последовательности методом однонаправленной ПИР» Принцип этого подхода

заключался в поэтапном клонировании перекрываюыихся Фрагментов последовательности CHS через ПЦР. На каждом этапе " П11Р +к л он и р о в а ние " один из

олигонуклеотипов выбирался на основе уже

клонированной З'-области CHS G.hirsutum 108F, а другой - на основе консенсус-пептидов CHS генов других растений (рис.13).

5

9 _Li г-н 17 270 3 _ 320 240

~4~ ~2~ Т

-

560

830 1 тип ПС

Рис.13. Схема, иллострирующая локализацию праймеров, использованных' в методе однонаправленного

ПНР (обозначены стрелками), и М13 клонов. ---

расположение нитрона; цифрами обозначены номера праймеров .

Как мы показали выше, с помощь» праймеров N1 и N2 (рис.3) были клонированы 3'-фрагменты размером 240п.н. из шести CHS-генов. На втором этапе была отобрана последовательность праймера N3, находящаяся на расстоянии 320п.н. от 51-конца уже известных CHS Фрагментов. Клонирование продуктов ПЦР, в которой использовали праймер N1 и праймер N3, дало только два типа CHS последовательностей, размером 560п.н., относящихся к гену chs5 и гену chs6. На основе структуры 5'-конца Фрагмента chs5 гена вновь был синтезирован олигону к леотид (праймер N4), а на основе структуры консенсус-пептидов CHS было синтезировано eue три праймера: N5, N6, N7, располагающихся на расстоянии 3 7 7 п.н. , 312п.н. и 247п.н. от праймера N4, соответственно, и . максимально приближенных к

ожидаемому месту расположения интрона. (Здесь необходимо отметить, что все исследованные до сих пор гены CHS содержат либо один, либо два интрона. Место расположения первого интрона строго специфично для всех известных CHS последовательностей: он

располагается на расстоянии 190-200п.н. от начала трансляции). ПЦР с парами праймеров N4-N6 и N4-N7 не выявила кахих-либо продуктов реакции при варьировании различных параметров. Анализ ПЦР продуктов,

выявляющихся при использовании праймеров N4-N5, дал лишь один тип последовательности CHS. Для того чтобы определить, х какому из шести CHS относится вновь клонированная последовательность, была проведена ПЦР с праймерами N1 и N6. Секвенирование концов единственной выявленной последовательности размером 830п.н. доказало ее принадлежность к chs6 гену. Все дальнейшие попытки прок л онировать 5'-область CHS генов G.hirsutum 108F с помощью ПЦР на геномной ДНК оказались безуспейными. Наши данные согласуются с относительно высокой вариабельностью этой области CHS-генов (Niesbach-Klosgen et.al., 1988)

Таким образом примененный нами метод

однонаправленной ПЦР позволил проклонировать 4/5 одного из генов халконсинтетазы G.hirsutum 108F. Основываясь на лоследо вательностях аналогичных генов других растений, можно предположить, что остался неисследованным 5'-фрагмент размером около 400п.н., эксперименты по клонирование которого проводятся в настоящее время. Однако нужно отметить, что применение метода однонаправленной ПЦР на таких геномах, как геном растений, приводит к появлению большого количества артефактов, связанных с наличием повторяющейся ДНК; трудоемкость этого метода существенно ' увеличивается, если необходимо

клонировать интроны или иные участки, степень вариабельности которых относительно высока.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что семейство генов халкоксинтетазы тетр&плоидного сорта хлопчатника СозБурл.ит Ь^гБиЪит 10 6 Г состоит из 8-10 членов. По степени сходстее первичной структуры гены в семействе разделяются на два подкласса, каждый из которых, вероятно, происходит ст одного 113 предков Соззурхига hi.rsut.un.

2. Остановлено, что аналогичное семейство СозЕургиш ЬсгЬесеиш состоит из вести .геков.

3. Еь'явлено сходное з в о л юц ис н к о е развитие генов •л а л ко н сик г е т а з ы в геномах исследуемых видов хлопчатника, которое можно представить как ряд последовательных дупликаций исходного гена с накоплением е дупл ицированных копиях точкови к у т а ц и &.

4. Идентифицированы гены халкоксинтетазы, специфично экспрессирую иеся в тканях лепестков йовбур^ш Ь1ГБи1иа 100К и СовБурхит ЬегЬссеит.

5. Установлено, что в тканях лепестков обоих исследованных растений экспрессируется один идентичный ген.

6. Разработан' новый вариант ... метода однонаправленной полимеразной цепной реакции, с помощью которого клонирована почти полная копия едкого из генов халкоксинтетазы Соазур^га Ьагои^т

1 огг ■

Основные результаты анссертации изложены в следующих статьях и докладах.

1. Вызова М.В., Краев A.C., Скрябин К.Г. "Клонирование гена халконсинтетазы из хлопчатника Gossypiura hirsutun 108F." Тезисы Всесоизной Конференции "Новые направления биотехнологии", Пувдино, 1988г., стр.63.

2. Вызова М.8., Краев A.C., Скрябин К.Г. "Молекулярная характеристика генов халконсинтетазы тетраплоидного сорта хлопчатника .Gossypium hirsutum 108F" - ДАН АН СССР, 1990 г., т.311, N3, стр. 742-744.

3. Вызова И.В., Краев A.C., Скрябин К.Г. "Применение метода ПЦР для клонирования Фрагментов генов семейства халконсинтетазы хлопчатника Gossypium hirsutum 108F". Тезисы докладов I ••Всесоозного симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", Пущино," 1991, стр.97.

4. Вызова М.В., Краев A.C., Позмогоза Г.Е., Скрябин К. Г. "Молекулярная характеристика семейства генов халконсинтетазы двух видов хлопчатника с помочь» полимеразной цепной реахиии" - Молекулярная биология, 1992г., т.26, N2, стр Ш-учс

5. Вызова М.В., Краев A.C., Позмогова Г.Е., Скрябин К.Г. "Идеити$ихация с помощью ревертаэной ПЦР генов халконсинтетазы, специфически экспресс а руюм и хся в тканях лепестков двух видов хлопчатника Gossypiura hirsutun 108F и Gossypium herbaceum" - Молекулярная биология i 8 печати.