Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности структурных изменений ДНК, возникающих при ее протонировании In situ

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Особенности структурных изменений ДНК, возникающих при ее протонировании In situ"

)

САНКТ - ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Нал правах рукописи

НАСИРОВ Назим Гусейн оглы

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНЫХ' ИЗМЕНЕНИЙ ДНК, ВОЗНИКАЮЩИХ ПРИ ЕЕ ПРОТОНИРОВАНИИ йг ¿Ни

03.00.02 Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт - Петербург 1992

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментально биофизики РАН

Научный руководитель: доктор химических наук Б .И.Сухоруков

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Э.В.Фрисман

доктор биологических наук Л.А.Носкин

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова

Защита состоится " •" ^1992 года в 16 часов на заседании Специализированного совета Д 063.57.50 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд.90)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М.Горько! Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан " ^ " 1992 года.

Ученый секретарь Специализированного совета канд. биологических наук

З.И.Крутецкая

- ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

- ■ .■;Актуальность проблемы. В настоящее время наблюдается суще.. ственное усиление закисления окружающей среды, связанное с рос-том-содёржания в атмосфере окислов серы, азота и углерода, кото-^■раё-'легко проникая через мембраны клеток и оболочки вирусов при "взаимодействии с внутренней средой этих объектов генерируют протоны соответствующих кислот. Поэтому исследование закономерностей влияния кислотности среды на жизнеспособность и изменчивость живых организмов связанных с повреждениями, возникающими в геноме при его протонировании становится актуальной задачей.

Будучи экзогенным фактором влияния на живые организмы, протоны среды в то же время, являются эффективным эндогенным факто-. ром регуляции внутриклеточных процессов, протекающих в том числе с участием нуклеиновых кислот.

В литературе имеется значительнее число работ, посвященных исследованию влияния протонов среды на структурные превращения ДНК В растворе (Gushlbauer et al. , I968;2immer,a!reibell , 1969; Сухоруков и др., 1973; 1983; 1990). В результате этих исследований выявлены наиболее сильные протон-акцепторные центры и порядок протонирования их в ДНК. Обнаружено, что Н+- ионы при малых степенях протонирования {<*■< 0,05) стабилизируют В-форму ДНК, при средних значениях (<* < 0,25) - осуществляют ее переход в новую конформацию ( S - состояние), а при больших степенях («;> >0,25) - разрушают двойную спираль, образуя неупорядоченную конформацию (g - состояние). Предложен механизм стабилизации В--конформлции и модель а - состояния. Выявлены промежуточные состояния и механизмы В -»в и В -»g превращений. Исследованы кинетика и механизм разрывов гликозидных и фосфодиэфирных связей ДНК, а также дезаминирования азотистых оснований (Lindahl et al., 1972; 1974). В то же время при изучении протонирования ДНК in aitu ни на один из этих вопросов ответ еще 'не получен. Вместе с тем, такие структурные особенности ДНК in situ как компактиза-ция и тесное взаимодействие с белками, могут определять особенности структурных превращений ДНК при ее протонировании. Для решения этих задач в работе били использованы наиболее простые и удобные объекты - бактериофаги, широко используемые в качестве модели простейшего генома.

Цель и задачи исследования. Работа посвящена исследованию структурных изменений внутрифаговой ДНК, возникающих при ее протонировании и их связи с кислотной инактивацией фагов. Исходя

из этого были поставлены следующие задачи: I) получить кривые рН-зависимости выживаемости фагов, содержащих ДНК различного GC--состава, подвергнутых протонированию с последующей нейтрализацией и определить параметры их кислотной инактивации; 2) получить данные по экстрагируемости ДНК из фагов, подвергнутых действию Н+- ионов различной концентрации с последующей нейтрализацией и для этих препаратов исследовать трансфецирувдую активность количество остаточного белка и содержание в нем кислых и основных аминокислот; 3) изучить роль ДНК-белковых взаимодействий как фактора способного определять особенности повреждений генома, возникающих при его протонировании; 4) исследовать УФ- и КД-спе-ктры при различных кислых значениях рН, а также кривые потенцио-метрического титрования интактных и разрушенных фагов в связи с изучением особенностей протонирования ДНК in situ по сравнению с ДНК в растворе и кислотной инактивации вирионов; 5) изучить взаимосвязь особенностей изменений физико-химических свойств ДНК при ее протонировании in situ с пространственной организацией внутрифаговой ДНК.

Научная новизна. Получены кривые выживаемости фагов Т4, ТЗ, Сд,Я и определены параметры их кислотной инактивации. Показано, что фаги по кислотной стабильности распологаются в ряд: Т4>Сд> ТЗ, из которого .следует, что рН-чувствительность вирионов возрастает с ростом GC-содержания их ДНК. Установлено, что кислотная инактивация фага при небольшом смещении рН от нейтрального значения к кислым обусловлена повреждениями внутрифаговой ДНК, при значительном же подкислении среды - о нарушениями структуры белков капсиды вириона, возникающих в результате агрегации фаговых частиц.

Проведен анализ экстрагируемости ДНК из фагов подвергнутых действию Н+- ионов различной концентрации с последующей нейтрализацией среды , из которого следует, что ухудшение экстрагируемости с ростом GC-содержания фаговой ДНК и понижением рН среды связано с возникновением нековалентных и ковалентных сшивок ДНК-белок. Показано, что нековалентные сшивки возникают при небольшом смещении рН от нейтрального значения к кислым ив их образовании участвуют GC-пары ДНК и остатки глутаминовых ( Glu) и ас-парагиновых. ( Asp) кислот белков нуклеокапсиды. Ковалентные -сшивки образуются лишь при значительном подкислении среды и представляют собой шиффово основание, возникающее между £ -аминогруппой лизиновых остатков белков и альдегидной группой открытой формы пентозы при апуриновых сайтах ДНК. Образование сшивок ДНК-

- белок является основной отличительной особенностью необратимых структурных изменений ДНК, возникающих при ее протонировании in situ по сравнению с ДНК in vitro. Помимо ее выявлены также особенности механизма непосредственно самого процесса протонирова-ния ДНК in situno сравнению с ДНК в растворе. Установлен порядок протонирования различных фрагментов нуклеокапсиды фага.

Исходя из особенностей изменения свойств ДНК при ее протонировании in situ по сравнению с ДНК invUh'o, предложена модель пространственной структуры ДНК внутри вириона.

Практическая значимость. Из полученных нами данных следует, что наряду с влиянием Н+-ионов на ферментативную активность возможен еще один путь регуляции протонами среды внутриклеточных процессов происходящих с участием нуклеиновых кислот, который связан с их действием непосредственно на структуру ДНК.

Обнаруженные в работе нековалентные сшивки в местах контакта GC-nap ДНК с Glu или Asp белков и предложенный механизм их образования важны для понимания молекулярных принципов нуклеино-во-белкового узнавания, механизма действия кислых белков на структуру и функции ДНК, а также позволяет понять причину возникновения изломов двойной спирали в области GC-nap, которые наряду с изгибами в области АТ-пар могут способствовать эффективной упаковке ДНК в составе хроматина и вирусных нуклеокапсид. Существование таких нековалентных сшивок ДНК-белок может объяснить феномен резкого возрастания частоты спонтанных и индуцированных мутаций типа транзиций QC •* AT.

Возникновение при подкислении среды и последующей ее нейтрализации сшивок ДНК-белок как нековалентной, так и ковалентной природы могут представлять интерес для радиобиологии, поскольку в треках ионизации, в водной среде, происходит и значительное повышение кислотности среды.

Полученные нами результаты исследования агрегационных эффектов, наблюдающихся при протонировании ДНП-комплексов могут объяснить причину нерасхождения хромосом при делении клеток и возникновения аномалий, лежащих в основе широкого круга наследственных болезней. Представленные в работе данные важны также для понимания причин и факторов отбора в процессе эволкционного развития живых систем.

Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на У1 симпозиуме СЭВ по биофизике белков и нуклеиновых кислот (Сегед, Венгрия, 1983), на международной конференции

"Взаимодействие ДНК о белками и лигандами" (Тбилиси, 1990) и на УИ конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа содержит: введение, главу - обзор литературы (3 раздела), главу- материалы и методы, 3 главы, в которых представлены результаты эксперимента и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы, насчитывающей 196 наименований, из них 58 отечественных и 138 зарубежных публикаций. Работа изложена на 164 стр. машинописного текста, включая 35 рис. и V таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Объектами исследования являлись коли-фаги Т4, Сд,ATir и ТЗ, ДНК которых содержит соответственно 35; 44,5; 49,5; 50,5% GC-nap оснований, а также препараты ДНК, выделенные из фагов методом фенол-детергентной депротеинизации.

Получение фагов Т4, ТЗ и Сд на соответствующих чувствительных к ним штаммах Е. coli производили в солевой среде Щ, а фага Л - в полноценной среде (Blattner et al., 1977). Концентрацию и очистку фагов проводили по методам Тихоненко и др. (1963) и Yamo-moto et al.(1970). Трансфекцию фаговой ДНК осуществляли по Maadel, Higa (1970). Выживаемость вирионов и инфекционноеть фаговой ДНК определяли по числу негативных колоний. Введение меченых по f^C--глутаминовую кислоту и по %-лизин осуществляли in vivo , а подсчет радиоактивности проводили в сцинтилляционном счетчике фирмы "Bekman".

УФ- и КД-спектры фага и его ДНК регистрировали на спектрофотометре "Carry "-2I9 и дихрографе "Jasco -J-4IA". Потенциомет-рическое титрование этих же препаратов проводили на приборе "рН--2II/I" с универсальным электродом фирмы 'Radelkis ". Плавление ДНК и'ее комплекса с глутаминовой кислотой проводили на спектрофотометре 'VSU -2Р".

I. Исследование влияния протонов среды на изменение биологической активности фагов и фаговой ДНК, протонированной in situn в растворе.

Представленные в данном разделе экспериментальные результаты исследования рН-зависимости трансфецирующей активности фаговой ДНК и выживаемости бактериофагов, отражают необратимые структурные изменения, возникающие в этих объектах после их инкубации в кислых средах и последующей нейтрализации.

В работе исследовали изменение трансфецирующей активности

ДНК, выделенной из фаговых частиц, которые предварительно инкубировали при различных кислых значениях рН и затем нейтрализовали до рН 8 (ДНК, протонированная in situ ). Наряду с этим изучали изменение трансфецирующей активности ДНК, выделенной из не-протонированных фаговых частиц, которую затем подвергали кислотной обработке и последующей нейтрализации в растворе (ДНК, протонированная in vitro ). рН-зависимости трансфецирующих активностей ДНК протонированной in aitu и в растворе были получены при различных ионных силах среды. Показано, что изменение ионной силы мало влияет на рН-зависимость трансфецирующей активности ДНК протонированной in situ , но сильно изменяет таковую у ДНК про-тонированную в растворе. Это обусловлено тем, что внутрифаговая ДНК в достаточной степени экранирована противоионами содержащимися в нуклеокапсиде фага.

На рис. I приведены кривые трансфецирующей активности ДНК при ионной силе 0,1, из которых обнаруживается принципиальное различие между структурными повреждениями ДНК, возникающими при ее протонировании in situ и in vitro . Видно, что трансфеци-

рующая активность в случае ДНК протонированной в растворе не изменяется при подкислении среды вплоть до рН 3,1. Резкая же потеря ее в интервале рН 3,1-2,9, связана с необратимым переходом двойной спирали в клубок. На это в частности, указывает возрастание в интервале рН 3,1-2,9 поглощения ДНК в УФ-спектре. В случае же ДНК протонированной1п situ уже при значениях рН< 5,5 наблюдается монотонное снижение трансфецирующей активности. В связи с этим возникает вопрос - каковы же особенности структурных повреждений, возникающих во внутрифаговой ДНК при сравнительно небольшом смещении рН от нейтрального значения к кислым? Также как и в случае ДНК, протонированной в растворе эти повреждения не связаны с катализируемыми Н+-ионами гидролитическими процессами - депурвнизацией, разрывами сахарофосфатных цепей и дезаминированием оснований. Об этом свидетельствуют не только наши результаты, но и данные ра-

Рис.1. Изменение в относительных единицах А трансфецирующей активности ДНК фага л при ее

средах . _______________

значениями рН. Время.инкубации 2,5 часа, Т=20 С.

га л при ее протонировании в растворе (IJ и in situ (2) в средах с различными

боты Киселевой и Тихоненко (1972), в которой показано, что при рНи.4 в среде см =0,1 и Т=37°С гидролитические процессы во вну-трифаговой ДНК не протекают даже после 5-часовой инкубации.

Нарушения структуры внутрифаговой ДНК не связаны также с переходом двойной спирали в клубок. На это в частности, указывают данные о том, что при протонировании ДНК in eituHe наблюдается возрастание ее поглощения в УФ-спектрах, сохраняется определенное значение трансфецирующей активности при таких кислых значениях рН, когда протонированная ДНК in vitro полностью находится в состоянии клубка (см. рис. I), а также наблюдается антибатный характер зависимости от GC-cодержания ДНК параметра рНш , представляющего собой то значение рН, при котором половина нуклеоти-дов находится в неупорядоченном состоянии и рН-чувствительности фагов (рис.2). Последнюю оценивали по начальной скорости инактивации Vq и параметрам pHgQ и pHgr,, представляющие собой значение рН, при котором за одно и то же время инкубации t выживаемость фага уменьшается соответственно в 2 и е раз. Эти параметры были определены из рН-зависимостей выживаемости фагов. Значения рНщ, относящееся к 20- и 90-минутным инкубациям в различных кислых средах суспензии фагов с исходной концентрацией ~107 БОЕ/мл в 0,1 М KaCI и Т=20°с , приведены Ж'еТое^Жьё^ЮбоГ 1 ЛиП ~ ниже в табли«е- Из нее видно,

Параметр ТЗ X Сд Т4

рн!8 5,02 4,43 4,2 2,95

рн!°о 5,33 5,0 4,68 3,25

что фаги по их кислотной стабильности распологаются в следующий ряд: Т4> Сд>Я>ТЗ, из которого следует, что чем больше ОС-пар оснований в составе внутрифаговой ДНК, тем выше чувствительность вирионов к Н+- ионам. При протонировании же ДНК 1п ^хо , на-

40 50 60

СС-содеряаше, ыол.%

Рис.2 Зависимость параметра рн|[]

от GC-содержания ДНК фагов Т4 ЬьЩ, Сд (44,550, <Я (49.5%) и ТЗ (50,5%) и параметра рнтот GC-содержания ДНК, полученных из

•по О TTMITUrrv »«пуплл'п'ппипптлп ( T3nvt

против, с ростом GC-содержания возрастает стабильность двойной спирали (см. рис. 2).

Как видно из таблицы и рис.2, чувствительность фагов к протонам среды возрастает примерно в 100 раз при увеличении GC-содержания ДНК от 35% до 50,5%( соответственно фаги Т4 и ТЗ). Это указывает на то, что при протонировании ДНК in situ необратимые структурные повреждения возникают в участках двойной спирали, обогащенных 9С-парами. Именно эти повреждения ДНК, по-видимому, обусловливают инактивацию фагов при небольшом смещении рН от нейтрального значения к кислым.Об этом в частности, свидетельствует говпадение кривых рН-зависимостей выживаемости фага X и трансфе-дирукхцей активности его ДНК при подкислении среды до рН 5,0. При дальнейшем же подкислении среды в инактивацию вносят вклад не только повреждения ДНК, но и фаговых белков, поскольку например, три смещении рН до 4,2 имеет место полная инактивация фага, в то зремя как трансфецирующая активность выделенной из него ДНК, гменыпается лишь на ~ 30%. Это подтверждают.также результаты исследования рН-зависимости светорассеивающей способности фага Л , 13 которой следует, что определенный вклад в инактивацию фага [ри значениях рН< 5 вносит процесс межвирионной агрегации частиц.

2. Биохимический анализ структурных повреждений ДНК, возникающих при ее протонировании in situ.

На рис. 3 показано изменение экстрагируемости ДНК из фагов азличного GC-состава, предварительно подвергшихся обработке при азличных кислых значениях рН с последующей нейтрализацией до Н 8. Видно, что повышение кислотности среды приводит к ухудше-ию экстрагируемости ДНК из протонированных фаговых частиц, т.е. меныпению выхода ДНК в водную фазу и соответственно увеличению э оодержания_в интерфазе при фенол-детергентной депротеинизации. гот факт указывает на образование прочных сшивок меящу ДНК и ка-зидными белками вирионов. Об этом же свидетельствует наблюдаете уменьшение оптических плотностей ^gQ/^gg и ^260^280 выде~ энных препаратов ДНК, характеризующих полноту удаления из них шга. Как видно из рис. 3 уменьшение экстрагируемости ДНК, со-ювождагацееся возрастанием количества остаточного белка в выде-¡нных препаратах ДНК зависит от GC-содержания ДНК фаговых час-IX. Увеличение количества прочно связанного с ДНК белка с повы-нием GC-содержания фаговой ДНК, указываем на особую роль GC-ар оснований в образовании ДНК-белковых сшивок. Исходя из это-становятся объяснимыми приведенные в предыдущем разделе дан-

ные о возрастании кислотной чувствительности фагов с увеличением GC-содержания их ДНК. С какими же фрагментами белков фаговой нуклеокапсиды связываются QC-пары ДНК при образовании ДНК-белковых сшивок?

На модельной системе (Lancelot, Helene, 1977) было показано, что константа связывания гуанина с глутаминовой и аспа-рагиновой кислотами превышает константу связывания его с ци-тозином в~ 30 раз. Исходя из этого мы предположили, что в нуклеокапсиде фага, в условиях пространственной сближенности остатков Glu или Asp белков с GC-парвми ДНК может реализоваться структура, когда гуанин будет предпочтительно связываться с Glu или Asp , а не с цитозином, приводя тем самым к образованию прочной нековалентной сшивки ДНК-белок, отличающейся от ковалентной прежде всего тем, что она возникает в результате сильных межмолекулярных взаимодействий, включающих водородную связь. Действительно, как следует из полученных нами результатов, приведенных на рис. 4, увеличение кислотности среды, в которой

5- 4 рН

Ряс. 3 Изменение экстрагируе-мости ДНК различного GC-coc-тава в относительных единицах R из фагов Л (I) и Т4 (2), обработанных в кислых средах. Время инкубации 2,5 часа, . ионная сила 0,1 M NaCI, T=20UC.

fi

1.5

1.4

Х.З 1.2 I.I 1.0

7 6 5 4 3

Рчс.*1 рН-зависимость содержания в относи-■ тельных единицах В остатков глутами-миновых кислот Ш и лизинов (2) во фрагментах белка прочно связанной с ДНК, полученной в результате фенол--детергентной депротеинизации и обработки протеиназой К фага Л . Перед выделением ДНК вирионы подвергались 2,5 часовому протонированию при различных кислых значениях рН с последующей нейтрализацией среды до рй 8. Ионная сила 0,1 М НаС1, Т=20°С ^-отношение радиоактивностей меченых

по -^С-глутаминовых кислот и %-ли-зинов в имп/мин на 1мкг ДНК при заданном значении рН к рН 7.

инкубировались фаговые частицы, сопровождается резким возрастанием количества остатков Glu во фрагментах белков нуклеокапсиды, остающихся прочно связанными с ДНК после фенол-детергентной де-протеинизации вирионов и дополнительной обработки их протеиназой К (кривая I). Максимальное.количество связанных с ДНК остатков Glu наблюдается'при рН~4. При дальнейшем понижении рН, число связанных с ДНК остатков Glu существенно уменьшается, что по-видимому, обусловлено процессом депуринизации и в первую очередь гуаниновых оснований (Тшш et al. , 1952). В области рН^ 4, одновременно с уменьшением числа остатков Glu в белковых фрагментах связанных с ДНК, с ростом кислотности среды увеличивается содержание лизиновых остатков (рис. 4, кривая 2). Это обусловлено тем, что при нейтрализации среды в протонированных фаговых частицах становится возможным образование шифйова основания между £ -аминогруппой лизиновых остатков белков и альдегидными

группами открытой формы пентозы при апуриновых сайтах ДНК, возникающих в результате кислотного гидролиза. Таким образом, как следует из полученных нами результатов, уже небольшое смещение рН от нейтрального значения к кислым приводит к образованию не-ковалентных сшивок ДНК-белок с непосредственным участием QC-nap ДНК и аминокислотных остатков Glu или Asp капсидных белков фага, а при значительном подкислении - преимущественно ковалентных сшивок с участием лизиновых остатков белков. Образование сшивок ДНК-белок является одной из отличительных особенностей структурных повреждений ДНК, возникающих при её протонировании in situ.

Как следует из работ (Courtois et ai. , 1968; Сухоруков, 1973) при протонировании ДНК в растворе гуанозиновый остаток претерпевает переход из anti- в syn -конформацию и образует комплементарную пару с цитозином по хугстиновской схеме ( так называемая а -конформация). В местах контактов фаговой ДНК и белков гуанозиновые остатки в syn-конформации могут образовывать водородные связи с карбоксильными группами Glu или Asp , стабилизируя тем самым это состояние. О справедливости такого утверждения свидетельствуют изменения параметров кривых плавления комплексов ДНК с глутаминовой кислотой при различных кислых значениях рН. Из полученных нами данных следует, что с ростом в среде концентрации водородных ионов усиливается дестабилизирующее влияние Glu на ДНК. Так, если при рН 4,8 разность STm -- температуры плавления ДНК в комплексе с Glu по сравнению со свободной ДНК в растворе состовляет 4°С, то при рН 3,5 возрас-

тает до Ю°С.

Рассмотренное вше, позволяет представить нековалентные сшивки ДНК-белок, возникающие в системе in situ в зависимости от наличия на ней заряда и степени сблоченности ее компонент следующим образом : A) dC...dGByn-Glu", Asp"

E)dC-dGanti- Glu, Asp в) dC...dGByn - Glu, Asp

Г) dCH*- dGsyn - Glu", Asp" Д) dCH+- dGsyn - Glu, Asp. Следует отметить, что-при образовании нековалентных сшивок ДНК-белок аул -конформация гуанина хотя и в меньшей степени может стабилизироваться и в результате взаимодействия с карбонильными, гидроксильными и др. группами боковых радикалов аминокислотных остатков и пептидных связей белков.

3. Исследование взаимодействия протонов среды с интактным и разрушенным фагом Я. методами потенциометрии и оптической спектроскопии.

Потекциометрическое титрование фага -А. . Кривые прямого титрования фага Л- интактного и разрушенного методом замораживания - оттаивания, а также свободной ДНК в растворе приведены на рис.5. Из кривых видно, что в области нейтральных и слабокислых

значений рн связывание протонов происходит преимущественно с интактным и разрушенным фагами, в то время как с ДНК связывание Н+- ионов не наблюдается. Последнее указывает на то, что в этой области значений рн протоны среды связываются с белками фаговой капси-ды и прежде всего с остатками гистидина ( His ), а также Glu и Asp . Поскольку количество His в белках фага очень мало, то связывание Н+--ионов происходит преимущественно с остатками Glu и Asp белков.

Как видно из рис. 5 в области нейтральных значений рН кривая титрования интактного фага по сравнению с разрушенным смещена в сторону щелочных значений рН. Такое смещение связано

РН

8 7 6 5 4 3 2.

Рис.5 Кривые потенциометри-ческого титрования разру -г шенного (I) и интактного(З) фагов я также ДНК в растворе (2). Ионная сила 0,01 МКаСТ, Т=20 С.

с наличием тесного взаимодействия протон-акцепторных центров белков и ДНК в нуклеокапсиде интактного фага, которое отсутствует в разрушенном фаге. Одним из наиболее вероятных мест такого взаимодействия могут быть участки близкого контакта GC-nap оснований ДНК с карбоксильными группами боковых радикалов Glu или Asp белков капсиды фага.Это находится в соответствии с законом Кирк-вуда -Бьеррума, согласно которому такое взаимодействие протон-акцепторных центров приводит к возрастанию основности каждого из этих центров.

Из рис. 5 также видно, что в области кислых значений рН, при которых связывание протонов в интактных и разрушенных частицах обусловлено исключительно протонирсванйем их ДНК, наблюдается кооперативное связывание Н+- ионов с ДНК разрушенного фага, в то время как связывание с ДНК интактного фага происходит некооперативно. Последнее обусловлено тем, что в отличие от ДНК прото-нированной в растворе', связывание протонов с ДНК интактного фага не приводит к образованию протяженных "петель" в двойной спирали вследствие ее плотной компактизации и иммобилизации внутри вирусной частицы.

УФ-спектры фага Я в средах с различной кислотностью. Результаты потенциометрического титрования фага, а также данные приведенные нами в разделе 2 показали, что уже при нейтральных значениях рН становится возможным захват протона в местах контакта QC-nap оснований ДНК и карбоксильных групп Glu или Аэр белка нуклеокапсиды фага. Вследствие протонирования гуанозиновые остатки ДНК могут претерпевать переход из anti- в зуп -конформацию с образованием нековалентных сшивок с Glu или Аэр по схеме В (см. разд. 2), нарушая при этом комплементарное спаривание с ци-тозином в GC-napax. С повышением кислотности-среды этот процесс усиливается. Это находится в.соответствии с полученными нами данными по рН - зависимости УФ-спектров поглощения интактных и разрушенных фаговых частиц.

Известно, что вклад молекулярно-ионных превращений ДНК в изменение спектров поглощения обусловлен в основном протонирова-нием цитозиновых оснований, переход которых из молекулярной в катионную форму сопровождается смещением X „„_ с 270 до 280 нм и

Мал

возрастанием поглощения. При этом длина волны 260нм близка к изосбестической, что позволяет используя отношение величин оптических плотностей на длинах волн 280 нм и 260 нм, полученных с поправкой на светорассеяние, провести сравнительный анализ протонирования цитядинлвыт .остатков в ДНК интактного и разрушенного

фагов,а также свободной ДНК в растворе. Так, из рис.6 следует, что протонирование цитидиновых остатков в составе ДНК интактно-го фага начинается при более нейтральных значениях рН. Это указывает на то, что во внутрифаговой ДНК у определенной части ци-тозиновых оснований водородное связывание либо ослаблено, либо отсутствует.

Рис.6 рН-зависимость в относительных единицах <1 отношения оптических плотностей при длинах волн 280 и 260 нм для ин-тактного (I) и разрушенного (2) фагов, а- отношение величин А2цд нм при данном значении рН к рН 7, Ионная си-

ла 0,01 МнаСТ, Т=20 С.

Исходя из данных потенциометрического титрования и рН-за-висимости УФ-спектров интактного и разрушенного фагов, а также свободной ДНК в растворе, по способности связывать протоны среды фрагменты нуклеокапсиды фагов можно расположить в следующий ряд: ( QC + Glu , Asp ) > (Glu , Asp )> dC...dGsyn- Glu,Asp > Glu, Аар > GC > AT, где в скобках представлен блок взаимодействующих между собой карбоксильных групп Glu или Asp , а. также GC-nap оснований ДНК и Glu. или Asp белков.

Нарушение комплементарного связывания части GC-nap, находящихся в контакте с капсидными белками, как нам представляется, может объяснить феномен "гиперхромизма ДНК in situ" (Tikohonenko, 1969). Оно является также причиной повышения химической реакци-онноспособности внутрифаговой ДНК по сравнению с ДНК в растворе, усиливающейся с ростом в ней GC-содержания.

КЯ-спектры фагаЛ в средах с различной кислотностью. На рис. 7 представлены КД-спектры интактного и разрушенного фага при различных кислых значениях рН. Анализ изменений ВД-спектров разрушенного фага в интервале значений рН 7 - 3,5 (рис. 7А) по-

казал, что рН-зависимости КД-спектров в области полосы поглощения ДНК (240-300 нм) для разрушенного фага и свободной ДНК в растворе идентичны между собой. Эти изменения состоят в том, что

161

10 в 6 4 2 О

Рис. 7 КИ-спектры разрушенного (А) и интактного (Б) фагаХ при различных значениях рн среды. Ионная сила 0,01 М наС1, Т=20°С.

с понижением рн среды наблюдается уменьшение интенсивности и ба-тохромный сдвиг X положительной полосы, уменьшение интенсивности отрицательной полосы, а также появление новой положительной полосы при Л=257 нм. Их обычно связывают с переходом гуано-зиновых остатков из аЩ;1 - в зуп -конформацию (нагаз1тЬоп , Вгуая , 1975), а также скручиванием и сжатием двойной спирали (Монтрель, Сухоруков, 1990). Особенность изменений КД-спектров интактного фага (рис.ТБ) по сравнению с разрушенным состоит в том, что интенсивность положительной полосы остается неизменной

при подкислении среды вплоть до значений рН, при которых наблюдается агрегация частиц (рН<4,5)

Наблюдаемый феномен неизменности эллиптичности положительной полосы ВД-спектров интактного фага связан с особенностями пространственной организации внутрифаговой ДНК, состоящей из отрицательно сверхспирализованных петлеобразных структур - доменов фиксированных на концах линкерными молекулами (У1ггапкоак1 - Са8-1;го<1ега «г а1. , 1980; 1981). отрицательная сверхспирализация

и топологическая' ограниченность доменов внутрифаговой ДНК приводит к тому, что характерный для протонированной ДНК в растворе переход двойной спирали в более скрученную форму в случае внутрифаговой ДНК будет затруднен. Поэтому наблюдаемое при протони-ровании постоянство эллиптичности положительной полосы КД-спек-тра интактного фага обусловлено в основном переходом гуанозино-вых остатков ДНК из anti- в аун-конформацию без существенного изменения параметров двойной спирали. Последнее является иллюстрацией неразрывной взаимосвязи между сверхспирализацией ДНК in situ и состоянием ее вторичной структуры.

Основываясь на выявленных нами особенностях физических и-физико-химических свойств внутрифаговой ДНК по сравнению с ДНК в растворе, а также литературных данных, нами предложена модель ¡информационного состояния ДНК in situ, согласно которой во внутрифаговой ДНК имеется два различающихся между собой типа отрицательно сверхспирализованных доменов. Один из них (1-ый тип) характеризуется наличием контактов двойной спирали с белками нуклеокапсиды фага,а другой - их отсутствием (11-ой тип). В доменах 1-го типа вторичная структура ДНК существенно неоднородна,' в ней имеются локально расплетенные участки двойной спирали в местах контакта QC-nap оснований с карбоксильными.группами Glu или Asp ,'в протяженных областях между которыми она равномерно скручена и сжата. Такое конформационное состояние возникает вследствие топологической ограниченности и замкнутости с концов доменов ДНК. При этом,чем больше QC-nap оснований вовлечено в контакт с капсидными белками, тем больше локальное расплетание двойной спирали и соответственно скручивание на остальных участках домена ДНК. В доменах II-го типа двойная спираль близка к обычной В-форме.

ВЫВОДЫ

1. Изучено изменение выживаемости ряда бактериофагов после их выдерживания в средах различной кислотности с последующей нейтрализацией и показано, что кислотная чувствительность фага увеличивается с возрастанием GC-содержания его ДНК. Установлено, что. кислотная инактивация вириона не связана с переходом двойной спирали в клубок.

2. Обнаружено, что инактивация фага при небольшом смещении рН от нейтрального значения к кислым является внутривирионным процессом и связана с необратимыми структурными изменениями ДНК, а при значительном подкислении среды - с деструкцией белковых

субъединиц фага или их комплексов, вызванной межвирионной агрегацией частиц.

3. Получены кривые потенциометрического титрования фага X интактного и разрушенного, а также свободной ДНК в растворе и проведен их сравнительный анализ. Показано, что в области кислых значений рН, при которых в этих объектах исключительно протони-руются основания ДНК, связывание протонов со свободной ДНК в растворе происходит кооперативно, в то время как с внутрифаговой -- некооперативно.

4. Измерены УФ-спектры интактного и разрушенного фага-X , а также свободной ДНК в растворе при различных кислых значениях рН. Их анализ показал, что по сравнению со свободной ДНК в растворе протонирование цитозиновых оснований в составе внутрифаговой ДНК начинается при более нейтральных значениях рН.

5. Получены КД-спектры интактного и разрушенного фага А. при различной кислотности среды. Обнаружено, что по сравнению с разрушенным фагом, КД-спектры интактного фага характеризуются постоянством эллиптичности положительной полосы при подкислении среды. Дана интерпретация этого феномена.

6. Установлен порядок протонирования различных фрагментов нуклеокапсиды фага. Найдено, что наибольшей основностью обладают фрагменты нуклеокапсиды, содержащие'блок взаимодействующих аминокислотных остатков глутаминовых и аспарагиновых кислот капсид-ных белков с QC-парами внутрифаговой ДНК.

7. Проведен сравнительный анализ кривых плавления ДНК и ее комплекса с глутаминовой кислотой, полученных при различных значениях рН, Показано, что с возрастанием кислотности среды увеличивается разность <5Тт мевду температурой плавления ДНК и ДНК в комплексе с Glu . Дано объяснение этой зависимости.

8. Исследована экстрагируемость ДНК из фагов, подвергнутых действию Н"**—ионов различной концентрации с последующей нейтрализацией среды. Из этих данных следует, что ухудшение экстрагируе-мости с ростом SC-содержания внутрифаговой ДНК и понижением рН среды связано с образованием сшивок ДНК-белок.

9. С помощью физических и биохимических методов анализа установлена рриро да сшивок ДНК-белок, возникающих при выдерживании фаговых частиц в средах с различной кислотностью и последующей нейтрализации. Показано, что небольшое смещение рН от нейтрального значения к кислым приводит к образованию нековалентных сшивок ДНК-белок с участием GC-nap ДНК и остатков Glu или Asp белков, значительное же подкисление среды - к образованию ковалент-

ных сшивок ДНК-белок типа шиффова основания между карбонильной группой открытой формы пентозы при апуриновых сайтах ДНК и лизи-Мовым остатком белка. Предложен механизм образования нековалент-ной сшивки ДНК-белок.

10. Исследованы рН-зависимости трансфецирующей активности фаговой ДНК, подвергнутой протонированию и последующей нейтрализации в системе in situ, и in vitro . Установлено, что

потеря трансфецирующей активности ДНК протонированной in situ при небольшом смещении рН от нейтральных значений к кислым связана с образованием нековалентных сшивок ДНК-<5елок, а при значительном подкислении - разрывами сахарофосфатной цепи, депури-низацией и образованием ковалентных сшивок ДНК-белок. Потеря же трансфецирующей активности ДНК при ее протонировании in vitro происходит лишь при значительном подкислении среды и связана с переходом двойной спирали в клубок. Показано, что влияние ионной силы на изменение трансфецирующей активности ДНК протонированной in situ значительно меньше, чем протонированной in vitro .

11. Предложена модель пространственной структуры внутрифа-говой ДНК, основаннай на представлении о доменной организации и неоднородности вторичной структуры ДНК.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Sukhorukov B.I., Nasirov H.G., Shabarchina L.I. Effect of compactization on structure and. function of ША upon its protonation. - Studia biophysica, 1984, v.101, pp.35-36.

2. Сухоруков Б.И. , Насиров Н.Г., Шабарчина Л.И. Необратимые изменения фаговой ДНК, возникающие при ее протонировании в растворе и в составе вириона, обнаруживаемые методом трансфекции.- Молекулярная генетика, митообиология и вирусология , 1986, т. II, с. 14-18

3. Sukhorukov B.I., Hasirov H.G., Shabarchina L.I. Irreversible changes of phage Ш1А arising upon its protonation in solution and inside the virion. - Studia biophysica, 1987, v.118, pp.87-94.

4- Насиров Н.Г., Сухоруков Б.И., Шабарчина Л.И. Петров А.И. ДНК-белковые сшивки как возможная причина повреждений ге-1991 ПтИ25Г°сП^15§|И?81§НИИ* ~ Молекулярная биология,

5 Сухоруков Б.И. Насиров Н.Г., Монтрель М.М., Гаряж В.В., Шабарчина Л.И. Исследование,.УФ- и КД-спектров фага лямбда и структуры внутрифаговой ДНК в средах с различной кислотностью. - уц Конференция по спектроскопии биополимеров, с. 238, Харьков, 1-4 октября 1991.

7.92.92 г. Зак.ЗЭЮР Тир. 125 эк». Уч.-иэд.л. 1.0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН