Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-динамические особенности макромолекулы ДНК и хроматина (метод спиновых меток и зондов)

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-динамические особенности макромолекулы ДНК и хроматина (метод спиновых меток и зондов)"

>9 с;1 и 9.?1

1 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н.Н. СЕМЕНОВА

На правах рукописи

МИЛЬ ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

ГРУКТУРНОДИНЛМЙЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МАКРОМОЛЕКУЛЫ ДНК И ХРОМАТИНА. (МЕТОД СПИНОВЫХ МЕТОК И ЗОНДОВ)

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена в Институте химической физики имени Н.Н. Семенова РАН

Официальные оппоненты

доктор! биологических наук профессорДЛЛ.Слитхо&схий доктор физико-математических наук, профессор ЭЛ. Рууге доктор химических наук, профессор МГ. Гольдфельд

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Защита состоится И&Я^Л 1992 г. в ^ час

на заседании Специализированного совета Д-00226.07 при Институте химической физики РАН.

Адрес 117977, Москва, В-334, ГСП-1, ул. Косыгина,4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики РАН,

Автореферат разослан " О^^^Л 1992г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат химических наук

МА Смотряеаа

общая характеристика работы

Актуальность проблемы, Проблема изучения динамических изменении структуры ДНК и ДНП связана с вопросами функционирования генома, при которых происходят изменения как вторичной структуры информационной макромолекулы, так и третичной структуры ДНК и ее комплексов с белками. Становится очевидным, что разнообразие конформаций двуспиральной структуры, локальные изменения структуры макромолекулы ДНК в составе хроматина определяется как первичной последовательностью ЛНК, так и факторами среды и взаимодействием со сложным комплексом гистоновых белков в нуклеосоме ( Drew H.R..Travers A.A.,1984 ; Richmond.T.J.,et al,1984).Актуальность проблемы определяется в частности и тем, что строение нуклеосомы , основной структурной единицы хроматина, а именно трехмерная укладка полипептидных цепей гистонов и строение связывавших контактов, находится еще в стадии изучения ( Klug A. et al,1980, Mlrzabekov A.D. et al, 1980, Me Chee J.D. et al,1960; Bentley A.L. et al.1984).

В последнее время предполагается, что ДНК-гистоновые взаимодействия в хроматине осуществляются как с помощью электростатических взаимодействий заряженных аминокислот с фосфатами, так и с помощью водородных связей между аминокислотами в а-спиральных участках белков с основаниями ДНК. Обнаруженный недавно общий принцип взаимодействия с ДНК регуляторных ДНК-связывающих белков с помощью консервативной а-спиральной структуры ( Takeda Y. et al,1983; Sauer R.T. et al.,1982) поставил вопрос о поиске аналогии и во взаимодействии и строении димерных комплексов октамеров гистонов с нуклеосомной ДНК. Для выяснения общих принципов образования таких комплексов может быть

полезен математический метод определения гомологии аминокислотных последовательностей между гистонаыи эукариот и ДНК-связываювдми белками прокариот.

Вместе с тем, для изучения структурных изменений ДНК и динамических особенностей хроматина .а также построения модели нуклеосомы, включая пространственную структуру гистоновых белков, может оказаться полезным метод спиновых меток и зондов, чувствительный к локальным конформационньм изменениям макромолекул. Метод спиновых меток и зондов нашел широкое применение в молекулярной биологии для изучения структурно-функциональных особенностей белков и ферментов и динамики ряда биологических систем ( Me Connel, et al,1965; Лихтенштейн Г.И.,1974;Кузнецов А.Н. и др., 1974). Однако, применение метода для изучения нуклеиновых кислот после успешного проведения ряда работ (Сухорукое и др. 1970, Slncha et. al., 1979) тормозилось, в связи с трудностью избирательной модификации ДНК спиновыми метками и физико-химическими особенностями комплексов ДНК. с зондами, интеркалирующими в двойную спираль. В последнее время ведется разработка новых методов синтеза спиновых меток , зондов ,спин-меченых красителей, что открывает перспективы широкого использования их как модельных аналогов биологически активных соединений i Hong Sun-Joo .Plette L.H.,1975; Robinson B.H. 1979,-Криницкая Л.A.,Шапиро A.Б. .1977 ).

Можно было полагать,что развитие метода спиновых зондов и меток позволит получить дополнительные сведения о структурных изменениях ДНК при химических воздействиях, при нормальном и опухолевом росте, действии УФ-и гамма-облучения,которые ранее были изучены

рядом физико-химических методов имануэль, 1974 ; Круглякова К.Е..Николаева Н.Н,1965;Жихина Г.П. 1986,-Уланов Б.П., Шарпатый В.А.,1978). Использование возможностей метода ЭПР в сочетании с другими физико-химическими и биохимиическими методами, по видимому, может дать новые подходы для получения исчерпывающей информации о тек превращениях, которые возникают в макромолекуле при взаимодействии с биологически активными соединениями. Метод спиновых меток может стать также тонким инструментом в изучении ДНК~гисгоновых взаимодействии при исследовании динамических изменений хроматина.

Цель работы. Цель работы состояла в исследовании структурных особенностей макромолекулы ДНК, ее комплексов с малыми молекулами, а также динамических изменений структуры ДНК и хроматина разного происхождения при физико-химических

воздействиях с использованием метода спиновых меток и зондов.

Е связи с поставленной целью решали следующие задачи: 1. Разработать новые подходы и выработать количественные критерии для изучения динамических особенностей структурно-изолированной макромолекулы ДНК и ДНП - комплекса методом спиновых меток и зондов.

?. Изучить особенности интеркаляиии спин-меченых производных -аминмакридинсвого ряда и использоЕать этот подход для мониторинга взаимодействия малих, биологически активных молекул с ДНК.. ^.Проанализировать конформационные изменения в ДНП нормы и опухоли под действием факторов среды <мочевины.детергентов.соли> с использованием жестких, коротких ртутьсодержащих спиновых меток. 4.Выявить особенности организации гистоновых октамеров в нуклеосомах покоящихся и функционально активных тканей.

5.С использованием математического метода анализа на ЭВМ выявить гомологию аминокислотных последовательностей между гистонами эукариот и ДНК-связываюшми белками прокариот.

6 Сформулировать обшие принципы построения ДНК-белковых комплексов у ДНК-связываюших регуляторных белков прокариот

и гистонов эукариот .Предложить схему пространственной организации нуклеосомы и гистоновьх белков.

7.Разработать метод определения ДНК-белковых сшивок в хроматине под действием УФ-света для анализа биологич еской активности химических соединении, обладающих протекторном или сенсибилизирующим действием.

Научная новизна работа.В диссертации впервые проведено систематическое изучение особенностей динамической структуры нуклеиновых кислот, дезоксирибонуклеопротеидов, л также комплексов ДНК с малыми биологически-активными молекулами при различных физико-химических воздействиях с помощью разработанных подходов и приемов, сочетавших метод спиновых меток и зондов с другими физико-химическими методами. Это позволило получить сведения о наличии ряда температурных структурных переходов в ДНК, зарегистрировать ранние предденатурационные изменения динамических характеристик ДНК. Установлено, что структурные нарушения обуславливают различия в температурах структурных переходов ДНК нормальных и опухолевых клеток, которые появляются более резко при действии малых доз гамма-облучения.

Сочетание метода ЭПР и дифференциальной спектроскопии впервые позволило получить данные о том, что интеркаляция крагитоля см-9 аминоакридина в ДНК осуществляется в нейтральной и в заряженной форме в зависимости от состояния ее вторичной структуры

Использование спин-меченого интеркалирующего красителя позволило обнаружить различия в изменениях структуры ДНК под действием дУФ- и кУФ-света.

Математический анализ аминокислотных последовательностей между гимстонами НЗ, Н4 эукариот и белком КСго прокариот позволил впервые обнаружить статистически значимую гомологию между ними по критерии, отражающему сходство в первичной струют/уре, и предположить определенную вторичную структуру участков, взаимодействующих с ДНК. Эти данные позволяют предположить возможность общего эволюционного происхождения этих белков, а также обших принципов образования ДНК-белковых комплексов, как с помощью электростатических взаимодействий заряженных аминокислот с фосфатами, так и с помощью водородных связей а-спиральных участков гистонов с основаниями ДНК.

С использованием новых ртутьсодержащих спиновых меток проведено изучение динамических особенностей и пространственной структуры ДНИ нормальных (тимус теленка) и опухолевых клеток (асцитныя рак Эрлиха) под действием факторов среды, что позволило обнаружить различия в конфорнационных изменениях в районе сульфгидрильных групп ДНП нормы и опухоли.

Практическая значимость работы- Проведенные исследования позволили разработать подходы к изучению структурных изменений нуклеиновых кислот методом спиновых меток и зондов, выявить количественные критерии изменения структуры ДНК при физико-химических воздействиях и при опухолевом росте. Эти подходы могут быть широко использованы при анализе структурных особенностей биополимеров, комплексов ДНК с белками и малыми биологически активными соединенями.

Установлено, что сочетание метода ЭПР и дифференциальной спектроскопии для изучения взаимодействия см 9-аминоакридина с ДНК и образования комплексов ДНК с малыми биологически активными соединениями, позволяет получить взаимодополняющую информацию о структурных особенностях изучаемых комплексов и их изменениях при действии дУФ-света.

На основании изучения комплексов ДНК с аминокислотами и фосфолипидами, а также данных о конформаиионных изменениях ДНК при действии дУФ и малых дозах кУФ-света, предложено использовать интеркалируюший краситель ( метод ЭПР и дифференциальной спектроскопии) для мониторинга взаимодействия ДНК с биоло гически-активными соединениями.

Анализ собственных и литературных данных по изучению структуры ДНП нормальных и опухолевых клеток позволил сделать ряд выводов о пространственных соотношениях в нуклеосомах нормальных и опухолевых клеток. Высказан ряд научных гипотез: общем эволюционном происхождении белка репрессора ^Сго прокариот и гистонов НЗ и Н4 эукариот; предложена схема взаимодействия гистонов НЗ и Н4 с центральными парами ДНК кора, которая может быть использована в качестве рабочей гипотезы в научных экспериментах.

Предложен метод определения ДНК-белковых сшивок в хроматине, образующихся под действием УФ-облучения в присутствии химических соединений, который может служить удобной тест -системой при отборе препаратов -модификаторов сиивох.. Метод защищен авторским свидетельством.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на IV Международном биофизическом конгрессе (МоскЕа,1972), Симпозиуме

Свободнорадикальные состояния и их роль при лучевом поражении и злокачественном росте (Москва,1972),X -ом всесоюзном совещании по биологическому действию УФ-облучения ( Горький,1974), V-th International Biophysical Congress (Kopengagen ,1975), Всесоюзных симпозиумах " Магнитный резонанс в биологии и медицине",(Звенигород,1981, 1982,1966,1989), VII-th Jena Sympozlum (Jena ,1975), 1-ом Биохимическом сьезде (Москва,1982 ), Всесоюзной конференции по нитроксильным радикалам (Черноголовка, 1982), б the СМЕА Symposium on EPR Spectroscopy In Biochemistry (Bratislava" 1988), Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка, 1987), Международная конференция по регуляции и свободно - радикальным реакциям (Варна,1989 ), A FEBS satellite meeting "Molecular Dynamics in Membrane",1980 , а также на конференциях Института химической физики в 1974-1986 годах.

Отдельные фрагменты исследований отражены в минографиях Г.И.Лихтенштейна "Метод спиновых меток в молекулярной биологии",1974, Бучаченко А.Л..Вассерман A.M. "Стабильные радикалы" 1973, Кузнецов А.Н. "Метод спинового зонда"19?6, Эмануэль Н.М. "Свободные радикалы в биологии " 1979, Розанцев Э.Г."Метод спиновых меток"1979, Кокорин А.И., Пармон В.Н. и др. "Стабильные бирадикалы "1980, Жданов Р.И. "Парамагнитные модели биологически-активных соединений"!981, Ажипа Я.И. "Медико -биологические аспекты применения метода ЭПР ",1983. Bobst А.М."Appllcatlon of spin labelling to nucleic acids",In "spin labelling" V2, 1979; Kamsolova S.G.,Postnlkova "Spin labelled nucleic acids".Quarterly Rewlews of Blophysles",1901; B.H.Robinson, H.Tomann at al "EPR and Advanced ESR studies of Biological Systems"Chapter 6"The application of EPR techniques to

the study or DNA" In 1982, lri 19Ö3, la 1ÜÖ5.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 работ.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Разработка подходов к иэучени/ю структурных изменений нуклеиновых кислот, взаимодействия ДНК с малыми биологически-активными соединениями, а также для исследования пространственной структуры ДНП методом спиновых меток и зондов.

2. Сочетание метода ЭПР и дифференциальной спектроскопии для изучения взаимодействия см 9-аминоакридина с ДНК и образования комплексов ДНК с аминокислотами и фосфолипидами.

3. Исследование и математический анализ на ЭВМ аминокислотных последовательностей гисгонов НЗ,Н4 и белков репрессоров прокариот Изучение конформации С-концевогс участка гистона НЗ в ДНП нормальных и опухолевых клеток методом спиновых меток. Структура и обьем работ. Диссертация состоит из введения, четырех глав, . заключения, приложения и основных выводов.. Каждая глава включает краткий обзор литературы и состояние исследований в соответствующих областях ЭПР. В главе "Приложение" описаны экспериментальные методики и результаты некоторых экспериментов. Общий обьем диссертации 1£>и страниц. Экспериментальный материал представлен

3S рисунками и 8 таблицами.Список литературы включает 1 работы.

содержание работы

Глава 1. структурные изменения спин-меченои днк при ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ воздействиях и функциональных нарушениях.

К началу настоящего исследования метод спиновых меток и зондов начал широко применяться для изучения структурно-функциональных особенностей белков, ферментов и

мембран в нашей стране и за рубежом IMac Connell,1965, Лихтенштейн, 1974, Кузнецов,1976, Берлинер,1979, Голь'&ельд, Гендель, Кольтовер, 1969). В то же время изучение нуклеиновых кислот с помощью этого метода развивалось более медленно. В ряде случаев это было связано с трудностью избирательной модификации нуклеиновых кислот спиновыми метками и недостаточностью информации, получаемой с помощью неспецифических зондов. Так, уже в 1967 году была проведена первая модификация нуклеиновых кислот спиновой меткой iSmlt, Janane,1967).затем методом спинового зонда были зарегистрированы температуры структурных переходов в пленках ЛИК различной влажности (Сухорукое и др.,1970). Однако, использованные в ранних работах метки и зонды недостаточно отражали особенности поведения ДНК при различных воздействиях. Поэтому нами была поставлена задача выбрать спиновую метку и провести модификацию ДНК без существенного изменения структуры макромолекулы, а также выявить количественные критерии, которые позволили бы охарактеризовать состояние ее структуры.

Для этих целей была выбрана и впервые использована спиновая метка на основе этиленимина 4Cß-N этилениминопропил)- окси -2,2,6,6 тетраметилпиперидин -1- оксил (см-зтиленимин), которая была синтезирована в лаборатории Э.Г.Розанцева (Шапиро и др.,1969). Выбор этой метки был обусловлен в первую очередь тем, что этиленимин и его производные обладают высокой алкилирующей активностью по отношению к основаниям ДНК, взаимодействуя в первую очередь с N7 гуанина и N3 аденина (Brown et al,1965, Морозова, 1973).

Нам удалось показать, что см-этилеимин производит модификацию ДНК , несколько снижая Тпл и матричную активность ДНК в

РНК-полимеразнои системе. Несколько позже эта метка была использована для модификации РНК и полинуклеотидов (Завриев, Григорян и др.,1973,1974 ). Важно было выбрать такие условия, при которых ковалентное связывание см-зтиленимина существенно бы не изменяло структурных характеристик макромолекулы. Контроль за этими изменениями проводили по приведенной вязкости, электронной микроскопии и другим показателям I Тпл).

Хотя присоединение метки несколько изменяло исходные показатели структурных характеристик макромолекула (Тпл, гирхперхромный эффект, матричная активность в РНК-полимеразной системе;, они всегда учитывались при анализе структурных нарушений в ДНК при различных воздействиях.

Температурные структурные изменения спин-меченой АПК.

Для различных спин-меченых ДНК (тимуса теленка, селезенки крыс) было показано, что спектры ЭПР при 22° представляет собой триплет с Аизо=1б,8 и временем корреляции спиновой метки (^ от 2-6.10 и зависят от состава среды. Анализ температурн

зависимости 1рис.1) спин-меченой ДНК тимуса теленка и селезенки крыс позволил нам впервые методом спиновой метки виделить нескилько линейных участков с различными значениями энергии, активации и обнаружить наличие ряда структурных переходов спин-меченой ДНК. в области -4иС( А. I, -14°С(В), переход в интервале 20-26°(С) и высокотемпературный переход. характеризуемый определенной температурой структурного перехода (Теп! а области 64-Ьо°С. Наличие переходов А и В связано с изменением физических свойств ДНК при изменении температуры: так в переходах при -43 и -14° существенную роль может играть вода, структурно связанная с ДНК.

2 -см ДНК тимуса теленка,3 -см ДНК селезенки крыс (эритромиелоз).

II Температурная зависимость времени корреляции (ТдЗ в координатах Аррениуса:1 -см ДНК тимуса теленка,2 -см ДНК селезенки крыс. Стрелками отмечены температурные переходы при -14(A), -4 (В), 20 (С), 66VC (Теп).

На это указывают данные ряда работ, в которых аналогичные переходы были зарегистрированы методом калориметрии (Привалов.1967), а также методом спинового зонда (Сухоруков и др.,1970). Наибольший интерес вызвал впоследствии переход в области 20-26° , зарегистрированный также в ряде работ по термокалориметрии (Сухоруков и др.,1970, 1980), а также с использованием других меток и зондов ( Bobst et al.,1979). Наличие

этого перехода может бить связано с процессом дезагрегации ДНК и изменением ее гидратной ободочки при повышении температуры выше перехода, например, за счет уменьшения связывания воды с сахарофосфатным остовом ДНК. Возможно, что переход ДНК в определенное состояние ее структуры подготавливает генетическую систему для функциональной активности.

При более высоких температурах , как известно, начинается процесс плавления ДНК, приводящий к денатурации макромолекулы. С помощью см-этиленимина оказалось возможным охарактеризовать этот процесс. Было обнаружено, что плавное увеличение значения т„ происходит уже в предденатурационной области и может быть использовано для характеристики изменений структуры ДНК до начала плавления. Другим параметром, регистрирующим структурные изменения спин-меченой ДНК может быть параметр Теп, определяемый по температурной зависимости xQ . Определяемая по этим двум параметрам температура перехода (Тсп ) оказалась на 5°-7° ниже,чем Тпл спин-меченой ДНК, регистрируемая спектрофотометрически. Это может быть связано с высокой чувствительностью метода спиновых меток к локальным структурным изменениям.Возможно,метод позволяет наблюдать предварительное разрыхление спирали, предшествующее плавлению, которое обеспечивает освобождение метки.

В согласии с нашими результатами находятся данные работы (Sheng Pelgen et al.,[967J, в которой в качестве спиновом метки было использовано производное bis-этиленимина и данные работы i Bobst et al., 1979),где использовали другую сгшниЕую метку. Данные различных физико-химических методов (метода КД. дисперсии оптического вращения, светорассеивания, импульсной полярографии и др.), которыми изучался процесс тепловой денатурации

макромолекулы, свидетельствуют о том, что изменение структуры ДНК при повышении температуры действительно начинается с локальных конформационных изменений спирали, происходящих в области предплавления (Palecek et al.,1976).

В результате систематического изучения препаратов ДНК с различным состоянием вторичной структуры, нам удалось показать, что параметр Теп сопоставим с началом кривой интервала плавления спин меченой ДНК, а изменение этого параметра происходит симбатно уменьшению гиперхромизма ДНК, определяемому спектрофотометрически. Это позволило предложить в качестве основной характеристики состояния структуры см-ДНК. параметр Теп, который, наряду с Тпл, может служить критерием изменений во вторичной структуре ДНК.

Характеристика вторичноя структуры си-ЛИК опухоленвых клеток.

Предлагамый нами критерий для характеристики вторичной структуры

ДНК (Теп) был использован для анализа ДНК из клеток здоровых и

больных животных,на примере лимфолейкоза крупного рогатого скота.

Ранее .рядом методов были показаны различия в структуре ДНК

нормальных и опухолевых клеток ( Жижина,1973,Ан^юникашвили, 1975)

Нами была прослежена температурная зависимость и

определены значения Теп и Еэфф для ДНК, выделенных из нормальных и опухолевых клеток.

Таблица 11

Характеристика препаратов ДНК в норме и при лимфолейкозе.

Препарат ДНК ЕЭфф Те п 1 °С ) Препарат днк E3<J»J> Ten ( °С )

ЛЕЙКОЗ

19,5 60, Oil 3 18,0 40*1

19,0 57 , 5±1 4 1 I ■ 5 54J. 1

5 10.0 49Л1

НОРМА

Препараты ДНК., выделенные из клеток здоровых и оольных животных, имели близкие исходные характеристики: температуру плавления -67,5 -88,5° С, гиперхромизм -38£ в растворе 1SSC -буфера, содержание белка в препаратах 0,5% . Однако, как следует из таблицы 1, значение Теп спин-меченои ДНК из лимфоцитов крови лейкозных животных регистрируется раньше 149-54°С) по сравнению с ДНК, выделенной из лимфоцитов крови контрольных животных 15 8-60° ). Такое различие может свидетельствовать о большей структурной лабильности макромолекулы ДНК из лейкозных клеток и об увеличении дефектов структуры в ней, поскольку повышение числа деспиралиэированных основании прк<едет к плавлению ДНК при более низких температурах. Независимыми методами 1КФ-метод, Жижина, Круглякова , 198Ы на тех же препаратах ДНК обнаружено увеличение количества участков с дефектами структуры (4-6.10 лейкозных клетках по сравнению

У

с нормой .0 различиях в структурах осооенностях ДНК нормальных и опухолевых клеток указывают также данные исследований Тодорова по модификации ДНК дибромацетатом (Тодорив и др. , I■ .

Существенное изменение параметра Теп и т. мы наолюдЗли также при действии малых доз /-облучения (0,5 1 Грей) на препаратах ДНК нормальных и опухолевых клеток той же партии живогньое.

Удалось показать, что ДНК этих клеток. именл рлчличнум) чувствительность к действию облучения . . О&нарул^НА бот шля "глубина" изменения конформации ь локальном окружении метки в нормальной ДНК при облучении дозами ди ft Грек, а Г&Хлк. снижение параметра Теп с дозой, чем в ДНК лейкозных клеток.

В обоих случаях температура структурного переход,-* при увеличении дозы существенно снижается, приближаясь к значении.'.

полученному для денатурированной теплом ДНК, что свидетельствует об ослаблении двуспиральноя структуры при облучении ДНК. Было показано, что достоверное снижение Теп и тс достигается уже при дозе 0,5-1 Грей, что может служить указанием на чувствительность этик параметров к изменению структуры ДНК. В то же время наблюдаемое экспоненциальное уменьшение величины тс спин-меченых ДНК с дозой свидетельствует о конформационных изменениях спирали в локальном окружении метки. Снижение времени корреляции спиновой метки слсдуе! связать с идущим при облучении процессом разрыва водородных связей и образованием локально денатурированных участков за счет атаки азотистых оснований продуктами радиолиза воды ( Шарпатыи ,1984).

Изменение Теп спин-меченых ДНК наблюдалось также при анализе препаратов ДНК, выделенных из опухолевых клеток при развитии эритромиелоза у крыс.

Таким образом, полученные с помощью метода спиновых меток данные указывают на возможность использования параметра Теп как критерия для обнаружения нарушения вторичной структуры ДНК в различных клетках. Наблюдаемые различия в Теп спин-меченых ДНК нормальных и опухолевых клеток, характеризующие различное физико-химическое состояние ДНК, находятся в соответствии с исследованиями других авторов, систематически изучающих структурные особенности ДНК нормальных и опухолевых клеток. Было показано, что в ДНК опухолевых клеток обнаруживается повышенное количество участков локальной деспирализации .содержатся однонитевые разрывы, причем эти участки находятся, преимущественно, в области быстрых повторов! Жижина,1974 Андроникашвили, 1975, Спитковский, Шугалий, 1982, Эмануэль,1974,

Тодоров, 19Ö4). Появление зон с измененной структурой, вероятно, частично можно отнести к ДНК , которая находится в активно-функционирующем в опухолевых клетках хроматине (Шапот,1975); с другой стороны , по-видимому, это и специфическая локальная деспирализация ДНК опухолевых клеток, не сводимая к дефектам, образующимся при репликации и транскрипции и имеющая нуклеотидный состав, отличающийся от среднего нуклеотидного состава, в котором обнаруживается большее содержание участков с Z-формоя ( Хижина, Круглякова ,Тодоров, Эмануэль,19Ö6).

Метод спиновых меток применительно к изучению нуклеиновых кислот получил дальнейшее развите в работах отечественных и зарубежных авторов ( Сухоруков, Петров ,1974, Завриев,Григорян, 1974, Botst,1979, Sheng Pelgen et al, 1986, Bobst et al,1991 и другие). Было установлено, что хотя в методе , в осноеном, была использована неспецифическая модификация ДНК, при которой выявляется слабая иммобилизация спиновой метки, он может быть использован для получения некоторых физических параметров коррелирующих с функцией ДНК: конформационных изменениях при B->C,B->A,B-»-Z переходах, при радиационных нарушениях, при связывании с полимеразои и красителями, а также дает возможноесть обнаружения по спектрам ЭПР области предплавления ДНК (Kair^olova, Postnikova, 1983, Хпанов, 1980, Robinson et al, 1УЭ2 , l(--ö3 ,19«Ь, Bobst et al.1989) Однако .следует иметь в виду .что во всо случаях следует учитывать некоторое изменение структуры ДНК , которое может быть вызвано ковалентным связыванием спиновои метк* с макромолекулой ДНК. Наиболее переспективными поэтому дл$ изучения конформационных изменений ДНК и структуры ее юмплексоЕ с различными молекулами, по-видимому, является использование

спиновых зондов, интеркалирующих в ДНК , вызывающих небольшие и обратимые изменения вторичной структуры макромолекулы. Именно этот подход был использован нами для изучения комплексов ДНК с биологически активными молекулами ( аминокислотами и фосфолипидами ) .

Глава II. взаимодействие днк с малыми биологически активными

молекулами.

Известно, что ДНК функционирует в клетке не изолированно, а в К1'М!1Л< К1 р различными белками и биологически активными малыми молекулами. Изучение структурных изменений ДНК ,в этом случае, требует специальных подходов и методов. Поэтому, в настоящее время все шире используются малые спин-меченые биологически активные соединения - это зонды, красители, интеркаляторы ( в том числ* канцерогены), которые могут встраиваться в макромолекулу ДНК без существеного нарушения ее структуры, подобно их немеченым аналогам. Тем самым можно получить информацию как о структурных изменениях самой макромолекулы ДНК, так и о структуре ее комплексов с малыми молекулами.

Использование дополнительного воздействия ( в нашем случае действие длинноволново .о УФ-света) позволяет получить более полнее данные и наблюдать динамику изменения структуры комплексов малых молекул с ДНК.

Характеристика компяекесои ИНК со слин-меченым 9 амин0акрид)!н0м ( зондом -интеркаляторои).

Одним из1 первых зондов-инт^ркаляторов был синтезирован спин меченый бромид этидня, который был использован в качестве модельного лиганда с известными свойствами, особенностью которого является преимущественная интеркаляния в ГЦ - лпры, а

также связывание с г-формоя ДНК (Ноод Бин^оо еь а1., 1976». Затеи, в течение короткого времени были синтезированы спин-меченые аналоги канцерогенных ароматических аминов, а также производные 2,4 -нитробензола, интеркалярующих в ДНК 131п1га е1;'а1. , 1973).

Аналоги акридина, как зонды для анализа нуклеиновых кислот были синтезированы , начиная с 1975 года (31п1та, СМёпеП, 1975, Криницкая ,1979 1

Известно, что см 9-аминоакридин является аналогом акрихина, для которого установлено методом ЯМР, что местом встраивания его в ДНК является малая бороздка ДНК ( РгИБЬе ег а1.,1981 )

Нам удалось показать, что спектры поглощения см 9-аминоакридина в растворе и в комплексе с ДНК полностью соответствуют его немеченому аналогу, то есть присоединение метки не влияет, на его встраивание в ДНК.

Особенности строения см 9-аминоакридина позволили нам впервые сочетать метод ЭПР и дифференциальной спектроскопии для характеристики его комплексов с ДНК. Это позволило получить ценную дополнительную информацию о микроокружении зонда в двойной спирали ДНК. Было показано, что при образовании комплекса красителя с ДНК ( при соотношении ДНК и красителя р/о=20 I наблюдается интенсивные изменения в дифференциальных спектрах комплексов см 9-аминоакридина 1в кювете сравнения препарат ДНК). Так, вместо полосы поглощения свободного зонда-интеркалятора (20Онм), в дифференциальном спектре зонда при образовании егс комплексов с ДНК появляются две полосы поглощения при 270 и 290 нм. Соотношение интенсивностей этих полос существенно менялось при образовании комплексов с препаратами ДНК различной кативности ( гиперхромизм 35И, 29Х, 10%), при этом в более нативнои ДНК

максимум наблюдается, преимущественно, при 270нм, а в денатурированной ДНК при 290 нм. Аналогичные данные были получены параллельно с нами в работе (МаЕ1аэ1 ей а1., 1976) для непарамагнитного аналога 9-аминоакридина -акрихина, при его встраивании в ДНК.

На основании изучения дифференциальных спектров поглощения красителя с ДНК нами был сделан вывод о том, что изменение соотношения полос поглощения красителя - ^Эо^гто может служить критерием изменения нативной структуры ДНК.

Далее, мы показали, что изолированный зонд- краситель в зависимости от рН среды может находиться в протонированнол (N11) и депротонированнои (И* )форме, что сопровождается сдвигом полосы поглощения зонда-красителя в область более длинных и коротких волн соответственно.

Это дало нам основание предположить, что встраивание красителя-зонда в ДНК осуществляется в протонированной (полоса 290) и непротонированной - зарялкнной (полоса 270нм) форме в зависимости от состояния вторичной структуры ДНК.

Как показано в ряде работ (01скегБоп et а1.,1983, Сухоруков и др.:1964), Н4 - ионы и молекулы воды малого и большого желоба играют важную роль в стабилизации В-формы ДНК. По-видимому, дифференциальные спектры зонда-красителя отражают как микро -рН, так и изменение притонирования оснований в районе его присоединения в ДНК, которое зависит от состояния вторичной структуры на этом участке. Дополнительную информацию дает использование метода ЭПР.

Были изучены спектры ЭПР интеркалированного в ДНК красителя в растворе 0.001М МаС1 (рис.2). Как видно из рисунка, в спектре ЭПР

наолидается наложение широкого сигнала с 2Т^ =57,5 Гс IинтеркаляцияI и узкого сигнала I взаимодействие по фосфатным группам!. Значение времени корреляции широкого сигнала находится в области медленных вращений, что требует специального определения.

Ориентация спин-меченого образца в потоке перпендикулярно внешнему магнитному полю приводит к увеличим» значения 21"^ до 60,0 Гс. По-видимому, это связано с тем, что N0" фрагмент зонда ориентирован под углом к плану кольца аминоакридина.

-С1

Н,С0

Рис.2. А. 1 -спектры ЭПР см-9-аминоакридина и его комплексов I-ДНК, различной нативности:2 -ДНК 35% Г"Х, 3-29% ГХ, 4 -10% ГХ Б. Температурная зависимость параметров спектров ЭПР комплексов зонда с ДНК , К-2, М-3.

При увеличении количества красителя 11) 1 к ДНК (И и уменьшение соотношения P/D (P/D=5), либо при увеличении ионной силы раствора до 10 тпМ ,в спектре ЭПР комплексов зонда с ДНК появляется интенсивный сигнал ЭПР с константой сверхтонкого взаимодействия а=17 Гс (см.рис.2), который обусловлен как связыванием зонда с фосфатами, так и тем, что часть зонда находится в растворе. Важно отметить тот факт, что значение xQ зонда в растворе (0,1 нсек) значительно отличается от значения тс зонда в комплексе с ДНК (0,5 нсек), а также характеризуются иний полосой поглощения , определяемой спектрофотометрически. Эти данные свидетельствовали о том, что появление четкой I._j компоненты триплета в нашем случае, в основном, было обусловлено взаимодействием зонда с фосфатными группами ДНК.

Нами было показано, что интенсивность узкой компоненты спектра ( I_j ) закономерно возрастает, а значение 2Tjj широкого сигнала снижается при денатурации ДНК, уменьшении гиперхромизма ДНК, фрагментировании ДНК и образовании комплексов с сополимерами.

Таблииа 2.

Параметры спектров ЭПР см 9-аминоакридина в комплексе с препаратами ДНК и полинулеотидами.

Полимер 2Tjj(+0,5 Гс) Полммер 2Tjj{«-0,5 Гс)

ДНК нативная 57,5 Фрагм.ДНК 500т.п. 56,5

Дик лгнпГПур. 57,0 фрагм.ДНК 200т.п. 55,0

кополинер поли НА 54,0

Как видно из таблицы 2. , величина 2Tj- j, которая характеризует подвижность интеркалирующего между основаниями зонда , снижается с уменьшением молекулярного веса препарата, что может быть обусловлено как увеличением подвижности молекулы в целом, так и

увеличением сегментальной подвижности при фрагментировании ДНК. Видимо, с этим же обстоятельством связано снижение в

денатурированной теплом ДНК.

Комплексы эонда-интеркалятора с нативнои и денатурированной ДНК различались по некоторому увеличению быстрой компоненты в спектре ЭПР комплексов зонда с денатурированной ДНК, а также по значению максимумов полос поглощения в дифференциальных спектрах. При этом, как видно из таблицы, значение 2Т1Г в них отличается незначительно. Можно было заключить, что комплекс зонда с денатурированной ДНК, как и с нативной ДНК , образуется с двуспиральными участками (количество которых в денатурированной теплом ДНК составляет до 50?.) .Однако, по-видимому, в денатурированной ДНК существует и измененная структура (возможна неканоническая В-форма), что отражается в различной стехиометрии комплексов зонда с нативной и денатурированной ДНК. На наличие двух типов интеркалируюших комплексов акрихина с ДНК указывают также данные ЯМР (РгПБЬе, 1981).

Для определения чувствительности зонда к изменению структуры ДНК в предденатурационной области при повышении температуры изучен процесс плавления ДНК и сопоставлены данные , полученные с помощью зонда-интеркалятора - см 9-аминоакридина и данные, полученные с помощью ковалентно-связаннои с ДНК спиновой метки - см-этиленииина.

С помощью зонда удалось показать, что с повышением температуры выше 30° значение в спектре ЭПР закономерно снижается.

Следовательно, процесс теплового воздействия сопровождается увеличением подвижности сегментов ДНК, а также с разрывом некоторого количества водородных связей , что .по-видимому,

сильно не сказывается на снижении гиперхромизма.

Вместе с тем, параллельно увеличению температуры происходит увеличение интенсивности быстрой компоненты в спектре , связанное с выходом зонда из двойной спирали ДНК. Поскольку форма спектров ЭПР является сложной суперпозицией нескольких сигналов, в качестве измеряемых параметров Оыли выбраны величины I+]/I_j=-K, В/1 j=L, A/I j=M. Первая величина связана с эффективным временем корреляции зонда, дающего узкий сигнал, а два других параметра отражают перераспределение зонда из двойной спирали ДНК в рагтьор с повышением Tf-мперагуры среды.

Улалось показать, что все три параметра (K.L.Mi регистрируют структурный переходо (Tcri) в одной и той же области предплавления (64 Ьб С) для различных ДНК.

Как видно, определенный с помощью зонда-интеркалятора параметр Теп находится в согласии с данными, полученными методом спиновой метки нами( 64-66°С) и зарубежными авторами (Bobst,1979, Sh. Pelgen,1988, Теп 62-66° С), а также полученными с использованием спиновых зондов, не интеркалирующих в ДНК (62-66° С, Сухорукое и др.,1970 1. При этом, во всех случаях величина Теп (или в зарубежных публикациях Ткрит.), определяемая методом ЭПР, регистрируется значительно раньше, чем Тпл определяемая спектрофотометрически.

Бибст (Bobst,1979 1 предположил, что это явление связано с дестабилизацией водородных связей меткой в районе ее присоединения .Однако, по-видимому, это не единственная причина, поскольку зонд-интеркалятор не изменяет их. Вероятно, метка и зонд более чув/ствительны к появлению ранних дефектов структуры ДНК, приводящим к изменению ее динамических параметров, которые

- -¿ч -

не могут быть обнаружены спектрофотометрическим методом. Скорее всего , метод спиновых меток и зондов отражает появляющийся задолго до плавления новый тип подвижности пар оснований и сегментов ДНК, расположенных между участками с нарушенным спариванием оснований.

Комплексы ЛИК с аиинокислошми.

Анализ изолированной макромолекулы ДНК в комплексе со см 9-аминоакридином позволил нам подойти к изучению комплексов ДНК с другими природными соединениями, в том числе аминокислотами и фосфолипидами, взаимодействие с которыми имеет значение при функционировании ДНК в клетке.

В настоящее время предполагается, что образование комплексов ДНК-белок в хроматине осуществляется как за счет электростатического взаимодействия заряженных групп аминокислот, с фосфатными группами ,так и за счет аминокислот, входящих в а-спиральные структуры, с основаниями ДНК. Взаимодействие ДНК с изолированными аминокислотами позволяет моделировать оба этих типов комплексов, а также их изменения при различных воздействиях (в нашем случае мы использовали воздействие длинноволнового УФ-света 310 ни).

За образованием комплексов ДНК с аминокислотами (АК I следили используя конкуренцию за связывание с ДНК аминокислот и см 9-аминоакридина. При образовании комплексов зонда с ДНК в присутствии АК: тирозина, триптофана и гистидина происходит увеличение интенсивностей быстрых компонент в спектре ЭПР, по сравнению со спектрами зонда в контрольной ДНК. Анализ формы линии быстрой компоненты свидетельствует о том, что часть зонда находится в растворе. По-видимому, это обстоятельство обусловлено

конкуренцией AK с зондом за фосфатные ípy.iuu и образованием внешнего неспецифического комплекса АК с ДНК за счет

электростатического взаимодействия между отрицательно заряженными

+

фосфатными группами ДНК и положительно заряженными e-NHj-группами аминокислот, образуя слабый тип связывания. Образование таких комплексов экранирует посадку зонда на фосфатные группы, при этом часть зонда остается в растворе.

Облучение комплексов ДНК с АК длинноволновым УФ-светом \'31() нм приводит к противоположному эффекту: в спектре ЭПР см 9-аминоакридина , взаимодействующего с облученной модельной системой, наблюдается значительное увеличение значения гэ4)<?| быстрой компоненты до 0,5 нсек. Таким образом, облучение приводит к диссоциации внешнего электростатического комплекса ЛК -ДНК, что приводит к увеличению связывания зонда с фосфатными группами ДНК и соответствующего увеличения т .

С другой стороны, аминокислоты Тир и ТрФ образуют внутренние комплексы с основаниями ДНК. Это было показано, используя анализ на наличие аминокислот по реакции с нингидрином , после диссоциации внешнего электростатического компл^а. Было найдено, что отношение Тир и Трф к основаниям ДНК остаточного комплекса составляет 1:20 и 1:25 соответственно. По-видимому, внутренний комплекс не диссоциирует под действием УФ-света и о)ьетсгвенен за специфический эффект действия облучения: сенсибилизации в случае облучения комплекса ДНК-Тир и защитный эффект действия при образовании комплекса ДНК-Гис.

Образование такого комплекса может происходить со стороны большой бороздки ДНК (Heien et al, 19öl) и, как видно из спектров JHP , не препятствует интеркаляции красителя в ДНК. Можно

полагать, что спин-меченый 9-аминоакридин , как и его аналог акрихин (Davidson et al,197GI встраивается со стороны малоя бороздки. Это и обуславливает отсутствие конкуренции между аминокислотой и зондом за образование внутреннего комплекса. По ряду данных (Helen et al,l901 ) триптофан и тирозин лишь частично интеркалируют в двойную спираль ДНК, причем триптофан более специфически связывается с одноцепочечными участками, и вероятно, вызывает частичное расплетание макромолекулы. Возможно, что этим эффектом обусловлено увеличение связывания красителя при образовании комплекса ДНК-Три (по сравнению с ДНК), обнаруживаемое по спектрам ЭПР.

Изучая дифференциальные спектры поглощения см 9-аминоакридина с ДНК, а также комплексов ДНК-АК без облучения и при действии на них дУФ-света можно было получить дополнительные данные о структуре комплексов и совместном воздействии света и АК на ДНК.

Так, было обнаружено, что при дУФ-облучении ДНК дозами 1 (Г ЗЛО® эрг/мм2, наблюдается возрастание интенсивности полосы поглощения красителя при 270нм и, в соответствии с этим, уменьшение соотношения П-,д0(рис ЗА). При облучении ДНК в присутствии Тир и Трф по дифференциальным спектрам поглощения также наблюдается эффект сенсибилизации повреждения ДНК, что отражается в более сильном изменении ^gQ/IWo ' данные-

по-видимому , свидетельствуют о существенном изменении протоиироования оснований даже при очень небольших дозах дУФ-облучения, которое, вероятно, может происходить и при действии экологического солнечного света.

Поскольку можно было полагать, что эффективность действия дУФ-облучения на ДНК можно сопоставить с теми изменениями

которые происходят в макромолекуле ДНК под действием малых доз кУФ-света, были проанализированы структурные изменения ДНК, вызванные различными дозами УФ-света.

Сопоставление данных по изучение теплового плавления комплексов ДНК-АК методом ЭПР и спектрофотометрии позволило обнаружить, что снижение Теп комплексов зонда с ДНК происходит симбатно уменьшение гип&рхромизма ДНК в процессе к-УФ и дУФ-облучения (рис~ЗБ).

Однако, сопоставление эффекта действия кУФ l х=254 ш>) и дУФ-облучения I \»310nm) на ДНК, выявляемое с помощью дифференциальных спектров поглощения см 9-аминоакридина (рис, 3, А и Б), показало существенные различия в изменении дифференциальных спектров поглощения зонда в комплексе с облученной ДНК (рис.3).Эти изменения, по-видимому, отражают противоположные процессы, происходящие при кУФ и дУФ-облучении : протонирование красителя при действии кУФ-облучения и депротонирование красителя при действии дУФ-облучения. Эти эффекты могут быть обусловлены различными первичными эффектами действия кУФ и дУФ-света , образованием специфических радикалов и фотопродуктов ( Tyrell et al.,1967, Круглякова .Грибова ,19751.

Различный эффект действия кУФ и дУФ-света на более сложные структуры, такие как ДНК-белковые комплексы, может приводить к различным конечным макроэффектам действия облучения: диссоциации некоторых ДНК-белковых комплексов под действием дУФ-света (Азизова и др.1973) и сшивкам ДНК-белок, образующихся при поглощении света \=254 rim (Brains et al. ,197в .Коломийцева, 1973).

Рис.3. Изменение отношения 270/290 в комплексах зонда с ДНК, облученных кУФ-свегом -1, дУФ-светом -2, дУФ-светом в присутствии триптофана -3. На вставке изменение Теп (®,А! и гиперхромизма ДНК (Д) при действии на ДНК кУФ-света -1, дУФ-света -2, дУФ-света на ДНК, содержащей 10£ остаточного белка -3.

В специальных экспериментах было изучено действие кУФ света на образование ДНК-белковых сшивок. Оказалось, что с увеличением дозы кУФ-света на хроматин, наблюдается экспоненциальный рост числа ДНК-белковых сшивок. Было показано, что на этот процесс существенным образом могут влиять различные химические соединения. Модифицирующее действие таких соединений может оказаться полезным для поиска и отбора биологически-активных соединений, переспективных как в качестве радиопротекторов, так и аккумуляторов повреждений,что бывает необходимо при лечении различных патологий, или в биохимических исследованиях. На основании экспериментальных данных был предложен биохимический

метод для определения образования ДНК-белковых сшивок в хроматине под действием кУФ- света в присутствии модификаторов, который защищен авторским свидсгилоством.

Взаимодействие ЛИК с фосфолипидами.

Нескольку в настоящее время широко обсуждается вопрос о алилнии липидов на процессы репликации и транскрипции (Адесенко и др.19ИЪ, Maiisoll et nl.,1963), что может быть обусловлено их способностью образовывать комплексы с ДНК, нами било изучено образование комплексов ДНК со сфингомиелином, фосфатидилсерином, палым i иковоя кис Литой и < перм;:диним, и.-пильзуя конкурентное связывание- см ч амнноакридина с ДНК.. Спектры ЭПР и дифф< 'р(-нцис1льные eneitip-j пигло ш*-ьия указывали на замелени^ см О-пминоакрилином липидов из комплексов ДНК 1.0 сфингомиелином и другими иьидамп,П(и атом, как было показано, сфпнгомиолин свяэпваегся с фосфатными группами ДКК. С результате тепловой денатурации ДНК и определения Тпл комплек*. о в, было обнаружено, "по в при. /к.твии дисперсии сфишомиелина и других фосфолилидов, происходит1 дестабилизация структуры ДНК, что впаивается связыванием ЛИК, с жирнокислотной цепью и не зависит от заряда головки фосфолипидл. Из литературы известно, что сф11нгоми«'лин и его магаОолит - сфингозин влияют на активность транскрипционных пиитов iКрасильников и др.,1:1й6,) и гетг'ролигическое метилирование ДНК <Алесенко и др.,19»о). Можно предположить, что связывание сфингомиелина с ДНК и его влияние на структуру макромолекулы мож^г оказать воздействие и на регуляцию активности гении.

Таким иораэом. сочетание метода ЭПР и дифференциальной спектроскопии с использованием см 9 аминоакридина позволяет

проследить за образованием комплексов ДНК-АК и изменениями под действием УФ-света разных длинн волн , наблюдать взаимодействие ДНК с липидами . Предлагаемое сочетание методов ЭПР и дифференциальной спектроскопии может быть использовано для мониторинга взаимодействия ДНК с другими биологически активными соединениями.

Глава III.ДИИАМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ДНК .ДНК-ГИСТОНОВЫЕ

взаимодействия и строение нуклеосомы.

В клетках эукариот ядерная ДНК. связана с большим числом белков и образует сложную компактную структуру - хроматин. Основной элементарной повторяющейся единицей хроматина является нуклеосома. Внимание исследователей привлечено к изучению пространственной структуры нуклеосомы и к молекулярным взаимодействиям в ней (Спитковский ,19вЗ. Mlrzabekov et al.lööu. Richmond et al.,1984 ). Они в настоящее время установлены только в общих чертах. Остаются пока еша неизвестными трехмерная укладка полшшптидных цепей гистонов и строение связываюшлх контактов между гистонами и ДНК. Установлено, что ядро гигтонового кора -октамер белков, содержащих четыре пары молекул гистонов НЗ, Н4, Н2А, Н2В, вместе с участком нуклеосомной ДНК длинен около 146 пар оснований составляют кор-частицу нуклеосомы ( Klug et al,1980,

К началу настоящего исследования предполагалось, что осноьной вклад в образование ДНК-белковых связей в нуклеосоме вносят электростатические взаимодействия между фосфатными группами ДНК и заряженными аминокислотами (Мирзабеков и др.,1980), что приводит к закручиванию ДНК вокруг белкового кора. Однако, обнаруживаемое в гистонах значительное число а-спиральных участков и

небольшое количество рструкгур (Teiltandltr et al.,1984) заставляло предположить существование взаимодействия и между ц-спиральними участками гистонов и ДНК.

В I982-1983 годах была определена пространственная структура некоторых регуляторных ' белков, взаимодействующих с ДНК с помощью консервативной структуры, содержащей две сближенные a-спирали tOhlendorf et al.,1963>.Это белки Ого и С1 бактериофага К и белки EsherJehla coli: Lac-penpeccop и CAP I Sauer et а 1.,1982, Takeda et al.,1963).Сходство пространственной структуры этих белков - регуляторов отражается в гомологии аминокислотных последовательностей участков,образующих две сближенные и-спирали.

Поскольку можно было предположить, что гистоны могут взаимодействовать с ДНК с помощью сходной а-спиральной структуры, нами был проведен матемагическии анализ на ЭВМ аминокислотных последовательностей гистонов, с целью обнаружения возможной гомологии между гистонами и белками репрессорами-активаторами, по критерию .отражающему сходство в первичной структуре.

Изучение гомологии ¿шинокислопыых последовательностей .между гистонами и ЛИК- связывавшими белками прокриот.

Гомология аминокислотных последовательностей оценивалась по критерию А. 3. ( Allghnisemt Score) -счета очков, основываясь на алгоритме, данном в работе (Needleman et al..1970) с модификацией (Sankoff ее al.,1972). Для определения значения A.S. двух последовательностей использовали таблицы IDeyhoff et al,1972 1. Статистика была основана на определении критерия А.I. (AIlghnment Index) индекса сравнения аминокислотных последовательностей

(fieyhof et al.. 197,'. ) no формуле:

A. I.

M

где Р - лучшее значение' счета очков двух сравниваемых прстеинов, М - среднее значение 400 хаотизированных последовательностей с тестируемой, о - среднеквадратичное распределение между ними.

Самостоятельно оыла составлена оригинальная программа, использующая логический язык "Бейсик" ; вычисления проводились на персональном компьютере "Slnklair ZX-80", Англия .

В результате эксперимента нами впервые была обнаружена статистически значимая гомология между тремя белками : гистином НЗ (участок 102-123), гистоном Н4 (участок 68-85) и участком ctj (24-45) белка репрессора С г о бактериофага Л . Интересно отметить, что именно с помощью этого участка белок Сто взаимодействует с ДИК и узнает на ней специфические .последовательности.

Û S

AJI

Т -D А! V

0- KJA I H A JijjR Kj -L ÍC~A L H А К R[~

т Y[Ç1F - LU A К R К] T

- I F 1. Т I

V т I M Р к

V т А Л - -

Г'ис.4. Аминокислотные последовательности гистона 1(4 морского конька -а, гистона НЗ тимуса теленка -б и белка ьСго -в на участке обнаруженной локальной гомологии.

Гомология между гистоном Нз и белком \Сго статистически значима i Л. 1. • 3,3 1,см. таблиц»' 3. В то ж- время, величина A.I. для гомологичного уча'- ■ ка гистона из гумуса теленка и Ж морского конька имеет значение 3,26 и близка к статистически значимой.

Сопоставление данного участка гистона 113 с а-спиральными участками оелка Cru было пробел;но нами не случайно: имении участок гистона 113 находится вблизи центра симметрии второго

3

порядка нуклеосомной ДНК в димерноя форме!как и ДНК-связываюшие белки) (Kamerynl Otero et al.,1970), a Cys-96 находится на поверхности гистонового кора (Мс Gee et al.,I960), что делает его потенциально возможным для взаимодействия с ДНК.

По схеме (Nielsen et al., 1962, Belavsky et al.,1980) гистон НЗ имеет контакты с центральными парами ДНК нуклеосомы, причем димер НЗj - Н32 взаимодействует с ДНК с центром симметрии второго порядка, как и регуляторные белки.

Однако, математический анализ на ЭВМ показал, что гомология между этими белками : НЗ, Н4 и к Сго не для всех организмов статистически значима и:з-эа замен аминокислот ( таблица 3 )

Таблица 3. ■

Попарное сравнение а.к. последовательностей гистонов НЗ, Н4 из разных источников и белка лСго на участке гомологии.

Протеины Длина Р М a A.I. A.I.»

фрагмента

НЗ тимус-\Сго 22 31 7.22 7,95 3,37 -

НЗ тимус-Н4 морской IS 36 6.83 0,89 3,26 3 ,65

НЗ тимус-114 тимус 18 23 3,44 7,39 2,53 -

НЗ тимус-Н4 акула 18 22 3.42 7,39 2.51 -

A.I.* - значение А Л., определенное по матрице сравнения а.к. последовательностей.приведенной в работе (Magnus et al.,1983).

Нами отмечено, что гистон НЗ на этом участке содержит ключевые аминокислоты А2а-98 х х х Gly-102 , ответственные за существование структуры типа спираль-поворот-спираль, и гомологичен всем ДНК-связывающим белкам , содержащим с-груктуру «2 - о;что согласуется с выводами работы (Magnus et al.,1963).

однако, по нашим данным, основанным на определении критерия A.I., отражающему сходство в первичной структуре , гомология между гистоном НЗ и ДНК-связываошими белками на участке «2 более слабая, чем на участке а^, где параметр A.I. существенно выше.

В результате эксперимента было установлено также существование зеркальной гомологии между гистонами НЗ и Н4 на этом же гомологичном участке, которая .как было показано, сохраняется для различных организмов.

Полученные нами данные представляют интерес как в плане возможной эволюционной связи этих гомологичных сегментов белков НЗ, Н4 и белка \Сго, так и с их возможной ролью в связывании гистонового кора с ДНК.

Последнее удалось показать при использовании метода спиновых меток, поскольку гомологичный белку ХСго С-концевои участок гистона НЗ 192-123) тимуса теленка содержит две SH-группы : Cys-96 и Cys-110 . что давало возможность провести избирательное связывание с ними ртутьсодержащей метки для выяснения роли этого участка в связывании с ДНК.

Характеристика сульфгиарильных групп гистона НЗ в ДНП.

Ранее, для изучения хроматина было предложено использовать ряд спиновых меток , титруюших гидроксильные группы серина, треонина и тирозина ( Lowrence et al., 1980, Clian et al., 1981'), a также ыалеимидную спиновую метку , связывающуюся с цистеинами для изучения SH-групп гистона НЗ (Palau et al., 1982), которая .однако, может связываться и с ДИК. Для выяснения роли SH-групп в структурной организации нуклеосоыа нами впервые были использованы короткие, ртутьсодержашие спиновые метки, синтезированные Шапиро А.Б( Институт химическои физики РАН).

В эксперименте, в основное использовали ртутьсодержащий нитроксильныя радикал 2,2,6,6 - тетраметил-1-оксил- JnnnepHÄHH ---4-меркулбромид (IIII . Ряд экспериментов проводили также с

радикалом 2,2,6,6 -тетраметил-Ч-оксил-Д5 пиперидин-4-меркулхло-ридом, а также 2,2,6,6-тетраметил-£к пиперидинометил-4броммеркур-4-дегидропиперидин-1-оке идом.

Нами было изучено связывание радикала с сульфгидрильными группами гистона НЗ в составе суммарного гистона и в ДНП комплексе, а также с препаратом ДНК, свободным от белка. Специфичность связывания радикала III с SH-группами белка была доказана с помощью блокирования SH-групп суммарного гистона 10-ти кратным избытком парахлормеркуриобензоата (р-ХМБ).

Таблица 4..

Число титруемых спиновой меткой SH-групп в гисгоне и в ДНП.

Суммарный гистон ДНП

Число SH-групп Число SH-rpynn

Среда гистона НЗ Среда гистона НЗ

О.ООЬМ l.ßiO.l 0.0Ü5M 1 ,1 tO ,2

трис -HCL трис-IICL

4M мочевина 1,9*0,3 4M мочевина 1,9±0,2

6М мочевина 2,2±0,2

В результате эксперимента было показано, что радикал III специфически связывается с SH-грунпами гистона НЗ в соответствии с числом доступных титрованию SH-rpynn , . которое изменяется в зависимости от состава среды (Таблица 4).

Специфичность присоединения коротких, жесткосвязанных нитроксильных радикалов позволяет наблюдать за конформационными изменениями гистона и ДНП при действии различных физико-химических факторов. Это дало возможность анализировать спектры ЭПР радикала III в растворе и в комплексе с препаратами гистоное и ДНП при сгехиометрическом соотношении радикала к SH-группам гистона НЗ (рис.5)..

Отличительной особенностью ртутьорганического радикала является расщепление триплетного спектра ЭПР на дублетные линии в результате взаимодействия неспаренного электрона с атомыми ртути (константа расщепления А =1,0 Гс, а =16,1 Гс (Шапиро А.Б.,1901)

Рис. 5. 1 -Спектр ЭПР стабильного нитроксильного радикала III ь трис HCl буфере pH 7,4.

И-Спектры ЭПР радикала 111 в суммарном tистоне при ступенчатом титровании SH-групп в растворе низкой ионной силы.

Ill-Спектры ЭПГ радикала в ДНП в трис HCl буфере-а, о-в растворе 4M мочевины.

lV-Спектры ЭПР радикала 1 при взаимодействии с ДНП - а и суммарным гистоном -б в растворе 2М NaCü

При поэтапном- титровании гистона ИЗ в составе суммарного гистона или в составе ДПП были обнаружены некоторые отличия в подвижности спиновой метки . Так, значение I для первой доступной 311 группы гистона ИЗ и ДНИ составляет 0,046 нсек, а параметр анизотропии вращения метки составляет 0,35 , что значительно выше , чем в суммарном гистоне ( 0,09). Это может Оить связано с некоторыми сторическими ограничениями вращения метки в области БН-'-рупп в дни, по сравнению с суммарным гистоном. Следует отметить, что в растворе мочевины, которая нарушает гидрофобные взаимодействуя между гистонаыи, а также гиетонами и ДНК в ДНП- комплексе, эти различия нивелируются в связи е разрушением структуры нуклеосоыы, при этом подвижность радикала возрастает.

Проведенные эксперименты свидетельствовали о том, что подвижность БН-групп остатков цистеинов 96 и 110 как в выделенном гистоне, так и в. ДНП комплексе отличалась примерно на порядок, при этом подвижность метки, связанной с ЗН-группами Суд-110 достаточно высока. Эти данные позволяют предположить, что ЗН-группа находится в свободной нише, доступной метке при низких ионных силах , в некотором отдалении от макромолекулы ДНК.

С другой стороны, ЗН-группы Суг-9б доступны титрованию в ДНП только в условиях высокой ионной силы (2М №С1), когда происходит диссоциация ДНК и белка в нуклеосоме, при этом движение метки существенно замедленно.Следовательно, ЗН-группа Суп-96 находится в существенно ином белковом окружении, чем Суз-110. В то же время, замедление вращения метки, связанной с СуЕ-96, однако, не наблюдается в низкой ионной силе, когда белок не образует «-спиральных участков. По-видимому, на этом С-концевом участке

гистон 113 свернут в «-спираль.

Конформационная неравноценность ЭН-групп остатков цистеияов 96 и 110 гистона НЗ позволяет предположить, что этот участок не представляет собой единую а-спираль, а имеет сложную конформацию. Не исключено, что именно здесь могут существовать две сближенные «-спирали, которые могут взаимодействовать с ДНК. При этом остаток Су$-96 .вероятно, расположен в месте сближения а-спиралей и маскируется при взаимодействии ДНК и белка е кор-частице, становясь недоступным титруюшим агентам, что находится ъ согласии с данными по гомологии.

Характеристика сульфгидрильны.ч групп Ш!П нормы и опухоли.

Аналогичные исследования по выяснению роли С-концевоги участка гистона НЗ в связывании с ДНК были проведены для ДНП опухолевых

клеток.

Для сравнения были взяты то же ДНП тимуса теленка и ДНП асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ)на 6-7 день развития опухоли, когда клетки находятся в фазе экспоненциального роста.

Как было показано в наших экспериментах, при одновременном воздействии ЫдС1 (от 0,6 до 2М) и 1% саркозила (детергент), происходит увеличение доступности ЭН групп в ДНП тимуса теленка по сравнению с воздействием ЫаС1,что наблюдается как с помощью спиновой метки, так и препарата ДТНБ (дитионатриибензоата). При этом полное титрование БН-групп осуществляется в растворе 1М МаС1,а не в растворе 2М НаС1,как в случае действия одной соли , т.е. доступность ЭН-групп повышается.

С другой стороны, в ДНП клеток АРЭ полное тирование 5Н групп происходит уже в 1М МаС!.. а при добавлении 1% саркозила

доступность SH-rpynn титрующим реагентам снижается.

Эти данные , по-видимому, свидетельствуют о том, что состояние вторичной структуры ДНИ асцитного рака Эрлиха и ДНП тимуса теленка различается. В том числе различно и состояние нуклеосом в них. Возможно, что это связано с тем, что АРЭ содержит транскрипционно активным хроматин. В настоящее время имеются данные о том, что нуклеосомы активного хроматина более развернуты (Prior et al., 1933-, в одном из микроорганизмов IFhysarum Ро1iclfalum) электронномикроскопическим методом наблюдали развернутые половинки нуклеосом. В таких системах титрование SH-rpynn тиоловым реагентом IAF осуществлялось при более низких ионных силах. Различие в титровании SH-rpynn наблюдается также в наших экспериментах.

Особенностью опухолевых ДНП оказалось и меньшее значение параметра анизотропии вращения метки -с в спектре ЭПР опухолевых ДНП, что может быть связано с большей упорядоченностью движения метки в районе сульфгидрильных групп в норме. С другой стороны , в присутствии саркозила, уровень титрования SH-групп ДНП АРЭ понижается, в отличии от ДНП тимуса , в котором он увеличивается Возможно, что эти эффекты связаны с более развернутым состоянием нуклеосим опухоли, которое приводит к существованию торзионных напряжении .характерному для транскрипционно активного хроматина, и Снятию этих напряжении -переходу в релаксированное , менее упорядоченное состояние при снятии саркозилом специфических белков опухолевого ДНП.

Таким образом методом спиновых меток обнаружено, что в нукл<;осомах опухолевых клеток происходят изменения , по-видимому, имеющие ту же направленность, что и в транскрибционно активном

хроматине. В то же время известно, что перестройки в хроматине опухолевых клеток более глубокие, они касаются и качественных изменений , в том числе первичных последовательностей белков и ДНК, а также появления новых, специфических для опухоли белков.

Однако понимание пространственной структуры и локального конформационного состояния нуклеосом опухолевых клеток может быть достигнуто . в том числе, с использованием метода спиновых меток и зондов.

Структура нуклеосом и ДШ--белковые взаимодействия Как было показано нами выше, О-концевои участок гистона НЗ, содержащий Сук-96 и СуБ-ПО в ДНП тимуса теленка , который по ряду данных может взаимодействовать с ДНК кора , имеет гомологию аминокислотных последовательностей с ДНК-связывающими белками прокариот, белком х.Сго и белком Н4 и , по нашему предположению может принимать участие в связывании с ДНК. Действительно, данные рентгеноструктурного анализа указывают на то, что взаимодействие протяженных участков гистона НЗ происходит с центральными парами коровой ДНК , с помощью структур, по очертаниям похожим на аспирали, однако взаимодействие имеет место не сс стороны большой (как это установлено для регуляторннх белков ({ис1гт1п<3 ег а1., 1964 ><, а со стороны малой гороздки ДНК

Вместе с тем было показано, что СуБ-ПО расположен в свободном желобе между спиралями НЗ^ и Н3£ , вблизи центра симметрии ьуклеосомы, что обьясняет его большую доступность и значительную подвижность метки в наших экспериментах. Однако, остается открытым вопрос :какие аминокислоты образуют участки, контактирующие с ДНК и как свернута здесь аминокислотная цепь?

На основании наших собственных и литературных данных мы

предложили место возможного расииЛожения Сук-96 на С~кольцевом участке гистона НЗ в кор -частице нуклеосомы (рис 6 ).(Очертания [■истонов приведены по данным (К1с1июпс1 е! а!., 1984 1). По нашему предположению остатки СуБ-Эб находятся вблизи контактов с ДНК кора, распило жены между а-спиралями и могут маскироваться от цейсгвия 5Н-реагентов при контакте белка и ДНК в кор-частице.

Рис.0. Схема возможного расположения аминокислот на '-терминальном участке гистона ИЗ! и ИЗ.-,, содержащего в ДНГ1

гимуоа теленка СуБ-9Ь и Суа - ПО .относительно центра нуклеосомы Ю), большой (М) и малой (ш> бороздки ДНК. Очертания гистонов триьедены по раооте (¡исйтопй е1 а1.,19б4).

Интересно отметить, что хотя гистоны очень консервативны, однако 5 положении 96 наблюдаются замени аминокислот. При этом в различных организмах обнаруживается Суз-96(тимус), Зег-96(крыса, акула, цыпленок) или А"а-96 (горох), что может свидетельствовать з ва*лос1И зтого участка для специфического связывания.

Мы предполагаем (см. рис.6', что конфигурация ¡л-спиралей •цст.;нсг 113 (от 96 к 110. т.е. с т N—>-С концу) такова, что они ¡аир!влень к центру симметрии второго порядка нуклеосомы вдоль

- з' ничей ДНК навстречу друг другу, как это имеет место у №Гу.1л'10р:11.Х белков.

Учитывая схему взаимодействия гистонов 113 и гистонов (14 вдоль нитей ДНК нуклеосомы (Nielsen et al.,1982 ,ßellavsfci et al., i960) , нами предложена оригинальная схема, по которое направление а-спиральных участков гистона НЗ протисоположт направлению таких же участков гистонов Н4 относительно цент[ симметрии ДНК кора (рис.?). Т.е. мы предполагаем, чтп имеете общие принципы построения ДКК-белковых комплексов меж1 гистоновыми белками эукариот и регуляторным;, белками прокариот заключающийся в том, что комплексы ДНК-гистон образуются помошью «-спиралей, взаимодействующих с ДНК в направлении от Н С-концу по Ь/-3/ цепи ДНК.

5'_ f из о_, Ht з'

V , нз

Рис.7, Схема возможных направлении аминокислота последовательностей (от N—С), принадлежащих двум «-спиралям д; гистонов НЗ и Н4 .относительно центра симметрии нуклеосимной ДН1-

Нельзя с уверенностью сказать, что именно гомологичный бель \Сго и гистону НЗ участок гистона 114 (54-85) принимает участие I взаимодействии с ДНК, однако, на этом участке обнаружены Д1 а-спирали (ЙоЫизоп е1 а1 . ,1985 > между №-70 и -НО, а ь участке 79-92 гистоны имеют контакты с ДНК. НашЬег! сЧ а1.,10ЬО

Кроме того , обнаружена прямая гомология последовательностей межд/ гистонами НЗ и Н4 и "зеркальная гомология" м^-.№у гистонами на этом участке. Гомология сохраняется п;

замененах аминокислот, которая имеет место в раэличт организмах .Эти данные не противоречат зысказаннои ранее

гипотезе о том, что эволюция гистонов шла от одного первично!

гистонц. , причем определенную роль в их эволюции могли играть последовательности, переносимые ярусами. Возможно, что наблюдаемая гомология трех белков свидетельствует об эволюционной связи между гомологичными сегментами белков, которые могли сохраниться в связи с необходимостью поддержания определенной вторичной структуры белков и, возможно, для связывания с ДНК.

заключение.

Таким образом, полученные с помощью применения методов гомологии а.к. последовательностей , методов дифференциальной спектроскопии и метода спиновых меток и зондов экспериментальна результаты по изучению структурно-динамических особенностей ДНК и ДНП, позволили нам предложить новые подходы и критерии для изучения этих биомакромолекул , а также позволили найти новые специфические физико-химические свойства ДНК и хроматина, которые не могут быть обнаружены другими методами.

Автор выражает благодарность К.Е. Кругляковой за научные консультации и помощь в работе.

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны новые биофизические подходы (варианты метода спиновых меток и зондов) и установлены количественные критерии для изучения структурных изменении нуклеиновых кислот, взаимодействия ДНК с малыми биологически-активными соединениями, а также для исследования пространственной организации и

чРйа

динамических свойств дезоксинуклеопротеидов.

Впервые методом спиновой метки зафиксированы температуры, при которых происходят как фазовые переходы системы, так и изменения

структурн AUK f при -14°, 1°, 20--f)°, 62 ЬС° С -ТепJ .Температура

структурного перехода (Tcnl, реги< трируемая в предденатурационно: области может быть использована для определения структурны: нарушения, обнаруживаемых при УФ- и у-облучении. а также npi опухолевом росте.

2. Для изучения особенностей интеркаляции спин-мечены производных 9-аминоакридина в ДНК предложено использоват: сочетание методов дифференциальнои спектроскопии и ЭПР . Это позволило обнаружить:

-два вида комплексов сильного типа,в которых взаимодеистви) спин-меченого аминоакридина с ДНК осуществляется в нейтрально! !протонированноиI и в заряженной форме; стехиометрия зти комплексов различна.

- выявить существенные различия е конформаиионкых изменениях ДНК облученных дУФ- ( депротонированне красителя) и малыми дозам; кУФ-света I протонирование красителя), установить, что Теп .выявляете с помощи) зонда-интеркаллтера

характеризуют те же структурные изменения ДНК, что и мето спиновой метки.

2.Метод спиновых зондов (спин-меченые интеркаляторы предлагается для мониторинга взаимодействия ДНК с малым: оиологически-активными соединениями на основами:

систематического изучения взаимодействия ароматически аминокислот с ДНК и анализа действия на комплексы дУФ-света, а также изучения комплексов фосфолигидов с ДНК.

4.Предложен биохимический метод для выявления протекторных сенсибилизирующих свойств химических соединении , основанный н определении количестве! ДНК-белковых сшивок, образующихся

роматине гюд действием УФ-облучения в присутствии химических оединений. Метод защищен авторским свидетельством. . Впервые использованы короткие .жесткие ртутьсодержащие пиновые метки, модифицирующие сульфгидрильные группы гистона НЗ, ля анализа особенностей и пространственной структуры ДНП и его лементарнои единицы- нуклеосомы. При этом установлено,что: о-концесой участок гистона НЗ, содержащий остатки Цис-96

тимус )и Иис-110 не представляет собой единую а-спираль, а имеет ложную конформацию и может играть ведущую роль при заимодеиствии гистона НЗ с центральными парами коровой ДНК.

динамические изменения в структуре ДНП нормальных (тимус еле.-жа) и опухолевых клеток (асиитньш рак Эрлмха) различны и аьиеят от состава среды.

(,. Математических аиализ на ЭВМ аминокислотных сследсьачельностеи белков - регуляторов-репрессоров прокариот и игтонов зукариот позволил установить возможность общего волюционного происхождения этих белков, предположить наличие о них принципов образования ДНК-белковых комплексов, а также пределенной вторичной структуры белков, участвующих в связывании ДН:!.. Удалось показать, что:

.-эминокислотние последовательности гистонов .43 (102-123), 114 и участок (24-45) белка репрессора X Сго прокариот, зто^ый взаимодействует с помощью двухспиральной структуры с НК, имеют статистически-значимую гомологию.

н.х основании обобщения собственных и литератерннх данных релложена схема взаимодействия а-спиралея гистонов НЗ и Н4 с

г

ДНК в нуклеосоме.

Список работ автора:

1. Миль Е.М. , , Григорян Г.Л,Круглякова К.Е. Взаимодействие

см- этиленимина с ДНК.// Тез. симп. Свободнорадикальные состояни! при лучевом поражении и злокачественном росте.М.-1971-С.93.

2.Миль Е.М., Григорян Г.Л..Круглякова К.Е. Структурные пере,чод1 см- ДНК.// Te3.IV Межд.биофизического конгресса.М.-1972-т.2-23î.

3.Козлова Л.Е.,Миль Е.М.,Саприн А.Н. //Тез.IV Международное биофизического конгресса.М.- 1972.

4.Миль Е.М..Завриев С.К..Григорян Г.Л..Круглякова К.Е.Изучение структурных переходов см- ДНК//Докл. АН СССР-1973-209- т. 1-е. 217-220.

5.Миль Е.М.,Жильцова В.М..Круглякова К.Е. Использование методе парамагнитной метки для изучение конформационных изменении ДШ при УФ-облучении.//Биофизика - 1974-Т.19, в,4-С.601-604.

6.Миль Е.М.,Бобович С.А.,Азизов Ю.М..Криницкая Л.А.,Жильцова В.М, Жижина Г.П..Круглякова К.Е.Структурные переходы в ДНК нормальных и опухолевых клеток.// Биофизика - 1975-T.2C, в.5 -С. 757-761..

7.Миль Е.М.,Жильцова В.М..Круглякова К.Е. Изученио конфорыационных переходов в ДНК при УФ-облучении.// СО. докл.К-г< Всесоюзного совещания ¡ю биологическому действию УФ иблучения Горький.-1974- С.105.

8 . Krugl Jako va К.Е..М11 Е.М., ZMltsova V.M. Structural Ce river.? loi

In DNA upon UV-llght ar.d ganmma-li radiation.//

Thes.V Intern.Blopliys. Congress. Kopenhagen. -1975-p.t>5.

9.Миль Е.М., Жильцова В.М.,Жижина Г.П., Бобович С.И.,Круглякова К.Е. О роли структурных изменении ДНК. в нарушении ре.-уляторнох механизмов облученной клетки./.' Тезисы Всес.Симпозиума Влиям радиации на регуляторные процессы в клетке.Пущино .-197t.

10.Mil Е.М. .Kruglyakova К.Е. .Zhlitsova V.M. Induces JV ma gamma-lrradlatIon conformation transition in DNA" // Тпсч VII Jena sympozlum. Jena.-1976.

11.Mil Е.М. .Zhlitsova V .M. .KrlnitsKaja L . A.. KrufeUyal;ova К .E.:;l>1i labelled 9-amlnoacrid ine for the structural .'hf/iges ti DNA.UV-irradiation effect .//Thés . IV-UV-co1ioqvlum UV siraMer. ii Biología and Medizin. DDR. Jena.-2977-p.37.

12.Грибова 3.П..Жильцова В.M.,Круглякова К.F.,Миль Е.М. Повреждение ДНК под действием УФ-света .//Тез .М."-гдунароан(. Симпозиума по Радиационной химии.Тбилиси.-1978.

13.Миль Е.М..Жильцова В.М..Круглякова К.Е. Изучение УФ-поврежд-н* в ДНК методом спиновогс зонда.//Сс5 .Фотобиология животнои клетки. Ленинград .Наука.-1979-С.131-135.

14.Mmii, Е.М..Лильцова b.M.,Круглякова K.t..Криницкая Л. А. Изучение шмплексов спин-меченого 9-АО с ДНК и полинуклеотидами. // 1звестия АН СССР, сер.биол.-1980-В4-С.512-517.

15.MU Е.М., 2hlltsova V.M., Krlnltskaja L.A..Krugllakova K.E. :omplex formation si- S-amlnoacrldlne wltli DNA and poly -lucleotlde.// Blo 1 .Bull .Acad.Sel. ( USSR > - 1980- v.7- p.252-254.

16.Миль E.M..Жильцова В.M.,Круглякова К.E.Использование :м 9-АО для анализа структурных изменений в ДНК под действием W-света.// Известия АН СССР .сер.биол.-1981-в.2- С.295-299.

17.Миль Е.М., Жильцова В.М..Шашкова Е.А..Круглякова К.Е. Использование спин-меченого красителя для сравнительного изучения структурных измиенения ДНК при облучении УФ-светом разной длины золны./'/Тез.симп.ЭПР В биологии и медицине..Звенигород.-1981 .

18.Krugllakova К.Е.,Mil E.M.,Zhlltsova V.M., KrinltsKaJa L.A. Interaction of 9-amlncacrldlne wlth DNA altered by différent tfaves UV-llght.// Studla blopïiys. -1981-V85-N 1- p.51-58.

19.Миль E.M., Жильцова В.M..Криницкая Л.А., Круглякова К.Е. Изучение взаимодействия спин-меченого 9-АО с ДНК.//Тез.Всес. :имп. Магнитный резонанс в биологии и медицине.- 1981.-С.245

¿О.Алесенко А.В.,Миль Е.М..Красильников В.М. Свойства комплексов ЯНК с фосфолипидами.// Тез. 1 Биохимического сьезда.М.-1982 .

Л.Миль Е.М.,Жильцова В.М..Круглякова К.Е. Метод ЭПР и аифференциальной спектроскопии для изучения структурных изменении ИНК. Тезисы 1 Биохимического сьезда.М.Л 982.

VI. Миль E.М.,Жильцова В.М. Действие длинноволнового УФ-света на •сомплексы ДНК-аминокислота. //Тез. Всесоюзная конференция по нитроксильным радикалам. Черноголовка.-1982.

23.Миль E.М.,Жильцова В.М.Диссоциация комплексов аминокислот с ИНК под действием дУФ-света.//Изв. АН СССР.сер.биол.Л983-В6-925.

¿4.Миль Е.М. Гомология аминокислотных последовательностей между гистонами НЗ и Н4 и регулягорными б е лками. // ДАН АН :ССР- 1984- т.279 -в2- С.481-484.

¿5.Миль Е.М..Круглякова К.Е.,Григорян Г.Л.Взаимодействие спин-меченых биологически-активных соединений с ДНК.// Метод спиновых неток и зондов..Редактор Н.М.Эмануэль. M.-1986-С.21-42..

¿6.Миль Е.М..Власова.С.А., Курочкина Л.П., Коломийцева Г.Я., чруглякова К.Е.Характеристика сульфгидрильных групп гистона НЗ из гимуоа теленка с помощью ртутьсодержащих нитроксильных радикалов.// Биохимия -1986 -T.51-N 3-рр.364-366.

27.Миль Е.М. Конформация С-концевого участка гистона НЗ в ДНП.// ГезЛХ Всесоюзного симпозиума .Структура и функции клеточного ядра. Черноголовка.-1967- С.172.

2(1.МИ E.M. Study of the DNA-ll^and complexes ;md m.« dynamic structure by spin label method.// Thes.6th CMEA symposium on ESR In Molecular Biology and Medicln. Czechoslovakia.-19й6-р.34-35.

29.Vlasova S.A., Mi 1 E.M..Dmltrlev P.I.

Modification of the Frc£ Photoreceptore membrane SH-groups by tin Hg-contalnlng spin-label.// Thes. 6th CMEA sympozlum. Czechoslovakia, Smoler.lce -1968-p.48.

30.Миль E.M..Жильцова В.M..Бинюков 3. И . .УФ-индуиированно1 образование сшивок ЛНК-белок в хроматине в присутствии химически; агентов.// Известия АН СССР ,сер.0иол.-1989-в5-С.766-770.

31.Миль Е.М..Бинюков Б.И. Локальная гомология аминокислогны; последовательностей гиетонов НЗ и Н4 и белка fenpeccop; Сго. Возможная конформация гомологичных участков гиетонов i ДНП. ^/Биохимия -1989-т53-в. 2-С. 196'J-l985 .

32.Миль Е.М..Столярова Л.Г..Кузнецов Ю.В.,Смирнов Л.Д. Действие препаратов группы БИО из класса бензимидазолов на ооиазованж сшивок ДНК-белок при УФ-облучении хроматина. //Ь:есоюзна; конференция Антиоксидант. М.-1989-С.105 .

33. Красильников В.А.,Миль Е.М.. Алесенко А.В..Бинюков В.И Сравнение комплексов ДНК со сфингомиелином, спермином и ионами Ms методом спинового зонда.// Биофизика-1909- т.31, в.64*53-957.

34.Власова С. А. .Миль Е .М., Дмитриев П.И. Модификация i'rl-rpyun родопсина в фоторецепторной мембране лягушки ртутной спи:ювой меткой.//Тез.VII Всесоюзной конференции . Магнитный резонанс в биологии и медицине . Звенигород.-19S9.

35.Алесенко А.В..Красильников В.А., Миль Е.М., Пушкарева М.Ю. Влияние сфингомиелина ипродуктов его ферментативного гидролиза на структуру и функциональную активность ДНК. /Тез. VII Всесоюзной конференции. Звенигород.-1989.

36.Mil Е.М., Alesenco A.A., Binlukov V.I.,Pushkareva M.Yu., Krasllnlcov V.A. Lipid-DNA interaction study by

spin-labelled 9-aminoacrldliie.//Tries . FEBS satellite meeting. Molecular dlnamlcs in membrane.Hungary.-1990.-P.25.

37.Миль E.M., Бинюков Е.И., Жильцова B.M., Столярова Л.Г.. Кузнецов Ю,В. Действие препаратов, производных бензимидаоола на образование сшивок ДНК-белок при УФ-облучении хроматина.// Изв. АН СССР, сер. биол. -1991.-3 .-С.458-462 .

38.Миль Е.М.. Воронина С.А. Бинюков В.И. Характеристика УН-групп ДНИ нормальных и опухолевых клеток с помощью дзтутьсодержа щей спиновой метки и ДУНБ.// Биофизика .-1992-т.3/.-в.о.

39.Миль Е .М., Жильцова В.М. , Столярова Л.Г. .Кузнецов К).В., Жижи на Г.П. Генотоксическия эффект действия препаратов класса

бензимидазолов.// Тез. Всес. конф. Антиоксидант..-1992.- С.145.

40.Mil E.M.Caracterlzatlon of the SH-groups Hlstone НЗ In normal and cancer chromatlne.//Thes.of VI CMEAE Sympozlun, Italy, 1992.