Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие ДНК с триплекс-образующими агентами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие ДНК с триплекс-образующими агентами"

РГЗ од

московский

" ' ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи УДК 577.113.6

КРАСИЛ ЬН ИКОВА Мария Марковна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК С ТРИПЛЕКС-ОБРАЗУЮЩИМИ АГЕНТАМИ

Специальность 03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ч

Москва" 1995

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук,

профессор франк-Каменецкий М.Д.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук,

профессор' Иванов В.И. доктор биологических наук Александров А.А.

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии РАН

Зашита диссертации состоится ... 1995 г.

вл£.3£часов на заседаний Специализированного Ученого Совета К 063.91.10 при Московском физико-техническом институте по адресу: 141700, г. Долгопрудный Московской области, Институтский пер. 9, МФТИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института.

Авторефератразосл ан ^ " ^Т&^Ш......1995Т7

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат физико-математических наук

В.Б.Киреев

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность .темы. Изучение агентов, способных избирательно связываться с ДИК и производить определенные изменения на генетическом уровне уже достаточно давно вызывает повышенный интерес, поскольку такие агенты имеют большие перспективы использования для медицинских и молекулярно - биологических целей.

Способность олигонуклеотидов определенного состава образовывать триплекс с двунитевой ДНК является важным свойством, позволяющим рассматривать олигонуклеотида как инструменты для внесения изменений в работу генов. Но, как выяснилось, некоторые свойства олигонуклеотидов, в частности их нестабильность в клетках и клеточных экстрактах, их связывание с не полностью комплементарными сайтами, препятствуют их успешному применению. Это стимулировало создание химических аналогов олигонуклеотидов, стабильных в клетке и сохраняющих ДНК - связывающие свойства. Особое место среди таких синтетических агентов занимает синтезированная в 1991 году ПНК (пептидно - нуклеиновая кислота), представляющая собой химеру, имеющую остов близкий к белковому, к которому присоединены азотистые основания. При этом образуется структура, гомоморфная ДНК (Nielsen P.E., Egholm М., Berg H.H., Buchardt О., Science, 1991, 254, 1497).

ПНК обладает достаточно большой силой связывания с ДНК, избирательностью по последовательности и очень высокой стабильностью в клеточных экстрактах. Одним из главных недостатков ПНК, с которым сталкиваются исследователи при попытках ее использования - это связывание с неполностью комплементарными сайтами на' ДНК, характерное и для олигонуклеотидов. Изучение возможности повышения специфичности связывания - это очень важная проблема, имеющая решающее значение для применения ПНК.

Способность ПНК специфически связываться с определенными (в том числе и весьма редкими) сайтами на ДНК позволяет надеяться на возможность использования ПНК в качестве агента для создания искусственных редкощепящих рестриктаз, имеющих потенциально

широкие возможности практического применения, в частности, для картирования геномых ДНК.

Созданию искусственной редкощепящей рестриктазы на основе различных ДНК-связывавдих агентов (белков, олигонуклеотидов, олигонуклеотидных аналогов) были посвящены многие исследования. Изучаемая в настоящей работе возможность применения для этой цели ПНК вносит определенный вклад в решение этой задачи.

Целью настоящей работы было:

1. Изучение возможности применения ПНК в качестве ДНК-связывавдего агента, способного осуществлять защиту определенных сайтов от метилирования для создания искусственной редкощепящей рестриктазы по принципу "Ахиллесовой пяты".

2. Исследование возможности повышения специфичности связывания ПНК с ДНК за счет меньшей температурной стабильности неспецифических ПНК-ДНК комплексов.

Научная новизна ц практическая ценность. В данной работе впервые установлена возможность создания искусственных редкощепящих рестриктаз на основе метода "Ахиллесовой пяты" с применением ПНК. Такого рода искусственные рестриктазы могут оказаться важным инструментом при работе с длинными геномными ДНК.

В работе продемонстрировано, что БНК способна защищать от метилирования непосредственно прилегающие к сайту ее связывания сайты для метилазы на плазмиде.

Впервые показано, что диссоциация неспецифических комплексов ПНК-ДНК при нагревании может быть использована для повышения специфичности связывания ПНК с ДНК. Этот метод может представлять определенную практическую ценность для решения ряда прикладных -задач, связанных с применением ПНК. —

Апробация. Материалы работы докладывались на Ежегодной научной конференции ИМГ РАН (Москва, 1995), на заседании Ученого совета ИМГ РАН (Москва, 1995), на Третьем международном симпозиуме по биоорганической химии (Дагомыс, 1995).

Публикации. По теме диссертации имеются 2 публикации и 2 приняты к печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка цитированной литературы. Работа изложена на 24 страницах машинописного текста, включающих 20 рисунков и 3 таблицы. Список литературы содержит ¿У наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулирована общая постановка задачи.

В первой главе. которая представляет собой обзор литературы, приведены ' необходимые для дальнейшего изложения сведения о структуре и свойствах тройных спиралей ДНК. Затем подробно рассмотрены имеющиеся в литературе данные, относящиеся к новому триплексобразующему агенту пептидно - нуклеиновой кислоте (ПНК). В обзоре литературы также обсуждаются известные подхода к созданию искусственных редкощепящих рестриктаз, основанные на применении белков, олигонуклеотидов и их аналогов.

Среди других аналогов олигонуклеотидов ПНК выделяется достаточно большой силой связывания с ДНК, избирательностью по последовательности и очень высокой стабильностью в клеточных экстрактах.

ПНК имеет остов, близкий к белковому, к которому присоединены азотистые основания (рис.I). Структурная гомоморфность остова ПНК сахарофосфатному остову ДНК имеет решающее значение для стабильности комплексов ПНК-ДНК. Аминокислота лизин, находящаяся на конце молекулы ПНК, препятствует агрегации ПНК в растворе.

ПНК связывается с комплементарной последовательностью ДНК сильнее, чем комплементарные цепи ДНК между собой. Это свойство, по-видимому, в основном обусловлено отсутствием отталкивания цепей ПНК и ДНК из-за того, что остов ПНК не несет на себе отрицательный заряд. Положительный заряд лизина способствует притяжению ПНК к ДНК.

Олигомеры ПНК, содержащие как пуриновые, так и пиримидиновые основания, способны связываться с комплементарной

[VI 1

1 -1 я п V/ 1 0 1 и Н

ПНК днк

Рис.1. Структура ПНК. К-лизин.

последовательностью однонитевых ДНК, РНК и ПНК по дуплексному тицу: одна молекула ПНК с одной молекулой ДНК (РНК, ПНК).

ПНК, имеющие в своем составе только пиримидиновые основания, связываются с однонитевой ДНК по триплексному механизму: две молекулы ПНК с одной молекулой ДНК. Пиримидиновые ПНК также связываются с двунитевой ДНК, образуя триплекс с комплементарной нитью ДНК, при атом вторая нить выпетливается.

Такое внедрение происходит достаточно интенсивно только при низкой ионной силе среда, что, по-видимому, связано с необходимостью флуктуационного раскрытия ДНК. Но уже сформировавшиеся комплексы стабильны и при высокой ионной силе, в том числе и при физиологических условиях.

-Другой-серьезной-проблемой в иримбненшЛШК7~как отмечается

в Гл.1, является недостаточная специфичность связывания. Это общая проблема, характерная как для олигрнуклеотидов, так и для ПНК. Для эффективного использования ПНК во многих прикладных задачах необходимо повысить специфичность связывания ПНК с ДНК. Этот вопрос изучается в настоящей работе.

Искусственные редкощепящие рестриктазы имеют потенциально

широкие возможности практического применения, в частности, для картирования геномых ДНК. Основное внимание в Гл.1 уделяется методу "Ахиллесовой пяты", представляющему из себя подход к созданию такого рода искусственных рестриктаз. Впервые метод "Ахиллесовой пяты" был предложен в 1988 году (Koob М., Grimes Е., Szybalskii W., Science, 1988 , 241, 1084).

Схема этого метода показана на рис.2. ДНК, в комплексе с ДНК-связывающим агентом (белком, олигонуклеотидом),

обрабатывается метилазой. При этом сайты метилирования, перекрывавдиеся с сайтами ДНК-связывающего агента, или примыкающие к ним, оказываются защищенными от метилазы.

Затем производится инактивация метилазы и удаление ДНК -связывающего агента, после чего ДНК подвергается гидролизу с помощью эндонуклеазы рестрикции, имеющий соответствующий сайт узнавания. В результате ДНК оказывается гидролизованной только по тем сайтам рестрикции, которые остались непрометшшрованными, т.е., по сайтам, защищенным днк-связыванщим агентом от

метилазы.

Защита от метилирования

I t '

4

Метилам

и Т Г Л TT=f£

4

Удаление защиты и метилазы

Рвстрикгаза

м ^ ,

I

Рис.2. Схема метода "Ахиллесовой пяты".

Впервые этот метод был применен для loci репрассоров, которые защищали от метилирования участки ДНК, находящиеся внутри сайтов их связывания. Затем было продемонстрировано, что не только белки, но и образующие достаточно прочный триплекс олигонуклеотиды способны защищать от метилирования сайты, перекрывающиеся с сайтом их связывания.

Ранее было показано, что ПНК способна ингибировать эндонуклеазы рестрикции, имеющие сайты узнавания, непосредственно контактирующие с сайтами связывания ПНК. Было высказано предположение, что ПНК способна ингибировать и метилазы. В этом случае ПНК могла бы быть использована в качестве специфически связывающегося агента в методе "Ахиллесовой пяты". Возможность использования ПНК в качестве такого защитного агента изучается в настоящей работе.

Вторая глава представляет собой описание материалов и методов, использованных в данной работе, а именно: выделение ДНК, формирование комплексов ПНК с ДНК, регистрация и локализация комплексов ПНК-ДНК методом внесения двухцепочечных разрывов в ДНК с помощью нуклеазы S1, метилирование ДНК, гель-электрофорез.

Основная часть работы. главы 3 и 4, включает описание проведенных исследований и интерпретацию полученных результатов.

Третья глава посвящена изучению возможности использования ПНК в качестве агента, защищающего определенный сайт метилирования в методе "Ахиллесовой пяты". Эта возможность в настоящей работе была проверена для двух модельных систем: ПНК Т10 с метилазой BamEI и ПНК ТСТ7С с метилазой Шю1. В обоих случаях сайты метилирования непосредственно контактировали с сайтами связывания ПНК без перекрывания (рис.3,4 ).

_Зашита от метилирования _ сайтов— метилазы—ВшНУ—на

плазмиде рт]0 с помощью ПНК Т|0

Плазмида рТ10 имеет один сайт связывания ПНК Т10, непосредственно фланкируемый двумя сайтами ВатHI (рис.З.а), других сайтов ВатЯХ плазмида не содержит. Сайты BamEI расположены таким образом, что предварительно линеаризованная эндонуклеазой С/г101 плазмида рТ10 после обработки эндонуклеазой BcrniRI распадается на фрагменты длиной 1324 и 1362 п.о., имеющие близкую

ПНК

5' — ООАТССААААААААААОСАТСС —3'

ВатИ I ВатН I

а)

Рис.3, а) Взаимное расположение сайтов метилазы ВатЯI и ПНК Т10;

б) Результаты метилирования и гидролиза плазмиды рТ 10, линеаризованной эндонуклеазой С/г 101: 1- исходная линеаризованная плазмида; 2- гидролиз эндонуклеазой ВшН1; 3-5- результат гидролиза предварительно прометилированной метилазой ВалЕI плазмиды (время метилирования 3, 5 и 10 мин., соответственно); 6-комплекс линеаризованной плазмиды с ПНК Т ; 7-9-результат гидролиза предварительно прометилированной в присутствии ПНК Т плазмиды (время метилирования 3, 5 и Ю мин., соответственно).

подвижность (рис.36, дорожка 2), и короткий фрагмент 14 п.о., не детектируемый на агарозном геле.

Линеаризованная эндонуклеазой С/г101 плазмида рТ10 обрабатывалась 0.3 ед. метилазы Ват.Н1 в течение 3, 5 и 10 минут (дорожки 3,4,5 на рис.36, соответственно). Практически полное метилирование сайтов происходит за 5 минут (дорожка 4). При этих условиях метилирование сайтов, защищенных ПНК Т10, практически не наблюдается (дорожки 7,8,9). Таким образом, ПНК Т10 практически полностью защищает от метилирования по меньшей мере один из двух примыкающих сайтов метилирования ВатН1.

При увеличении времени метилирования наблюдалось частичное метилирование сайтов ВдагН1, что приводило к появлению негидролизованных по рассматриваемому сайту молекул ДНК. Поскольку сама по себе диссоциация комплекса ПНК-ДНК в буфере для метилирования, но в отсутствие метилазы происходит чрезвычайно медленно, предполагается, что наблюдающийся эффект обусловлен взаимодействием фермента с комплексом ПНК-ДНК.

В целом же, как видно из рис.36, подбором оптимальных условий удается осуществить практически полную защиту сайтов метилирования с помощью ПНК.

Вместе с тем, исследованная система носит сугубо модельный характер, поскольку в ней имеется всего один сайт узнавания использованной эндонуклеазы рестрикции. Возможность выделения рассматриваемым методом одного сайта рестрикции из многих была исследована на другой системе.

Зашита от метилирования одного из сайтов метилазы НШТ на плазмиде р1ГС19 с помощью ПНК

Метилаза Юга! имеет на плазмиде риС19 17 сайтов

_матилиров ания._Один_из_них,_имеющий—координату—1437—,-

непосредственно контактирует с сайтом связывания ПНК ТСТ7С (рис.4,а).

о отсутствие ПНК и без метилирования после гидролиза эндонуклеазой Шю1 образуется набор коротких фрагментов (от 20 до 400 п.о., рис.4б, дорожка 3). При гидролизе эндонуклеазой НЬа! линеаризованной плазмиды р11С19, предварительно прометилированной в присутствии связанной ПНК, при увеличении концентрации метилазы

пнк

5'— ОС^АОАААААААа-3'

ИЬа I

а)

123456789 10 11 12

б)

Рис.4, а) Взаимное расположение сайтов метилазы НЬп! и ПНК ТСТ?С

б) Результаты метилирования и гидролиза плазмиды рЦС19, линеаризованной эндонуклеазой £сой1: 1- исходная линеаризованная плазмида; 2- гидролиз интактной риС19 эндонуклеазой В§11 (репер); 3- гидролиз эндонуклеазой НТю1; 4-10- результат гидролиза эндонуклеазой НТю! предварительно прометилированной в присутствии ПНК ТСТтС плазмиды (количество метилазы 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16 ед., соответственно); II- комплексы линеаризованной плазмиды с ПНК, гидролизованные по сайтам связывания ПНК нуклеазой ; 12- комплексы линеаризованной плазмиды с ПНК, гидролизованные нуклеазой Б1 после предварительной инкубации в течение 30 мин. с 2 ед. метилазы НШI.

9

нарастает интенсивность полос, соответствующих ДНК, гидролизованной по сайту с координатой 1437 п.о. (дорожи 4-7). При дальнейшем увеличении концентрации метилазы становится заметным фрагмент, соответствующий исходной линеаризованной рШ9 (дорожки 8-10), что отвечает частичному метилированию и сайта с координатой 1437 п.о., защищенного ПНК. При большой концентрации метилазы все сайты оказываются полностью прометилированными (дорожка 10). Этот процесс аналогичен тому, что наблюдался на первой системе, но выражен резче.

Для ПНК ТСТ7С и метилазы Н1таI при оптимальной концентрации фермента наблюдается частичная (около 50%) защита сайта метилирования. Это обусловлено диссоциацией части ПНК-ДНК комплексов во время метилирования. Для того, чтобы проверить, какая доля комплексов ПНК-ДНК диссоциирует при инкубации с метилазой, комплексы ПНК - линеаризованная плазмида риС19 прогревались при 37°С в условиях метилирования с 2 ед. метилазы, затем обрабатывались нуклеазой Б1, в результате чего по сайтам связывания ПНК возникают двунитевые разрывы ДНК (дорожка 12). Видно, что во время метилирования значительная часть комплексов ПНК-ДНК диссоциирует, что и ведет к неполной аащите.

Другой фактор, который может приводить к снижению

эффективности защиты - это возможность несовершенного связывания

ПНК в альтернативной ориентации, что приводит к образованию

комплексов вида:

СТТТТТТТСТ СТТТТТТТСТ

5' -ССОСАСАААААААС-З' ИЛИ б'-ССССАСиАААААС-З'

В этом случае ПНК отдаляется от сайта метилирования, что, возможно, также приводит к неполному ингибированию действия -метилазы.—Эта—проблема,—очевидно,—может—быть—решена—за—счет-синтеза симметричных или же, наоборот, полностью ассиметричных ПНК.

Полученная эффективность защиты от метилирования (порядка 50%) может быть вполне достаточной, в частности, для целей картирования ДНК.

Таким образом, в третьей главе продемонстрирована принципиальная возможность использования ПНК в методе "Ахиллесовой пяты". В случае метилазы ВатН1 и ПНК Т10

эффективность метода оказалась достаточно высокой. В случае метилазы Hhal и ПНК ТСТ7С эффективность метода ниже, но не исключает возможности его применения. Использование ПНК в методе "Ахиллесовой пяты" расширяет возможности этого метода для получения разнообразных искуственных редкощепящих рестриктаз.

Однако, серьезной проблемой при использовании этого метода может оказаться недостаточная специфичность связывания ПНК, поскольку ПНК может связываться также с сайтами, отличающимися от специфического на один или несколько нуклеотидов. Для длинных молекул ДНК вероятность случайного соседства не полностью специфического сайта связывания и сайта метилирования может оказаться значительной, в результате чего ДНК будет подвержена множественным разрывам. Таким образом, проблема повышения специфичности связывания в данной задаче является весьма актуальной.

Глава 4 посвящена исследованию возможности повышения специфичности связывания ПНК с двунитевой ДНК за счет меньшей температурной стабильности неспецифических ПНК-ДНК комплексов.

Для регистрации сайтов связывания ПНК был разработан метод, позволяющий работать с длинными молекулами ДНК, содержащими со значительной вероятностью однонитевые разрывы. Этот метод является усовершенствованием предложенного в работе Демидова с соавт. метода (Demldov V., Frank-Kamenetski1 M.D., Egholm M., Buchardt 0., Nielsen P.E., Nucleic Acida Rea., 1993 , 21, 2103) , схематически показанного на рис.6,а. Оказалось, что применение первоначальной версии этого метода требует достаточно большой концентрации нуклеазы S1, сопоставимой с той, которая требуется для гидролиза ДНК в местах изначально существовавших случайных одноцепочечных разрывов. Это, по-видимому, связано с тем, что для осуществления двуцепочечного разрыва короткие участки ДНК, непосредственно примыкающие к сайту связывания ПНК,должны быть гидролизованы. Длинные молекулы ДНК часто содержат большое количество повреждений, поэтому при обработке высокой концентрацией S1 нуклеазы они достаточно сильно разрушаются, что делает практически ненаблюдаемыми искомые фрагменты. В связи с этим возникла необходимость разработки усовершенствованного

IV

* 4 V

Рис.5. Методы внесения двухцепочечных разрывов ДНК в местах связывания ПНК; а)- метод, использованный в работе Демидова с соавт.; б)- предлагаемый

усовершенствованный метод; I - связывание ПНК с ДНК, II разрушение однонитевых участков ДНК большим количеством нуклеазы Б1, II - разрушение вытесненного участка ДНК малым количеством нуклеазы Б1, III -удаление ПНК, IV - разрушение освободившихся однонитевых участков

метода, позволящего обходиться меньшим количеством нуклеазы .

В предлагаемом усовершенствованном методе (рис.5,6), в отличие от первоначальной версии (рис.5,а), разрезание ДНК по сайтам связывания ПНК производилось в две стадии: сначала при помощи небольшого количества нуклеазы Б1 гидролизовались одноцепочечные участки ДНК, вытесненные при связывании ПНК, затем производилось разрушение комплексов ПНК-ДНК. Освободившиеся однонитевые участки ДНК гидролизовались нуклеазой во вторую стадию.

Эффективность предлагаемого метода была изучена на плазмидной модели. Была использована плазмида рТ8С2, содержащая сайт связывания ПНК Т8С2 (5'-ААС Мй АААА-3'), и ПНК Т8С2.

Комплексы ПНК с линеаризованной при помощи эндонуклеазы С/гI плазмидой рТ8С2 обрабатывались различными количествами нуклеазн S1 в соответствии со сравниваемыми методами с целью определить минимальное необходимое количество фермента. Соответствующие количества оказались равны 4-6 единицам нуклеазы S1 при использовании предлагаемого усовершенствованного метода и 30-60 единицам фермента при использовании первоначального варианта Демидова с соавт. Таким образом, предлагаемый метод позволяет понизить концентрацию фермента на порядок, что дает возможность работать с ДНК фага X, поскольку при таких концентрациях нуклеазы S1 случайные однонитевые разрывы двойной спирали практически не подвергаются гидролизу.

Возможность повышения специфичности взаимодействия ПНК с ДНК за счет диссоциации неспецифических ПНК-ДНК комплексов при нагревании была изучена на модели ДНК фага лямбда и ПНК с последовательностью ТТСТТСТТТТ (в тексте ПНК Т8С2).

ДНК фага лямбда содержит один сайт специфического связывания используемой ПНК Т8С2 (координата сайта 26782 п.о.; здесь и ниже координата сайта отвечает расстоянию от начала ДНК фага лямбда) и множество неспецифических сайтов с одной, двумя и большим количеством нуклеотидных замен.

Для изучения возможности повышения специфичности формировались комплексы ПНК с линейной ДНК фага лямбда, которые обрабатывались нуклеазой S1 в соответствии с предложенной методикой. В результате после электрофореза в агарозном геле (рис.6) можно было наблюдать большое количество фрагментов ДНК (дорожка 10). Для того, чтобы убедиться, что указанные фрагменты связаны именно с взаимодействием ДНК с ПНК, ДНК фага X была подвергнута обработке нуклеазой S1 без предварительного связывания ПНК. При этом никаких дополнительных полос но возникает. Таким образом, можно заключить, что рассматриваемые фрагменты соответствуют ДНК, разрезанной в местах специфического и неспецифического связывания ПНК.

С целью попытаться избавиться от неспецифического связывания ПНК с ДНК пробы, содержащие комплексы ПНК-ДНК, прогревались при 40-70°С в 500 мМ NaCl, 20 мМ FIPES (pH 7,0) в течение 7 мин.

123456789 10 11 Ь. °С 70 - 65 - 60 - 55 50 40 20 -

Рис. 6. Диссоциация комплексов ПИК Т8С2 с ДНК фага А. при прогревании при соответствующих температурах; 1, 3, 5, Т;—8~,——Ю—=—ДНК1—гядродизвванная—нуклеаэой——па сайтам связывания ПНК. 2, 4, 6, 11 - реперы: ДНК фага А., гидролизованная эндонуклеазами ВвьЗб!, ЕсоН1, БстН1 и ЕП , соответственно

После этого производилась обработка проб нуклеазой Б1 по методу, описанному выше.

Было обнаружено, что с ростом температуры, при которой прогревались пробы, количество наблюдающихся фрагментов уменьшается (дорожки 1-10 на рис.6) и к 60°С остаются четко различимыми лишь пять из них (дорожка 5 на рис.б). Верхняя полоса соответствует интактным молекулам ДНК, которые при прогревании потеряли всю связавшуюся ПНК. По меньшей мере половина молекул ДНК не связана с ПНК после такой термообработки. Остальные полосы могут быть приписаны фрагментам, соответствующим ДНК, разрезанной либо по сайту специфического связывания ПНК с координатой 26782 п.о. (фрагменты С1 и С2, имеющие ожидаемую длину 26782 и 21720 п.о.), либо по одному из неспецифических сайтов (короткие фрагменты Н1 и Н2, соответствующие им длинные фрагменты не видны, поскольку они оказываются за пределами разрешающей способности геля)'.

Таким образом, можно заключить, что при этой температуре остается лишь незначительное количество комплексов ПНК-ДНК, содержащих ПНК, связавшуюся с более, чем одним сайтом на ДНК. Длины видимых фрагментов были определены сравнением их с реперами и оказались равны 6,5; 7,3; 22; 27 тыс.п.о..

Для того, чтобы определить расположение соответствующих сайтов, ДНК фага лямбда была предварительно обработана эндонуклеазой а затем полученные фрагменты, как и ранее,

связывались с ПНК, прогревались, подвергались обработке нуклеазой Б1 и анализировались на агарозном гелем. В этом случае получается картина, подобная наблюдавшейся на рис.б: после прогревания до 60°С остается лишь несколько фрагментов. Их длины соответствуют следующим координатам сайтов:

сайт специфического связывания С - 27 тыс.п.о., сайты не специфического связывания Н1 и Н2 - 7,2 и 42,0 тыс.п.о..

С целью поставить в соответствие наблюдающимся фрагментам конкретные сайты связывания ПНК был проведен компьютерный анализ последовательности ДНК фага лямбда. В качестве наиболее вероятных мишеней для ПНК рассматривались сайты с одной заменой и сайты с

двумя заменами на краях. Среди них были выбраны те, координаты которых могли бы соответствовать фрагментам, отвечающим неспецифическому связыванию ИНК, ясно видимым после прогревания до 60°С. Таким образом, были найдены два возможных варианта для сайта Н1 (замены выделены, в скобках указаны координаты): GAAA GAA GAA (7279 П.о.) И AAG AAG ААСТ (7281 П.о.) и два возможных варианта для сайга Н2:

САЛА GAA GAT (41979 п.о.) и AAG AAG АТАА (41981 п.о.). В рамках используемого метода выбрать из имеющихся для каждого сайта вариантов один невозможно. Однако, это можно попытаться сделать путем привлечения дополнительных соображений. Основными предположениями являются следующие:

- сайты с меньшим количеством замен дают более сильное связывание ПНК;

- сайты с заменами на краях дают более сильное связывание, чем сайты с таким же количеством замен посредине, поскольку не приводят к образованию дополнительных границ в структуре комплекса;

- сайты с легкоплавким (А, Т- богатым) окружением дают более сильное связывание, поскольку они менее чувствительны к заменам на краях, и соответственно, более стабильны, чем сайты с заменами на краях и более тугоплавким (G, С- богатым) окружением.

В рамках приведенных предположений, из каждой пары возможных можно выбрать сайты с координатами 7279 и 41979 п.о.

Проблема, возникающая при повышении специфичности связывания ПНК Т8С2 с ДНК фага лямбда с использованием диссоциации неспецифических ПНК-ДНК комплексов при нагревании, состоит в том, что при разрушении неспецифических комплексов одновременно -происходит -разрушение-и -части-специфических.- Одним -из -возможных объяснений этого эффекта является то, что молекулы ПНК с последовательностью ТТСТТСТТТТ способны связываться с сайтом АААА GAA GAA в различных ориентациях относительно остова ДНК, а также друг относительно друга:

ТТТТСТТСТТ ТТСТТСТТТТ ТТСТТСТТТТ

5'-AAAAGAAGAA-3 * 5'-AAAAGAAGAA-3' 5'-AAAAGAAGАА-3'

ТТТТСТТСТТ ТТСТТСТТТТ ТТТТСТТСТТ

В этих случаях комплекс может диссоциировать при более низки■: температурах, поскольку образуется восемью нуклеотидами вмест десяти.

Хотя для данной модели оказывается невозможным полностью избавиться от неспецифического связывания, это может оказаться возможным в случае ПНК с другой последовательностью, либо обладающей полной симметрией, либо не обладающей ею вообще, и п таком случае можно ожидать более высокого выхода специфических комплексов после прогревания.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ ДИССЕРТАЦИИ

1. Установлено, что ПНК способна защищать от метилировали;: сайты, непосредственно прилегающие к местам ее связывания.

2. Продемонстрирована принципиальная возможность создания искусственных редкощепящих рестриктаз на основе метод;) "Ахиллесовой пяты" с применением ПНК.

3. Показано, что для повышения специфичности связывания ПНК с ДНК может быть использована диссоциация неспецифических комплексов ПНК-ДНК при нагревании.

4. Локализованы сайты образования не полностью специфически.-: комплексов ПНК ТТСТТСТТТТ с ДНК фага лямбда, обладающих стабильностью, близкой к стабильности специфических комплексов. В рамках выдвинутых предположений о закономерностях образования неспецифических комплексов дано объяснение происхождения их стабильности.

5. Разработан усовершенствованный метод локализации сайтов связывания ПНК путем внесения двухцепочечных разрывов ДНК з местах посадки ПНК с использованием Sl-нуклеазы. Данный вариант метода, в отличие от предложенного ранее, позволяет работать с длинными молекулами ДНК, содержащими со значительной вероятностью однонитевые разрывы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

1. Krasilnikova М.М., Izvolsky K.I., Krupnik O.V, Lazurkln Yu.S. Use or Polyamide Nucleic Acid (PNA) as an "Achilles heel" cleavage (AC) approach agent. Abstracts ol the Third International Symposium on Bioorganic Chemistry. Dagomys, Sept. 17-23, 1995, p.83.

2. Красильникова M.M., Извольский К.И., Крупник О.В., Лазуркин D.C. Использование специфического связывания пептидно-нуклеиновой кислоты с ДНК в методе "Ахиллесовой пяты". Доклады Академии наук (1995), т.344, N4, с.

3. Красильникова М.М., Веселков А.Г. Повышение специфичности связывания пептидно-нуклеиновой кислоты с ДНК. Мол. биол., 1996 (принято к печати).

4. Красильникова Ы.М., Извольский К.И., Крупник О.В., Лазуркин Ю.С. Применение пептидно-нуклеиновой кислоты в методе "Ахиллесовой пяты". Мол. биол., 1996 (принято к печати).