Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Двойные и тройные спирали олигодезокирибонуклеотидов с параллельной ориентацией цепей

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Двойные и тройные спирали олигодезокирибонуклеотидов с параллельной ориентацией цепей"

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГ

ЩЕЛКИНА АННА КИРИЛЛОВНА

ДВОЙНЫЕ И ТРОЙНЫЕ СПИРАЛИ ОЛЙШДЕЗОКИРИБОНУКЛЕ

С ПАРАЛЛЕЛЬНОЙ ОРИЕНТАЦИЕЙ ЦРГ‘

СпсиИйЛЫ'ОСТЬ М !Ч) :! ' - М'ЧСЬЛЛЯрЧ

А В Г О Р Н 'Г> Я Р А Г

диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва - 1997 г.

лории физики биополимеров . биологии им В А Энгедьгардта РАН

поненты:

-«-математических наук, профессор Н.С. Андреева .ичеошх наук, профессор Е.С. Громова шихоматематичсских наук, профессор Ю.С. Лазуркин

' Ведущая -Организация:

т теоретической и экспериментальной биофизики РАН

т. -■поится "<2_" 1998 г.

^^минут на заседании Диссертационного совета х.01 Института молекулярной биологии им. В. А. Энгедьгардта И по адресу: 117984 Москва, В-334 ул. Вавилова, д. 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан “$■6 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

ОБШЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА-САБОТЫ

1.Ли)д.1Ыил11|_ црийклш Одной из центральных проблем молекулярной биологии является свхть структуры и функции нуклеиновых кислот. Современные ЯМР и кристалло1рафия обогащают научное знание впечатляющей и быстро расширяющейся библиотекой структур биологически энгтмт молекул, центральное место среди которых занимает ДНК. Еше более широкое разнообразие предсказывает полуэмпнричесыш компьютерный поиск стереохимически возможных структур. Становится все более очевидным, что структурное разнообразие ДНК простирается далеко за пределы трех главных А-, В- и г-семейств двойных спиралей с антипараллельной 5’-3’/3’-5’ориентацией цепей и Уотсон-Криковским типом спаривания азотистых оснований. Теоретическое предсказание существования стереохимически возможных необычных структур двойных спиралей ДНК с параллельной 5’-3’/5’-3’ориентацией цепей (РаЦаЫгатап, 1986) дало мощный толчок к их экспериментальному поиску. Как следует из молекулярною моделирования, параллельные ДНК (парДНК) могут характеризоваться новыми правилами комплементарности оснований и параметрами структуры, отличными от двойной спирали Уотсона-Крика, что может обусловить их сродство к новым типам специфических лигандов, в частности, регуляторных и структурных белков. Интересно, что новая форма трехцепочечной ДНК, параллельный (рекомбинантным) триплекс, аккомодирующий две идентичные нити в параллельной ориентации, или И-форма ДНК, была впервые предложена также на основе компьютерного моделирования (гЬигкт « а!.. 1994). Вместе с тем, биологическая роль парДНК, как и параллельных триплексов, к настоящему времени не установлена экспериментально. Обсуждается гипотетическая особая роль параллельны» ДНК и их комплексов с белками в процессах рекомбинации, матричного сишетг, эволюции (Чуриков и соав., 1988, 1989, Курявьш. 1987), в стабилизации структуры генома однотяжевых вирусов, в каталитическом механизме обратной гиразы термофильных

бактерий, включающем параллельные интермедиаты (К1ррс с1 а!.. 1992).

Промежуточное образование Я-формы ДНК было предположено в процессах гомологической рекомбинации и матричного спнтета (Но^ап1-Р1апс1сгч, 1984, гЬигкт е{ а!.. 1993, 1994.).

Становится все более очевидным, что для определения II оценки критически* взаимосвязей и взаимозависимости между структурой. энергетикой и биологическими функциями, кроме структурной информации необходимо знание термодинамики и других физико-химических характеристик новых конформаций /я \-Uro. Экспериментальное получение и физико-химическое исследование теоретически предсказанных новых конформации ДНК, параллельной двойной спирали и параллельного триплекса, явилось необходимым и актуальным.

2. Цель и задачи исследования. .

Целью настоящей работы являлось экспериментальное выяснение возможности и условий существования новых структур ДНК, параллельных двойных спиралей и параллельных (рекомбинантных) триплексов, изучение термодинамики их образования в зависимости от нуклеотидной последовательности и внешних факторов, их комплексов с лигандами.

В ходе проведенных исследований были решены следующие задачи:

1 .Осуществлен выбор адекватных типов модельных олигонуклеотидов и экспериментальных условий для получения внутримолекулярных високоэнергетических структур ДНК. Выбран комплекс физико-химических методик, обеспечивающих контроль гомогенности внутримолекулярных образцов и отсутствия примесей альтернативных межмолекулярных структур.

2. Получены и охарактеризованы термодинамически, а также рядом спектральных методов параллельные двойные спирали ДНК и параллельные триплексы в зависимости от нуклеотидной последовательности, типа противоионов, интеркалнрующнх и иных лигандов. Определены условия стабилизации этих структур. .

3, Ра «работами подходы к получению стабильных межмолекулярных парЛИК н Н-формы ЛИК, что открывает возможность использования тгих струкцр дли узнаьаки?

о шюнуклеошдачи оянотжевои ЛИК в параллельном ориентации (парДНК) и кативши лпоГшоП спирали ЛИК с любом прои (вольной последовак'лынкчыо основании (И форма)

1Ь)Ч)Ш НШШЛЫ.

Представленные научные результаты им<*«>т приоритгогиЛ тярзхтгр н открывают повое направление исследовании.

Были впервые найдены экспернметгтальные подходи получения мономолекулярных двух- н трехцепочечных спиралей из олигонуклеотидов, в которых для задания определенной ориентации нитей были использованы ненуклеотидные линкеры. С помощью специально разработанного набора оптических спектральных методов контролировалось отсутствие в образцах примесей альтернативных межматеку.тириых структур, что обеспечило возможность количественного определении термодинамических параметров образования парДНК к пара/ыельных триплексов, их комплексов с лшандами, спскгральны* характеристик лих новых структур.

Для модельных олигонуклеотидов с ненуклеогндными линкерами впервые доказано образование парДНК с альтернирующей АТ последовательностью.

Впервые получены стабильные параллельные внутримолекулярные и меж молекулярные двойные спирали природною АТ/ПС состава основании. Впервые обнаружена зависимость стабильности парДНК не гольки ш нуклеотидного состава, но и от последовательности оснований в АТ/СС содержащей парДНК. В опровержение существовавших представлений показано, что наличие ОС пар может не только ослабить двойную спираль парДНК, но и сибилтиршип. ее в случае последовательного расположения двух или трех ОС пар.

Установлены новые свойства парДНК, обуслоюенные особенностями ес вторичной структуры. Впервые обнаружено независимое связывание пептидных антибиотиков дистамицина А и нетропсина в обе бороздки ТАТА участка, что

является ярким отличием парДНК от Уотсон-Криковской ДНК. Показано, что сродство иктеркалирующих лигандов к парДНК смешанного АТ/вС состава ниже.чем к АТ-содержащим пар ДНК и антипараллелыюй ДНК.

Впервые экспериментально получен и исследован новый тип структур ДНК-параллельные рекомбинантные триплексы или Я-форма ДНК. Показано, что стабильность параллельных триплексов зависит от последовательности оснований. Предложены способы стабилизации параллельных тришсксов, как внутримолекулярных, так и межмолекулярных, образованных при узнавании олигонуклеотидом нативной двойной спирали ДНК. Впервые достигнуто узнавание 14-ную)еотндной последовательности из четырех основании нативной двутяжевой природной ДНК гена Н5КК1/К^ человека с помощью образования триплекса.

Настоящая работа имеет фундаментальный характер. Разработанные в ходе исследований экспериментальные подходы открыли возможности получения и количественного изучения высокоэнергетических форм ДНК на модельных олигонуклеотидах, способных образовывать внутримолекулярные двойные или V тройные спирали. Поскольку для множества последовательностей параллельные двойные и тройные спирали энергетически менее выгодны, чем структуры канонического антипараллелыюго типа, стандартные подходы неизбежно приводят к образованию в растворах сложного равновесия множества межмолекулярных альтернативных структур, что делает невозможным изучение высокоэнергетнческих форм. Предложенные новые подходы к конструированию, получению в растворе и контролю гомогенности образцов нашли применение в ряде лабораторий, изучающих необычные конформации ДНК и РНК и их комплексов, в том числе Отделе молекулярной биологии Т. Джовина Института биофизической химии Макса Планка (Геттинген, ФРГ), лаборатории С.ЧИБ 1430 Н. Таатцнльс (Университет Париж 13. Франция). Институте вирусологии Университета в Йене

(ФРГ).

Полученные в работе результаты открывают направления поиска практического применения необычных двух- «''трехмжешх' структур ДНК в аши.ч!нс и триятексиой технологиях для рстулмиш экспрессии 1енов, генетической диагностик, терапии и хирургии, а также дня решения «ругах задач молекулярной биологии. требующих сайт-спеиифическон> узнавания последовательностей ^Ну|Я*.еВОЙ И ОдПОГЯЖеИОИ 1ШК. Олигонуклеопиы, содкрясашке МИНорНЫе основания вмесю ЦС н <1(иоМс1С) имссю й1_, мо.у| быть предложены как

Г!гт:’?е:’-'Г'Г!Т? «•}» 6т<'К!«ргпиП,Ч •ИКТТ'С-гтт ГГЯ^Г гРг^СТТ"’? ~гб!г_!н!.'”

параллельных мЖк:ДМК дуплексов, устойчивых, в отличие от антипараллельпых дуплексов, к действию клеточных нуклеаз. Узнавание двутяжевой ДНК любой произвольной последовательности оснований олигонуклеотидом путем образования параллельного (рекомбинантного) триплекса способно расширить репертуар последовательностей для триплексной антигенной технологии, в основном ограниченный в настоящее время олигопиримидиновмми и олигопуриновымн 1шс::едова!'*Л1,1Шстя'.'1!.

5, Оаюмлк.НУДолстм. Млжь’ИММч* ЯЧ шишу. сфъркулиронаиы р. вы«и*х

6.. Анробаши дабохи.

Материалы диссертации были представлены а виде устных докладов на международных конференциях “Молекулярная биология на рубеже XXI века” (1994 г., Россия), “Стереодинамика биомолекул” (Олбани, США., 1993 и 1995 п.), Российско-германском симпозиуме "Нуклеиновые КИСЛОТЫ н их взаииодеисл ьис с белками” (Берлин, ФРГ, 1995 г.), XII Международном биофизическом конгрессе (Амстердам. Голландия, 1996 г.), а также в виде 10 постерных сообщений на международных конференциях1993-1997 гг.;

обсуждены на приглашенных докладах в Университете Пари Норд (Пгриж, Франция, 1994 г.), Институте биофизической химии Макса Планка (Геттинген, ФРГ) и Национальном институте здоровья (Бетезда, США, 1995 г.)..

На конкурсах научных работ ИМБ РАН циклам работ, содержащим представленные в диссертации результаты, были присуждены премии: 1990 г. - 2-я премия, 1991 г. - 1-я премия, 1992 г. - 2-я премия, 1993 г. - 1-я премия, 1994 г. - 1-я и 2-я премии, 1995 г. - 1-я и 2-я премии.

По материалам диссертации опубликовано 31 работа.

7. Личный вклад автора.

Содержание диссертации отражает личный Еклад автора, осуществлявшего физико-химические исследования в рамках общего направления исследований ряда необычных структур нуклеиновых кислот, проводимых в ИМБ РАН усилиями неформальных коллективов нескольких лабораторий. Автор принимал непосредственное участие во всех работах, по которым написана диссертация, и на всех этапах: постановке задач, получении экспериментальных результатов, обработке экспериментальных данных; подводил итоги и определял направление дальнейших . исследований.

7. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, библиографии (208 назв.), 56 рисушоп, 13 таблиц, заключения, выводов и приложения, изложенных на 229 стр. машинописного текста

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Во веедении изложена история проблемы, обосноьысается актуальность выбранной теми, формулируется цель работы, обсуждается новизна и значимость полученных результатов, кратко аннотируются последующие главы

Глава ! излагает разработанные экспериментальные подходы к получению и исследованию высохоэнергетических форм ДНК: выбор экспериммгтальных

моделей, условий и способы определения ориентации цепей ДНК в двух- и многоцепочечных спиралях.

В § 1.1. описывается сложное термодинамическое равновесие многих внутри- и межматехулярных структур, возникающее в общем случае в растворах

!>:іиіо>')клеопшоі>. і: которых отдельные шиї; ДНК ковалентно сшиты гибкими ' ткиуч'Ц-'Яіиіні.ічи линкерами. Г.іміе (.шіонухле-нчлы поіеїтнальпо ин« еЛны .■■іі.ліаьмчаи. міу^лім!лекущрш-е дьииныс или трошше спирали с ■••"•кип}* (К( сіі'шіій сфумуроіі ориентацией ікліе.г імралледміме (а/тініі.'р.їл;телі-««еі :шшлі.к'і шиї і|>іііиькси, но также и множество примесят псспм.нфнческш

'іп.м\; і Іі'К:и.>;чїї- глмможцие 'У'Ч ча п .и.иеро дпуч о;тн>і!уі:лсоі н.чо.і

.^меывлсны на схеме 1. Бата решена задача подбора экспериментальных условий.

" ' ' * ,__ ,ч.^шлмплмнчсгк(Ч'* -------- ; ь стрпну • .Мгл-.~.

!шу;римодскудяішх. шпилек (типа I дгы двоимых спирален) под контролем наборз специальных методов. Исследог.алнсь структуры, существующие в области pH 7.0-8.5.

Нативный тедь-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), детектирующий в ряде случаев образование медленнее движущихся межмолекулярных примесей, не всегда служил достаточным (и никогда гсчкчестгешшы) ко.ит.м™ риугркмгп.* гу•.1и.«хчи лпр..«,.-, і!с*:па'::.ку хь >.-.-п *

і V; !. ■ . ■і’, "им її., геі1:'П.‘,нжоин<іс,';:..ое і11 і' л і.і і.'*,к:'и.:с мсллц-і аил-ип :\!.іні.и. 1

'*•. ‘ і* и*. ►' < "’К}'-: ї;; г, ‘у *. * і ь. *»♦*••*»'« *: ‘.."і чмх ^ мь.'.д ^. ь -<у\‘Т'' N

•....і *г»ч ' . ■ і г.ч.гг .ґґм< и с і и к ф.иьчі.к* хирлі.’л*)

і і 1. і. . ії' л і»ч чс-'.л'!'^ ч-'; .п:іііі'і ІЛ/і іч нач'лслчхчись

-і■.і. і і ■: ! ч и-нцетір. ігідЧ, мііпимшіию іижлцих іа структуры ДНК и

исключающих миграцию энергии молекул зоила Выло гтс'-г’.'Н': 1 ч .}«•■<

■«личины полярнзашш флуоресценции (Р) шггеркалироваїшого бромистого зтнаш (Е(Вг) чрезвычайно чувствительно к наличию ке-кчглгкулярннх структур. Д іл н?ло асим«етпччн,.!Г яп-гг-л т.” >м.) р і'-чм-і::: ■ * і нчиїш.і: ппеї ■; '■. “ ■>*<•: -

■>і!К. ч і.іи п н ,і;'мн.-.;:ч.'і’і п’И''.;мі >рой р.<>.і Г . ■) ігсиилііісм.

р = ЗчУ/кТ, і. і),

СХЕМА І

димер шпилек ■(<>)

З'-СТАТАСССАТ "Ч З'-САТАТСССТА З'-СТАТАСССАТ З'-САТАТСССГА

1І

рї шпилька N1 (1)

З'-СТАТАСССАТ-З'-САТАТСССТА-

З

1!

Линкер Ь= -р0(СН2СН20)Зр-

ГЛ

З'-СТАТАСССАТ АТСССТАТАС-З' рі дуплекс (3) З'-САТАТСССГА^ТАСССАТАТС-З'

І!

<---- 3-СТА

З'-СТАТАОСКЗАТ^'

ТА СЄСАТ

АТ ГСГ ТА ІГАП -З

АТСССТАТАС-З’ ері дуплекс

с мисмэтчами

(4)

(2)

В'-СТ/ 5

' 5 э'-оаЦ

С:

ТА СЄСАТ УГ ССС ТА

арї дуплекс с мисмэтчами

(5)

О

■•ре с С" З’-ссосососсс оссюоссссс-з' открытая конформация (7) И

арі шпилька с мисмэтчами

да

о ■’ с

с сбс г\;со о

в ССвЗ’ З'ССС с с с

£

З'-ОСОССССІСОС 5'-сосасосссс-з'

5'-ссссссск:ос-з' 3’-СОСССС5СССО------(9)

где к— постоянная Больцмана.

(1/Р-1/3) = ()/Р0-1/3)(1 + Зт/р ) (2),

те Р и Р0'-'степень поляризации адсорбированного на образце Е1Вг и ее предельное значение при Т/т ->0 соответственно; т - длительность флуоресценции связанного Е(Вг.

20.0

10 bp

РисЛ, \! Р структур и ассоциатор

£

15.0

10.0

* parARB triplex + GT letraplex

• ATT triple* dimer

5.0

0.0

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 TrtvlO-^K-Pti1)

Образцы, содержащие-‘шпильки (или дуплексы) т 10-нп или триплекси из 10 триплетов давили численные значения І/Р-І/3, ло-кащнеся точно на полученные ^калибровочные прямые (■Рис.!-), тогда как наличие примесей бимолекулярных структур приводило к большим значениям величини Р. Поскольку тетраэтиленгликолевый линкер не является абсолютно гибким шарниром, этот полход дает позжожнссть дискриминировать структуры типа 1 от 3,4,5, и 6 (Схема

1). Не менее важным структурным тестом служило определение доли неспаренных оснований (1-0) в полностью нативном образце при 3‘С при помощи измерения «Гемепи жизни гетерогенной флуоресценции акридинового оранжевого (АО) на фазовым флуорометре (Борисова и Тумерман, 1964). Высокая чувствительность этого метода позголила выявлять структуры типа 4,5 и 8, дискриминируя их от 3,6 и 9, соответственно (Схема 1). Дополнительную информацию о типе структур давал анализ кривых связывания интеркаляторов, кооперативный характер которых указывал на присутствие в растворе БкІе-Ьу-яісІе димеров двойных спиралей (а для

некоторых последовательностей тетраплексов), что могло помочь дискриминировать бимолекулярные структуры типа 6 и 9 от 3 (Схема 1).

При исследовании комплексов парДНК с лигандами, а также спирален, образуемых отдельными нитями, предпринимались специальные определения ориентации нитей флуоресцентными методами, описанные в соответствующих разделах.

51.2. Перечислены факторы, влияющие на равновесие форм, и экспериментальные условия, сдвигающие равновесие в сторону образования специфических внутримолекулярных спиралей и минимизирующие примеси альтернативных меж- и внутримолекулярных структур. Показано, что в общем случае равновесие форм сильно зависит от нуклеотидной последовательности, типа противоионов, температуры, способа приготовления и истории образца (Таблица 1). Под контролем флуоресцентных методов установлены условия, а именно, диапазон концентраций, способы приготовления образца, типы противоионов, обеспечивающие гомогенность внутримолекулярных специфических структур. Концентрационная зависимость кривых тепловой денатурации дает возможность определить область концентраций олигонуклеотидов, в которь(\ ■ кривые плавления остаются неизменны и не зависят от концентрации, отражая, следовательно.

Рис.2 Кривые плавления рвАТ с гексаметиленовым линкером в зависимости от концентрации:

1-0.5 цМ, 2- 0.55 цМ,

3- 0.9 цМ, 4-3.1 цМ,

5- 19 цМ, 6-85 ЦМ.

0.5М N30, pH 7.0

'плавление образца (Рис.2).

Таблица!. Процент нвспареиных оснований, поляризация н

относительные гидродинамические объемы олигонуклеотидов, способных сворачиваться п 10-Ьр шпильки ( 0.5-0.7 шМ олигонуклеотидов, pH 7, температура 3-4°С)

Олигонуклеотид % неспа-ренннх оснований в Of М LiCl X, ns.ee время жизни флуоресценции Е1Вг Р, поляри -зацйя в 0.1 М UCI р, явес, время вращательной релаксации » 0.1 м иа ^/У10 !>р 0.1 м иа V/Vie 5mM MSa2

psNl З'-CTATAGGGAT > З’-GATATCCCTA 7.0±2 20.0+1.5 0.118 20.2+1.5 1 1.78

psN2 З'-CTGAGTAGAT Л З’-GACTCATCTA 7±1.5 23*1 0.116 22.7±1.0 1 1.97

psN3 3-CGTATAGGAT Л , З'-ССАТАТССТА 7.5±2 1.3

psAT З'-АТАТАТАТАТ ~Л З’-ТАТАТАТАТА 7+3 23.0+1.5 0.116 22.7+1.0 1 1.12

apsAT З’-АТАТАТАТАТ Л 5’-ТАТАТАТАТА J 3±1 26+1 0.10 21.0±1.0 1

ap.s 5'-GAGAGAGAGA Л GA/CT З’-СТСТСТСТСТ 0 1.45

ap^N2 .VCTATAGGGAT - з'-gatatcccta j 0 26+1 0.10 21.1 ±1.0 1

"psGC'’3'-GCGCGCGCGC Л 3 -CGCGCGCGCG J 12 2.0±0.1

apsGC .Г-GCGCGCGCGC Л 5'CGCGCGCGCG 8±1 26+1 1.06. быстро в лед 1.45

p', 3'-CTATAGGGAT-5' duplex 3^GATATCCCTA-5' 7±2 1 0.1 1.0

aps 3-CTATAGGGAT-y duplex 5,-GATATCCCTA-3‘ 0 1 0.105 1.0

Итак, внутримолекулярные двойные (и тройные) спирали (шпильки) образуются в условиях

- концентрации олигонуклеотидов ниже 1 цМ,

- низких концентраций противоионов и и\ но не М^*, (Таблица 1)

- приготовления с быстрым охлаждением после предварительного нагрева до 90 °С.

В зависимости от относительной стабильности шпилек эти условия могут и не обеспечивать их преимущественного образования, что сказывается на увеличении их гидродинамического объема (psGC, Таблица 1). Последовательность нуклеотидов сильно влияет на картину термодинамического равновесия форм. Последовательность psN3 с липкими GC концами дает примеси межмолекулярных структур. Интересно, что образование антипараллельного дуплекса (или димера двух шпилек) из альтернирующей GA/TC последовательности в низких, но еще детектируемых оптическими методами концентрациях, всегда сопровождало образование антипараллельной шпильки (Таблица 1).

Глпип II посвящена исследованию параллельных двойных спиралей олигодезоксирНибонуклеотидов.

§11.1, Параллельные ДНК с АТ парами оснований.

С использованием олигонуклеотидов с гексаметиленовыми линкерами впервые получены парДНК с чередующейся АТ последовательностью. Спектр кругового дихроизма (КД) psAT имеет характерное отличие от КД apsAT (Рис.З)

Рис.З. Спектры КД psAT и apsAT, утолщенная кривая-разностный спектр. 10 мМ Na фосф. буфер,pH 7.0, температура 3°С.

220 240 260 280 300 320

wavelength (nm)

Кривые плавления иаряпцепчачги зттспрг.тіс.(Пімч нм:>< кк с чер,- лк.шммии А '•

и линчи. я \/| і;<ч'ії,:іо.П:ми Г.пли іИ'= \і:и 'Н :иг!іі..!;ч і и

їїруу сг'сг"г:;::і':. “::”ї:і;п и сравнены гср'.'одчнамичеіі.і'е п.іраче'рч її'. .'й*а«-.ча.си

!1:р ЛИК. ;і.: АТ пар ив-теїся правіш лпіп.иіі.ю <КД» с исскаїько меньшим

. , 1-.;Чі-.ч :Уф ІІІНІчроМІПМ) И >' С •11 ' : І І ї І • • ■ МЛІ.НІ ч . І !<', і; М . :.'И) ’ , ,1 [■, ,., > І

я н--iMii.il- оп’гл 'и, нра-іл* іі.рДІІК с альтернирующей АТ последовательностью УСТУП я па » -—я-—--;гг. .....ДІоС <, шии«/іг..т і

П'.--—-І

Глава 11.2. описывает исследование пархтледышх ДНК смешанного природного АТ/ОС состава, представляющих особый интерес в связи с наличием в геномах различных организмов протяженных параллельных комплементарных последовательностей (Чуриков, 1992). Был получен 40-Ьр параллельный дуплекс фраімента сш локуса О. теїапоеатег, содержащий 17 вС пас. ■» и> кшппы» ...

и..ч :: соосдс'іі.чхич с Л Г :г.-р,м:‘ і ./лыи ’г і 5' сттчп, іслінії

; ,і> '.'ч'нч'1 и 5д:>ка\ щ 2 иди З С<С" пар 0'.п,(;.»'.;..|іц.- с!аг>чн-> сі.;(..і ЛИК

:і;'-чч: тчи н. іа:'.і іч.а і.ідол. в іі|нш,ь.ірг лми с ._1лы.акны-'и л-чіпч,;' -■ де.1"-Он пі'лііии ііар ДІІК при замене чеилрех ЛТ пар на чг:1 мре ”.іолироі.аш:і її. (!С пары г ДТ -солср/<і"(см З^-Ьр дуплексе (Кір[Нї еі а!, іугЮ) Г->іо прт'сю нас к предположению о сушговопанин зависимости стабильности нзрДИК прчродт-ю состава от последовательности оснований, необходимости ее детального изучения и шяси-лши природи С'С нар в параллельной ДНК. 10-Ьр дуплекс с і рема последовачельными ОС парами оказался достаточно стабильным при 3-5”С, нейтральных pH и физиологической ионной силе (см. ре дуплекс в Табл. 1).

Определение доли неспаренных олигонуклеотидов (1-9) в 10-Ьр параллелм.цх

дуплексах показало, что не более двух оснований неспарены. Огносителыш стабильность АТ и ОС пар в 40-Ьр и 10-Ьр параллельных дуплексах была изучена методом измерения квантового выхода ц флуоресценции акрнфлавина (АФ), интеркалирующего между любыми парами, но флуоресцирующего с высоким выходом при интеркаляции между двум* АТ парами и полностью потушенного гуанином при контактировании с СС парой.

где nf - число флуоресцирующих мест, nq-число потушенных мест. Был сделан вывод, что при 5‘С в Ю-bp парДНК денатурирована концевая АТ, но не GC пара, что предполагает большую стабильность по крайней мере концевых GC пар. Более того, температурная зависимость q АФ связанного с 40-Ьр параллельным дуплексом позволила предположить при чрезвычайно низкой кооиеративности плавления относительно меньшую стабильность АТ пар в сравнении с GC парами, причем наименее стабильными оказались 6+1 АТ пара (возможно, концевая и те АТ пары, которые заключены между двумя GC парами) из всех 23 АТ пар дуплекса.

Для количественного сравнения парДНК с различной последовательностью был изучен набор параллельных шпилек с тремя GC парами в блоке (psNl), изолированными GC парами (psN2) и сгруппированными по две (psN3), причем концевые пары были одинаковы (см. Таблица 1). Термостабильность psNl и psN3 оказалась близкой, но гораздо выше, чем у psN2. Особенно важно, что GC пары в блоках по 2 и по 3 приводили к стабильности парДНК большей, чем у psAT (Рис. 4а и Таблица 2). Специально был изучен вопрос, в рамках какой модели должны быть определены термодинамические параметры образования этих парДНК? Формы кривых плавления этих внутримолекулярных структур позволяют предположить более сложный, чем two-state, механизм (Рис. 4а).

Рис.4а. Кривые термической денатурации

В 0.1 М УС1, 10 тМ шб, pH 8.

рзАТ (Д). рзМ (в), рзК2 (О). Показана каждая третья экспериментальная точка.

1 £ Ло I

И' !

I - I I Я о.в I

§ !■

I *3 I

II I

«

- !Г -Г

Г I

• I

///

00 1

и*»**

20 40 60

Тетрегашге (°С)

80

РИС Н). Д'1ЛИ ПС«',^'П-е^Ч:.1Х

| ОС!Ит»(Ш'И 0Л ' {])/'* .

I

{ сппе.и'.'к'И.'ки а .и'г

I ■

21ррег МОДСЛН.

» и\1. ПЧ|М« !«•».

I

рьМ2 (О).

100

IIЛЛ 1 сл1.-ч.1скг(кч|ирсч н чечт'р.иур-тм градисто рчМ!» апИПЛ/С 'I «чип онуклеотж)»

10 т%( МкС'12, 10 тМ /го Мга/с. pH 8

Темт-рл ура

ю 20 за 40' г

1-------------(------------1------------1---------«>•

1 Г 3 4 Ь 6 7 3 9 10 1112 13 4

Рис. 5. р5Ж-дорожки I, 2, 5, 6, 9, 10, 13, 14; арьв А/ТС-дорожки 3, 4, 7, 8, II, 12. Гель прокрашен ЯуЫСгеепП так, что районы пятен с наибольшей плотностью ДНК остаются неприкрашенными к хорошо выделены как белые пятна.

Эксперименты по двумерному гель-злектрофорезу в 16% ПААГ были предприняты с целью визуализировать тепловую денатурацию шпилек с тем, чтобы выбрать адекватный формализм, модель двух или множества состояний, для обработки УФ кривых плавления (Рис.5). Линейный температурный градиент приложен перпендикулярно направлению электрического поля. Линней АВ обозначены положения шпилек контрольного олигонуклеотида apsGA/CT, линией CD -медленнее мигрирующих бимолекулярных дуплексов, неизбежно примешивающихся в растворах MgCh, детектируемых дополнительно измерением их времен вращательной релаксации. При низкой температуре подвижность наибольших фракций обоих шпилек одинакова (дорожки 1, 2, 3, 4), однако при повышении температуры ясно визуализируются различные механизмы перехода спираль-клубок двух шпилек. В отличие от перехода между двумя формами с определенными подвижностями для apsGA/CT, полоса шпильки psNl прогрессивно замедляется с повышением температуры и при температурах выше 80°С (не показано) обе расплавленные шпильки мигрируют вместе. Эти данные свидетельствуют в пользу выбора модели многих состояний (multi-state) перехода спираль-клубок параллельных внутримолекулярных спиралей, в которой в образце при каждой температуре присутствуют в разных долях шпильки с разным числом расплавленных с конца пар оснований. Непрерывные линии рис. 4а -теоретические кривые, наилучшим образом подогнанные методом нелинейной регрессии к экспериментальным точкам, а на рис. 46 даны рассчитанные зависимости доли неспаренных оснований в образцах. В таблице 2 представлены термодинамические параметры диссоциации параллельных шпилек, определенные в рамках данной модели. Т^, определена как максимум первой производной экспериментальной кривой плавления, Г(0]) • температура, соответствующая половине расплавленных пар, определяемая из теоретических симулированных кривых и сравнимая с температурой плавления в модели двух состояний. Величины энтальпии и энтропии плавления в пределах ошибки эксперимента неотличимы для обоих GC-содержащих параллельных шпилек, что позволяет предположить одинаковый тип GC пар в обоих контекстах. Из сравнения энтальпии плавления psKl H psAT становится ясно.

Oligonucleotide

Ттах>, “С 5 тМ MgCl2

psN’i j-ctat«.c,(;g/. : З’-GA'l AlCCCi.

53±1

ЛИ.

AS4’ Agu,37V ЛН\

IS

1" (0.5) I' <0.5)

V I M ЧІМ

kJ/miil U'.nol kJ/moUbp kj. тої kj/mol 0.1 M G.iVLiCl 0.1 M UCl 0.< M'

\iCl

b.a

N.iCl

O. I M ‘чіС 1

4 :±1 47.5-1.0 1 tS-2<> 0.4H.-0.07 2.1 ±0.3 ПЗЫ- !>..'•! ^0.07

psN2 з'-стслсллслт-З'-GACTCATCIA-

psAT З’-АІАТАГАТАТ'.

З'-ТАТЛІ АТА 1Л

* З'-АТАТЛТАТАТ

Сі

З'-ТАТАІАТАТА'

* 3'-АТАТАТАТЛГ\

Hi

_____ .V-TATAIATATA-'

44+1

36±1

:‘>±1 35г1 ЫЧг1С 0 4?.0.01 1.6+0.2 10Ь±5 О.М^О.ОЗ

?±1 змліі.о :o3t:.‘> f-o.os і.бб^о.оч мо-іс (•••• •• о>

137+ 1» 1* О.^іО.Щ*

1 Gcrmann si аі.. 1У90, Biochemistry. 29. 942t> ‘>432

V • ' t

U/lV'!/hp

0.1 M \<!( '<

\ 56±0.0l<

Ї 16±>1 OS

1.3* I !

что ббльшая стабильность рвМ связана не с слК}С типом пар с тремя Н-связями, но носит энтропийный характер. Значительная разница (12* С) температур плавления Рб№ и р$№ предположительно также носит энтропийный характер и может быть объяснена разным числом АТЛЗС границ. В главе обсуждается особая роль ионов 1л* в стабилизации пар ДНК смешанного АТЛЗС состава.

§П.З. Особенности связывания лигандов с парДНК.

§11.3.1 посвящен связыванию бороэдочных пептидных лигандов-антибиотиков с параллельными АТ-содержащими ДНК. Поскольку моделирование (РаиаЫгатал) дает шаг спирали и межплоскостные расстояния АТ-пар ДНК близкие таковым для Уотсон-Криховской спирали, длина пар ТАТА участка ргЖ должна быть достаточной для связываний дистамицина А ф5(А) и нетропсина (№). Основная особенность вторичной структуры парДНК- близкая геометрия обоих бороздок. Бороздки ТАТА участка идеально изогеометричны друг другу, в отличие от существенно различных малой и большой бороздок Уотсон-Криковской двойной спирали. Однако, число электрон донорных и акцепторных групп в каждой из бороздок парДНК зависит от последовательности, например, потенциал связывания пар ДНК с аценииами в одной цепи и тиминами в другой (гомоА-гомоТ) различен в двух бороздках, поскольку N3 аденинов и 04 тиминов экспонированы лишь в одну из бороздок. В работе установлена необычная стехиометрия связывания борозаочных лигандов 2:1 независимо в обе бороздки ТАТА участка парДНК. На рис. 6 представлены спектры КД рзМ1 в низкой ионной силе (10 гпМ Ка фосфат, pH 7) при добавлении Э51А от 0 до 2 молекул (Рис. 6а) и от 2 до насыщения при 4 молекул лиганда на шпильку. Хорошие изодихроичные точки свидетельствуют о наличие только двух форм в каждом случае, свободной парДНК и 1-го типа комплекса с ИбсА на рис.ба, а при дальнейшем титровании (Рис. 66) 1-го и 2-го типов комплекса. Разностные КД спектры 1-го и 2-го комплексов различны (Рис.бс).

Ле(М‘ сп ) І Лс(М спі

*«уеІеп&йі (пт)

Ряс. 6а Спектры КД ріМ! при добавлении дистамшшном А от 0 до

2 молекул на шпильку.

10 тМ Ыа фосфат буфер. pH 7, !°С.

■ Рис. 66. Спектры КД рвЫ1 при добавлении дистамицином А от 2 до

4 молекул на Ч’ин'іг'у ! 10 іпМ Ыа фосфат буфер, і pH 7, 1°С.

Рис. 6с Разностные снеп.іи КД 1-го и 2 го типа комплексов дистамиціша А с рхЫ!.

Л е 320 пт

Первый тип комплекса является сильным и специфическим, а втором тип вытесняется добавлением соли (Рис. 7а,6) и. по аналогии с канонической ДНК, возможно отражает слабое связывание с СС участком.

1Ь тМ На рЬо*. ЬиТвг. pH *7 & 1етпр. 1 С

; ; ' •!. • _ -• >•-' 5 0

4 0

* . 1. . . . а|аАТАТСССТА-^ 3 0

20

фм / ! I 1 0

00

2 3

Рис.7, (а) КД в 320 нм но данным рис.

1 6а,б. (б) вытеснение

2-го комплекса добавлением ЫаС1.

О 0 к 02 03 0 4 0 $ Об

(N>0)

Стехиометрия связывания специфического комплекса с ТАТА участком равна 2:1, причем связывание происходит независимо в обе идентичные бороздки участка. Альтернативное объяснение стехиометрии - связывание з1с!е-Ьу-51с!с димеров в одну из бороздок- противоречит данным КД, спектры которою претерпевают, как показано в работе, специфические изменения с появлением новых изодихроичных точек при образовании тахих димеров па антипараллельных сайтах. Интересно, что в отличие от альтернирующей ТАТА последовательности, шпилька р*-С43'-<)(ААААААААААСССС-5’-5’-ТПТТТТПТ)-3'связывает только две молекулы 0>,(А в два 5-Ьр места, то есть в два раза меньше, что объясняется вторичной структурой и согласуется с данными других авторов. С помощью процедуры подгонки методом нелинейной регрессии уравнения закона действующих масс к экспериментальным значениям КД при 320 нм при титровании были определены константы ассоциации лигандов в преположенин независимого связывания в два мест» (Рис. 86 а.б.с). Результаты приведены в таблице 3. Сродство бороздочных лигандов к пар ДНК оказалось более,чем ш два порядка меньше, чем к канонической ДНК, что можно объяснить иными геометрией бороздок и решеткой реакционных центров.

I К1V-

(к Ь.шрт N I, (М М 1 »< 1

2 исм|к«ми< мгхт* ( («мина К 1»*с

<• '

; ••

I7 ' ■

-------1-------1-1-----------1..—„— 1----- »

о • К»* 2 Н) ли 4кч>* 5»о‘ МО

7 1Ы/ р1и . , ; , ,

|'>ы.1;!1)ап.

о клЯ.

------т------г------Т------(-----

2 •гяямсши! мест* с ршшиа

ре Ьигрт N 1, О 1 М 1иО.

/X*

О МО* 250* 110* 4 104 5 10 * 610* 7(0*

1 (1С1кф»1п/ Ьыгр4я

(.‘'ч’ст-^т!

Рис.Ха Кривые сынывания pi.Nl с Р^А а 0.1 М иС|, 1°С. Сплошные лимнн-георетические кривые

Рис.86 Кривые связывания р51М1 с нетропсином «0.1 М иС1, 1°С.

Рис.йс Кривые сим швания ар*ГЧ1 с нетроношом и 0 1 N1 иС1, ГС.

Связывание с лигандами может привесми к сдвигу термодинамическою равновесия форм в растворе, и стабилизации комплексов ли!аилов с миоогчевыми несовершенными антипараплелньнмми спиралями, что било показано для связывания АТ-содержащих параллельных дуплексов с лигандами (Ь'п1г5сЬе е! 1993). В работе было подтверждено сохранение параллельной ориенгаиии нитей рьЫ 1 в комплексе с РиА независимым фяуоресистныы методом. Для злого был

Нетропсин а Диетамидин А

Олигонуклеотид Макс.число N1 на 4-Ьр сайт 320 пт (М1 ст') к,„,с (ц М-1) К с л2 <т (Ц М-1) Макс-.число 051А на 4-Ьр сайт ЛсЬ ' 320 пт (М' ст') (ц м-1) К с л2 ли (и м-1)

psN 1 Э-СТАТАССОАТ ~Л З-САТАТСССТА 2 17±2 1.2±0.4 1.2±0.4 2° 2* 42.0±1.4 а 30.1*1.8 Л 5.8±1.8 0 1.1±0.1 и 5.8±1.8 а 1.1±0.1 а

ар^Ы1р 5'СГГАТАСССЛТ З'САТАТСССТА 1 24.7±0.7 2300±130 -

ар^АТ 5*-АТАТАТАТАТ Л З'-ТАТАТАТАТА - ' И 82.5±1.1 * 133±94 а -

“ в 0.1 М иС1, при 1°С; * в 0.6 М №С1, при 1°С

* Для сравнения КД сигналы рвссчитаны на одну связанную молекулу лиганда (а не нуклеотид). Величины определены как параметры подгонкой уравнения действующих масс к экспериментальным кривым.

С К, для первой и К2 т для второй молекулы лиганда оценены подгонкой уравнения действующих масс к экспериментальным

кривым ( Рис.7)

сишсшрован олигонуклеотид р.чЖ с амикпгруппамн'на обоич .V компах, тис чего Силы проведена реакция присоединения пирсн бутнрат сукеиними.и Мекиш НР1Х. выли очишенн н разделены шпильки с ковалентно присоединенными мотек;, ими иирена к обоим и ю н ко к одному ит З’-копцов. Комплексы ИИСТЯЧИ11ИНЗ Л С МС'ЧСПНЫМИ НО обоим копнам ииреном ШПН'Н К4МН р^М демон,. триров.ии иыьнын ниреновын .жеимерный ситал флуоресценции, свидетельств) юншй о непосредственном кочт^тс обон.ч исчс,ш\ З'-чочмоч Кишродьные комплекс!' М1"!ппш\ но одном) и) концов шпштех с дистамицином давали лишь слабый фоновый ситал, возможно за счет малых примесей атретатв

КОМПЛЕКСОВ.

В §11.3.2 исследовано связывание СЫА с предполагаемой необычной структурой ДНК- антипараллельной-параллельной комбинацией (АРС), в которой возможно образование полувитка параллельной спирали из пяти пат АТ пар, внутри обычной аптширадледыюй ДНК. Иснолыуя необычную стехиометрнк» святыкашм ПмА с пар ДНК, спектральными метлами было Подтверждено образование АРС структуры в комплексе с дистамицином А и определены константы ассоциации 510И) дшанда с А1’С..

В §11.3-3 представлены данные по связыванию ингеркаляторов с пар ДНК как юнцов, обнаруживающих особенности конформационной под<ш*.но<ли иарДНК рачичного нуклеотидного состава. Некоторые характеристики комплексов ЕШг с ДНК указаны в Таблице 1. Методом флуорнметрнческот титрования 6u.ni определены константы связывания и максимальное число пар но теории связывали* протяженных лигандов с матрицей конечной длины. Обнаружено пониженное сродство пар ДНК смешанного состава к интеркалятору ЕШг (Рис.9а, Таблиц! 4) по сравнению с альтепннруюшей парАТ последовательностью, которая свяилвзгт Е1Вг так асе, как и арьАТ и ар:>Ш (Рис.9б, Таблица 4). Возможные причини *гоп> объясняются в терминах особенностей вторичной структуры и динамит пар ДНК Били выведены в явном вше уравнения г(С,) в модели Заседателей н др., 1971, и определены параметры связывания их подгонкой к экспериментальным данным:

. (7АГ + 20А.'’Г,)С, „ , ,

* г = ОI) ■ ---------------—------ . N =9, I =3. или .

I + 7 АТС, + Ю(АС,)

(8/Г + 42Л!С, + 60АГ,(Л1 + 20А’,С'У’1

Г = 0.11 • --------------------г------------,-------. .V =4, I =2;

I + 8(А'С,) + 21(А'0,) + 2ЦКС,) + 5(ЛГ,)

Рис. 9. Кривые связывания Е1Вг в 0.1 М ЫС1, 3°С. Точки-экспернментальные данные, кривые- наилучшие теоретические кривые для эффективной длины лигаши=3 (А) и 2 (В).

Таблица 4. Параметры связывания Е(Вг

/, макс. число Ьр

Олигонуклеотид на связанный (М ')

Е1Вг

р&М* З'-СТАТАСССАТ

З-САТАТСССТА 3 <7.6±0.2)104

р*Ш* З-СТСАСТАСАТ

З-САСТСАТСТА 3 (8.2±0.2)104

рвАТ*’ З’ АТАТАТАТАТ 2 С

3-ТАТАТАТАТА (5.2±0.2)-10

ар«АТ 3-АТАТАТАТАТ С

5-ТАТАТАТАТА “У (5.3±0.!)-10

ар*\2* 5--СТСАСТАСАТ

З'-САСТСАТСТА 3 (6.4±0.3)-105

АД с(М сш ) # Дс(М сгп

11.4. О возможности конформаниппного перехода пар ДНК смешанного ЛТ/ОС иким при понижении активности воды. Компьютерное моделирование предсказывает стереохимическую ненромшорсчияость многих конформаций параллельной двойной спирали, в том числе с 2'и 3' «тк(о конформациями сахаров (Ильичева и’др., 19X9. Черный и др. 1‘МО, Курчвий, 1993). "А"-подобные конформации парДНК с 3' сп<]о сахарами в мсиыией степени отличны от "В"-подобиых парДНК с 2’ еш)о сахарами, менее наклонены и отодвинуты от оси. чем А формы ашниарадлельных ДНК и РНК. В работе иа примере относительно стабильной парДНК 5’-(1(СТАТАСССАТ)-375,-с)(ОАТАТСССТА)-3’ и контрольной антинарз-члельиой 5’ -(1(СТ АТ АСОС|АТ)-3'/3‘ -(1(0 АТ АТСССТ А)-5’ наблюдали кооперативные изменения КД спектров в ' водно-трифторэтанольных (ТФЭ) растворах при понижении активности воды (относ ителной влажности) (Рис. 10 а.б)..

20

-2 0

иа\с1спр01 (пт)

с’ ' ' сЬрз^ЬСОархМ

/г **• X у* ■*-«*»■ — — Л. —

' V \ • - \ < 1*

\

Г-»,!-,* л , * 1120.0 1 Ь ' — 62~ ГМ: —нгь'ттгп

220

2-ю 2Ы) 2X0

иаУс!спд1Ь (пт)

л»

»а»с1еп^1Н (пт)

Рис. 10. КД рч(а) и арч (б) дуплекса в 62% и 82,6% ТФЭ, ЗтМ №С1. 005тМ ЭДТА. pH 7.0. -ЗО'С. (с)Разность КД спектров рч и арч дуплекса в 624, 82,6'.1 ТФЭ,а гакле рч\1 и арч\1 в воде, 0.1 М 1лС1 (1°С) Огчегнм харзк терний вклал !гап\С>С пар в КД р> ДНК в 290-295 нм.

Характерное плечо КД в 290-295 нм во всех спектрах парДИК свидетельствует о сохранении параллельной ориентации шпей в водно-'ГФЭ растворах. Максимум "А”-подобного спектра нарЦНК сдвинут относительно A-формы aps дуплекса в область длинных волн, а амплитуда полосы уменьшена. Полученные данные были интерпретированы как конформационнын переход параллельной двойной спирали из В-подобной (Вр) в A-подобную (Ар) конформацию, кооперативное^ которого, по аналогии с ДНК, связана с изменением конформации сахаров. Были построены кривые Вр - Ар переходов как дачи Ар формы в образце относшелыю активности води в растворе н количественно оценена свободная энергия перехода, равная 7.4 ккалДтоль декадунлехсов. В пределах точности эксперимента и оценки эта величина близка к, свободной энергии В-A перехода антипараллельного декадуплекса изученной нуклеотидной последовательности. Полученные данные свидетельствуют о возможном полиморфизме параллельной двойной спирали.

§11.5. В разделе даны некоторые характеристики стабильных парДНК с минорными основаниями. Параллельная направленность цепей обуславливает не только возможность AT, AC, GT, GC комплементарности оснований с

образованием двух водородных связен в паре но и комплементарность минорных isoG и 5Mel-isoC с С и G, соответственно с образованием обратных Уотсон-Криковских пар с тремя водородными связями (Курявый, 1987). Показано, что параллельные ДНК с isoG-С и G-5Met-isoC парами могут конкурировать в

стабильности с канонической ДНК, это может определять некоторые биологические роли этих минорных оснований и открывает необычайно широкое поле их практического применения. Были экспериментально получены внутримолекулярные шпилын из олигонуклеотидов 3’-d(TC)6-5’-L-5'-(isodGdA)6-3’ (pstl) и 3’-d(AG)6-5’-L-5'-(5Mei-isodCdT>6-3' (psl2) и определены термодинамические параметры их

образования. В модели многих состояний свободная энергия образования на пару

оснований pstl Ag°( 37°С) = -6.6 кДж/моль пар (для' сравнения, Ag°( 37°С) = -4.3 кДжУмаль nap aps 5’- d(GA)s-L-d(TC)5-3'). Структура psl2 с G-SMet-isoC парами оказалась менее стабильной чем pstl, ее Ag°( 37°С) = -3.7 кДж/моль пар, что.

гушяко. срлринчо со с:аби тынк*?ы<1 ка пару оснований атипараллельчой 5’ ак'.А)*, I. ап( ц .Г

['М19й___Ш* тчлшпена парилсльпым (рекомбинантным) триплексам

П 1И10,10 МК,;П|>ибоНук’1Ст н.н м

В $.!!!. I пртюдена иснолыусмая в работе классификация триплексов и оиисыиэетг* '-*Уг»Т"р!?*.ГГ?Г7ПТ?-ЧЛЛ МиЛ^1«. К-ЫСсИЧчХкИС фИ1ШеКГЫ, и котормт

.м.4ажання 1рсп>еи нити связаны в узкой борошке Уозсон-Криковского дуплекса хутспшовскими Н-связями с одним из основании дуплекса, напваются

анпшпара.г.че.1ы1ыми тринлсксами, поскольку дпе олигопиримидииовме или слигопуриновые нити в них направлены антипараллельно друг другу. Новый тип триплексов, называемых параллельные (рекомбинантные) триплексы, аккомодирует любую последовательность основании, и связанная в широкой бпптмк* Уотеом-Хрим>ыкого .чунлекса трои* (К) ннгь папранлена нара.шелмю шччмич'и.й нити Л’у'аьии) Основания грет»о?* лиги <лтнны голороднычн гм<чми <. (/><ч?мн

1Ч^!шячи дуггкко <П(. и-/ч‘ланмг ра^тчичти заметим, чт ь ряд г нуь ги*;п*»й “|мр п,и.-'П'МЬ’мм" тимнаьчт \ кхелгколк- п нчопуриж^'Ыг тр?т!е.\сы »::« пн* <л »н>чачии. что трл I я (о;!ии>!1>р:>ч1./Н<^) пни. направлена пап<гпел!.но " •НЬЧПфИМИДИИОР.ОП ПИП! луплекса; г,)м Ж’рПЧСНТЛ П МОП МОДСЛЬЮ Л 14 ТМ1уЧ1 нич и

исследования триплексов с заданной ориентацией цепей служили олигонуклеотиды,

0<ии: Ч.а1ЧИЦ0СЧ \иНЛ<М И «.'.г. »I-1 ^ И. т Г. ИК.Ю.'ПЦИО 151 ПС;. ЛГ »< «М Л >

к-иалеыии сшших ненукде^иднымн грилиленгликолевымн линкерами. При этом включение идентичных нитей в два крайние положения однозначно определяло их параллельную взаимную ориентацию, а в среяи^е и р огпо :п концевых*

^нтмпара.п*д'Н ную (’ристанию:

(рагАТА) (ам1АА7),

d(CTCTCTCTCT)

С d(GAGAGAGAGA)-5'

3d(CTCTCTCTCT)-'N (umiAG)

d(GAGAGAGAGA)

С d(GAGAGAGAGA)-5-

5’-d(CATGCl'AACT)

s- d(GTACGATTGA) (parARB) s- d(TCAATCGTAC) (jhuCWC)

d(CATGCTAACT)-3’ diAGTTAGCATO-S1

Образование внутримолекулярных триплексов контролировали измерением поляризации флуоресценции при 3-4°С (см. Рис. 1, калибровочная прямая для 10-триплетных триплексов), при этом присутствие нежелательных примесей межмолекулярных структур обнаруживали но увеличенным значениям поляризации. Способность к образованию межмолекулярных структур завнеила от нуклеотидной последовательности, будучи наиболее сильно выраженной для обоих AG последовательностей. Модельный параллельный триплекс parARB оказался удачным выбором произвольной последовательности, практически не дающим межмолекулярных ассоциатов в отличие от белее пурин-богатой последовательности parCWC (в котором Watson и Crick нити триплекса parARB взяты в качестве Crick и Watson нитей, соответственно). Ионы MgJ* (в отличие от Мп2*) и высокие концентрации NaCl также сдвигали равновесие в сторону образования межмолекулярных структур, что подобно их влиянию на Ю-bp шпильки (Глава I).

Несомненным достоинством ковалентной сшивки нитей является сильная стабилизация внутримолекулярных триплексов по сравнению с тронными спиралями, образованных отдельными нитями, за счет понижения трансляционной энтропии системы. Как следствие, стало возможным экспериментальное наблюдение высокоэнергетических структур, которые в случае образования отдельными нитями плавились бы гораздо ниже 0°С. В отличие от нуклеотидных линкеров, вносящих в результате стекинг-взаимодействий в петле вклад в энтальпию системы, ненуклеотндные линкеры, по-видимому, меньше влияют на собственные энергетические параметры структур ДНК.

§111.2. Термодинамические параметры образования триплексов были определены в модели трех состояний, описывающей два последовательных перехода

олигонуклеотида из развернутой открытой нити (О) в Уотсон-Крикоиский-пуппекг +

ПСі.1''іМіІИ<Ч Ірсн.я ПИП. < 1>>. э иіем ч'ПЧ ІЬПі.ШИО ірор.^и ШПИ Ю^ю^ЧИЧИ к'ГЯ^М" С ТЛТ! ^ К С П ~ і і Ч.іСТЬК; С й^р.'іц'ЖЛІШ;. Ч 1 рИ; І. к'М а (Т'

Кр К 7

о<

(4)

Л іч ьимримп-екулчрныч 5Ч‘ре\п;зом ісмпер'^УР'1 плавлсиїя не 'іЛ2:і^:п концентрации и крипяя ппаилрния пписыйяртся упяйш»миі»м . * Лх ■ А,, • л7

Л(7"Ь

(5)

1 + А';) + К„ ■ К,

іде .^(7)- измеряемый спектральний параметр, Л", Л[’, А\ -его предельные значення для каждого из трех состояний. Уравнение (5) можно выразить как функцию семи независимых параметров - энтальпии, энтропий двух переходов и трех предельных значений и определить эти параметры попгонкой

КрМі’МЧ )р.і‘.НГ!іНЧ І ^ • Ч .)*•',> і-“рИЧНЧ ■';! РЧ I ‘ >'4Г Ь< И- • ’> МЛ *

* Г ,м .н ■-2

г: і г'.:сі ^пипчи і:і.ичм гс'пнч'и / 1{ / } ■ Лі*

- —.( \ J

‘Ч)рІ‘;.Є Ч'МИ і іСрчОДИН-і^М-Н*'. КіР і! «р-т.,1 ( ' 1'Н І*;!"'<1, «

і;р\';р;і\'чу. )'Ш:і,’ваюш\к- линеш!)ю иь:к лч>ч-п. продг. ім:м\ тачаній .і[‘ ;і Г от ;:?чпсраг\ры и г:м л’лліч гк.':.".ча і”і:с дг.е иерсчегіш<х ;Л >лїгп, 1УУ6). ^га программа дала качественно сходные результатів в пределах

‘чемгрнч'-’н 1 і !• (•{.Iу «т.леглч^слічі М і р;і,- і І мрі1- аіг‘р-<чі-ч7 -і л нс я н н*''[' ‘ іі*ч-;.'к.ач кр(:ны'- 'і и*< іипгі рл: Ч^П

73

є

о

2

Рис. 11. Кривые плавлення

рагЛІШ по поглощению в

259 мч

ІсшрсгаШгс (*С)

внутримолекулярное плавление третьей нити, что следует из измерений времен врващательной релаксации. Определенные термодинамические параметры структурных переходов этого и других триплексов даны в Таблице 5.

Таблица 5. Термодинамические параметры структурных переходов внутримолекулярных триплексов

Олигонук- Триплекс-дуплекс Дуплекс-открытая нить

леотид

АН”, Д5°. т„ АН° ДХ°, Тш

(кхал/моль) (илМ'К'1) (°С) (ккал/моль) (кал-М'1 К1) (°С)

0.25 М №С1.10шМ N8 фосф. буф., pH 7

аппАТТ (0.1М) ■ 19 63.5 26 60 183 54.7

ашПГТА (О.Ш) 42.2 139 ЗОЛ 42.5 130 56

ап»АТТ 34.2 112 34 41.6 125 60.3

рагТАТ 14.4 49 20.9 50 148 62.4

ап^ААТ 14.1 46.8 28.3 50 149 • 60.3

рагАТА 14.5 46 32.6 46.3 138 63.2

рагТАС 25.5 86 22.6 50 149 62.6

апЦАС 31.6 101 39.2 49 126 83.4

рагАв 27.8 94 21.8 48 136 76

рагАИВ Г0.1М) 11 37 23.5 ±8 56 163 72.5

10 тМ МпСЬ

аг.ИАТТ 35.5 114 39.2 50 150 58.1

рагТАТ 31.8 109 19.6 50 151 55.4

рагТАС 34.9 111 413 49.5 151 57.2

апНАй 26.9 88 31.6 . 52.2 151 72.0

рагАС 19.6 65 27.9 50.5 147 70.5

рагАЯВ 33.7 112 29 49 145 65

parCWC ИА 34±2 52 155 63

Ошибки: ±2 ккал/моль для АН", ±6 кал'М'1 К'1 для 4У" ±1 °С для Тт.

Из этих данных следует, что параллельные триплексы существенно менее стабильны, чем антипараллельные. Так, разница свободных энергий образования рагАС н апПАО в 0.25 М ИаС1 при О‘С ДДС°= 1.9 ккал/моль; отношение констант образования ехр(-ДДС°/КТ)=0.03. Следовательно, в случае образования триплексной

структуры из отдельных нитей данной последовательности лишь окало 3% всех триплексов были бы параллельного типа. Исключение представляют АТА триплексы, стабильность обоих типов которых близка в 0.25 М NaCl. Теоретические оценки предсказывают различную стабильность изоморфных триалетов параллельного триплекса: GCG>ATA>TAT2CGC. Экспериментальная оценха вкладов различных триплетов в свободную энергию образования R-ДНК приведена в пункте 111.4. Гетерогенность структуры парДНК с нерпулярной смешанной последовательностью parARB приводит к усложнению формы и значительной ширине кривой плавления триплекс-дуплекс.

Теоретически предложенная схема АТА триплета была подтверждена методом ИК спектроскопии в совместной работе с лабораторией Э. Танлландье. Дополнительную информацию дает метод КД (Рис. 12, 13). Разрыв водородных связей третьей Т нити с АТ дуплексной частью в anti ATT (Рис. 12а, кривые 1 и 4) приводит к небольшому уменьшению амплитуды полосы в 250 нм (характерному для некоторой потери стекинга) и большим изменениям «чтит>;ш к формы длинноволновой положительной полосы, свидетельствующим о сильном изменении взаимной ориентации моментов переходов оснований, которое мотет затрагивать и сам Уотсон-Крлкииский дуплекс. КД спектр раг'ГАТ при З'С (рис. 126) напоминает по форме КД спектр antiA.1T, но при несколько более высокой температуре, возможно, более раскрученный. Получены также спектры КД parARB триплекса (Рис.13). Изменения спектров КД при нагревании <ц 0 до 40'С (рис. 13, а) можно интерпретировать как ослабление стекинг-взаимодействий оснований. Эти изменения были объяснены диссоциацией третьей нити. Измеренный пкролингми'.лкяй обгем стргугтурм при З'С рзггн таковому то япти ATT, >rro свидетельствует о теской связи третьей нити с дуплексом. Тем самым, наблюдаемый эффект не может объясняться "плалпением” несвязанной третьей нити. Интересно, что отход или присоединение третьей нчти не ведет к качественным изменениям формы спектра КД. Эго можно объяснить усреднением сигнала от всех разнообразных контактов-ближайших соседей в триплексе. Этот “усредняющий” эффект хорошо известен для двойной спирали ДНК с произвольной

последовательностью оснований. Второй переход при температурах выше 40'С - это

пчааление дуплексной части, связанное с еще более драматической потерей

взаимодействий моментов переходов основании и выражен более ярко.

Рис. 12. (а, слева) КД агшТТА 10 шМ N3 фосф. буфер, pH 7. ■

1-0.1 М ЫаС1, 6'С; 2-1М ИаС!, 6'С; 3-10 шМ Г^С12 ,6"С; 4-0.1М N301, 40’С.

(б, внизу)- сравнение КД рагТАТ и апПТТА.

X (nrn)

wavelength (пт)

wavelength (пгп)

2)0 230 250 270 290

' wavelength (nm)

Рис. 1.3. (а,б) -Температурная зависимость спектров КЛ parARB п 0.1 М Nad, 10 шМ Na фосф. буф.., рН7.

(с) Плавление parARB но КД. Ордината - КДэд НМ (D-

КД212им(^8’С) И КД;я,шП)-

temperature (°С)

В п. W.3. описаны способы стабилизации R-формы ДНК. В предыдущем разделе было показано, что стабильность параллельного триплекса с произвольной parARB последовательностью низка. Стабилизация структуры была достигнута путями, эффективными и для стабилизации канонических триплексов: действием катионов щелочноземельных металлов Mniv и Mg1* (см. Таблицу 5) и поликатиона спермидина. В 0.1 М растворах спермидина Тт триплекса parARB поднялась до 36-37’С, энтальпия плавления Д#°=50±2 ккал/моль. энтропия Д5°=142±б кал-

моль"1-К"1. Однако и в этих условиях белок-независимое образование параллельного триплекса из отдельной нити н дуплекса ДНК оказалось практически невозможным.

Основной проблемой, на которой было сосредоточено дальнейшее исследование, было выяснить, возможно ли в принципе образование R-формы ДНК с произвольной последовательностью из отдельных нитей или, другими словами, возможно ли сайт-специфическое узнавание нативной ДНК произвольной последовательности олигонуклеотидом через образование параллельного триплекса в отсутствие рекомбинаэ. В работе был применен (см. следующий пункт) специально модифицированный подход (впервые разработанный для канонических трнплексов Хеленом с соав.) повышения сродства к ДНК-мишенн без потери специфичности узнавания - использывання коньюгатов триплекс-формирующих олигонуклеотидов (ТФО) с иктеркаляторами. Благодаря успехам фосфорамидитного синтеза появилась возможность включать интеркалятор на достаточно длинной гибкой ножке не только на У или 5’ конец ТФО, но и в сахаро-фосфатный остов внутри его цепи. Для конструирования наиболее эффективных ТФО-конъюгатов было необходимо определить, какова оптимальная степень их насыщения интеркаляторами. Между тем, в литературе не существует единого мнения, стабилизирует ли такой классический интеркалятор, как EtBr, канонические триплексы, или дестабилизирует. На примере модельных трнплексов parARB и antiATT было установлено, что пропиднй иодид (PI), EtBr , АО могут в зависимости от степени заполнения как стабилизировать, так и дестабилизировать триплексы обоих типов. Растворы трнплексов и контрольных гомологичных дуплексов при 3°С были протитрованы красителями. Параметры связывания, константы ассоциации А'ш, и максимальное число л триплетов оснований на молекулу связанного красителя были определены двумя способами. Один из них -подгонкой (fitting) к экспериментальным данным теоретических кривых в рамках двух моделей -МакГи и фон Хиппеля (1974) для связывания протяженного лиганда с бесконечным гомоплимером и Заседателева с соавт. (1971) для связывания протяженного лиганда с гомополимером конечной длины (кривые связывания EtBr и АО ) Кривые связывания Р1 анализировали в рамках модели гетерополимера,

7]ЛМЯЛ‘

«іпелитчга*»• надиміте трех рзітгмх кгистпігг сяг?»>:вз:пи" Сро:к'\іо х]..йїггс:к*й н ДО «'♦ иаисі, н Г! [м«а вите :іи рагЛКН, чом ллч іомолппічч»-»:*» л-гги?и\і »і н М) ; чи ииик- дія ашіЛТТ. чек' ;ич и^чпо!н мимо ечу дчі’ЛсН’л Констангз сйї ,ді‘.аи!<* рлЛНВ г ІМ. обіалаюшіто ,юг?о шшолміон Гмжок'ь-і по.ш.*.н1ельмп улрчьхглюі) ! «ч'іг:1 *■.'•;і !і 10 р.и г.:ко;г\нл л-ы ЛїїК Н р^иче пршчмг н:.’ 'ч/мнчч

.' Р ’!' > і і .; і V \,і.]\-.Кі1'рНСІ]!К ф.і)ОрС-Л;Сі;:*И;і і; ііираМСГрОЬ ІптиЬівсіНИХ. ЬыЛИ

пассчктйіім Лп6яшід#»кім#* ітііійитлїіііпі уп^ит-п;.!» ? ^

;» цси.ісм олііоіі, ,іпу\, іреч или иольтеїи числа молекул кажлого из крчситслей с молельными триплексами, приготовлены и проплавлены соответствующие

комплексы. Важно, что одна и две молекулы ЕіВг и АО (или до четырех РІ), связанные с тршілексамн длиной 10 триплетов стабилизировали структуру трнплексов, тогда как третья связанная молекула ЕіВг и АО, или пятая Р1, силыю дестабилизировали триилексы обоих тнпоя (Рис. 14)

-V ; : . ■« Г»;ч 1-І » е'*«»Г{М1\(Ч1

> • * ' ’ V ч' •*

~ ■ ‘ ' 1 їймл^гн*?'* г.

ч і , *

і - 4 ", «пкг гскі оп

4> I '

■>(| т - . ^ ин«ч,{‘Г'.л.г-амр.,1‘-?м.

' 25^'-'І і \І - \ 0.1 М N30, 10 гпМ N3

15

10

і : -К-

, |мгП'(;,ЛО А апЬАТТ> АО

і

о ; г з 4

Среднее число і!іпх;рка;ііірч>і'3іпиах молекул крэсии'.ш

Пре;;ггаожснп, что ннтеркаляпия трсм.і-й моїгк^лі.і ПВг ній А*-) на 10 іріш'нті'и индуцирует значительные конформаиионнме изменения тройной спирали, связанные с ее растяжением и раскручиванием, которые ослабляют связь третьей нити с дуплексом. В работе даны термодинамические параметры плавления комплексов

тригыексов с красителями, полученные в модели грех состоянии. С использованием теории Франк-Каменецкого и Карапетяна, описывающий плавление ДНК (в нашем случае переход триплекс-дуплекс) в присутствии малых концентраций протяженных скрепок, удалось независимым способом по сдвигу и уширенню кривой плавления триплекса оценить энтальпию образования рагАЯВ триплекса. Эта величина совпала в пределах точности эксперимента с энтальпией, определенной в модели трех состоянии (Таблица 5).

§.111.4. посвящен узнаванию фрагмента нативной ДНК олигонуклеотидом при помощи получения межмолеку.пярного триплекса, аккомодирующего все четыре основаниям. Был выбран 14- Ьр фрагмент 1ена белка цинковых пальцев НТР10 человека, включающий все четыре основания, и сконструированы ТФО конъюгаш с разным числом (от одной до трех) молекул 2-метокси,6-хлоро,9-аминоакршина (Асг) и/или псоралена (ряо) , включенных в разные положения в сахарофосфатный остов на гибких пентамешлеиовых ножках. Бьч! также исследован ТФО, включающий две молекулы красителя фенантридинового ряда метндия (МеО на тетраэтиленгликолевых ножках. В качестве мишени были синтезированы 16 Ьр двойные спирали в виде шпильки или дуплекса, а также контрольные двойные спирали с изучаемой последовательностью в антипараллельной к ТФО ориентации и с неспецифической последовательностью.

ТФО-ннтеркалятор конъюгаты

Г^Нг-Ь-б ’ - АО ААТйТСОС АААО-З1 -1-Дм МНтЬ-З'-АСААТСТООАсгСАААО-ЗЧ-Асг Шг-Ь-З’-АОААДсгТСТОСДаСАААО-ЗЧ-Аы: Р80- 5'-АОААТПТОСАсгСАААО-31 -Ь-Ш;

Р*ь -У-А0АААсгТСТС0АсгСААА0-3'-Ь-№Ь

рБО-Асг ■ рБ0-2Асг

55-ЗАсГ

бз-Асг

55-2Асг

Р*ь 5‘-А0ААТ0ТС0САААС З’-Ь-ЫНз 5’-СТТТС1ССАСАТТСТ-Аис-3'

вв-СТ-Асг

5’-АСААМ£|ТОТ(КЗСАААМ£10-3’

55-2Ма

NH-)-L-5*-A*GA*A*TGTGGCA*A*A*G-3’-l-Acr где A1 -2.6-диаминопуріін

Мишени

NH2-L-5 ’ -CAGAATGTGGCAAAGG W strand

З’-GTC TT ACACCGTTT CC ^ С strand

KH2-L-5’-CAGAATGTGGCAAAGG-3’ VV strand специфическая мишень (ds)

З’-GTC TT ACACCGTTT CC-5’-NH2 С strand

5'-GTC TT ACACCGTTTCC .. антипараллеьная мишень (aps)

3 ’-CAGAATGTGGCAAAGG

5’- GGTTCTTC TAGTCGTC неспецифнческая мишень (nsp)

3 -CCAAGAAGATCAGCAG ^

Образование триплекса детектировалось и кажущиеся константы его образования определялись как в. растворе по тушению флуоресценции и возрастанию анизотропии интеркалированного Асг, так и количественным неденатурирующим гель электрофорезом в ПААГ при 8°С. (Рис. 15 а,б,с). После фореза собственная флуоресценция ТФО-красителей в геле детектировалвсь CCD камерой через соответствующие оптические фильтры, тем самым, на левых А частях Рис. 15а,б,с визуализированы положения только. связанной с красителем третьей нити и ее замедление при' связывании с дуплексом. Затем гель прокрашивали бромистым этидием, что давало возможность через фильтр 615 нм в случае ТФО с Асг и pso визуализировать положения только многонитевых структур (правые части В рис. 15а,б). В случае связывания ss-2Met, часть В Рис. 15с демонстрирует через фильтр 615 нм все полосы, как положения связанного с метидием олигонуклеотида, так и прокрашенные этидием после фореза полосы дуплекса и триплекса. Благодаря положительным зарядам метидия, хорошо разрешимы полосы медленно мигрировавшего к аноду триплекса и полос избытка незаряженного дуплекса

38

специфическая мишень (hp)

16% PAAG; 8‘C;

10 mM Mg, tris borate pH8

0 1/4 1/23/4 1 2 3 4 5 6 aps nsp

ds: 0 1/4 1/23/4 1 2

12 3 4 5 6

3 4 5 6 aps nsp

7 8 9.110.11 12

1 2 3 4 5Г.6. 7 J8- 9"J10 111 12

triplex

ss-Acr

Intrinsic fluorescence of the Acridine moiety Fluorescence of the gel stained with at 520 nm Ethidiuni bromide at 615 nm,

selective detection of the multi-stranded DNAT

Рис. 15 а. Связывание NH2-L-5’-AGAATGTGGCAAAG-3 -1-Acr (ss-Acr) нити со специфической мишенью (hp)

NH2-L-5’-CAGAATGTGGCAAAGG (дорожки 1-10) и неспецифическими aps (дорожка 11) и nsp (дорожка 12) мишенями. З’-GTC TT ACACCGTTT СС

Concentration of the ss-3Acr conjugate is the same in all lane: 14.4 \iM j ^ C/c p,\ A(i, x "C

10 mM M<j, tris borate, pH 8

Ods UA i/2 3/4 Ids 2 3 4 5 6 aps nsp

123456789 10 11 12

Ods 1/4 1/23/4 Ids 2 3-45 6 aps nsp

1 2 3 4 5 6 7 3 9 10 11 12

Intrinsic fluorescence of the Acridine moiety at 520 nm.

Acridine is fluorescing when Intercalated between AT A triplets

Fluorescence of the gel stained with Etliidiuin

bromide at 615 nm for selective detection of the multi-stranded species in lanes

Рис. 15 б. Связывание NH2-L-5’-AGAAA£cTGTGGActCAAAG-3’-l-Acx (ss-ЗАсг) нити со специфической мишенью (hp)

NH2-L-5 ’-СAGAATGTGGCAAAGG -ч (дорожки 1-10) и неспецифичеекими aps (дорожка 11) 11 nsp (дорожка 12) мишенями. З’-GTC ГГ ACACCGTTT CC J

0 l/2ds Ids 2ds 3ds 4ds 5ds 6ds 8ds lOds aps nsp 0 l/2ds Ids 2ds 3ds 4ds 5ds 6ds 8ds lOds aps nsp

1234 5 6 7 8 9 10 I! К 1 2 3 4 56789 10 11 12

;V-

c t i jt: & *

Я9»»ф.

A: Intrinsic Me&kJium fluorescence B: the gel stained with EtBr*

Fluorescence was registered at 615 nm

15 с. Связывание 5’-AGAAMetTGTGGCAAAMetG-3’ (ss-2Met) нити со специфической мишенью (ds)

5’-CAGAATGTGGCAAAGG (дорожки 1-10) и неспецифическими aps (дорожка 11) и nsp (дорожка 12) мишенями. З’-GTC TT ACACCGTTT СС

(Рис. 15с) 'Концентрация ТФОлштеркалятороя то всех дорочеках била постоянна; г концентрация шпилек- (или дуплекса- на рис.15с) мишени увеличивалась от О (дорожка I) до 8-кратпого избытка . Дорожка ! 1-добавлен 4-6 кратный избыюк контрольной антинараллельной мишени, дорол.ка 12- неспецифической мишени. Очевидна высокая селекгипность свяшвання к идентичной шкледователнкнпн.

Была количественно опрделена интыральная илопгость одноткжсйь;х ТФО-

И’ПТргЯЛЯТпр ЛМПГ Я У'"'"Т ’отрп пРрп~ПГ Г?ТГЙ ТТГТГ-г) Г

NlH-iшage и построены кривые связывания. Некоторые примеры даны на Рис. 16.

Путем подгонки (фиттинга) теоретических уравнений закона действующих масс к экспериментальным точкам были определены параметры связывания ТФО с мишенью - константы связывания и стехиометрия, равная 1:1 в пределах ошибки эксперимента (Таблица 6). Сделаны выводы относительно влияния типа ннтеркаляторов, их числа и места включения на стабильность триплекса. В согласии с результатами предыдущего пункта, включение 2 молекул акридина вместо одной повышало сродство к мишени (сравн. $$-2Асг и 55-Асг), а включение

Таблица 6. Константы диссоциации триплекса ТФО-нптеркалятор+мншсиь 8-10°С, 16% PAAG, 10 mM Mg, iris borate pH 8

ТФО К diss, |дМ нитей Ошибка, цМ

ss-3’-Acr 41.6 6.9

ss-ЗАсг 33.0 8.8

ss 2,6aminoPu-3’-Acr 6.9 1.8

ss-5’-pso 41.5 20.3

ssCrick-З’Асг 133 32

ss-2Mclhidium 7.7 1.8

третьей це давало преимущества (ss-ЗАсг). Включение двух молекул метидия било наиболее эффективно. Связывание по 3' концу Асі или по 5’ концу псоралена давало одинаковый результат.

На основании анализа экспериментальных даншм для различных ТФО можно сделать выводи о зависимости стабильности R-формы от последовательности. Согласно схеме водородных связен в триплетах, замена эденинов на 2,6-днам:;ііоііурнііи должна привести к образованию трех водородных связей Л* с основаниями дуплекса вместо двух водородных связей у аденина. Тем самим стабильность такого триплета должна быть близка к стабильности самого энергетически вьн одного GCG триплета, в кагором гуанин связан тремя водородными связями с основаниями дуплекса. Действительно, сравнение свободных энергий образования всех изученных 14-нт последовательностей (с одним концевым Асг) позволяет сделать некоторые выводы об Екладе различных триплетов (Таблица 7). Оценка вкладов различных триплетов: AG° на один пиримидин =0.32ккал/моль, AG° на одни адешш =0.32 + 0.013=0.33’ ккал/моль, AG° на один гуанин (или 2,6-диаминонурин) = 0.33+0.167s0.50 ккад/мшіь. Относительная стабильность триплетов

для триплекса данной ппоп«ич>атм»"Г7И • горсгао"' горр<-:ыруёт" с’ радом г і лГн.іі.іш' і її і рнсю її* чр.м'к.* енні їм для рягДНМ гріч-лгксг Мтгркклчшт ягпі<т.из » л*тп:х '5КГПСрИМ«НІДМ.ІІІ.ІЧ условиях ЛЛЄ І ЯМИгрші СРЧГ-ПЯИИ", оксрпш !,р!іблі. ІИІе'ІІ.ІІО 0.2 КХал/мОІЬ.

і а/иіпіп 1. Сні'Г’іктич жерпія диссоциации ірс.ьн* нніен, игсуших одни

ТФО

К ви, ЛІ

М°, д 0

кхал/моль АС -АС (\Valwn нити) нитей 8°С

їв-Асг

(2.4±0.4)10

5.67

0 А-.* о

■()

■і 67

/7 0-.

І'!. ІЬ? И.'V!

II і ОТЧ’* І ІЧ'Р І.') І о.)

55-СТ-АСГ -0 7? ГГЯЛ

’' ' _______________II -I ;.у< чм.ч I.-) Ь\ ;

В п.ПТ.4 приведены полученные независимыми методами доказательства

ь,, „< ..куил>1Г ’.чд ’снил |очот'.;т.чнпи ним1 :■} ^гс:х

ПЧ1.1 '\iuinJ нн'чмо!:" г '<'р,Г'(";;;'1:к'ч 1К'П'Н,'| V',сон Крли некого Л}:П!.х--х При 1ЫП!,|<’’М эле>г:ро'^оре^с не ночрляег,.!» полоса сг^С'Ольой 10- нук-т.'отщшс!! тгги 1.111*. сыэыьшши ТФО-ишерьааггср ксиыигато» с 16-1>р jtyiuien.coM, что прямо свидетельствовало бы о вытеснении гомолишчной шгти. Кроме того, были проведены эксперименты по химической модификации тетрокекдом осмия

триплекса и контрольных дуплекса-мишени и Уотсон нити. Было показано, что тимины Уотсон нити в триплексе полностью защищены от действия модифицирующего агента, что исключало возможность вытеснения этой нити в раствор при связывании третьей нити. '

В главе суммируются полученные данные, свидетельствующие о получении новой R-формы ДНК на внутримолекулярной модели и в межмолекулярной системе и делаются выводы об особенностях этой конформации.

Я заключении кратко подведены итоги работы и намечены новые направления исследований.

Я приложении кратко изложен multi-state формализм перехода спираль-клубок.

I. Исследована и охарактеризована новая двойная спираль ДНК- параллельная ДНК, определены условия ее существования и термодинамические параметры ее образования.

1. Экспериментально доказано существование параллельных ДНК (парДНК) на модельных олигонуклеотидах, состоящих из двух нитей ДНК, ковалентно сшитых гибким ненуклеотидным линкером достаточной длины, причем ориентация нитей ДНК в такой внутримолекулярной двутяжевой структуре однозначно задается химической структурой.

2. Впервые обнаружена зависимость стабильности парДНК не только от

AT/GC состава, но и от последовательности оснований. Наличие трех последовательных GC пар обеспечивает термосгабильность парДНК ббльшую, чем у АТ-содержащей парДНК, тоща как изолированные GC пары дестабилизируют парДНК. .

3. Исследованы комплексы ДНК природного состава оснований с лигандами различной природы - как связывающимися в бороздки ДНК , так и интеркалирующими. Впервые обнаружено независимое связывание дистамнцина А и нетропсина в обе бороздки ТАТА участка, что является специфическим маркером

10. Tchurikov N.A., Shchyolkina A.K., Borisova O.F., Chcmov B-K. Southern molecular hybridization experiments with parallel complementary DNA probes. FEBS Utters. 1992, v. 297. p. 233-236.

11. Borisova OF., Shchvolkina A K., Timofeev E.N., Floreniiev V.L. Evidence

for tctraplex structure formation by repetitive d(GT)n DNA sequence. FEBS hit,, 1TC. \ 306, p 140-142 ------- - - -

12 Ьпрнсона О Ф . Щепкина Л.К., MjMaeRa ОК., Лысов, 10. И, Черн»4й,

Д.А... Горин Д.A.. 'Ьыофсси 3.H., Флорснгьсв. ПЛ. Структура повторяющихся d<Glin роследовйтелыюстей с nap.iLie.ii.HMMK к энтгшараллельнмми пенями Miпск\лярн(1ч био.кк'и.ч, 1992. т.26. с. 452-46^

13. Щелкина А.К., Борисова О.Ф., Чернов В.К., Чуриков Н.А.,. Конфорчамионныи переход параллельной ЛИК в pact порах с помиренном ,*к « и.-жнлью ноли Л/< > н-м. 1 чрт '.я Сиологич, 1992, г 26, с 1344-1348.

14. Борисова О.Ф., Щелкииа, А.К., Чернов Б.К., Чуриков Н.А. Ог,"'сг*те,?».*М!! ст*!б*гтмюст!» АТ и ПС ппр я пзрапслмгоГС природной Д!!К. ДЛИ

1^2. т V6. с KlHS-H»o.V

15. Щелкииа А.К., Мамаева O.K., Борисова О.Ф., Лысов, Ю. П., Тимофеев

Э.Н.. Ильичева И.А., Готтих Б. П. , Флорентьев BJT. Трехиепочечная скрепка из

олишпуклеотила 3-(dA)i0'pO(CH2CH2O)3p-{dT)|0 pO(CH2C!l2O)3P'f(^^10-5'. Молекулярная биология, 1992, Т.26, с.1314-1326.

16. Borisova O.F., А.К.Shchyolkina, В.К. Chernov,N.A.Tchurikov. Relative stability of AT and GC pairs in parallel -stranded DNA duplex formed by a natural

sequence. FEBS Letters, 1993, v.322, p.304-306,

17. Borisova О Г . Shchvolkin* A К Timnfp^v F N , Flo*-enti**v V f FviJ^ncr*1

.'i>i ;i!i; icibiptwx NtnJciurc of the d'(jT)n г с | v* t! 11 v rr «.еоиспее in solution J t4 ihnrnnl : 4 Ih -i . v ■(), p a01 7

'AK, О Г L4>!!sc.'..i, В K,( W rnov. N A Tthunkov. The • onK-ntvio: \l 'jI pjrJlct l3N.\ i:i •-oi-jiun zi low M;i;cr ап-чеу ./ <//

l<> >,r„. * ,v />',» , .. !<), p -.1X2.

sO Sh- hуt)]kinA К , — .Horisow., В К Ou*rno'-\ N.A.Tchunko- Parallel stranded DNA with mi*cd st*qucncc. r.vidence for conformational transitjon in -ioludoi) !o,v \>,,'4'T j 111 v i г v j V (rmtiic f)\n, 1994, v M. n. ’237-1250

‘20 5>hch\o!kin.i А К, Mamavc’-a ОК.. Borisova O.F, Il'icheva I.A, Timofeev E.N., Gottikh B.P., Florentiev V.L. Three-stranded Clip of the

С!ч:огпк Voik.'1 T--'-iA i 'Of Cl nCII^O; ;p uJT <ru pO- CM2^*M?0Mp id Г) j о 5

A^intrr.f h S l)c\ t'l.'pmt'ni, 1994. \ J, p 27-33

21. Shchyoikma A.K., fc.N. fimoteev, O.F.Borisova, I.A.fJ icneva, fc.E.Minyat, E.E.Khomyakova. V.L.Florent’ev. R Form of DNA does exist. FEBS Letters, 1994, v. 339, p. 113-118.

22 Shchvolkina AK. OF Borisova. V I, FVveni'ev* Stabilization of parallel

mple\ or R-b>rm DN.\ lntercalator propidiurn iodide Ahs’racis of 'he Heventh

International Rn-jnd T^ble "Nu>.b.'OM(iev nuJcoiiJcs and ineir .ipplKJNons", 1994. p201.

23. Borisova O.F., Shchyolkina A.К., Timofeev E.N., Tsybcnko S.Yu., Mirzabekov A.D., Florentiev V.L.. Stabilisation of Parallel (Recombinant) Triplex With Propidium Iodide. J. Biomol. Struct. & Dynamics, 1995, v. 13. p. 15-27.

24. Shchyolkina A.K., Borisova O.F., Minyat E.E., Timofeev E.N., ll'icheva I.A., KhomyaJcova E.B., Florentiev V.L. Parallel purine -pyrimidine-purine triplex: experimental evidence for existence. FEBS Letters, 1995, v. 367, p. 81-84.

25. Shchyolkina A.K., Borisova O.F., Timofeev E.N., ll'icheva 1.А.. Minyat E.E., Khomyakova E.B., Florentiev V.L., Jovin T.M. Intramolecular parallel (recombinant) triplexes formed by oligonucleotides with non-nucleotide linkers. J.Biomol.Struct. & Dynamics., 1995, v. 12, p. a214.

26. Dagneaux C., Shchyolkina A.K., Liquier Florentiev V.L., Taillandier E.. A triple helix obtained by specific recognition of all 4 bases in duplex DNA can adopt a collapsed or an extended form.-C.R. Acad.Sci. Paris, Sciences de la Vie/Life Science,

1995, v. 318. p. 559-562

27. Shchyolkina A.K., Minchenkova L.E., Minyat E.E., Khomyakova E.B., Ivanov V.I., and Jovin T.M. Distamycin-stabilized formation of the antiparallel-parallel-combination (APC) DNA: a half-tum parallel-sranded segment embedded in antiparallel-stranded DNA. Second Russian-German Symposium on Protein-Nucleic Acid Interaction, 1995, Abstr., p.27-28.

28. Борисова О.Ф., Щелкина, A.K., Тимофеев Э.Н., Флорешьев, ВЛ. Димеры

триплексов ДНК. Молекулярная биология, 1995, т.29, с. 1076-1085. ‘

29. Shchyolkina А., К., Amdt-Jovin D., Jovin Т: R-DNA formed by 14 bp fragment from human HTF10 gene. Progress in Biophysics and Molecular Biology,

1996, v. 65, suppl.l, p. 69.

30. Dagneaux С., H. Gousset, A.K.Shchyolkina, M. Ouali, R. Letellier, J.Liquier. V.L.Florentiev, E.Taillandier. Parallel and antiparallel A*A-T intramolecular triple helices. Nucleic Acids Res., 1996, v. 24, p. 4506-4512.

31. Borisova O.F., Shchyolkina A.K. Intercalation of ethidium bromide into short DNA hairpins: effect of hairpin-hairpin dimerization. J. of Biomol. Struct. & Dynamics,

1997, v. 14 , a023.