Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Двойные и тройные спирали олигодезоксирибонуклеотидов с параллельной ориентацией цепей

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Щелкина, Анна Кирилловна, Москва

Президиум ЗАК Pocxj,:

(решение dt" ¿1 ' lô-Éfr., Na

ярисудил ученую ст>т1<л;.>Дс i 1 OPA

HafüAí ii j< управления Б *

<Рс

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ЩЕЛКИНА АННА КИРИЛЛОВНА

ДВОЙНЫЕ И ТРОЙНЫЕ СПИРАЛИ С

ОЛИГОДЕЗОКИРИБОНУКЛЕОТИДОВ С ПАРАЛЛЕЛЬНОЙ ОРИЕНТАЦИЕЙ ЦЕПЕЙ

Специальность 03. 00. 03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

На правах рукописи

Москва - 1997

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................4

ГЛАВА I. Экспериментальные подходы к получению и исследованию

высокоэнергетических форм ДНК...........................................................12

§1.1. Методы характеризации равновесных форм в растворах

олигонуклеотидов......................................................................................13

§ 1.1.1 Время вращательной релаксации или

гидродинамический объем олигонуклеотида.................................16

§ 1.1.2 Определение доли неспаренных оснований.......................21

§ 1.1.3 Определение взаимной ориентации нитей......................23

§1.2. Экспериментальные условия, способствующие образованию

внутримолекулярных структур...................................................................24

§ 1.2.1 Оптимальный диапазон концентраций...............................25

§ 1.2.2 Тип и концентрация противоионов....................................27

ГЛАВА II. Параллельные двойные спирали олигодезоксирибонуклеотидов.....32

§ II.1. Параллельные ДНК с АТ парами оснований................................34

§ II.2. Параллельные ДНК смешанного природного AT/GC состава......46

§ II.3. Особенности связывания лигандов с парДНК...............................66

§11.3.1. Олигопептидные антибиотики в бороздках парДНК.......68

. §11.3.1.1 Стехиометрия связывания..................................68

§11.3.1.2..Сродство бороздочных лигандов к

параллельному TATA участку...............................77

§11.3.1.3.Доказательство сохранения параллельной ориентации нитей в комплексе парДНК psN 1 :дистамицинА...........................................................88

§11.3.2. Стабилизация дистамицином необычной АРС

конформации ДНК.........................................................................93

§11.3.3. Интеркаляторы как зонды вторичной структуры

парДНК..........................................................................................104

§ II.4. Параллельная ДНК в условиях пониженной активности воды.. 112

§ II.5. Стабильность пар ДНК с isoG-C и G-5Met-isoC парами............121

Выводы главы II........................................................................................124

ГЛАВА III. Параллельные (рекомбинантные) триплексы

олигодезоксирибонуклеотидов.................................................................127

§ III. 1. Классификация триплексов, экспериментальная модель..........132

§ III.2. Термодинамика образования параллельных триплексов...........135

§ III.3. Способы стабилизации R-формы ДНК......................................149

§ III.4. Узнавание фрагмента нативной ДНК олигонуклеотидом при

помощи получения межмолекулярного параллельного триплекса........163

Выводы главы III......................................................................................183

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................185

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.......................................................................................187

ПРИЛОЖЕНИЕ. Описание формализма модели многих состояний перехода

спираль-клубок..............................................................................190

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ..........................................................194

ЛИТЕРАТУРА......................................................................................................199

ВВ ЕДЕНИЕ

Одной из центральных проблем молекулярной биологии является связь структуры и функции нуклеиновых кислот. Современные ЯМР и кристаллография обогащают научное знание впечатляющей и быстро расширяющейся библиотекой структур биологически значимых молекул, центральное место среди которых занимает ДНК. Еще более широкое разнообразие предсказывает полуэмпирический компьютерный поиск стерео химически возможных структур. Становится все более очевидным, что структурное разнообразие ДНК простирается далеко за пределы трех главных А-, В- и г-семейств двойных спиралей с антипараллельной 5'-3'/3'-5'ориентацией цепей и Уотсон-Криковским типом спаривания азотистых оснований. Теоретическое предсказание существования стереохимически возможных необычных структур двойных спиралей ДНК с параллельной 5'-3 75'-3'ориентацией цепей (РаНаЫгатап, 1986) дало мощный толчок к их экспериментальному поиску. Как следует из молекулярного моделирования, параллельные ДНК (парДНК) могут характеризоваться новыми правилами комплементарное™ оснований и параметрами структуры, отличными от двойной спирали Уотсона-Крика, что может обусловить их сродство к новым типам специфических лигандов, в частности, регуляторных и структурных белков.

Интересно, что новая форма трехцепочечной ДНК, параллельный (рекомбинантный) триплекс, аккомодирующий две идентичные нити в

параллельной ориентации, или R-форма ДНК, была впервые предложена также на основе компьютерного моделирования (Zhurkin et al., 1994). Вместе с тем, биологическая роль парДНК, как и параллельных триплексов, к настоящему времени не установлена экспериментально. Обсуждается гипотетическая особая роль параллельных ДНК и их комплексов с белками в процессах рекомбинации, матричного синтеза, эволюции (Чуриков и соав., 1988, 1989, Курявый, 1987), в стабилизации структуры генома однотяжевых вирусов, в каталитическом механизме обратной гиразы термофильных бактерий, включающем параллельные интермедиаты (Rippe et al., 1992). Промежуточное образование R-формы ДНК было предположено в процессах гомологической рекомбинации и матричного синтеза (Howard-Flanders, 1984, Zhurkin et al., 1993, 1994.).

Целью настоящей работы являлось экспериментальное выяснение возможности и условий существования новых структур ДНК, параллельных двойных спиралей и параллельных (рекомбинантных) триплексов, изучение термодинамики их образования в зависимости от нуклеотидной последовательности и внешних факторов, их комплексов с лигандами.

В ходе проведенных исследований были решены следующие задачи: 1.Осуществлен выбор адекватных типов модельных олигонуклеотидов и экспериментальных условий для получения внутримолекулярных высокоэнергетических структур ДНК. Выбран комплекс физико-химических

методик, обеспечивающих контроль гомогенности внутримолекулярных образцов и отсутствия примесей альтернативных межмолекулярных структур.

2. Получены и охарактеризованы термодинамически, а также рядом спектральных методов параллельные двойные спирали ДНК и параллельные триплексы в зависимости от нуклеотидной последовательности, типа противоионов, интеркалирующих и иных лигандов. Определены условия стабилизации этих структур.

3. Разработаны подходы к получению стабильных межмолекулярных пар ДНК и Я-формы ДНК, что открывает возможность использования этих структур для узнавания олигонуклеотидами однотяжевой ДНК в параллельной ориентации (парДНК) и нативной двойной спирали ДНК с любой произвольной последовательностью оснований (Ы-форма).

На защиту выносятся следующие положения: 1. Исследована и охарактеризована новая двойная спираль ДНК- параллельная ДНК, определены условия ее существования и термодинамические параметры ее образования.

Экспериментально доказано существование параллельных ДНК (парДНК) на модельных олигонуклеотидах, состоящих из двух нитей ДНК, ковалентно сшитых гибким ненуклеотидным линкером достаточной длины, причем ориентация нитей ДНК в такой внутримолекулярной двутяжевой структуре однозначно задается химической структурой.

Впервые обнаружена зависимость стабильности парДНК не только от AT/GC состава, но и от последовательности оснований. Наличие трех последовательных GC пар обеспечивает термостабильность парДНК большую, чем у АТ-содержащей парДНК, тогда как изолированные GC пары дестабилизируют парДНК.

Исследованы комплексы ДНК природного состава оснований с лигандами различной природы - как связывающимися в бороздки ДНК , так и интеркалирующими. Впервые обнаружено независимое связывание дистамицина А и нетропсина в обе бороздки TATA участка, что является специфическим маркером парДНК. Показано, что наличие GC пар приводит к понижению сродства парДНК к интеркаляторам.

Необычная структура ДНК - антипараллельная-параллельная комбинация (АРС) в комплексе с дистамицином А была потверждена оптическими методами, используя необычную стехиометрию комплекса дистамицина А с параллельной ДНК. Было показано, что дистамицин А стабилизирует 1/2 витка параллельной спирали из пяти AT пар из неполностью комплементарного участка [5'-d(AAATT)-3']{3'-d(AATTT)-5'], находящегося внутри обычной антипараллельной GC-содержащей ДНК.

Исследована парДНК, содержащая trans dG-5-Methyl-ísodC и trans isodG-dC пары, стабильность которой превышает таковую Уотсон-Криковой антипараллельной ДНК с GC парами в гомологичной последовательности.

2. Впервые получен и исследован новый тип структур ДНК - параллельные (рекомбинантные) триплексы.

Получены внутримолекулярные параллельные триплексы из

олигонуклеотидов 3'-(dT)io-L-(dA)io-L-(dT)io-5' (parTAT), 3'-(dA)io-L-

(dT)io-L-(dA)io-5' (parATA), 3'-(dGA)5-L-(dTC)5-L-(dGA)5-5' (parAG).

Определены термодинамические параметры их образования и сопоставлены с таковыми для обычных антипараллельных триплексов из олигонуклеотидов 3'-

(dA)io-L-(dT)io-L-(dT)io-5' (anti ATT), 3'-(dA)i0-L-(dA)i0-L-(dT)i0-5'

(antiAAT) и 3'-(dCT)5-L-(dAG)5-L-(dGA)5-5' (antiAG).

Впервые полнены экспериментальные доказательства существования R-формы ДНК - рекомбинантного триплекса, включающего четыре природные основания-для нескольких последовательностей ДНК. Оценены свободные энергии образования триплетов АТ*А, GC*G и дипиримидиновых триплетов ТА*Т, CG*C.

Разработаны способы стабилизации R-формы путем экранирования отрицательно заряженных групп и связывания специфических интеркаляторов.

В отсутствии рекомбиназ получен межмолекулярный параллельный триплекс при узнавании фрагмента нативной ДНК гена HSKRUPZN человека, содержащим 5'-d(AGAATGTGGCAAAG)-3' последовательность,

олигонуклеотидом с идентичной последовательностью.

Становится все более очевидным, что для определения и оценки критических взаимосвязей и взаимозависимости между структурой, энергетикой и биологическими функциями, кроме структурной информации необходимо знание термодинамики и других физико-химических характеристик новых конформаций in vitro (см., например, Tinoco, 1996; Oliver, 1996). Экспериментальное получение и физико-химическое исследование теоретически предсказанных новых конформаций ДНК, параллельной двойной спирали и параллельного триплекса, явилось необходимым и актуальным.

Представленные научные результаты имеют приоритетный характер и открывают новое направление исследований. Новизна работы определяется следующим:

Были впервые найдены экспериментальные подходы получения мономолекулярных двух- и трехцепочечных спиралей из олигонуклеотидов, в которых для задания определенной ориентации нитей были использованы ненуклеотидные линкеры. С помощью специально разработанного набора оптических спектральных методов контролировалось отсутствие в образцах примесей альтернативных межмолекулярных структур, что обеспечило возможность количественного определения термодинамических параметров образования парДНК и параллельных триплексов, их комплексов с лигандами, спектральных характеристик этих новых структур.

Для модельных олигонуклеотидов с ненуклеотидными линкерами впервые доказано образование парДНК с альтернирующей АТ последовательностью.

Впервые получены стабильные параллельные внутримолекулярные и межмолекулярные двойные спирали природного АТ/СС состава оснований. Впервые обнаружена зависимость стабильности парДНК не только от нуклеотидного состава, но и от последовательности оснований в АТЛЗС содержащей парДНК. В опровержение существовавших представлений показано, что наличие ОС пар может не только ослаблять двойную спираль парДНК, но и стабилизировать ее в случае последовательного расположения двух или трех вС пар.

Установлены новые свойства парДНК, обусловленные особенностями ее вторичной структуры. Впервые обнаружено независимое связывание пептидных антибиотиков дистамицина А и нетропсина в обе бороздки ТАТА участка, что является ярким отличием парДНК от Уотсон-Криковской ДНК. Показано, что сродство интеркалирующих лигандов к парДНК смешанного АТЮС состава ниже,чем к АТ-содержащим пар ДНК и антипараллельной ДНК.

Впервые экспериментально получен и исследован новый тип структур ДНК- параллельные рекомбинантные триплексы или И-форма ДНК. Показано, что стабильность параллельных триплексов зависит от последовательности оснований. Предложены способы стабилизации параллельных триплексов, как внутримолекулярных, так и межмолекулярных, образованных при узнавании

олигонуклеотидом нативной двойной спирали ДНК. Впервые достигнуто узнавание 14-нуклеотидной последовательности из четырех оснований нативной двутяжевой природной ДНК гена HSKRUPZN человека с помощью образования триплекса.

Структура диссертации. В диссертации отсутствует единый литературный обзор. Литературные данные по соответствующим темам обсуждаются в начале глав или параграфов, а также при изложении результатов. В Главе I описаны экспериментальные модели, методические подходы и экспериментальные условия, разработанные для получения и количественного физико-химического исследования новых

высокоэнергетических структур олигонуклеотидов, способ определения ориентации цепей ДНК в двух- и многоцепочечных спиралях. Глава II посвящена результатам изучения параллельных двойных спиралей олигодезоксирибонуклеотидов. В Главе III представлены результаты исследования Ы-формы ДНК - параллельного (рекомбинантного) триплекса. В конце каждой главы даются выводы. В приложении кратко излагается формализм перехода спираль-клубок в модели многих состояний.

ГЛАВА I.

ВЫБОР ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ И УСЛОВИЙ.

СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОРИЕНТАЦИИ ЦЕПЕЙ ДНК В ДВУХ- И МНОГОЦЕПОЧЕЧНЫХ СПИРАЛЯХ.

Наиболее стабильной, низкоэнергетической вторичной структурой ДНК с произвольной последовательностью природных оснований в условиях, близким к физиологическим, является Уотсон-Криковская двойная спираль В-типа (см., например, обзор Tinoco, 1996). Предметом данного исследования являются менее выгодные в общем случае, или высокоэнергетические, двойные и тройные спирали ДНК. In vivo неканонические структуры могут стабилизироваться в комплексах с белковыми и низкомолекулярными лигандами. В условиях физико-химического эксперимента в растворе, целью которого является количественное определение параметров стабильности и конформационных особенностей неканонических сттуктур, необходим специальный выбор экспериментальных моделей. В этой связи возникают важные методические вопросы: каким образом получить гомогенный образец,

содержащий неканоническую структуру, если канонические структуры на основе данных последовательностей оснований являются более стабильными? Каким образом определять и контролировать взаимную ориентацию цепей в двойных и тройных спиралях? Эти проблемы рассмотрены далее в этой Главе.

§ 1.1. Методы характеризации равновесных форм в растворах

олигонуклеотидов. Задача состояла в подобре моделей и адекватных методов анализа растворов олигонуклеотидов в тех конкретных экспериментальных условиях, в которых определяются количественные термодинамические и спектральные характеристики структур и их комплексов с лигандами.

Были использованы модельные системы двух типов:

(а) внутримолекулярные структуры,

(б) бимолекулярные дуплексы и межмолекулярные триплексы.

Идея синтеза олигонуклеотидов, состоящих из двух комплементарных нитей, соединенных гибким ненуклеотидным линкером , была генерирована в ИМБ и осуществлена впервые Б.К. Черновым, разработавшим оригинальный синтез не только 5'-, но и З'-фосфорамидитов для синтеза параллельно направленных цепей, а также гексаметиленовые и тетраэтиленгликолевые линкеры. Внутримолекулярные двойные спирали, образованные такими олигонуклеотидами, имеют ориентацию цепей, определяемую первичной структурой, например

рвАТ

3' АТАТАТАТАТ

З'ТАТАТАТАТА

арвАТ

3-АТАТАТАТАТ

5' ТАТАТАТАТА ^

Олигонуклеотиды с ненуклеотидными линкерами потенциально способны образовывать внутримолекулярные двойные (или тройные спирали) с заданной первичной структурой ориентацией цепей - параллельные (антипараллельные) шпильки или триплексы, но также и множество примесных неспецифических структур. В растворе возможно установление сложного термодинамического равновесия многих внутри- и межмолекулярных структур. Некоторые возможные структуры на примере двух олигонуклеотидов представлены на Схеме 1. Таким образом, синтез специальных олигонуклеотидов дает возможность получить образцы параллельных внутримолекулярных структур, иначе шпилек, но не гарантирует чистоты и гомогенности образца. В тех или иных экспериментальных условиях и в зависимости от нуклеотидной последовательнос