Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Олигонуклеотидное узнавание двунитевой ДНК

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Олигонуклеотидное узнавание двунитевой ДНК"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

НА права! рукопиои

Мальков Владислав Арнольдович ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОЕ УЗНАВАНИЕ ДЙУНИТЕВОЯ ДНК

03.00,02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной отвпени кандидата физико-математических наук

МОСКВА 1992

j>«4»*a выполет» В

'{igo^pt^f. д. im*-м^.цод**!} ; 'од^ОД до*

Счгрвтоавкмв И.Яг>\'

ВеДУЮ*! > :•'. ^F^jB^lja:. ; ^¿(«fjT ■.. ' ВДяцрим" §

pi/ ^ЛЦ ^¿ОДДООД' '.ДО > ИМ. ЛмЮЩКЮМ. '

éíwtpMtoe •* |M2r. i ^.»додаем

; Спец|И4иа1г^ок4Нн9Го . во»*та / ' f ОвЗ.МЛО - .ДО/, "'JtottÇMç*«« ' qo' ' -'ifiW*. ; ^ДОДО*

*í»'tftyTe*iifí до. , i, .

С *«ûcej>rawie» -ДОца авмакоыр-Гьоя ¿ библиотеке Московского. . »иавко-Техимчвского Института. ■ ..

Автореферат рюоолан I »Mr.

Ученая секретаре Специалиакрованного совета ■ кандидат фивчко-^танатачлскшх док

В. Б. Киреев

i. характеристика работы.

Актуальность проблемы. В последние пятнадцать лет молекулярная генетика переживает настоящий подъем. В его основе лежит "промышленная революция" в методах Исследования и работы с ДНК. Решение ряда новых задач, возникающих при ееквенировании генома человека, требует разработки принципиально новых подходов при манипулировании с ДНК. Среди них: получение еысокоспецифичннх редкощепящих рестриктаэ, физическое картирование, очистка и выделение длинных ДНК фрагментов, разработка новых агентов для химической гемотерапии.

С 1970 года, года открытия В. Арбером фериентов-рестриктаз, было найдено и налажено серийное производство огромного количества ферментов этого типа. В настоящее время работа ни одной молекулярно-генетической лаборатории уже просто не мыслится без использования рестриктаэ. Однако все эти природные ферменты обладают сравнительно небольшими сайтами узнавания. Сайт рестрикции рестриктаэ И типа, как правило, симметричный палиндром длиной от 4 до 0 пар нуклеотидов. Если считать последовательность ДНК случайной, то ясно, что рестриктаза специфичная к восьми парам оснований будет вносить один разрыв в среднем на 4°=65.5 кЬр. Очевидно, что при разрезании хромосомной ДНК возникнет большое количество фрагментов приблизительно одинаковой длины и это сильно затруднит их идентификацию. Таким образом, для ряда задач (например, для секвенирования генома человека) были бы очень полезны искусственные редкощепящие рестриктазы. Поскольку создание такого фермента на основе узнавания ДНК-белок в настоящее время выглядит крайне затруднительным, то наиболее вероятным кандидатом на эту роль представляется модифицированный олигонуклеотид. Узнавание в этом случае достигалось бы образованием специфичного комплекса, а разрезание- за счет реакционной группировки, пришитой к олигонуклеотиду, либо с использованием методики "ахилессовоП пяты". На этом пути возникает целый комплекс проблем: эффективность разрезания, .качество разрывов и специфичность узнавания. Решение вопроса специфичности, в свою очередь, невозможно без определения термодинамических и кинетических параметров.

Традиционные методы разделения и очистки ДНК лишь частично применимы для длинных двунитепнх хромосомных ДНК.

Высокоспецифичное узнавание ДНК с помощью олигонуклеотидов и здесь могло бы сыграть решающую роль.

Электронномикроскопическое картирование с помощью специфически* комплексов олигонуклеотид- дуплексная ЛНК является хорошей альтернативой современных методов физического картирорання.

В настоящее время широко обсуждается использование олигонуклвотидного узнавания для химической генотерапии. Ясно, что для этого необходимо получить модифицированный олигонуклеотид, который проникал бы в клетку, был устойчив к действию нуклеаз и образовывал бы стабильный комплекс при физиологических условиях. Это позволило бы выклпчать нежелательные гены (например, онкогены), блокировать развитие вирусов.

Итак, олигонуклеотидное узнавание двунитевоП ЛНК является на сегодняшний день одной из самых актуальных и перспективных тем в физической химии нуклеиновых кислот.

Цель настояаей работы заключается в изучении свойств межмолекулярных пиримйдин-пурин-вуринрвых триплексов, разработке методов УФ фотофутпринтинга триплекс.ов с детекцией" ■ц1исло3утэноаых фотодимеров и электронномикроскопической визуализации тройных комплексов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе ьпервые были найдены универсальные условия образования межмолекулярЬых пиримидин-пурин-пуриновых триплексов при физиологических Рн; показано, что время жизни таких тройных спиралей довольно ' велико, по крайней мере, больше нескольких часов; исследовано влияние разных типов триплексов на выход циклобутановых димеров, то есть, детально отработан вариант метода УФ фотбфутприитинга, который может' быть применен для исследования триплексов как 1 п v^:ír'o^ так и ¿о \-ivo*, обнаружен новый тип "тройных саирадей- проТонированныЙ

пиримидин-пурин-пуриновый трлплек'с; разработан универсальный метод электронно- микроскопической визуализации тройных комплексов между олигонуклеотидом и плаэмидной ДНК. Практически одновременно с другими авторами' было показано, что пиримидин-пурин-нуриновые триплексы имеют лишь антипараллельную полярность нитей (по отношению к пуриновой нити дуплекса). Также была открыта новая неканоническая структура из семейства 11 форм,

содержащая нротонированннй пиримидин-лурин-пуриновый триплекс. Апробация. Материалы работы докладывались на международных конференциях "Synthetic Ol igonucleotides: Problems алс1 Frontière оГ PriicLicnl Application", Москва (Июнь 1991 г. ) ; "7th Conveг«г» t i oris on ïiiото 1 ecu 1 ar S t e reod yrmm i es " , Albany (ИЮНЬ

1991 r. ) ; Второй Всесоюзной Конференции "Геной Человека--91 ", Переславль-ЗалесскиП (Октябрь 1991r.)i "DNA Structure and Proteln i ion", Miidriii (Март 1992г.); студенческих конференциях МФТИ 1 990г., 19911-., 1 992г.; а также на семинарах Отдела Экспрессии Генома ИМГ РАН.

Публикации. Но теме диссертации имеется 7 публикаций и еще 3 статьи посланы в печать.

Материалы н методы. В данной работе был использован целый ряд различных подходов. Среди них: комиграция меченных олнгонуклеотидов с плазмидной ДНК при гель-электрофорезе, фотофутнринтимг с регистрацией 16-41 и циклобутановых фотоднмеров, химическое зондирование и другие.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Данная работа посвящена олигонуклеотидному узнаванию двунитевой ДНК, а именно, условиям образования стабильных комплексов, специфичности узнавания и проблемам его применения.

Первая глава работы является обзором литературы, затрагивающей эту тему.

Глава I. Литературный обзор.

Существуют два основных типа триплексного узнавания: Ру-Ри-Ру и Ру-Ри-Ри. Структура, свойства, условия образования и возможные применения Ру-Ри-Ру тройных спиралей интенсивно изучались с конца ВО1 годов. Триплексы этого типа возникают между произвольной гомонурин- гомопиримидиновой последовательностью и соответствующим пиримидиновим олигонуклеотицом, причем, пиримидиноные нити антипараллольны друг другу. В основе Ру-Ри-Ру триплексов лежат канонические тлт и сне* триады (Рис.1). Триада сас' содержит протон при N3 атоме цитозина, который участвует в Хугстиповском спаривании с N7 атомом гуанина. Вообще, протонирование одиночного цитозина происходит с рк 4.2. В Хугстиновской паре водород оказывается сразу связанным о двумя атомами азота, что энергетически значительно более выгодно или, другими словами, рК Хугстиновской пары много выше, чем рк свободного цитозина. И действительно, рк триады сос* лежит между

.-ск ..-••Л

С С

н I

сн, Г У-»

- 4 ?

ЛАТ

сн.

Г '

т А Т

и н

Л+ О С

Рис.1 Схемы триад. Верхний ряд: изоморфные канонические триады Т**т и сс»с*, лежащие в основе внутри- и ыежмолекулярных Ру-Ри-Гу триплекоов; средний ряд: близкие к изоморфным канонические триады ?л*А и сс»а, лежащие в основе внутри- и ыежмолекулярных Ру-Ри-Ри тройных спиралей; нижний ряд: триады ТА»т и ее***, участвующие в образовании Ру-Ри-Ри триплекоов. Триады сй»с* и ссодержат протонированные по НЗ цитозин и по N1 аденин соответственно.

7 и 8. В результате возникает сильная • рН зависимость от нейтральных рИ до рк порядка рК свободного литозина.

Внутримолекулярный Ру-Ри-Ру триплекс (Н форма) возникает в гомопурин-гомопиримидиновых зеркальных палиндромах под действием сверхспирального напряжения и/или низких рН. В Н форме, пиримидиновая нить образует Ру-Ри-Ру триплекс о половиной пуриновой нити, причем другая половина пурииовой нити остается не структурированной.

Теория рН зависимого структурного перехода дает изменение свободной энергии при связывании олигонуклеотида с образованием тройной спирали:

АКгАР^НТМ/гПп! (1 + 10рК1г~рН)/(1 + 10рК<!~рН)|

где ДР,- свободная энергия образования триплекса со всеми не протонированными триадами, г- число оснований, приходящихся на один цитозин, рК1г=<7-8 , рКе=<4.3.

Из этой формулы следует, что в основной области рк.<рн<рк4г свободная энергия очень сильно изменяется в зависимости от рН. Поскольку кинетика прямой реакции практически рн не зависима, то вся зависимость лежит на кинетике развала комплекса:

Т1г=То 10"К Р,,/г где N длина олигонуклеотида.

Это чрезвычайно крутая зависимость: для олигонуклеотида, содержащего 10 цитозинов, эта формула дает изменение времени жизни в 10 раз при изменении рН всего на 0.1.

В областях рН>рК1 и рн<рк зависимость выходит на насыщение и ли перестает зависеть от рН.

Внутримолекулярный Ру-Ри-Ри триплекс (н'форма) возникает под действием отрицательной сверхспирализации и ионов двухвалентных металлов, являясь рН не зависимым. В н* форме, пуриновая нить образует Ру-Ри-Ри триплекс с половиной пиримидиновой нити, причем другая половина пиримидиновой нити остается не структурированной.

Межмолекулярные Ру-Ри-Ри триплексы в настоящее время исследованы в несколько меньшей степени. В ряде работ было показано образование тройных спиралей с образованием триад ТА*А и/или сс»о. Ранее наличие такого типа спаривания было найдено при расшифровке структуры тРНК. Предполагаемая структура . триад приведена на Рис. 1. Как и для Ру-Ри-Ру случая триады ТА*А и со»о удовлетворяют принципу винтовой симметрии. Легко видеть, что обе триады не содержат протонированных или депротонированных элементов и поэтому образование канонических Ру-Ри-Ри триплексов

lie зависит от pfl. Однако, хотя пурины третьей нити образуют по две полноценных водородных связи, оказывается, что Py-Pu-Pu триплексы не образуются в отсутствии двухвалентных катионов.

Несмотря на наличие нескольких примеров межмолекулярных Ру-Ри-Ги триплексов, до наших исследований не били известны условия, при которых при нейтральных рН происходит специфическое "узнавание" произвольной гомопурин- гомопиримидиновой последовательности. Не выяспенным оставался также вопрос о направлении третьей нити.

Глава 2. Влияние различных двухвалентных ионов металлов на стабильность Гу-Гч-Ги триплексов

Первый раздел посвяцен материалам и методам, использованным в главе.

Второй раздел главы содержит данные о влиянии двухвалентных металлов на образование ме'жмолекулярныт тройных спиралей dC df) do И d(CT) d( AG) d(C,A) .

п n n n n n

Для регистрации образования этих тройных спиралей были использованы методы DMS и фотофутпринтинга, а также комиграция олигонуклеотида с плазмидной ДНК при гель-электрофорезе.

На Рис.2 представлен один из экспериментов по комиграиии меченных олигонуклеотидов с плазмидной ДНК. В условиях, когда образуется стабильный комплекс, меченный пиримидиновый слигонуклеотид движется при гель-электрофорезе вместе с плазмидной ДНК. Понятно, что при такой постановке эксперимента можно наблюдать только высокостабильные комплексы, у которых время жизни больше времени комиграции, так как после диссоциации олигонуклеотид уходит вперед и комплекс не может ренатурировать.

Правая панель Рис.2- фотография прокрашенных бромистым этидием агарозных гелей, демонстрирующая положение линеаризованных плазмид; левая панель- радиоавтограф того же геля, показывающая положение меченных олигонуклеотидов. Гель-электрофорез проводили сверху вниз. Не связавшиеся олигонуклеотиды за время фореза прошли весь гель и не попали в радиоавтограф, олигонуклеотиды же в комплексе с плазмидной ДНК выглядят как полосы на автографе на уровне линеаризованных плазмид.

Рис.2 демонстрирует образование высокостабильных триплексов dC da dG И d(CT) d(AG) d(CA) В ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ Mn** (ДороЖКИ

n i> n n ft n

Таблица 1. Образование межмолекулярных Гу-Ри-Ги триплексов в присутствии различных двухвалентных катионов.

Катион <НС) <1(С) <1(0 п п п (ИСТ) «НАС) <1(СА) п п п

Ва3* - -

Са3* + -

не3* + -

С<13* + +

Со3* + +

Мп3' +

гп3* + +

N43 * + +

"к14 - -

боэ Ив'* - -

р031 рТСЗЗ рЛ56 1 2 3 4 5 6 1

2 3 4 5 6

45vJF.il

1«! ' .и Ли' 1 ' ' Л'"- ' * - '.Г.' V »:г' -Я

'•-С-..--. V^

V -> = ' " > - ;<> . ,1 'дм . л":. *ЧАГ¡а

гкгу

¡¡ылшп

Рис.2 Комиграция меченых олигонуклеотидов о соответствующими плазмидами при нейтральных рН, в присутствии ионов Мп1* . Справа: прокрашенный бромистым этидием гель, слева: радиоавтограф того же гелп.

1, 3). Отсутствие связывания пиримидиновых- олигонуклеотидов <tci0 (дорожка 2) и d(CT)6 (дорожка 4) с плазмидами, несущими вставки dc,.da и d(ct) d(ag) „ соответственно, не удивительно, так как

3131 1 • 14

инкубация и гель-электрофорез проводились при нейтральных рн, а триплексы с участием этих олигонуклеотидов образуются при умеренно кислых рн. Триплексы dTndAndTn и dTftdAndAn хотя и регистрировались ранее в похожих ионых условиях, но, по всей видимости, малостабильны и диссоциируют за время гель-электрофореза и поэтому не регистрируются методом комиграции (дорожки 5,б).Аналогичная картина связывания была получена в присутствии ионов cd3* , Со3* и Zn *.

В присутствии ионов Са3* и Mg3* наблюдалась комиграция только меченногр олигонуклеотида dG10 с плазмидной ДНК pG3i. Тройная спираль d(CT)nd(AO) d(GA)n в этих условиях не наблюдается.

В таблице 1 собраны все данные, полученные dms и фотофутпринтингом, по влиянию двухвалентных металлов на образование межмолекулярных тройных спиралей. Мы показали, что тройная спираль d(c)nd(G)nd(G)n стабильна в присутствии Са3*, Me1*, cd3* , Со3*, Мп3*, Zn3* и Ni3*, но не Ва3* или Hg3+; тройная спираль же d(TC)nd(GA)nd(AG)n образуется в присутствии Cd3*, Со3* , Мг>3*, Zna* И Ni3*, НО не Ва3*, Са2* , Mg2* ИЛИ Hg3* .

Третий раздел первой главы посвящен изучению зависимости образования межмолекулярного Py-Pu-Pu триплекса между пуриновым олигонуклеотидом и зеркально-симметричной гомопурин-гомопириииди-новой последовательностью от различных двухвалентных катионов.

Наличие целого ряда катионов (Cda* , Со3* , Мп3*, Zn3* и Ni3*), стабилизирующих как dc dG da , так И d(CT) d (AG) d(GA)

Ann II n n

позволяло надеяться, что в присутствии ионов этих металлов будут стабильны Py-Pu-Pu триплексы для произвольных последовательностей. Для того чтобы убедиться в атом, была взята плазмида, содержащая нерегулярный гомопурин-гомопиримидиновыя зеркальный палиндром S'-aagggagaaaggggtataggggaaagagggaa-s1, и синтезирован к ней пуриновый олигоиуклеотид S'-dGAGaaagggg.

Рис.3 демонстрирует данные dms футпринтинга по образовании тройного Py-Pu-Pu комплекса. В присутствии Mg3* картина модификации однородна вдоль всей последовательности и одинакова, как без олигонуклеотида (дороаска 1), так и в присутствии олигонуклеотида (дорожка 2).

5' 3'

3'

G* С* С.

С»

А о Ло Ао С» Ао С»

3' 5'

Mg*Mn* Zn*

oligo: -+-+-+

1 23456 ........-"""wp

Рис.3 dms зондирование межмо-..... лекулярного Py-Pu-Pu триплекса между олигонуклеотидом " dGAGAAAGGGG И зеркалЬНОСИМ-метричным гомопурин-гомопири-мидиновым участком при нейтральных рН в присутствии ионов двухвалентных металлов. Квадратной скобкой отмечен участок, отвечающий параллельной ориентации пуриновых' нитей в триплексе, а на схеме изображена образующаяся тройная спирзль с антипараллельной полярностью нитей. Преинкубация и модификация проводились при ÍO°C В 25mH Tris рН7.0, 25тМ NaCl, ЮгаМ MgSO^ (дорожки 1,2); 25тМ Tris рН7.0, 25тМ NaCl, ЮтМ MnAc (ДОрОЖКИ 3,4); 25тМ Tris рН6.5, 50гаМ NaCL, ЮтМ ZnSO (дорожки б.С).

В буфере, содержащей ионы Мп3*, происходит образование межмолекулярного Ру-Ри-Ри триплеса и наблюдается четкая защита гуанинов в сайте, соответствующем антипараллельному (относительно пуриновой нити дуплекса) связыванию (дорожка 4). В сайте, соответствующем параллельному связыванию, реакционная способность гуанинов не меняется при добавлении в раствор олигонуклеотида, что свидетельствует о невозможности параллельных Ру-Ри-Ри триплексов. Интересно, что наряду с защитой от метилирования рмб под тройной спиралью наблюдается усиление модификации у 3' фланкирующего гуанина дуплекса, непосредственно примыкающего к триплексной области. Это обстоятельство, по-видимому, объясняется сильным возмущением на границе дуплекс-триплекс.

В присутствии ионов гп2* защита от метилирования рмб выражена несколько слабее (дорожка 6). Однако, по усилению 3' фланкирующего гуанина, как и в случае нпа* (дорожка 4), можно с уверенностью говорить об образовании тройной спирали. Неполный характер РИй защиты, по-видимому, можно отнести не к частичному комплексообразованию, а скорее к разрушению диметилсульфатом триплекса, до модификации присутствовавшего почти во всех молекулах вставки. Аналогично случаю с Мпа*, в присутствии ионов гп не регистрируется параллельный Ру-Ри-Ри триплекс.

Третий раздел главы посвящен исследованию Ру-Ри-Ри триплекса между 5'-¿ассассасоаса и гомопурин-гомопиримидиновым аааоаааоаоаа участком вируса папилломы человека (нру-16).

Как и в предыдущих случаях, когда триады сс*в чередуются с триадами та*а, в присутствии ионов Мй * тройная спираль не образуется (данные не приведены).

Для многих практически важных случаев часто бывает нужно понизить константу связывания олигонуклеотида со своим сайтом. Такая проблема, например, возникает когда нужно повысить специфичность связывания. В случае Ру-Ри-Ру триплексов эта задача обычно решается путем повышения рН раствора. Для Ру-Ри-Ри тройной спирали оказалось, что стабильность триплекса можно варьировать с помощью изменения ионной силы.

Рис. 4 показывает, что при уменьшении концентрации Мп24 (в присутствии БОтМ На*) происходит значительное падение стабильности тройного комплекса. В присутствии Зтм или 1тМ Мп3* (дорожки 2,3) наблюдается лишь частичная защита от метилирования диметилсульфатом.

В' 3

G С

А T

С G

А T

G С

С G

T A

3 С G

До А T

С* G С

Ао А T

С* G с

С» G с

АО А T

G» G с

G» G с

Ао А T

С* G с

G* G с

Ао A T

5' T G А с

A т

A т

A т

T А

A т

G с

A т

T А

G С

G С

3- 0

oligo: -444 - + 4 + 1234 5678

нн

..____г- Г»" 1—Т

Рис.4 í)ms футпринтинг PytPu-Pu тройной спирали между олигонуклоотидои dAGGAGOAGGAGA И ГОМОПУрИН-ГОМОПИрИМИДИНОВЫМ участком вируса папилломы человека HPV-16 при нейтральных pli в присутствии ионов Ип * при различных ионных условиях: ЗОюМ Tria рН7, 1шН МпАс, 50шМ NaCl (Дорожки 1,2)! ЗОиМ Tris рН7, ЗтМ ИпАс, 50тМ NaCl (дорожка 3); ЗОтМ Tria рН7, ЮтМ НпАс, бОшМ . NaCl (дорожки 4-0); ЗОшМ Tris рН7, ЮтМ МпАс, ЮОюМ NaCl (Дорожка 7); ЗОтМ Trie рН7, ЮтМ МпАс, 200mM NaCl (дорожка 8).

На Рио. 4 также представлены данные по влиянию различной ионной силы no Na* при фиксированной концентрации 10шМ Мп3*. Легко видеть, что при 200mrt' Na* (дорожка 8) происходит линь небольшое уменьшение доли триплексов.

Заметим, что для этой системы, как и для системы с зеркальным паллиндромом, наблюдалась лишь антипараллельная (относительно пуриновой нити дуплекса) полярность третьей нити. Действительно, олигонуклеотид был синтезирован исходя из антипараллельной укладки, и хотя его последовательность квазисимметрична, но в случае триплекса с другой, взаимнопараллельной, ориентацией пуриновых цепей наблюдалась бы лишь частичная защита гуанинов на з' и/или 5' концах вставки. Рио. 4 демонстрирует почти полную защиту на протяжении всего гомопурин- гомопиримидинового участка, что однозначно свидетельствует об антипараллельной полярности.

Рассмотрим вопрос о влиянии различных ионов двухвалентных металлов на стабильность Py-Pu-Pu триплексов. Рис.2-4 и таблица 1 показывают, что хотя стабильный Py-Pu-Pu триплекс только с триадами cg*o образуется в присутствии Mg3* или Са3* , но для всех остальных последовательностей, содержащих как триады cg*g, так и та»а, ионы щелочноземельных металлов не стабилизируют образование тройных комплексов. В то же время в буфере, содержащем один из ионов переходных металлов (Мп3*, Zn3* , Cd3* , Со3* и Ni3*), происходит связывание всех изучаемых пуриновых олигонуклеотидов со своими последовательностями. Таким образом, наличие в растворе одного из ионов: Cd'* , Со2*, Мп3*, Zn3* или Ni3* является универсальным условием для образования стабильного Py-Pu-Pu триплекса.

На сегодняшний день не существует прямых структурных данных о Py-Pu-Pu триплексах и о сайтах связывания в них различных двухвалентных катионов. Можно лишь сделать общие предположения, почему наблюдается именно такая зависимость от двухвалентных катионов. Разумно предположить, что для ионов Ва3* и Hg3* лимитирующим 'является большой размер, что не позволяет им встраиваться в тройную спираль. То обстоятельство, что именно poly dc poly da poly do образуется в Солее широком диапазоне

haft

условий не вызывает большого удивления, так как хорошо известно, что для гзмополинерной последовательности структурные ограничения часто бывают ослаблены. Вероятно, poly dc^ poly da^ poly dGn

существует в двух подконформациях: одну из которых принимает

Ру-Ри-Ри триплекс с чередующимися са*с и та*а триадами (в

присутствии са", Со2*, мп3>, гп2* или ых3* ), а другая (в

присутствии М8 * или Са2*) не стабильна для смешанного случая о

триадами сс*0 и та*а. Причины в отличном от других двухвалентных 2 + 2 ♦

ионов поведении Са им«, по всей видимости, нужно искать в их более предпочтительном связывании с фосфатами, в то время как ионы переходных металлов преимущественно связываются с основаниями, в основном с N7 пуринов.

Глава 3. Влияние образования межмолекулярных Ру-Ри-Ру и Py-Pu-Pu триплекоов на выход циклобутановых фотодимеров в ДНК.

При облучении ДНК ультрафиолетовым светом 240-300 пго в ней образуется большое количество разнообразных фотопродуктов. Наибольший квантовый выход в двунитевой ДНК имеют реакции фотодимеризации соседних нуклоотидов, хотя возможны фотореакции и с отдельными нуклеотидами, например, образование фотогидратов.

Среди фотодимеров при небольших дозах в двунитевой ДНК преобладают циклобутановые димеры. Эти димеры могут образовываться между любыми соседними пиримидинами тт, тс, ст, ее. Квантовый выход 1G-4I димеров при небольших дозах значительно меньше, чем для димеров циклобутанового типа. Кроме того в двойной спирали димеры этого типа образуются лишь между 5' тс 3', СС и много хуже между тт.

Метод УФ футпринтинга триплексов выгодно отличается от аналогичных с применением однонитевых малоспецифичных эндонуклеаэ тем, что работает в широком диапазоне внешних условий таких как рН, ионная сила, наличие двухвалентных катионов и других, и поэтому является удобным средством для изучения тройных спиралей in vitro и in vivo. Преимущества использования слежения за циклобутановыми димерами по сравнению с 16-4) димерами очевидны: значительно более высокий квантовый выход, простота, а также можно следить за выходом любых пиримидиновых димеров, а не только тс и сс.

Первый раздел посвящен материалам и методам, использованным в главе.

Второй раздел главы содержит данные о влиянии Py-Pu-Py триплекса d(CT) d(GA) d(CT) на выход циклобутановых димеров. Рис.5 демонстрирует УФ фотофутпринтинг триплекса между меченным фрагментом, содержащим две вставки d(CT)ied(AG)ia, и олигонуклоотидами d(CT)0 (Рис.5а) ИЛИ d(AG)B (Рис.бв).

иг* 2* г* 2*

Нз и со нп гп щ

й(Ю)5: - ♦ - ^ ,

1 2 3 4 5 У 7 8 9 101П?

РН 4.5 6,5 12 3 4

сКСТ^ -

мв

Рис. В УФ фотофутпринтинг тройных спиралей между <1(СТ) 6<](Аа) и олигонуклеотидаыи а(ст)6 (левая панель) и а(Аа)б (правая панель) с использованием циклобутановых димеров. Ру-Ри-Ру триплекс изучался при кислых рН в присутствии 150вМ Ка*. а Ру-Ри-Ри - при нейтральных Рн в присутствии 7-10 юМ ионов двухвалентных металлов.

В отсутствие олигонуклеотида при рн 4.5 (дорожка 1 ) и рн 6.5 (дорожка 3) наблюдается выход димеров характерный для в-формы ДНК. В присутствии олигонуклеотида <мст)8 при рН е.5, как известно триплекс не образуется, ДНК находится в в-форме и выход фотодимеров тот же (дорожка 4). Любопытно, что на денатурирующем форезе образуется "дублет", в котором нижняя более интенсивная полоса соответствует димеру тс, а верхняя менее интенсивная димеру ст (дорожки 1,2,4) При рн 4.5 в присутствии 150тМ ма* олигонуклеотид а(ст)б связывается со вставкой а(ст)п<1(АО)п с образованием тройной спирали. Это сопровождается практически полным ингибированием выхода . димеров (дорожка 2). Уменьшение интенсивности не может быть приписано влиянию олигонуклеотидов на УФ эндонуклеазу, так как интенсивность полос вне вставок <1 (тс)(аас.)( (дорожка 2) равна интенсивности этих же димеров в в-форме (дорожки 1,2,4). Кроме того на дорожке 4 тоже тогда должно было бы быть падение интенсивности полос, чего не наблюдается.

Такая же полная защита от выхода циклобутановых фотодимеров была продемонстрирована и в случае дополнительной стабилизации <Нст) с!(сл) а(ст) триплекса с помощью мg2* или гп3* при рнб.о.

п п п

Неожиданной оказалась картина выхода циклобутановых димеров под ¿(топ<}(АС)пс1(АО)птриплексом (Рис.бв). Никакого ингибирования фотореактивности но наблюдается и в помине; при небольшом падении выхода тс димеров обнаруживается значительное повышение выхода ст димеров! Внешне это проявляется как "инверсия полос" в "дублетах".

Как нами было показано в главе 2, триплекс между сКтс)1ва(АО)1(5 и а(АС)в стабилизируется рядом двухвалентных металлов са3* , Со2*, мп3* , ш3* или гп2*, но не Мя2*. Рис.53 показывает, что для всех этих случаев наблюдается эффект "инверсии полос": для са3* (дорожки 3,4), Со2* (дорожки 5,8), Нп3* (дорожки 7,8), гп3* (дорожки 9,10), Ш3* (дорожки 11,12). В присутствии Мй * картина не зависит от того добавлен олигонуклеотид или нет. Это свидетельствует об 'отсутствии триплекса с1(тс) с1{ас> а(ла) в присутствии мв3*.

п п п

Следует заметить, что так же как и для Ру-Ри-Ру случая, аффект "инверсии полос" не может быть отнесен к изменению специфичности УФ эндонуклеазы под действием олигонуклеотида <1 (аа) , так как подобный эффект наблюдался бы и в присутствии Мя2* (Рис.йв, дорожка 2).

TES duplex

TES duplex»dGt

duplex

duplextdG

Co" duplex

Co" duplextdG

Zn duplex

Zn" duplex«dGi(

tuJ^n

jlA

П_.-.J

r tticitciuiutaaataxieKcacvita c

Рис.6 Денситограмма радиоавтографа геля с экспериментом по УФ фотофутпринтингу с использованием циклобутановых димеров триплекса между и оли-

гонуклеотидом <Н*,0 в присутствии различных ионов двухвалентных металлов.

Четвертый раздел главы содержит данные о влиянии тройной спирали между вставкой <Нс)1ва(с)1в и олигонуклеотидом а(а)>0. В этой главе было исследовано влияние этого триплекса на выход циклобутановых димеров, а также образование этого триплекса в присутствии различных двухвалентных металлов.

Денситограмма (Рис.6) показывает, что наблюдается удивительное явление. В дуплексе С,(с)1вй(°)1» в отсутствии олигонуклеотида без двухвалентных металлов, в присутствии Мя1* наблюдается нормальный выход циклобутановых фотодимеров. При наличии же в растворе Со1* или гп1* выход циклобутановых фотодимеров резко падает! Такое же падение фотодимеризации в двунитевой ДНК в <Ис>,в<Н°)1в наблюдалось в присутствии. Ва1* , Мп2+ , Cd1* или ги1*. Имеющиеся данные свидетельствуют о переходе вставки <1(°)1в<1(С)1в в присутствии двухвалентных катионов в другую конформацию.

В присутствии Са2* и Mg2* , для которых фотореактивность дуплекса не отличается от фотореактивности В-форны, олигонуклеотид образует тройной комплекс, но не наблюдается защиты от образования циклобутановых димеров, напротив, выход циклобутановых димеров под триплексом d(o)led(c)le+d(G)lo даже несколько больле, чем для в формы.

Циклобутановые димеры отлично позволяют регистрировать триплекс в присутствии Со2* или Zn2* (Рис.6), а также cd2*, Мп2* или Ni2* (данные не приведены). В их присутствии образование триплекса ведет к "антифутпринтингу": в триплексе образуются циклобутановые димеры, а без него практически нет. Обращает внимание "тонкая структура" триплекса: по длине тракта d(с) ed(G) л наблюдается сильные колебания выхода циклобутановых димеров. Этот эффект является несколько неожиданным, так как последовательность- гомополимер.

Глава 4> Внутри- и межмолекулярные протонированные fy-Pu-Pu тройные спирали.

В отличие от предыдущих двух глав, посвященных изучению "канонических" Py-Pu-Pu триплексов с триадами cg*g и та«а (Рис-1 ) при нейтральных рМ, в этой главе продемонстрировано рН зависимое образование Py-Pu-Pu тройной спирали о триадами cg*g и cg»a*.

Первый раздел главы посвящен межмолекулярному протонированному триплексу.

В качестве объекта исследования била взята плаэмида со вставкой <hc>ied(g)ie и олигопуклеотид d(AG)8 • В буфере 200nM Na* рН4.о при отсутствии двухвалентных катионов была обнаружена практически полная защита от модификации диметилсульфатои. Триплекс является рН зависимым и уже при рН4.в не удалось зарегистрировать образование комплекса.

Как и для традиционного межмолекулярного Ру-Ри-Ру триплекса двухвалентные катионы дополнительно стабилизируют тройную спираль и позволяют получить стабильный комплекс при более высоких рН. Так в присутствии Mg2* стабильный триплекс наблюдается при рН4.0 и рН4.5, при рН5.о видна лишь частичная защита, а при pHS.S триплекс не регистрируется. Ионы Zna* еще сильней продвигают стабильность тройной спирали в нейтральную область. Полная защита наблюдается и при рН5.0.

Таким образом, обнаружено рН зависимое связывание олигонуклеотида d(ag)в со вставкой d(c)jed(a)ie. Единственным элементом, который может быть протонирован при таких значениях

рН, является N1 атом адекипа. А значит, возможно только одно объяснение: обращуетоя новая протрнированная структура с чередующимися cqg и сса* триадами. .Модели изоморфных триад в тройной спирали (Ри.о. 1Г отвечают аит.йпараллельному случаю (относительно пуриновой W-C нити), когда все основания находятся в anti конформаиий.

Во второй разделе четвертой главы говорится о внутримолекулярном прогонированном Py-Pu-Pu триплексе.

Поскольку третья d( ас ) нить в протонированном триплексе, вероятней всего, антипараллельна пуриновой нити дуплекса, было разумно попытаться обнаружить н-ДНК подобную структуру во вставке б1 -(g) ttaa(ag), в сверхспиральной плазмиде при кислых рН. Чтобы

10 - о

проверить эту гипотезу, Олегом Волошиным была сконструирована такая плазыида и исследована с помощью химического зондировання.

Данные химической модификации однозначно продемонстрировали образование структуры, изображенной на Рис.7. - Ее главным элементом является протонировашшй py-j'u-pu триплекс с триадами cg*g и cg«a* (Рис.1). Данная структура также содержит деструктурированную (cti^ttaa.

з' —CCCCCCCCCC-fl

5'—GGGGGGGGGG-T-Tft «+•+»+■+•+ J

У-GnGnGnGftGft п п

7

/-стстстстст—т

3' 5'

Рис.7 Схема неканонической Н-подобной структуры, возникающей под действием отрицательной сверхспиралнзации при кислых рН в отсутствие ионов двухвалентных металлов. В основе этой формы лежат триады сою и изоморфные им протонированные триады сс»л*.

Снятие ограничения на полную зеркальность гомолурин-гомопиримидиновой последовательности ведет к значительному повышению вероятности встречаемости таких вставок. Однако, для возникновения внутримолекулярного протонированного Ру-Ри-Ри триплекса требуется достаточно сильное искажение зеркальности

паллиндрома, поскольку в противном случав будет наблюдаться II форма с мисметчами.

Как было показано в главах 2 и 3, в отсутствии двухвалентных катионов не образуются ни

poly dC poly (10 poly do , ни

n П n

poly d(CT)n poly а(ло)п poly d(GA)n. Напротив, в отсутствии двухвалентных катионов мы видим при кислых рН образование стабильного комплекса между dC)(jdOle и d(A0)g. То есть, триплекс с половиной неканонических триад со*а* при кислых рН много стабильнее правильного триплекса. То же самое правильно и для внутримолекулярного случая: никому не удавалось зарегистрировать возникновение н* структуры в отсутствии двухвалентных катионов, внутримолекулярный протонированний ру-ри-ри триплекс с половиной неканонических триад со*а' успешно образуется при рН 4.0. Это обстоятельство и позволяет говорить о иротониропанном Py-Pu-Pu триплексе, а не о просто мисметче в тройной спирали.

Глав 5. Визуализация межмолекулярпых Гу-Ри-Ру и Гу-Pii-Fu триплексов с помощь» электронной микроскопии.

С помощью метода dus защиты были найдены условия образования межмолекулярных триплексов между олигонуклеотидами dTCTCCTCcTt'CTCCTTT (для Ру-Ри-Ру триплекса) или (Iaggaggaggaga и аналогичным олигонуклеотидом с адвнинами, замененными на тимини dTGGTGOTGGTGT (для Ру-Ри-Ри триплекса), и соответствующий гомопурин-гоыопиримидиновым участком вируса папилломы человека hpv-16. На Рис.8 приведены данные по Py-Pu-Pu тройным спиралям. В присутствии Мп2* , 7.п**, но не Mg2* при нейтральных значениях рИ оба олигонуклеотида: dAGGAGGAGGAGA И dTGGTGGTGGTGT образуют стабильный комплекс. Как и в главе 2, в этом случае наблюдается триплокс с антипараллельной полярностью пуриновых нитей. Интересно, что использование в олигонуклеотиде тиминов вместо аденинов не приводит к дестабилизации триплекса. Разумно предположить, что спаривание тимина с аденином в Py-Pu-Pu происходит, как изображено на Рис.1. Различие та*т триад для Ру-Ри-Ру и Ру-Ри-Ри триплексов связано с противоположной полярностью нитей для тройных спиралей разных типов.

Для электронномикроскопической визуализации межмолекулярпых комплексов дуплексная ДНК-олигонуклеотид был разработан универсальный метод. Метод состоит в использовании биотинилиропанного олигонуклеотида и стрептавидина » качсстпе электрониоплотной метки. Олигонуклеотид образует специфический

3* 6'

м|+ Мп+

оН£о: -12-12-12

123456789 -'

oligo 1: X:

о^о 2: Х=

;Т

Рис.8 омб футпри-нтинг межмолекуЛЯРНОГО Ру-Ри-Ри

триплекса между олигонуклеотидами

I: ¿деСАССАССАал,

2: атсстсатсстст и участком вируса НРУ-16. 3' внизу. Дорожки 1 , 4, 7 контроль без оли-гонуклеотида (-); дорожки 2, 5, в эксперименты с олигонуклеотидом 1 ; дорожки 3, 6, 9-о олигонуклеотидом 2. Модификация проводилась в 40ц1 буфера ЗОюМ Тг1в-НС1, рН7.0, 50 тМ МаС1 И ЮгоМ МйЭО^

(дорожки I-3), 1ОшМ МпАее^Ъе (дорожки 4-6), 1 ОгаМ гпБ04

(дорожки 7-9) в течении Зш1п. О.25% РМБ.

35

W

V

X О) 30

a

25

20

о

1 15

Е 3 10

с

ф р 5

F 0

-l^.-l-. I-

1/1 0) X Ш

a E 8

a) л E з с Ф

E

35 ■ 30 ^ 25 j

20 j

i

15 1 10 j 5 ,

0 I i

509 1000 1500 2000 2500

Length, bp

- I-П II Ц Л. М-rl-1 fc jfliJ

0 500 1000 1500 2000 2500

Length, bp

Рис.9 Гистограмм» распределения мест связывания молекул стрептавидина вдоль молекул ДНК плаэмиды рРК1 б/ЕсоЩ: Слева-Ру-Ри-Ру триплекс, 84 молекулы плазмидной ДНК; Справа- Ру-Ри-Ри триплекс, 77 молекул плазмидной ДНК. Ось У обозначает количество связанных молекул белка через 0.5х длины молекулы плазмидной ДНК. Положение гомопурин- гомопиримидинового блока 120-137 пар нуклеотидов. Положении центра пика для Ру-Ри-Ру -"119 пар нуклеотидов, для Ру-Ри-Ри - 128 пар нуклеотидов, суммарная ошибка в определении положении гомопурин-гомопиримидинового участка (С учетом размера молекул стрептавидина) около 1в пар нуклеотидов.

комплекс, стрептавидин прочно связывается о биотипом и, таким образом, по месту нахождения молекул стрептавидина, размер которых достаточен для наблюдения в электронный микроскоп, можно судить о местах связывания олигонуклеотидов с двунитевой ДНК.

На Рис.9 представлены гистограммы распределения меот связывания стрептавидина вдоль плазмидной ДНК для случаев Ру-Ри-Ри и Ру-Ри-Ру триплексов. Из гистограмм следует, что в условиях существования стабильных триплексов происходит образование специфических стабильных комплексов, регистрируемых электронномикроскопически в виде связанной с ДНК молекулы стрептавидина. Положение пика на гистограмме связывания (110 нуклеотидов) в пределах ошибки измерения, составляющей около 1В пар нуклеотидов, относительно ближайшего конца молекулы ДНК, совпадает с положением гомопурин-гомопиримидинового блока (120-137 нуклеотидов). Из этих данных мы делаем вывод, что регистрируемые комплексы- это суть триплексные структуры.

Суммарная эффективность специфического взаимодействия стрептавидина с ДИК в наших условиях составляла 70-80%. Специфическое взаимодействие' стрептавидина со связанным с ДИК олигонуклеотидом сопровождается образованием некоторого количества неспеиифических комплексов. По нашим оценкам эффективность специфического комплексообразования превышает

5

неспецифическое примерно в 10 раз.

Таким образом, Ру-Ри-Ру И Ру-Ри-Ри триплексы могут быть использованы для задач физического картирования геномов, в том числе, и методами электронной микроскопии. При этом возможно картировать уникальные короткие пуриноиые или пиримидиновые последовательности, либо использовать триплексы в качестве маркеров, например, для однозначной идентификации концов молекул ДНК.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВПВОДЫ ДИССЕРТАЦИИ

1. Методами фотофутпринтинга с детектированием цикло- и 16-41 фотодииеров, а также иМБ зондирования и комиграцией при гель-электрофорезе показана возможность образования стабильных межмолекулярных пиримидин-пурин-пуриновых триплексов при нейтральных значениях рн в присутствии катионов двухвалентных металлов. Стабилизация триплекса «а{ст)м<з(аи)(АОнаблюдается в присутствии са24 , Со34, Мп24 , гп24 и м14 , но не м«24 и са14 : в то же время стабилизация триплекса ас <ю ао происходит в присутствии всех вышеперечисленных катионов. Для нерегулярной гомопурин-гомопиримидиновой последовательности продемонстрировано образование межмолекулярного Ру-Ри-Ри триплекса в присутствии Мп24 или гп24, но не не14 , причем нить олигонуклеотида антипараллельна пуриновой нити дуплекса.

2. На участке природной ДНК вируса человеческой папилломы (нру-16) продемонстрировано образование межмолекулярного антипараллельного Ру-Ри-Ри триплекса в присутствии Мп14 или гп24 , но но мв24 с участием триад со*а, та*а или сс*а, та*т.

3. Для регистрации на нуклеотидном уровне межмолекулярных тройных спиралей был разработан новый метод- УФ фотофутпринтинг с использованием циклобутановых димеров. Этим методом было показано:

а) практически полное ингибирование выхода димеров под триплексом а(ст))йа(Аг;)|4+а(ст)6 при разных способах стабилизации

триплекса; • ,

б) "антифутпринтинг" (увеличение выхода ииклобутновых: фотодимсров) под триплексом dC( dG) + dG(0 ;

в) образование Py-Pu-Pu триплекса d(CT)t 4d( Afl)t 4 +d( АО )в приводит к эффекту "инверсий полос" (более интенсивные в В форме пиклобутановне фотодимеры тс, по сравнению с ст, под триплексом становятся менее интенсивными).

4. Обнаружены необычные фотохимические свойства dQie1,c,s' В присутствии Пл" , cd1*, Со'*, мпЗФ, ZnJ* или Ni" наблюдается значительное падение выхода как 16-41, так и ииклобутановнх фотодимеров.

5. Продемонстрировано рН зависимое образование меж- и внутримолекулярных Py-Pu-Pu тройных спиралей с изоморфными триадами cg»g и сg*a*. Такие протонированные тройные спирали, в отличие от обычных Py-Pu-Pu триплексов, могут образовываться и в отсутствии двухпалентных катионов, хотя наличие, двухвалентных катионов дополнительно стабилизирует межмолехулярную тройную спираль.

6. Использование системы: биотинилированные олигонуклеотидн-стрептавидин позволило сделать возможным визуализацию межмолекулярных триплексов с помощью электронной микроокопии. Показана высокая специфичность электронномикроскопического картирования.

Основные результаты изложены в следующих работах:

1. Voloshin, O.N., Malkov, V.A. , Franlc-Kamenetski 1, M.D. and Soyfer, V.N. (1991) "Stabilization of PyPuPu Triplexes with Bivalent Cations", J. Biomol. Structure and Dynamics 8, a244

2. Frank-Kamenetskii, M.D., Voloshin, O.N., Lyamichev, V.I., Malkov, V.A. and Soyfer, V.N. (1991) "Triplex Formation between Homopurine-homopyrimidine Region and Purine Oligonucleotide", Abstract of International Symposium "Synthetic Oligonucleotides: Problems and Frontiers of Practical Application", p.38, Moscow, June 23-30

3. Демидов, В.В., Мальков, В.А.;>, Сойфер, В.Н. и Франк-Каменецкий, М.Д. (1991) "Триплекс-образующие. Пиримидиновые Олигонуклеотиды Содержащие 5-Бром Уридины как Фотоактивные, Ген-направленные Биологически Активные Вещества", Тезисы Второй Всесоюзной Конференции "Геном Человека-91", Переславль-Залесский, Октябрь 1991

4. Frank-Kamenct.sk) i, M.D., Malkov V.A., Voloshin, O.N. fane!

Soyfer, V.N. (1991) "Stabilization of P.v PuPu Triplexes with Bivalent Cations" Nucleic Acids Res. Synp. Ser. 24, 159-162.

5. Frank-Kamenetskii, M.D., belotserkovskii, b.p., Malkov, V.A., Veselkov, A.O., Voloshin, O.N. and Soyfer, V.N. (1992) "Multistranded DNA structures", Abalrnct of WorkRhop on "DNA Structure and Protein Recognition", p.37-38, Mndrid, March 15-18

6. Soyfer, V.N., VoloBhin, O.N., Halkov, V.A. and Frank-Kamenetakii, M.D. (1992) "PhototootprInting of Inter- and Intramolecular DNA Triplexes" in: 7th Conversations on Blomolecular Stereodynnmics. Adenine Press, ,V. Y.

7. Malkov, V.A., Soyfer, V.N. and Frank-Kamenetskii M.D. (1992) "Effect of Intermolecular Triplex Formation on the Yield of Cyclobutane Photodimers In DNA", Nucleic Acids Res., ZO, 4889-4895.

8. Halkov, V.A*, Voloshin, O.N., Veselkov, A.C., Rostapshov, V.M., Jansen, I., Soyfer, V.N. and Frank-Kamenetskii, M.D. (1992) "Protonated Pyrimidine-Purine-Purine Triplex", Nucleic Acids Res., wtaMu1. ¿b- ^^¿ii

9. Malkov, V.A., Voloshin, O.N., Soyfer, V.N. and Frank-Kamenetskii, M.D. (1992) "Cation and Sequence Effects on Stability of Intermolecular Pyriinidine-Puri ne-Purine Triplex", Nucleic Acids Res., i ' i ' 1 ■

10. Cherny, D.I., Malkov, V.A., Volodin, A.A. and Frank-Kamenetskii, M.D. (1992) "Electron-microscopy Visualization of Oligonucleotide Binding to Duplex DNA via Triplex Formation", J. Mol. Biol., iiIiimIM ■ 1 (' ' .

. TU*

ft&Til 2.{L.9Z tfi MS rf> 8C