Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Параллельные спирали в структуре ДНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Параллельные спирали в структуре ДНК"

1 8 3 9 1 .

АКАДЕМИЯ НАУ& СССР

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А.Энгельгардта

На правах рукописи

Черный Алексей Аркадьевич

УДК 577.323

ПАРАЛЛЕЛЬНЫЕ СПИРАЛИ В СТРУКТУРЕ ДНК

03. 00. 03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

5

5 ^

Москва - 1991

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор

кандидат физико-математических наук

В.Л.Флорентьев Ю.П.Лысов

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук

кандидат химических наук

В.И.Полтев В.В.Шик

Ведущая организация:

Институт органической химии им. Н.Д.Зелинского АН СССР

Защита состоится "«¿о " . 1991 г. в 'час. на заседании

специализированного Совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молеклярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР

Автореферат разослан

•25'" (рев. 1991 Г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат химических наук

М.Крицын

^'Vv,,- f

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Принято считать, что ДНК представляет собой двойную спираль, образованную комплементарными антипараллельными цепями. А-, В-и Z-форма ДНК имеют именно такую структуру. Однако, принципы строения двойной спирали ДНК, заложенные в модели Уотсона-Кртса и правилах Чаргаффа не исключают возможности существования двойной спирали ДНК с параллельно ориентированными цепями. Выбор в пользу антипараллельной модели был сделан в 1961 году после работы Джоссе и соавт. [Josse, 1961] по анализу частот ближайшего соседствования оснований. Тем не менее, и эта работа не отвергает возможности существования в ряде случаев параллельных спиралей ДНК наряду с каноническими антипараллельными.

Рис. 1 Схемы возможного образования участков параллельной спирали - из антипараллельной двойной ДНК с палиндромным участком (а), из одноцепочечной ДНК с комплементарными участками (б), из двух одноце-почечных ДНК с комплементарными участками (а) [Ю.Цапктя, 1988).

Вопрос заключается а том, насколько параллельные спирали ДНК отличаются по своим термодинамическим параметрам от канонических антипараллельных спиралей, и не требуют ли они экзотических условий для существования?

Способность ДНК образовывать параллельные структуры напрямую связана с возможностью существования структур с количеством цепей больше двух - трех- и четырехцепочечных полинуклеотидных комплексов, существование которых в принципе возможно только лишь при условии параллельности отдельных цепей.

Однако, поскольку экспериментальные методы не являются "прямыми" и дают лишь усредненную картину строения ДНК, из имеющихся данных нельзя получить детальную информацию о информационных возможностях как двойных параллельных спиралей ДНК, так и трех- и четырехцепочечных полинуклеотидных комплексов. Пространственно разрешенные варианты таких структур могут быть получены из модельных построений и информационных расчетов.

Цель работы заключалась в решении следующих задач: 1. Изучение термодинамики образования структур ДНК с параллельной ориентацией сахарофосфатных остовов.

«тгмм»

а

Я'вТ'О'

I-I

2. Разработка алгоритма, позволяющего производить поиск оптимальных кон-формаций ДНК с произвольной взаимной ориентацией цепей в широком диапазоне параметров спирали.

3. Конформационный анализ регулярных параллельных спиралей ДНК, содержащих симметричные неканонические пары оснований.

4. Конформационный анализ регулярных гетерономных параллельных спиралей ДНК.

5. Конформационный анализ регулярных симметричных четырехцепочечных спиральных комплексов ДНК.

Научная новизна и практическая ценность. Показано, что двутяжевые олиго-нуклеотидные структуры с параллельной ориентацией цепей существуют в раствори в условиях близких к физиологическим. Изучена тепловая денатурация и рассчитаны термодинамические параметры образования таких структур.

Разработан алгоритм и созданы программы поиска оптимальных конформааий регулярных гомополимерных структур в широких диапазонах параметров спирали. Данный алгоритм позволяет существенно сократить время вычислений и является универсальным для регулярных спиралей. Универсальность заключается в произвольной ориентации как цепей (параллельность или антипараллельность), так и пар оснований относительно направлений сахарофосфатных остовов в изучаемой спирали. В несколько модифицированном виде этот алгоритм может быть использован для поиска оптимальных конформеров трех- и четырехтяжевых спиралей.

Проведен конформационный анализ всех возможных параллельных гомополимерных спиралей ДНК с симметричными неканоническими парами оснований. Показано, что для параллельных спиралей, наряду с конформационной областью, характерной.для В-формы ДНК, существует еще одна энергетически выгодная область.

Проведен конформационный анализ регулярных параллельных двойных спиралей poly(dA)*poly(dT), в которых сахарофосфатные остовы разноименных цепей могут иметь разные конформации (гетерономии), для всех возможных типов спаривания оснований. Рассмотрены все варианты ориентации пары оснований, относительно направления сахарофосфатных остовов. Проанализирована зависимость потенциальной энергии от строения пары оснований и ориентации ее в спирали. Показано, что параллельные спирали ДНК обладают энергией близкой к энергии ДНК в В-форме.

Проведен конформационный анализ четырехцепочечных спирален poly(dА)«poly(dT> 'poly(dA> 'poly(dT) имеющих ось симметрии. Рассмотрены все возможные варианты строения квадруплектов оснований и взаимной ориентации цепей. Полученные результаты позволяют сделать заключение о энергетичесхой

оправданностн образования четырехцепочечных спиралей ДНК из двух канонических антипараллельных двойных спиралей.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзном рабочем совещании по органической химии дуплексов нуклеиновых кислот (Киев, 1989 г.), на Расширенной научной сессии "Конформации и функции биологических молекул" (Рига, 1989 г.), на Советско-итальянском симпозиуме "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Катания, 1990); на Всесоюзной конференции по кон-формациям биополимеров в растворе (Тбилиси, 1990 г.), на Всесоюзных Энгельгар-дтйвских чтениях (Москва, 1990 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы. Дис.ертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 124 страницах, содержит 29 рисунков, 10 таблиц и список литературы насчитывающий 97 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор посвяшен теоретическим и экспериментальным данным о структурах ДНК и РНК, содержащих параллельно ориентированные сахарофосфат-ные остовы. Рассмотрены исследования двух-, трех- и четырехцепочечных полинук-леотидных структур.

Во второй главе излагается изучение термодинамики образования двутяжевых структур ДНК с параллельной ориентацией сахарофосфатных остовов.

С точки зрения возможной биологической функции параллельных дуплексов чрезвычайно важно ответить на вопрос: могут ли «модифицированные олигодезок-сирибонуклеотиды образовывать двойную спираль с параллельным расположением цепей в условиях, близких ' физиологическим?

Для исследований были синтезированы олигонуклеотиды

3'-<1 (АрТрАрТрАрТрАрТрАрТр) рО- (СН2)6-Ор<1 (рАрТрАрТрАрТрАрТрАрТ) -3' < парАТ)

3•-d(ApTpApTpApTpApTpApTp)pO-(CH2)6-Opd{pApTpApTpApTpApTpApT)-5• (аитиАТ)

3•-d(ApApApApApApApApApAp)pO-<CH2)6-Opd(pTpTpTpTpTpTpTpTpTpT)-3• <пар(А-Т)

3•-d(ApApApApApApApApApAp)pO-(CH2)6-Opd(pTpTpTpTpTpTpTpTpTpT)-5• (антиА-Т).

Кривые плавления всех олигомеров имеют двухфазный характер (Рис. 2). Первый переход наблюдается при температуре от 10 до 30°С (низкотемпературный переход), второй - при температуре 30 - 70°С (высокотемпературный переход).

■ Двухфазность кривых плавления связана с наличием двух равновесных процессов:.

! *2' ГН1 Р] Ю]

! М-1н. 2Н^.О. 2М-10. —, ,

1-2

где М - отдельные цепи олигонуклеотида, Н - шпилька (высокотемпературный комплекс), О - дуплекс (низкотемпературный комплекс). Методом нелинейной регрессии нами рассчитаны изменение мольных долей компонентов равновесия в зависимости от температуры (Рис. 2) и термодинамические параметры фазовых переходов (Табл. I).

Высокотемпературный переход. Как показали наши исследования высокотемпературный переход соответствует внутримолекулярному раскрытию шпильки. Убедительным доказательством того, что рассматриваемый переход является переходом "шпилька - отдельные цепи" (т.е. мономолекулярным процессом), служит отсутствие зависимости Тм от концентрации олигонуклеотида. Параллельные шпильки менее стабильны, чем соответствующие а нти параллельные. В то же время шпильки, содержащие гомополимерные цепи (парА-Т, антиА-Т) стабильнее соответствующих шпилек с чередованием аденинов и тиминов (парАТ, антиАТ), причем чередование в цепи аденинов и тиминов сильнее дестабилизирует параллельные шпильки, чем антипараллельные.

Важно отметить, что энтальпийная стабилизация параллельного дуплекса заметно ниже, чем в случае антипараллельного. Это понижение стабильности частично компенсируется более выгодным энтропийным фактором. Другими словами, параллельные дуплексы обладают большей конформационной подвижностью по сравнению с антипараллельными.

Для всех изученных шпилек Т^по-вышается с увеличением концентрации ЫаС1, причем угол наклона зависимости Гцд от |£ [ЫаС1] определяется типом последовательности, но не взаимной ориентацией цепей (Рис. 3). Величина Дп (Табл. I) отражает изменение степени ассоциации противоионов при термической денатурации шпилек. Видно, что параллельные шпильки при плавлении теряют меньше ионов, чем антипараллельные. Этот факт можно объяснять тем, что в параллельных спиралях отрицательно заряженные фосфатные группы расположены более выгодно с точки зрения электростатического отталкивания - основания образуют обратную уотсон-крпковскух» пару, при этом оба желоба спи ради имеют примерно оди-

Щчи]

Рис.3 Зависимость температуры перехода "шпилька - отдельная цепь" от концентрации КаС1. и - парАТ, 2 - антиАТ, 3 - парА-Т, 4 - антиА-Т).

Рис. 2 Экспериментальные данные по термической денатурации в сравнении с зависимостью, рассчитанной методом нелинейной регрессии (1, правая ось ординат), и рассчитанные мольные доли (левая ось ординат) "низкотемпературного комплекса" (2), шпильки (3) и отдельной цепи (4) пар АТ (а), аятиАТ (б), парА-Т (в) и антиА-Т(г).

Таблица I

Терыодвиакнчеаеке сзраметры обрзэовгяхх ппписг кз отдельных цепей в дуплека» яз пптклег

Олитонук- Т ил* дс^. Гилерхро-

леотид кал кал "С ккал мизм, Дл

моль моль* К моль %

Высокотемпературные комплексы (шпильки)

парАТ -24,5 -78.8 37.9 -1.0 17 0.022

автиАТ -41.6 -127.4 53.5 -3.6 26 0.035

парА-Т -30.4 -933 52.8 -2.6 22 0.046

антиА-Т -47.1 -142.9 56.6 -4,5 32 0.081

Низкотемпературные комплексы (дуплексы)

парАТ -25.4 -58.9 20.6 -7.8 10 - '

антиАТ -31.1 -76.9 24.5 -8.2 12 -

парА-Т -26.0 -57.8 36.1 -9.1 8 -

антиА-Т -22.7 -44.7 41.9 -9.4 9 -

наковую ширину, причем существенно большую, чем ширина узкого желоба в В-форме.

Низкотемпературный переход. Низкотемпературные комплексы изученных олигонуклеотидов четко разделяются на две группы (Табл. 1) - олигомеры с гомо-папимерными цепями (парА-Т, антиА-Т) и олигомеры, содержащие цепи с чередующейся (парАТ, антиАТ) последовательностью оснований. Обычно низкотемпературному комплексу приписывают строение канонического дуплекса. Однако в рамках этого предположения невозможно объяснить, почему так резко отличается поведение олигомеров с чередующейся и нечередующейся последовательностью оснований. Полученные термодинамические данные и результаты экспериментов по связыванию олигонуклеотидами бромистого этидия [Борисова, 1989], указывают на то, что низкотемпературные комплексы олигомеров с гомополимер-ными цепями существуют в растворе в виде четырехцепочечных комплексов. Такие комплексы (квадруплексы) могут иметь следующую структуру:

уГТТТТТТТТТ-5' 5'-ТТТТТТТТТТ^ -ТТТТТТТТТТ-5' \AAAAAAAAAA-3' 3'-АААААААААА /^ЧАААААААААА-3'

....................ИЛИ ..............................

АААААААААА-3' 3'-АААААААААА.V уАААААААААА-31

С

А,

ГТТТТТТТТТ-5' 5 ^ — ТТТТТТТТТТ* ЛТТТТТТТТТТ-5' Цепи в квадруплексах связаны между собой за счет дополнительных водородных связей между нуклеиновыми основаниями, причем цепи несущие одинаковые основания ориентированны параллельно (антипараллельная ориентация одноименных цепей невозможна по стерическим соображениям).

Третья глава посвящена изучению конформационных возможностей параллельных спиралей ДНК. Из имеющихся экспериментальных данных можно получить лишь усредненные данные о строении спиральных структур, поскольку в растворе ДНК существует в виде равновесной смеси взаимопревращающихся конформеров. Наиболее вероятные конформеры могут быть получены путем конформационного анализа, сопоставление которого с экспериментальными данными позволяет построить модель адекватно отражающей природу параллельных ДНК.

Параллельными спиралями ДНК, вообще говоря, можно называть любые дву-тяжевые структуры, в которых направления обеих сахаро-фосфатных цепей совпадают. Прежде всего, оговорим, что мы будем рассматривать только регулярные цепи, т.е. такие, в которых постоянны сдвиг вдоль оси спирали (£)г) и поворот вокруг оси спирали (О) при переходе от 1-го к (г+1)-му нуклеотиду. Существенную роль в предопределении вторичной структуры двойной спирали ДНК играет геометрия пары оснований, поскольку от строения пары оснований зависит расположение гликозид-

ных сзязей, а следовательно, и взаимное расположение сахарофосфатных остовов. Нами были рассмотрены все 42 возможные пары оснований с количеством водородных связей не менее двух. С точки зрения симметрии все пары можно поделить на три типа: с осью (псевдоосью) симметрии второго порядка, лежащей в плоскости пары (1); с осью, перпендикулярной плоскости пары (2); не обладающие симметрией (3) (псевдоось симметрии связывает только гликозидные связи СГ-Ы). Первый тип. характерен для канонических антипараллельных спиралей, в парах второго типа гликозидные связи находятся в транс-положении (параллельны и разнонапрачлени).

Симметрия распространяется не только на основания и гликозидные связи, по и на сахарофосфатные остовы: в спиралях первого типа остовы ориентированы антипараллельно и имеют одинаковую структуру; в спиралях второго типа 3'-5'-на-правления остовов совпадают и сами остовы являются идентичными" (желобки при этом имеют одинаковые размеры); в асимметричных случаях ни взаимная ориентация сахарофосфатных остовов, ни их конформации никак не связаны.

Таким образом, для описания параллельных спиралей, можно использовать, в зависимости от структуры пары оснований, симметричную модель для спиралей с парами 2-го типа либо ассиметричную модель для спиралей с парами 1-го илй 3-го типов.

Поскольку стороны нуклеинового основания в нуклеозиде стереохимичсски неэквивалентны (диастереотопны), важной характеристикой олигонуклеотида является ориентация основания относительно 3'-5'-направления сахарофосфатного остова. При рассмотрении параллельных полинуклеотидов следует независимо анализировать два возможных варианта структур с участием одной и той же пары оснований. Эти варианты различаются взаимной ориентацией 3' 5'-направления цепей и сторон оснований. Для однозначного описания ориентации оснований в спирали использована «^номенклатура [Ю.ПЛысов, 1979].

Выбор модели. Симметричная модель подразумевает наличие оси симметрии второго порядка, совпадающей с осью спирали, то есть спираль должна содержать симметричные пары, состоящие из одинаковых оснований и иметь полностью идентичные сахарофосфатные остовы. Такая структура оказывается принципиально возможной для двенадцати пар оснований. Для определения структуры рассматриваемых параллельных спиралей в рамках симметричной модели достаточно указать тип спаривания оснований, ориентацию пары относительно сахарофосфатных остовов согласно о^-номенклатуре и определить следующие параметры: £1 - угол спирального закручивания, Ог - расстояние между 1-тым и ¡+1 слоями оснований в спирали, углы • "пропеллера" (си) н излома (дс) в паре оснований, и фазовый угол псевдовращения сахара Р. Такие параметры спирали как Лс н <1у (сдвиги центра пары оснований

относительно оси спирали), а также углы крена (17) и наклона (в) пары оснований должны быть равными нулю из соображений симметрии.

Гетерономная модель описывает двойную спираль, подчиняющуюся следующим правилам: двойная спираль является регулярной; гликозидные связи СГ-К в паре оснований не связаны друг с другом никакими элементами симметрии (асимметричны). Таким образом сахарофосфаткые остовы разноименных цепей могут иметь разные конформации в рамках одной двойной ■ спирали (то есть являются гетерономными). По сравнению с симметричной моделью, гетерономная предполагает большее число параметров: не равные нулю ёх, ёу, 17, в; и различные в разных цепях фазовые углы псевдовращения Я] и />2.

Расчет конФормаиии и потенциальной энергии. Взаимное расположение оснований в спирали описывали с использованием параметров Арнотта, для получения структуры спирали использован алгоритм расчета конформационных углов сахаро-фосфатного остова по заданному расположению оснований [гЬигкт, 1978]. Потенциальную энергию конформера вычисляли как сумму энергий ван-дер-ваальсовских, электростатических и торсионных взаимодействий. При вычислении потенциальной энергии регулярной спирали, взаимодействие различных частей учитывалось с такими весами, чтобы в итоге получалось взаимодействие на единичный участок регулярной спирали - один динуклеотид, что позволяет ликвидировать влияние концевых эффектов. Для расчета использованы силовые параметры [Журкин, 1980], для оценки энергии водородных связей - потенциалы [Полтев, 1984].

Алгоритм поиска оптимальных конфоомаций спирали. Принимая во внимание большое количество возможных структур параллельных спиралей и почти полное отсутствие информации о возможных значениях параметров спирали для таких структур, мы разработали следующий алгоритм поиска относительно устойчивых конформации параллельных спиралей.

Прежде всего необходимо определить "области существования" параллельных спиралей, то есть для всех параметров спирали найти диапазоны значений, при которых сахарофосфатный остов способен образовывать геометрически замкнутую структуру с потенциальной энергией, не превышающей некоторого разумного предела. Поиск таких диапазонов осуществляется сканированием пространства параметров. Однако, поскольку количество параметров, необходимых для описания спирали

в рамках гетерономной модели, достигает 10, а для каждой пары оснований искомые в

диапазоны довольно индивидуальны, простое сканирование пространства параметров в относительно широких пределах и с достаточно небольшим шагом требует просмотра очень большого количества вариантов и практически нереализуемо на имеющихся вычислительных средствах. Поэтому мы применили следующий метод поиска областей существования спиралей, позволяющий значительно сократить объем расчетов.

Если параметры со, в, к, 17 равны нулю, то положение азотистого основания в любой из цепей двойной спирали можно описать параметрами Я, Dz, R и ф, где параметры Ли ф определяют положение гликозидной связи основания относительно оси спирали: R - расстояние от оси спирали до гликозидного атома азота основания, |р - угол между прямой, соединяющей ось спирали с гликозидным атомом азота и гликозидной связью (фактически это аналоги параметров dx и dy). Такая подмена параметров спирали позволяет абстрагироваться от типа основания, то есть получать информацию об областях геометрического существования сахарофосфатного остова с регулярной структурой для всех типов гомополимерных спиралей.

Просканировав пространство переменных Q, Dz, R, ф и Р, получаем области геометрического существования сахарофосфатного остова в виде значений гликозидного угла х для одноцепочечной спирали poly(dX) , где X - произвольное основание. Построив затем пару оснований XY, и определив тем самым взаимное расположение гликозидных связей этих оснований, то есть параметры Ях, фх, Ну и фу, сопоставив их значения с полученными областями существования одноцепочечной спирхчи, получаем пересечения областей существования одноцепочечных спиралей poly(dX) и poly(dY), то есть области существования двойной спирали poly(dX)«poly(dY), которые затем используются в качестве начальных точек для поиска устойчивых конформаций спирали.

Метод является универсальным для всех регулярных двойных гомополимерных спиралей (как симметричных, так и гетерономных) типа poly (dX)» poly (dY), независимо от взаимного направления сахарофосфатных остовов и ориентации сторон оснований относительно 3'-5'-направления сахарофосфатных остовов. Сканирование пространства параметров спирали позволяет охватить все возможные области существования спиралей. (Приведен алгоритм поиска оптимальных конформаций двойного спирального полинуклеотида в рамках гетерономной модели; в случае симметричной модели число параметров спирали уменьшается, вследствие равенства одних параметров (Лх - Ry, ф% - фу, - Ру) и невозможности изменения других (0-0, 7-0)).

Результаты информационного анализа симметричных параллельных спиралей. Как было сказано выше, в рамках симметричной модели мы можем рассматривать только спирали, содержащие строго симметричные пары оснований. Какие же закономерности формирования параллельных спиралей определяются по данным настоящих расчетов? Конформационная энергия параллельных структур имеет примерно ту же величину, что и у антипараллельных. Энергия параллельных структур гомо-полимеров в существенной степени зависит от последовательности оснований. Так, пуриновые гомополимеры могут образовывать значительно более устойчивые формы спиралей, чем гомопиримидиновые. Последние, скорее всего, вообще не могут сформировать сколько-нибудь протяженные участки в параллельных спиралях, й, по-ви-

димому, могут быть представлены только вкраплениями отдельных пар в гомопури-новые цепи. Исключение составляет правая спираль, содержащая тиминовые пары, в которой все конформационные углы лежат в пределах, характерных для ß-формы ДНК . Из энергий всех гомопиримидинов лишь ее энергия оказывается близкой к энергии антипараллельной спирали В-ДНК. Конформеры, отвечающие локальным минимумам потенциальной энергии, приведены в Табл. 11.

Интересно отметить, что в случаях, когда по экспериментальным данным во-дородносвязанные нуклеотиды, в кристаллах образуют комплекс с параллельным расположением сахарофосфатных цепей, что имеет место в кристаллах 3',5'-ди-0-ацетилтимидина [Wilson, 1984], а также натриевой [Coll, 19871 и аммониевой [Cruse, 1983] солей дезоксицитидилил -<3',5')- дезоксигуанозина, значения конфор-мационяых углов лежат в тех же пределах.

Для параллельных спиралей стерически разрешены оба типа закрутки цепей -правый и левый, хотя более устойчивыми оказываются правые конформеры. Конформационные углы сахарофосфатных цепей в параллельных спиралях допускают, согласно расчетам, более широкие пределы изменений, чем в антипараллельных. Так, помимо привычных по антипараллельной ДНК структур с анти-ориентацией основания, гош+-областью значений у и знакомыми по ¿-форме пределами значений углов ß, с, £ в с (MINI-тип), присутствуют устойчивые формы с транс-значениями угла у и коррелирующее с этим понижение значений угла а (до 110-160°), вместо близких к 280°, характерных для конформеров Б-типа (М1Ы2-тип). Это два основных типа энергетически устойчивых конформации, которые отвечают спиралям с привычными пределами значений угла спирального вращения ß ( 30 - 40°) и шага спирали (Dz - 3 - 4 А, хотя возможны и более раскрученные и растянутые спирали с (Q = 20°, а Dz - 5 А. Форма сахарного цикла у конформеров MINI-типа может варьировать в пределах от С1'-э«гзо- до С2'-зкдо-структур (Р изменяется от 120 до 180°). У конформеров MIN2-nma форма сахара либо С2'-эндо- и СЗ'-экзо- (Р " 160-190°), либо СЗ'-эндо- (Р- -10-5°). Помимо этих основных типов конформации, допустимы структуры с гош~-областью значений угла у (х при этом в анти-области) и структуры с син-, транс- или син-, гош+-областями углов % и у.

Итак, конформационный спектр параллельных структур достаточно широк, хотя наиболее вероятны все же "канонические" спирали с углами, характерными для В-типа ДНК. Интересно, что электростатические взаимодействия сахаро-фосфатных групп противоположны* цепей сближенных в пространстве спиральной закруткой, т.е. расположенных на расстоянии половины шага спирали, оказывают в параллельных спиралях не большее дестабилизирующее влияние на структуру, чем в антипараллельной Л-форме. В обоих случаях оно составляет около 30-40 ккал/моль. В антипараллельной -форме отталкивание сахарофосфатов на 10 - 15 ккал/моль

Таблица II

Конформационные параметры и потенциальная энергия параллельных спиралей (симметричная модель)

С пир а л ь К о н ф о р и а и ион н ы е пар а м е т 1 ы Энергия

Лара Тип Область конфор- мацион- иых углое град ч. А ПС. град Р. град град <*< град 0, град г. град с. град С, град в;. ккад моль ккал моль

АА1 аа МШ1 34 93 3.41 0 .33 158 92 244 .3 287 8 181 9 62 2 185 6 245 1 -6.28 -11.1

АА2 аа М1Н2 50 66 3.49 1 .64 357 00 173 1 150 9 191 4 176 4 220 6 292 8 -6.60 -12.

ААЗ аЬ М1И2 46 49 3.40 -0 .95 0 .28 178 .3 141 5 179 8 191 4 215 4 304 5 -2.24 -11.

СС1 аа МШ1 39 22 3.61 0 67 149 24 241 .7 289 3 180 8 62 7 184 6 254 8 2.23 -8.«

СС2 аа М1Н1 42 32 3.82 0 83 157 60 242 7 287 7 173 0 67 4 192 3 246 7 5.10 -7.

001 яа 36 33 3.60 2 33 170 46 253 2 286 5 166 5 65 3 202 8 227 3 -3.94 -12.

СС2 аа 47 05 4.17 -0 67 171 89 270 1 298 4 141 2 61 2 233 0 204 7 -6.5 -7.

ССЗ аа М1М1 36 52 3.43 1 38 169 12 250 4 291 5 175 7 60 6 191 1 235 5 -7.05 -14.

004 Ьа -39 80 3.33 1 90 122 01 161 8 262 5 168 6 57 7 188 9 253 1 1.03 -13.

ОС 5 аа М1Ш 34 64 3.38 6 33 150 82 243 7 291 3 180 6 62 4 183 2 248 6 -7.11 -14.

ТТ1 аа М1И1 37. 41 3.89 0 83 142 75 241 0 288 9 179 5 64 6 187 I 255 7 -2.10 -8.

ТТ2 ЬЬ МШ1 -51 62 3.40 -0 72 154 13 174 0 255 4 174 3 47 7 189 3 242 4 0.88 -10..

АТЗ 8-ЛНК МШ 38. 10 3.21 -6 50 154 00 250 3 287 0 179 1 61 8 186 7 250 4 -2.58 -12.

АТЗ А-ДПК М1Н1 33. 59 3.78 -9 78 30 29 208 5 282 8 177 2 62 1 202 7 289 9 -1.06 -11.<

- общая энергия; £| -

энергия взаимодействия оснований.

снльнее. Объясняется это тем, что один из желобков Д-формы антипараллельной спирали заметно уже, чем желобки в параллельной спирали.

Конформационный анализ гетерономных параллельных спиралей производили на примере спирали poly(dA)• poly(dT), поскольку наши экспериментальные исследования, также как и эксперименты большинства исследователей, базируются на олигонуклеотидах именно такого состава. Рассмотрены все возможные АТ-пары уотсон-криковская, хугстиновская, обратная уотсон-криковская и обратная хугсти-новская (две последние имеют транс-ориентацию гликозидных связей) и все возможные ориентации пары оснований, относительно направления сахарофосфатных остовов. В Табл. III приведены параметры наиболее устойчивых форм для каждого типа спаривания оснований (значение энергии дано в расчете на один АТ-динукле-отид). Для сравнения приведены параметры антипараллельной спирали в ß-форме с уотсон-криковским спариванием оснований, рассчитанной в рамках гетерономной модели.

Прежде всего можно отметить, что потенциальная энергия параллельных спиралей (1,2 ккал/моль для оптимальной конформации) имеет примерно ту же величину, что и у антипараллельных спиралей (0,2 ккал/моль). Кроме того, энергия параллельных спиралей, в состав которых входят пары оснований с транс-рясполо-жением гликозидных связей (1,2 ккал/моль для обратной уотсон-криковской (Рис. 4а) и 4.4 ккал/моль для обратной хугстиновской пары (Рис. 46)), существенно более

Рис. 4а Стереопара параллельных спиралей, содержащих обратные уотсон-криковские пары оснований.

Рис. 46 Стереопара параллельных спиралей, содержащих обратные хугстинов-ские пары оснований.

устойчивы, чем спирали с уотсон-криковской (7.6 ккал/моль) и хугстинопской (6.0 ккал/моль) парами оснований. Потенциальная энергия и углы сахарофосфатного остова такого конформера почти не отличаются от соответствующих величии для антипараллельной спирали с уотсон-криковским спариванием оснований.

Полученные результаты, таким образом, хорошо согласуются с экспериментальными данными по термической денатурации параллельных шпилек. Действительно, основания образуют обратную уотсон-криковскую пару, спираль имеет желобки одинаковой ширины, причем ширина желобка (приводится расстояние между атомами фосфора) для обратного уотсон-криковского спариванием (14.9 А) и обратного хугстиновского спаривания (15.2 А) значительно больше, чем в узком желобе Д-фор-мы ДНК (8.8 А). Поскольку для оптимальных форм параллельных спиралей характерно транс-расположение гликозидных связей, а конформационние параметры адениновой и тиминовой цепей отличаются очень незначительно, можно ожидать, что и параллельная двойная спираль с чередующейся последовательностью poly (dA-dT)*poly(dT-dA) будет иметь структуру близкую к полученной для спирали polv(dA)«polv(dT). Некоторое отличие угла образуемого гликозидными связями в обратной уотсон-криковской АТ-паре от 180°, по-видимому может быть компенсировано возникновением бирегулярнрсти структуры.

Таблица III

Конформационные параметры и потенциальная энергия параллельных спиралей (гетерономная модель)

Тип К о н Ф о Р м а ц и 0 н н ы е пара метр ы* Энергия

спирали а, О*, ы, в 1, "Р. X, Г. 0. а С. с

град А град град град град град град град град град град град ккал моль

Уотсон-криковский тип спаривания

аЬ -31 0 3.6 -31.4 И 9 -5.2 -29.7 183.0 172.8 199.5 177.1 95 4 206.8 226 2 7.6

* 32.5 262.7 57.6 165.3 274 9 273.3 195 1

Обратный уотсон-криковский тип спаривания

ЬЬ 40 1 3.2 -3.8 -9 9 0.3 1.2 169.4 255.0 67.6 168.9 288 7 233.9 192 2 1.2

142.8 244.8 65.2 172.5 290 3 254.6 186 9

Хугстиновский тип спаривания

ЬЬ 33 2 2.9 -17.0 -0 1 5.6 -1.7 157.0 223.5 188.5 172.8 145 2 260.2 188 5 6.0

30.0 200.9 69.8 179.7 273 8 286.9 206 2

Обратный хугстеновский тип спаривания

аЬ 45 6 3.5 -8.7 -10 4 1.4 -0.9 160.0 53.7 180.9 180.0 151 4 264.3 187 1 4.4

152.2 243.7 70.5 168.0 294 3 247.9 187 3

Уотсон-криковский тип спаривания (антипараллельная гетерономная спираль)

Ьа 38 3 3.2 3.9 -9 2 4.2 -1.2 154.4 252.7 62.9 176.3 287 8 248.1 188 3 0.2

145.1 241.6 64.2 177.8 289 7 254.7 183 2

* В первой строке для каждой формы приведены параметры адениновой цепи, во второй - тиминовой цепи.

По-видимому и среди всех остальных возможных пар оснований оптимальными для параллельных спиралей окажутся пары с транс-расположением гликозидных связей и основное внимание в дальнейших информационных исследованиях параллельных спиралей следует уделить структурам именно с таким типом спаривания оснований.

Полученные результаты позволяют сделать предположение о причине консервативного строения трехцепочечных спиральных комплексов ДНК (имеется в виду «(направленность "дополнительной" пиримидиновой и "основной" иуриновой цепей и хугстиновсхое спаривание оснований этих цепей трехцепочечной спирали). Согласно полученным нами данным, параллельные спирали Аа-типа с обратным хуг-стиновским типом спаривания оснований имеют в оптимальных конформлцмях (Е - 12 ккал/моль, тимины находятся в энергетически невыгодной снн-конфпрма-ции) значительно больший угол спирального закручивания (Я = 46°), чем исходная АТ-спираль (Я ■= 36°), в то время, как спирали ¿¿»-типа с хугстиновским спариванием оснований имеют угол спирального закручивания Я ■ 33 - 35° близкий к Я исходной спирали, и более низкую потенциальную энергию (Е ~ 6 ккал/моль), чем спирали с обратным хугстиновским спариванием АТ. Таким образом, в случае со-направленности "основной" и "дополнительной" цепей, более вероятным следует-считать хугстиновское спариваний оснований "основной" и "дополнительной" цепей в трехцепочечной спирали.

Четвертая глава посвящена изучению информационных возможностей чети-рехцепочечных спиральных комплексов. Экспериментально было показано [Борисова, 1989] образование четырехцепочечиых комплексов с разнонаправленными адениновыми и тиминовыми цепями, однако нет принципиальных ограничений на существование аналогичных комплексов со всеми сонапрвленнымн цепями. Поэтому в расчетах мы не ограничились конкретным случаем, а рассмотрели все возможные варианты квадруплексов.

Выбор модели. Мы рассматривали следующую модель четырехцепочечной спи- . рали: двойные спирали, образуют четырехцепочечную спиральную структуру за.счет образования дополнительных водородных связей между нуклеиновыми основаниями; четырехцепочечная спираль обладает осью симметрии второго порядка, совпадающей с осью спирали. Такая модель обусловливает следующие свойства структуры четырехцепочечной спирали: 1) одинаковое 3'-5'-направление (параллельность) и геометрическую идентичность одноименных цепей; 2) отсутствие ограничения на взаимное направление разноименных цепей в четырехцепочечной спирали; 3) симметричное строение квадруплета оснований (найдено шесть возможных вариантов (Рис. 5)); 4) из соображений симметрии следует невозможность сдвигов ¡¡х и с1у относительно оси спирали, наклона (ф в крена (в) квадруплета. С другой стороны, в квадруплетах возможны углы "пропеллера" (ш) и излома (дг) в АА-пзре, однако.

Для описания рассматриваемой четырехцепочечной спирали достаточно определить строение квадруплета из двух водородносвя-занных пар оснований ЛТ, указать направления сахарофосфатных цепей и определить строение ее половины - двухцепочечной спирали poly (dA)« poly (dT), то есть определить следующие параметры: Q -угол спирального закручивания, Dz - расстояние между i-тым и (/+7)-м слоями оснований в спирали, угол

эти углы эквивалентны углу крена (б) и наклона 0/), соответственно, в АТ-паре оснований.

в

г

д

е

Рис. 5 Симметричные комплексы из четырех водородносвязанных оснований.

'пропеллера" to), излома (к), хре-

на (0) и наклона (17) в АТ-паре,

гликозидные углы (¿д и хт) и углы псевдовращения (Рд и Ят) Сахаров при аденине и тимине, соответственно. При указании типа двойной спирали по afr-номенклатуре первая буква относится к адениновой цепи, вторая - к тимнновой. Параметры оптимальных конформеров для спирали каждого типа квадруплета приведены в Табл. IV. При оценке энергий возможных информации учитывалось, что энергия электростатического взаимодействия атомов сахарофосфатных остовов разных цепей четырехцепочечной спирали (для всех рассматриваемых вариантов спиралей 30 - 38 ккал/моль) в растворе существенно нейтрализуется противоионами. Значение энергии приводится в расчете на один полуслой четырехцепочечной спирали (АТ-динук-леотид).

По энергетическим оценкам устойчивость четырехцепочечных спиралей poly (dT)« poly (dA)« poly (dA)* poly (dT) убывает в ряду: комплекс "е" (Е - -21.8 ккал/моль), V (-20.0 ккал/моль), "а" (-15.9 ккал/моль), "(Г (-14.1 ккал/моль), V (-13.7 ккал/моль), "г" (-8.4 ккал/моль). Наблюдается корреляция между энергией конформсра и взаимным расположением гликозндиых связей разноименных оснований в нем относительно оси спирали. Чем меньше различие в расстояниях £Л от оси спирали до Cl'-атомов Сахаров разноименных оснований (т.е. чем изоморфнее квадруплет), тем меньшей потенциальной энергией обладает четырехцепочечная спираль. Значения AR для комплексов: "е" - 0.54 А, "¿Г - 0.37 А, "а" - 1.43 А, "<Г -2.94 А, "в" - 3.7 А, "г" - 4.65 А.

Таблица ¡V

Конформаииоиные параметры и потенциальная энергия четырехцепочечиых спиралей

Спираль

Тип

Ко н формацией н ые параметры*

т.

град

Я,

град

град

о,

град

град

л.

град

X, грал

7.

град

0, град

в. град

е,

град

с, град

Энергия

В, К&ад моль

щил моль

аЬ ЬЬ

Ьа

ЬЬ Ьа ЬЬ

Спирали с

-35.6 34.1

30.0

33.7

32.1 34.0 34.4

3.5

3.9

3.5

3.3

140.1 160.1

109.9 176.9

30.0 110.0

125.8

176.9

антипараллельной ориентацией разноименных '169.8 178.8

1.2 -4.1 -1.2

2.5

-0.3 -2.5 -2.1

1.3

-5.3 1.0 -3.0

-2.7

-7.0 1.6 -3.1

-0.5

49.9

265.8

195.4 223.2

201.9 56.3

55.9 40.2

58.2 73.5

71.1

58.3

180.4 234.2

171.5 116.8

172.4

171.3

174.4 177.0

188.4 184.3

цепей 266.3

225.2

299.3 285.2

281.2 291.9

152.8 96.2

Спирали с параллельной ориентацией разноименных цепей

3.3

3.5

3.4

105.2 175.9

163.1 147.9

163.0

152.1

2.9

-2.3

3.3

-20.9

-0.6

-0.5

9.1

-2.4

1.5

-2.3

8.9

2.6

223.9 242.7

213.3 40.9

216.5 211.1

63.8 172.5

186.3

203.7

189.5

189.8

159.4 167.7

169.2

172.3

164.9

172.5

300.0 150.6

145.9 127.9

145.1 141.3

239.0 211.9

268.0 219.4

288.0

268.3

264.1 230.1

258.4

253.5

262.3

272.5

267.4

266.6

190.2

293.8

191.9 198.9

201.4 190.2

193.4 195.1

198.1

203.7

192.8

192.2

188.7 192.4

26.9

24.8 12.5

14.7

21.5

20.9

15.6

-15.9 -13.7 -21.0

-20.8

-14.1 -14.6 -21.8

а

аа

я

л

е

б

я

с

В первой строке ллн каждой формы приведены параметры адениновой цепи, во второй - тиминовой Приведена энергия без учета электростатического взаимодействия сахарофосфатных остовов.

цепи.

Потенциальная энергия четырехцепочечной спирали ниже суммы энергий двойных спиралей, ее образующих: энергия двойной АТ-спирали достигает -14.2 ккал/моль в случае антипараллельной ориентации цепей (для канонической В-фор-мы) и -13.4 ккал/моль в параллельной двойной спирали. Таким образом, в ряде случаев ассоциация двух двойных спиралей ро1у(<1А) ро1у(<1Т) в четырехцепочечные комплексы с параллельно ориентированными одноименными цепями оказывается энергетически оправданной. В большинстве случаев оптимальными оказались спирали с антипараллельным расположением разноименных цепей и параметрами, существенно не отличающимися от параметров канонической спирали, то есть наиболее вероятно образование четырехцепочечных комплексов из двух канонических антипараллельных двойных спиралей ДНК, <гго согласуется с экспериментальными данными [Борисова, 1990], однако, в ряде случаев имеют место неординарные структуры, в частности, левозакрученные формы н спирали с параллельной ориентацией А- и Т-цепей.

Какие же структуры могут образовываться с участием подобных четырехцепочечных спиралей и какова их роль в биохимических процессах? Четырехцепочечные спиральные структуры могут, например, образоваться из "крестов" путем связывания лучей "креста" друг с другом или с соседними участками спирали. Такие легко распознаваемые характерные структуры могут служить "сигналами" для определенных белков. Возможен также переход участка двойной сверхспирализованной ДНК в четырехцепочечную спираль, который должен приводить к сбрасыванию супервитков,-при условии совпадения направлений закрутки двойной спирали и суперспирали.

ВЫВОДЫ

1. Изучена термодинамика образования двутяжевых структур ДНК с параллельной ориентацией сахарофосфатных остовов. Показано, что параллельные спирали, с А-Т-парами оснований, могут существовать в растворе олигонуклеотидов в физиологических условиях, хотя и являются несколько менее устойчивыми с термодинамической точки зрения, по сравнению с антипараллельной спиралью.

2. Разработан алгоритм и созданы программы поиска оптимальных конформации регулярных гомополимерных структур с произвольной взаимной ориентацией сахарофосфатных остовов в широких диапазонах параметров спирали.

3. Проведен конформационный анализ всех возможных параллельных гомополимерных спиралей ДНК с симметричными неканоническими парами оснований. Показано, что:

а) для параллельных спиралей, наряду с информационной областью, характерной для £-формы ДНК, существует еще одна энергетически выгодная область.

б) конформационная энергия параллельных структур имеет примерно ту же величину, что и у антипараллельных и в существенной степени зависит от типа основания - пуриновые гомополимеры образуют более устойчивые формы спирален, чем гомопиримидиновые.

в) стерически разрешены оба типа закрутки цепей - правый и левый, однако более устойчивыми являются правые конформеры.

4. Проведен хонформационный анализ гетерономных параллельных спиралей poly (dA)* poly (dT). Рассмотрены все возможные АТ-пары оснований и все возможные ориентациии пары оснований, относительно направления сахарофосфатных остовов. Расчеты показали, что:

а) потенциальная энергия параллельных спиралей, в состав хоторых входят пары оснований с траке-расположением гликозидных связей, существенно более устойчивы, чем спирали с каноническими парами оснований.

б) потенциальная энергия и углы сахарофосфатного остова оптимальных кон-формеров почти не отличаются от соответствующих величин для антнпараллельной спирали с уотсон-криковским спариванием оснований.

5. Проведен хонформационный анализ четырехцепочечных спиралей poIy(dT),poly(dA)«poly(dA)«poly(dT) в рамках симметричной модели, который показал, что:

а)наблюдается корреляция между энергией конформера и взаимным расположением гликозидных связей разноименных оснований в нем отноентелыю оси спирали. Чем меньше различие в расстояниях ДЯ от оси спирали до С1 '-атомов сахароз разноименных оснований (т.е. чем изоморфнее квадруплет), тем меньшей потенциальной опершей обладает четырехцепочечная спираль.

б) в оптимальных случаях потенциальная энергия четырехцепочечной спирали ниже суммы энергий двойных спиралей, ее образующих.

в) в большинстве случаев оптимальными оказались спирали с а непараллельным расположением разноименных цепей и параметрами, существенно не отличающимися от параметров канонической спирали, то есть наиболее вероятно образование четырехцепочечных комплексов из двух канонических антнпараллельных двойных спиралей ДНК, однако, могут иметь место и неординарные структуры, в частности, левозакрученные формы и спирали с параллельной ориентацией разноименных цепей.

Основные материалы диссертации изложены в публикациях:

1.A.K.Shcyolkina, I.A.Il'ichova, Yu.P.Lysov, Yu.B.Golova, B.K.Chernov, A.A.Chernyi, E.P.Gottikh, V.UFlorentitv "Parallel stranded DNA with AT base pairing" FEBS Letters, 1989, V.244, N.l, P.39-42

2.А.К.Щелхина, Ю.ПЛысов, И.А.Ильичева, Ю.Б.Голова, Б.К.Чернов, А.А.Чер-ный, Б.П.Гоггих, ВЛ.Флорентъеа "Экспериментальное доказательство сущестЕОЕа-

ния параллельной двойной спирали ДНК" Доклады АН СССР, 1989, т.304, N.2, С.476-480

3.А.К.Щелкина, Ю.П.Лысов, И.А.Ильичева, Ю.Б.Голова, Б.К.Чернов, А.А.Чер-ный, Б.П.Готтих, ВЛ.Флорентьев "Параллельные двойные спирали ДНК. 1.Доказа-тельство существования параллельной спирали с АТ-спариванием оснований" Молекулярная биология, 1989, Т.23, ВЫП.1, С.295-305

4.И.А.Ильичева, Ю.ПЛысов, А.А.Черный, ВЛ.Флорентьев, А.К.Щелкина, Б.П.Готтих Параллельные двойные спирали ДНК. II. "Конформационный анализ регулярных спиралей, имеющих ось симметрии второго порядка." Молекулярная биология, 1989, Т.23, ВЫП.4.С.1154-1162

5.I.A.ll'ychova, Yu.P.Lysov, A.A.Chernyi, V.L.FIorentiev, A.K.Shchyolkina, B.P.Gottikh "Parallel double helices of DNA. Conformational analysis of regular helices with the second order symmetry axis." J.of Biomolec. Struct, and Dynamics, 1990, VOL7, N.4, P.879-897

6.А.А.Черный, Ю.ПЛысов, И.А.Ильичева, А.С.Зибров, А.К.Щелкина, О.Ф.Борисова, О.К.Мамаева, ВЛ.Флорентьев "Четырехцепочечные спирали ДНК. Конформационный анализ регулярных спиралей псшиМА^лолиМТ^поли^А) •полиЫТ) с различными вариантами спаривания оснований" Молекулярная биология, 1990, Т.24, ВЫП.5, С.1399-1410

7.А.А.Черный, Ю.ПЛысов, И.А.Ильичева, А.К.Щелкина, ВЛ.Флорентьев "Параллельные двойные спирали ДНК. Конформационный анализ регулярных спиралей поли (dA)* поли (dT) с различными вариантами спаривания оснований" Молекулярная биология, 1991, Т.25, ВЫП.1, С.275-283

Сдано в набор 11.02.91 В пиатъ 06.02.91

Формат 60x901/16 Петатъ офсвтми Усл.печ. л. 1,25 Усл. »p.-OTT. 11,37 Уч.-взд. л. 1,32

ТЧ>. 100 ' «о. Зет. Ю60

Провзводстввкно-взаатвльскхЛ комбшиг ВИНИТИ 140010, Люберцы 10, MocsoaczDl оба., ОктябрьсххА проспект, 403