Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности и биологические эффекты процесса транспозиций ретранспозонов в геноме Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Пасюкова, Елена Генриховна, Москва

/ / " / •'(

Российская Академия Наук Институт молекулярной генетики

Пасюкова Елена Генриховна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ПРОЦЕССА ТРАНСПОЗИЦИЙ РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ В ГЕНОМЕ ОЯОЗОРШ-А МЕЬАЫОвАЭТЕЙ

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

В. А. Гвоздев

Москва -1999 год

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1. Классификация, структура и свойства МЭ. 13

Ретротранспозоны 13

Ретропозоны (!-^Е-элементы) 16

Транспозоны 18

РВ-элементы 19

2. Ретротранспозоны как источник генетической изменчивости 20

3. Саморегуляция активности ретротранспозонов 26

4. Геномные факторы, регулирующие активность ретротранспозонов 31 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36

Линии дрозофилы 37

Системы скрещиваний 43

- Изогенизация 43

- Совмещения хромосом разных линий 43

- Получение рекомбинантных инбредных линий 43 Оценка компонентов приспособленности 45

- Определение индекса конкуренции 45

- Определение выживаемости яиц 46 Измерение частоты мутаций 47

- Определение частоты сцепленных с полом леталей 47

- Определение частоты сцепленных с полом видимых мутаций 47

Основные растворы и используемые сокращения 48

Методы работы с ДНК 49

- Выделение плазмидной ДНК 49

- Выделение геномной ДНК Drosophila melanogaster 49

- Выделение ДНК фага М13 50

- Ферментативная обработка ДНК 50

- Гель-электрофорез и элюция фрагментов ДНК 51

- Трансформация и трансфещия 52

- Введение метки в ДНК 53

- Саузерн-блот анализ 54

- Полимеразная цепная реакция 55

- Определение нуклеотидной

последовательности ДНК 56

Методы работы с РНК 57

- Выделение РНК 57

- Гель-электрофорез 58

- Введение метки в РНК 58

- Нозерн-блот анализ 59

- Определение относительных количеств РНК copia 59 Определение сайтов локализации МЭ на хромосомах 60

- Изготовление цитологических препаратов 60

- Гибридизация in situ 61 Оценка числа копий МЭ в геноме 62

- Гаплоидное число копий 63 -Диплоидное число копий 63

Измерение частоты транспозиций 64

Р-зависимая трансформация эмбрионов 69

- Оборудование для инъекций 69

- Получение и анализ трансформантов 70 Статистическая обработка данных 72

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 75 1. Экспериментальные модельные системы, использованные в

работе, и общая характеристика процесса транспозиций в них 76

Линия НА 76

Скрещивания с использованием хромосом-балансеров 78

Линяи 2Ь 82

Линия Harwich 89

2. Ретротранспозоны как источник генетической изменчивости 92

Инсерционный мутагенез 92

- Частота мутаций в линии 2Ь 92

- Спектр транспозиций 94 Влияние инсерций ретротранспозонов на

приспособленность 96

- Распределение ретротранспозонов по хромосомам

в природных популяциях 97

- Изменение частоты транспозиций, числа копий copia и приспособленности особей в

инбредных сублиниях 2Ь 100

- Число копий ретротранспозонов и

приспособленность в линиях 2Ь и Harwich 106

- Закономерности изменения локализации мдг1, коррелирующего с изменением приспособленности,

в линии НА и ее производных 113

3. Саморегуляция активности ретротранспозонов 118

Зависимость частоты транспозиций ретротранспознов от числа их копий в геноме 118

Нуклеотидные последовательности активно перемещающихся ретротранспозонов 129

4. Геномные факторы, регулирующие активность ретротранспозонов 137

Сопряженность процессов транскрипции и транспозиции 137

- Количество транскрипта copia в линиях, характеризующихся различной частотой транспозиций 137

- Уровень транскрипции и частота транспозиций copia

у самцов и самок 140

- Согласованные изменения количества транскрипта и частоты транспозиций copia у самцов разного возраста 145

Картирование районов хромосом, контролирующих высокую частоту транспозиций и количество транскрипта copia 152

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 161

ВЫВОДЫ 165

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ - 169

ВВЕДЕНИЕ

Геном эукариотических организмов представляет собой сложно организованную систему генов и разнообразных регуляторных и структурных элементов. Принадлежностью генома практически всех исследованных на этот счет эукариот являются и мобильные элементы (МЭ) различных типов, причем на их долю приходятся десятки процентов геномной ДНК (Berg, Howe, 1989). При этом МЭ представляют собой весьма обособленную часть генома, поскольку благодаря особенностям своего строения они способны к размножению внутри него. Уже давно было высказано предположение о том, что МЭ представляют собой «эгоистичную» ДНК (Orgel, Crick, 1980; Doolittle, Sapienza, 1980), то есть функционально незначимые для организма нукпеотидные последовательности, сохраняющиеся только благодаря способности к внутригеномной экспансии. И до сих пор, несмотря на проводимые исследования и полученные важные результаты, вопросы о том, какие механизмы обеспечивают сохранение МЭ в геноме и какова их биологическая роль, остаются не до конца ясным и требуют дальнейшего изучения.

История исследования МЭ дрозофилы насчитывает более 20 лет (llyin et al., 1978; Ananiev et al., 1978; Finnegan et al., 1978:). Существенная доля информации об особенностях поведения МЭ эукариот была получена именно в исследованиях на дрозофиле. Это объясняется не только удобством плодовой мушки как модельного лабораторного объекта в целом, но и тем, что общее число МЭ у дрозофилы относительно мало, около 103 копий на гаплоидный геном, сходство нуклеотидных последовательностей внутри каждого семейства МЭ очень велико, а частота транспозиций в некоторых случаях существенно превышает спонтанную, причем эта высокая частота может сохраняться в течение нескольких

лет или воспроизводиться в определенных экспериментальных условиях (Bucheton et al., 1976; Ким, Беляева, 1986; Георгиев и др., 1988). Такие особенности МЭ дрозофилы, а также наличие у нее политенных хромосом, на которых местоположение копии МЭ может быть определено с помощью гибридизации in situ с меченой ДНК МЭ, позволяют изучать перемещения и наследование индивидуальных копий МЭ, и именно это обусловливает преимущества использования дрозофилы как модельного объекта для изучения МЭ. Исследования на дрозофиле являются источником идей и методических подходов к изучению МЭ других организмов.

МЭ дрозофилы были впервые описаны как фрагменты ДНК с неизвестной функцией, которую предстояло найти, исходя из структуры и других свойств МЭ. В последнее время определение нуклеотидных последовательностей целых геномов различных организмов (бактерий, дрожжей, дрозофилы, мыши, человека) рассматривается как одно из наиболее перспективных направлений генетики и молекулярной биологии и потому является одним из наиболее активно разрабатываемых. Предполагается, что полное описание генома явится базовым этапом на пути к пониманию его функционирования. Предпринятая в данной работе попытка исследования МЭ в направлении от известной молекулярной структуры к функции in vivo представляется в связи с этим весьма актуальной как пример, показывающий особенности такого подхода. Не менее важным и интересным является исследование динамики числа копий МЭ в геноме, факторов, контролирующих транспозиции МЭ, фенотипических эффектов МЭ и других вопросов в рамках более широкой проблемы сосуществования и коэволюции эндосимбионта и хозяина.

Исследование МЭ генома с точки зрения взаимоотношения эндосимбионт -хозяин является плодотворным, поскольку дает возможность сформулировать конкретные вопросы, требующие экспериментального разрешения, на основании комплексного общебиологического подхода к проблеме. Принимая во внимание тот факт, что процесс транспозиций является основным характерологическим свойством МЭ, целю настоящей работы было выбрано изучение закономерностей и биологических эффектов процесса транспозиций МЭ в геноме. На наш взгляд, наибольший интерес среди всех типов МЭ представляют ретротранспозоны, не только потому, что они являются наиболее широко и разнообразно представленной группой МЭ, но и потому ещё, что по структуре они близки к провирусам ретровирусов млекопитающих. В связи с этим работа была сосредоточена на исследовании ретротранспозонов. ОговорЬНа те1апода8(ег была выбрана в качестве удобного объекта исследований.

Можно выделить три основных аспекта взаимодействия МЭ - хозяин. Прежде всего, МЭ, внедряясь в различные локусы и меняя функции генов, генерируют генетическую изменчивость и фенотипическую вариабельность хозяина. Именно эта роль МЭ, прежде всего, обусловливает контроль взаимодействия МЭ - хозяин естественным отбором. Кроме того, взаимодействие МЭ - хозяин осуществляется на генетическом уровне. С одной стороны, активность МЭ зависит от их собственных нуклеотидных последовательностей, которые не только кодируют ключевые белки их жизненного цикла, но также, благодаря присутствию различных регуляторных сайтов, обеспечивают взаимодействие с геномом хозяина. С другой стороны, в геноме хозяина присутствуют гены, управляющие активностью МЭ. В

соответствии со сказанным выше были сформулированы три основные задачи данного исследования.

1) Охарактеризовать роль ретротранспозонов в генетической изменчивости хозяина и, прежде всего, оценить влияние ретротранспозонов на приспособленность, поскольку естественный отбор оценивает любой компонент генома только по его вкладу в этот комплексный признак.

2) Проанализировать способность ретротранспозонов регулировать число своих копий в геноме, в том числе охарактеризовать нуклеотидные последовательности тех копий ретротранспозонов, которые способны с высокой частотой перемещаться в геноме.

3) Изучить генетический контроль экспрессии ретротранспозонов со стороны генома хозяина.

Ряд данных, представленных в диссертации, был получен автором в результате плодотворного сотрудничества с Еленой Спартаковной Беляевой, Леонидом Зиновьевичем Кайдановым, Инной Владимировной Глушковой, с работавшими под руководством автора аспирантами - Сергеем Викторовичем Нуждиным, Дмитрием Александровичем Филатовым и Татьяной Викторовной Морозовой, а также с Христианом Бьемоном (Университет Лион-1, Франция), Кевином О'Харой (Имперский Колледж, Великобритания), Эндрью Флавеллом (Университет Данди, Великобритания) и Труди Маккей (Университет Северной Каролины, США). Всем им автор приносит глубокую и искреннюю благодарность.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Мобильным элементам вообще и ретротранспозонам Drosophila melanogaster в частности посвящено множество публикаций в научных периодических изданиях. Результаты многолетних исследований МЭ обобщены также в ряде монографий (Хесин, 1984; Berg, Howe, 1989; Arkhipova et al., 1995; и др.). В задачу настоящего обзора не входит полное рассмотрение всех направлений исследования МЭ. Цель его - рассмотрение закономерностей поведения МЭ в геноме с точки зрения взаимодействия элементов в системе эндосимбионт - хозяин. Будут рассмотрены, главным образом, ретротранспозоны Drosophila melanogaster, с привлечением в отдельных случаях наиболее интересных и имеющих принципиальное значение данных о других группах МЭ и других организмах. В контексте наиболее важных достижений и выводов других авторов будут указаны направления собственных исследований, проведенных в течение последних лет и описанных в главе «Результаты и обсуждение». В соответствии с тремя задачами исследования, взаимодействие МЭ - хозяин будет проанализировано в трех основных аспектах. Во-первых, будут охарактеризованы современные представления о роли МЭ в фенотипической вариабельности и генетической изменчивости хозяина. Во-вторых, будет обсуждено присутствие в самих МЭ регуляторных элементов, обеспечивающих их взаимодействие с хозяином. И, наконец, в третьих, будут обобщены сведения о генетическом контроле поведения МЭ со стороны генома хозяина. Основным главам будет предпослана краткая сводка данных о классификации, структуре и свойствах МЭ.

1. Классификация, структура и свойства МЭ.

В соответствии с молекулярной структурой и механизмом транспозиций мобильные элементы эукариот разделены на 4 группы (Berg, Howe, 1989): ретротранспозоны, ретропозоны (LINE-элементы), транспозоны, FB-элементы. В последнее время ретротранспозоны и ретропозоны часто объединяют общим названием ретротранспозоны. Именно так используется термин ретротранспозоны в данной работе.

Ретротранспозоны

В эту группу входят мдз1, мдг2 (412), мдгЗ, мдг4 (gypsy), copia, В104 (roo), 297, 1731, H.M.S.Beagle, blood, Stalker, torn и некоторые другие МЭ Drosophila meíanogaster. По структуре ретротранспозоны сходны с провирусами ретровирусов (Berg, Howe, 1989). И ретротранспозоны, и ретровирусы состоят из кодирующей части, имеющей в разных случаях от одной до трех открытых рамок считывания, соответствующих белкам Gag, Pol и Env. Как и ретровирус, ретротранспозон фланкирован по концам длинными, до нескольких сотен нуклеотидов, прямыми повторами - ДКП (длинные концевые повторы). Эти повторы обычно не содержат длинных открытых рамок, но содержат регуляторные последовательности, влияющие на уровень экспрессии МЭ. В настоящее время выделяют две подгруппы ДКП содержащих ретротранспозонов, названные по наиболее изученным представителям каждой: 7у/-сор/а-подобные и Ty3-gypsy- подобные ретротранспозоны. Представители первой группы не имеют белка Env, а

представители второй группы, как правило, кодируют белок Env, образующий наружную оболочку вирусоподобной частицы, и, как следствие этого, обладают инфекционностью (Kim et al., 1994а; Song et al., 1994; Tanda et al., 1994), что практически позволяет рассматривать их как ретровирусы насекомых.

Предполагаемый механизм транспозиций ретротранспозонов аналогичен жизненному циклу ретровирусов и включает транскрипцию, синтез белков, упаковку полноразмерного транскрипта в комплексе с обратной транскриптазой в вирусоподобную частицу, синтез ДНК-копии на матрице РНК, интеграцию в геном (Shiba, Saigo, 1983; Emori et al., 1985; Garfinkel et al., 1985; Arkhipova et al., 1984, 1986; Gorelova et al., 1989;; Yoshioka et al., 1990, 1991, 1992). В случае ретротранспозонов обратная транскрипция и встраивание в геном разобщены: обратная транскрипция происходит внутри вирусоподобных частиц, и в геном встраивается уже готовый полноразмерный ретротранспозон. Поэтому, в отличие от LINE-элементов, инсерции ретротранспозонов обычно не делетированы с 5' конца.

Рассмотрим несколько более подробно строение ретропозона copia (рисунок 1). Последовательность ретротранспозона copia содержит 5.2 тпн. Один ДКП длиной 276 нп имеет обычное для ретровирусов U3-R-U5 строение и не содержит длинных открытых рамок считывания (Mount and Rubin 1985). В ДКП находится промотор и сайт полиаденилирования, а также потенциальный сайт связывания cAMP (Yun, Davis, 1989). Правда, хотя последовательность, соответствующая консенсусной, найдена в ДКП, однако влияние сАМР на экспрессию copia не показано. За ДКП следует 5' нетранслируемая регуляторная область, содержащая сайт связывания гомеобелков (Cavarec,

Транскрипция

-^ Свит связывания гонеобелков

дкп

Энхансер

Ара! Pvatt

I.........1

mndtS EcoRI

+

Pstl

тд pr int роГ ДКП

QRF1 . I I :-1 |-1 ORF2

тнп

О 1

полноразмерная

рнк

сплаисированная

Рисунок 1. Структура ретротранспозона copia.

ДКП - длинный концевой повтор; gag - gag белок; рг - протеаза; int - интеграза; pol - обратная транскриптаза; ORF1 и ORF2 - две открытых рамки считывания; Apal, PvuII, Hindlll, ЕсоШ, Pstl -сайты рестрикции соответствующих рестриктаз.

Транскрипция -►

orf1

н

ORF2

Pvu И Pstl Pvu Й EcoRt Salt EcoRI Sali Xba EcoRI Kpn

ТНП

—I—

0 1 полноризиерная

рнк

Рисунок 2. Структура ретротранспозона Doc.

ORF1 и ORF2 - две открытых рамки считывания; Xba, Kpn, Pvull, Hinälll, ЕсоШ, Pstl - сайты рестрикции соответствующих рестриктаз; 1 - район гомологии с ДНК или РНК-связывающим белком; 2 - район гомологии с геном обратной транскриптазы.

Heidman, 1993) и в\/40-подобный энхансер (Sneddon, Flavell, 1989). За 5' нетранслируемой областью следуют две перекрывающиеся открытые рамки считывания. Ретротранспозоны транскрибируются РНК-полимеразой Н, и, по-видимому, для базального уровня транскрипции необходим только район старта транскрипции и +30 район (Arkhipova, llyin, 1992). В культуре тканей Drosophila melanogaster обнаружены транскрипты длиной 2 и 5 тпн (Emori et al., 1985). Меньший транскрипт образуется путём сплайсинга из большего транскрипта (Yoshioka et al., 1990). Полноразмерный транскрипт содержит обе рамки считывания (Emori et al., 1985, Mount, Rubin, 1985). Первая рамка соответствует Gag белку, протеазе, интегразе и обратной транскриптазе ретровирусов. Сначала синтезируется единый полипептид размером около 163 кДа, который затем разрезается на два белка, обладающих несколькими активностями. Вторая рамка должна была бы соответствовать белку оболочки ретровирусов Env, однако ее последовательность не имеет гомологий с Env белками ретровирусов (Berg and Howe 1989). Сплайсированный транскрипт кодирует единый полипептид размером 48 «Да, который разрезается на два белка, один из них Gag (Yoshioka et al. 1990). Белок Gag представляет собой основной белок вирусоподобных частиц copia, которые были обнаружены в культуре тканей (Emori et al. 1985).

Ретропозоны (LINE-элементы)

В эту группу входят /-элемент, F, G, Doc, jockey, Het-A, R2 и некоторые другие МЭ Drosophila melanogast