Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЭПР спектроскопия с переносом СВЧ насыщения биомембран и модельных систем

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "ЭПР спектроскопия с переносом СВЧ насыщения биомембран и модельных систем"



гл

уг.

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА Н. Н. СЕМЕНОВА

На правах рукописи

ЛИВШИЦ Всеволод Аронович

УДК 612.8.14: 547.962

ЭПР СПЕКТРОСКОПИЯ С ПЕРЕНОСОМ СВ.Ч НАСЫЩЕНИЯ БИОМЕМБРАН И МОДЕЛЬНЫХ

СИСТЕМ

03.00.02. — Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва 1989

Работа выполнена в Ордена Ленина Институте химической физики АН СССР имени академика Н. Н. Семенова.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

профессор, доктор химических наук Г. И. Лихтенштейн; профессор, доктор физико-математический наук Э. К. Рууге;

профессор, доктор физико-математический паук -В. Е. Холмогоров.

Биологический факультет Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Защита состоится « . . . ».....: . 1990 г. в.

. . . час. на заседании Специализированного Совета Д 002.26.07 при Институте химической физики АН СССР по а.'ресу: 117977, Москва, ул. Косыгина, д. 4. ' С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инсти-/та химической физики АН СССР.

Автореферат разослан « . . . ».....19 Г;

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

А. Ф. ВАНИН

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В основе многих процессов,определявших функционирование биомембран и других биополимершх комплексов лежат молекулярные движения - молекул как целого или внутримолекулярные конформационше перестройки. Характер, амплитудно-частотный спектр этих движений отражает структурпуп организации и кэамолекулярные взаимодействия в системе. Поэтому изучение уолокулярной динамики биомембран и модельная систем является одним ия фундаментов для поникания механизма их функционирования.

Биокзибрака представляют собой многокомпонентные и иикро-гетерогенные система: следовательно, ваяной задачей является изучение динашкя отдельных компонентов системы иди отдельных участков макромолекул. Метод спинозих каток - один из наиболее адекватных для ровения этой задачи, поскольку метки или зонда могут бить в принципа введены селективно а отдзлышб участка кикроготерогеиной систеш ..ли юкромолекули.

Чувствительность к юлзкудярным вращениям обичной (линейной по СВЧ полв) ЗПР споктроскойии спиновых моток ограничена времзнаш корреляции Это на позволяет исследовать многие

функционально вахта о движения а биомомбракая (заторисгемнз вря^ения белкоз, их еэгигнтоз и белковых комплексов, коопэра-тив!шо переориентации фосфрлипндов), а также низкочастотные движения в липидшх слоях, стоках, полимерах. В связи о этим актуальной проблемой является разработка методов изучения медленных молекулярных врадзний и применение этих котодоа для ->епго-ния конкретных задач структура и динамики биоиэмбрял и модслыагх систем.

В последние годы в ЭПР спектроскопии развивается новый подход - ЭПР спектроскопия с переносом СЗЧ насыщения (Э11Р СПН), позволяемой повысить на 3-4 порядка, до времен корреляции 10"э-чувствительность к ывдленним молекулярным вращениям. 1С началу выполнения данной работ на были выяснони в дсс.таточно.1 степени физические принцапы этого мотода и оптикаяькге мзтодо регистрации медленных движения в биологических системах, но были развиты подходы для анализа форма спектров ЭПР с переносом надо» цення при изучении различных типов ыолокулярных движений и не

выявлены возможности метода в биофизических исследованиях неубранных систем.-

О^чрвныо задачи работы. Разработка новых экспериментальных и теоретических подходов в ЭЯ? спектроскопии спиновых меток для изучения "сБорхыодлонных" молекулярных вращений (амплитудно-частотных параметров, анизотропии вращения), межмолекулярных вэаимодеРствий, релаксационных характеристик спин-меченых молекул.

Применение развитых подходов для изучения закономерностей вращательной молекулярной подвижности в I.химерах, лилидных слоях, растворах глобулярных белков.

Изучение с помощью этих подходов молекулярной динамики и ассоциации интегральных мембранных белков - Са зависимой АТФаза сарко. ¿азматического ретикулума и родопсина в фоторецопторных мембранах - и корреляции эт л свойств в функциональными характеристикам белков. •

Научная новизна. Теоретически и экспериментально развит подход для регистрации "сверхиедлетых" вращений спиновых меток и анодов, и интервале времен корреляции Ю - 10"^с, основанный на измерении парь-ютров-СВЧ насыщения в условиях быстрого про-.хождения через резонанс. Разработаны метода расчета спектров ЭПР ПН в модели скачкообразного врьщен...! с учетом анизотропии вращения, модуляции зеемзновского "и СВЧ полей. Для Зсм и 2мм диапазонов СВЧ предложены подходы для определения анизотропии вращения, разделения фмллитудных к частотных параметров вращения, вращения и магиитной релаксации.

Путем параллельного измерения времен корреляции вращения методами диэлектрической релаксвдии и ЭРР установлен скачкообразный характер вращения спкноього зонда в жидкости.

Впервые нэучона молекулярная динамика и лекторов ских цультиглоях липидсв. Установлена ориентация эоадов в цультислое, фазовая и диненичеснаг. гетьроговность этих систем, механизм и параметры молекулярных переоряэнтаций стнокых зондов.

В полимерах вблизи и ниже тачки стеклования обнаружено распределение по времелам корреляции вращзкия слкноеых меток. Выявлены суперликейнак корреляция между екоростьи реакции в по-лкмере и частотой вращения в области медленных вращений и близкая к линейной корреляция в области быстрых вращений.

Предложат модель движения метки относительно белка и определена зависимость релаксационных паракерров меток от вязкое-

л их окружения.

Показано, что изиеренная методом ЭПР СШ вращательная под-ижнозть спин-меченой Са-АТФазк в ыембранах саркоплазматическо-о ретикулума и протеолипосомдх. соответствует внутримолекуляр-ой подвижности з гидрофильной области белка; выявлены её заии-имэсть- ст липидного окружения и конформационного состояния елка и корреляция с А1\Базной активностью. Развит подход для пределения степени ассоциации мембранных белков и определена тепень ассоциации Са-АТФазы в нативной мембрана. Обнаружены аизлег-лдо 5Н группы е Са-АТФазе и показана возможность ис-ользованля феррокитрозильного комплекса с этим группами в ка-естве конформационно чувствительной спиновой метки.

Обнаружена обратимая, зависящая от рН и ионной сила ассо-нация-родопсина в фоторецептс>рных мембранах в темнота и пока-ано.отсутствие фотоиндуцировашой ассоциации при образовании етародопскна II. С помогла селективно связанных по остаткам ."у5 -140 и. ^¿-316 шток подучеш данные с топографии ловерх-ости родопсина и- характера'её структурных перестроек при обра-ования иетародопсина-II. обнаружены и изучена структурные из-еиенял з фотсргцспторгпя ¡мз^брелах при повреждавцем действии единого света: необратимая.агрегация родопсина к вызванные ей эигнеиия в белко я дипидисн б:гглоо.

Научная и практическая ценность. Развитые в работе подходы урываю* новые методические возможности для применения ШР СПИ пирокоцу кругу биологических'я з¡гко-хнмясК'лх систем:био-з.чбргн и других биополккортш■'комплексов; голой, стекол, поля-зров и др. Эти подходы наили применение а совместных работах с этрудникаш Института химической физики, Института фнзигсо- :и~ ической медицины, Института эппдеииологии,. Биологического фа-рльтота МГУ, Института новых химических проблем.

Результаты по динамической и статической гетерогенности знгизровских цультслоеп следует учитывать при разработка уст-пйств молекулярной электроники на основе этих слоев.

Данные о молекулярных иэхаииздох повревдахгцэго действия зета на фотороцепторные мембраны могут быть полезны для разра-зтки соответствующих средств защиты.

Полученные в работе результаты отражены в монографии: "Спя-звно зонды в физико-химии полимеров", используются в методн-эских пособиях и лекциях по биофизике фоторецепции на Биологи-гском факультете МГУ.

Апробация работа. Материалы диссертации докладаеались на Всесоюзных симпозиумах и школах "Магнитный резонанс в биологии и медицине (197?, 1979, 1981, 1983, 1985, 1986), XX Международном конгръссе АЫГ1ЕРЕ (Таллинн,19^8), Всесоюзном симпозиуме "Липида Дологических мембран (Ташкент,I960), Всесоюзном биофизическом съезде (Москва,1982), Всесоюзной конференции по нитроксильным радикалам (Черноголовка,1982), Всесоюзном симпозиуме "Равновесная молекулярная динамика биополимеров (Пущино,1983), международных симпозиумах "Применение магнитного резонанса в биологии и медицине (Берлин, 1982,198-1), Всесоюзной конференции по магнит-но»ф резонансу (физические аспекты)(Казань,1984), 16-й конференции ЗЕЁО (Москва,1984), III Всесоюзной конференции "Физика и химия злеыентарн : процессов"(Ыосквь,1987), Советско-Швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функция" (Рига, 19887.

Публикации. Материалы диссертации изложены в 46 публикациях в отечественных и зарубежных иарналах.

Личное участие автора. Материал, включенный в диссертацию, получен при непосредственном участии автора как в проведении э' зперимонтов и теоретических расчетов, та., и в обсуждении ре-, зуль'^атов. При выполнении работы автором подводились итоги отдельных этапов, проводилось обобщение результатов и определялись -направления дальнейших исследований.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, общего заключения, выводов и приложений, изложенных на 310 сгр. машинописного текста, содержит'рисунков и 2S 'таблиц. Библиография насчитывает I'lS наименований. В диссертации отсутствует единый литературный обзор и отдельная глава по методике эксперимента, так как в каждой главе анализируются • литературные данные, относящиеся к теме исследования, и имеется методическая часть, оодврасащая характеристику объектов и методов исследования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В соответствии с изложенными задачами значительная часть рабсм посвшцена теоретическим и методическим подходам в ЭПР СПН, которые звтем применяются для изучения систем возрастающего уровня сложности: растворов нитроксильных радикалов в вязких средах, липидных слоев, полимеров, глобулярных белков в растворе и,

наконец, нативных биомембран еаркоплазматического ретикулина и фоторецепторов. Наряду о ЭПР СПН использовалась "линейная" спектроскопия ЭПР и вспомогательные физико-химические методы. Кроме того, с целью выявления функциональной значимости молекулярной и конформационной подвижности изучали некоторые функциональные характеристики мембранных белков.

Глава I. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ЭКаТЕРШЕНТАЛЬНШ ПОДХОДЫ В ЭПР СПЕКТРОСКОПИИ С ПЕРЕНОСОМ СВЧ НАСЫЩЕНИЯ

Чувствительность обычных спектров ЭПР спиновых меток к молекулярной Еращекип обусловлена усреднением при вращении анизотропии резонанского поля и соответствует временам корреляции Т^'Ю'^о. Хайд (Ни<.{<. ,1972,1973) показал, что при регистрации квадратурных сигналов первой гармоники дисперсии ( 0[) и второй гармоники поглощения ( К/ ) в условиях СВЧ насыщения Чувствительность к вращениям возрастает до времен £ 10"*3о.

В этой главе дан краткий обзор современного состояния ЭПР СПН, на основе собственных результатов ^асскотрэна природа чувствительности спектров ЭПР "Ч ( и ^ ) к "свврхмедленным" вращениям, влияние релаксационных параметров и условий прохождения через резонанс на форму этих спектров, изложены новые подходы в ЭПР СПН для определения.частот вращений в многокомпонентных спектрах ЭПР, анализа-анизотропных и ограниченных по углу молекулярных вращений.

Для реализации теоретической части программы использовала простая теоретическая модель, в которой спиновая система описывается уравнениями Блоха, а резонансное поле случайно модулируется в результате некоррелированных переориентаций. Модель некоррелированных скачков, применявшаяся ранее для описания ударного уширения,, спектральной диффузии, молекулярного вращения (Бурштейн,19бб; Корет,1971) обобщена на случаи анизотропного вращения, СВЧ насыщения и модуляции. Так, для аксиально симметричного вращения при произвольной ориентации оси симметрия относительно главных осей тензоров ^ - фактора и СТВ выражение для форма спектра ЭПР в отсутствие СВЧ насыщения икает вид:

иг 1м от х (2); Ь)

- о ~

где fu fx - частоты вращений зонда (метки) вокруг оси симметрии и перпендикулярных к nett осей, ot - TV* + » Tg- врем.» поперечной релаксации, Hw(т.ё/Ч') ~ резонансное поле, действующее на электронный спин; интегрирование проводится по ориелтациям, соответствующим одноосному вращению ( f ) и ориентациям самой оси симметрии ( В ) относительно магнитного поля. Уравнения (1-3) могут быть обобщены на случай анизотропной среда, а также позволяют проанализировать ряд важных частных слу чаев (быстрого изотропного и сильно анизотропного вращений). При меры расчетов формы спектров даны в /В/.

Расчет спектров ЭПР с учетом Cd4 насыщения и модуляции. В этом случае компоненты намагниченности ( ь' Ъ ) могут быть разложены в сходящиеся ряды Фурье вида: f_ ' ,(^"/2 - чаете а модуляции) и для комплексных коэффициентов 2Л

получается бесконечная систем интегральных уравнений. Решение ¡этой системы п аналитическом виде (в виде интегралов от комплексных матриц) получено в приближении малых амплитуд модуляции (Н/г Для компонент намагниченности на первой и второй гар< иониках зеемановской модуляции.

Аналогичный подход был применен для расчета формы спектров ЭПР ПН, когда модулируется не зеемановскоу, а СБЧ поле и при одновременной модуляции двух полей. Эа т подход может быть использован также для расчета спектров двойного электрон-электронного резонанса, поскольку поляризованная по кругу амплитудная модуляция эквивалентна воздействию двух СБЧ частот.

Методика эксперимента. Для прецизионной регистрации спектров ЭПР в условиях СБЧ насыщения были измерены абсолютные значения и распределение по оси резонатора амплитуды Clin поля (Hj), зависимость Н^ от толщины кюветы, на основании чего были Еыбра-ны оптимальные размеры образцов и условия регистрации спектров ЭПР ПК. При смене образцов с различными диэлектрическими потерями, изменении вязкости и температуры проводилась коррекция на постоянство Н-г.

п /'

При измерениях спектров настройка фазы модуляции контро-. лировалась для каждого образца по миницуыу сигнала в отсутствие СШ насыщения ( T/if-rus Л ^1976) до и после снятия спектра.

■Модуляционные методы. Природа чувствительности к "сверхмед-;|анны.у"врад;енкям. Расчеты спектров ЭПР ПН на базе развитого формализма показали, что существующие в литературе представления о природе чувствительности п "сверхыедленным" вращениям: нарушение

адиабатичности прохождения через резонанс па счет молекулярного вращения или спектральная диффузия СВЧ возбуждения ( Hydt ,J><i(ion 1979,1985) не дают адекватного объяснения в случае стационарны-« спектров ЭПР ПН ( Ь1/ и V'z''). Так, чувствительность сигналов У/к временам 'С-^ 10 —1в расчете и эксперименте сохраняется при малых значениях Н,п , когда форма спектра на зависит о? Н^,, т.е. от скорости прохождения через резонанс, определяемой величиной Далее, механизм нарушения адиабатичности предсказывает сильную зависимость чувствительности к вращению от

Н-^, однако 'Спи для расчетных спектров очень агабо зависит от Hj. Изменения форш сигналов Ц' и V/ нельзя объяснить и снятием СВЧ наснщения за счет спектральной диффузии, так как в областях с наибольшей скоростью диффузии наблюдалось би увеличение (а но уконьсекиз как в эксперименте) интенсивности линиЛ.

Чувствительность форш сигналов и V/ к вращении обусловлена тем, что они регистрируют эффекта запаздывания в спиновой система в ответ на модулирующее пола. Величина запалддаашк (и соответственно интенсивность линии в данной точка спектра) определяются соотношением -между Т и скоростям! релаксациокш« процессов, одним из которых является перенос намагниченности по спектру за счет гранения. Последняя процесс наиболее зффектизол в областях спектра, котором соответствует каимсиьетй статистический вес- ориентация (накболыгзэ зиачекие d^ui/dd ) что пргооди? к ур.зныззняп относительных интенсивности в этих областях.

Приведенное объяснение справедливо и для других способов возмущения спиновой снстеш в условиях СВЧ насыщения. ДзЯстви-тельно, в работе с покощьюрасчетоз показана оозиожноать • пользования модуляции СВЧ мощности для регистрации "сверхмзд-ленкых" вращений. При этом рази/э.'компонента ( UL) Rt ^ ) по разно?.у чувствительны к вращетга н спин репзгочной релаксация, что позволяет экспериментально исследовать оба процесса.

Использование эф^егтоэ СВЧ Hftctrtsmtq дтя., кзучзпия, "сворт-» медленных" враяений. Хотя сигнаяа Ц' и V2'-характеризуются-высокой чувствительностью) к вращению, сущэствениака-недостатками при их применении являются потеря чувствительности по концентрации спиноз и трудность определения времен 'V при наличия сигналов от слабо иммобилизованных «сток. С цэльи преодоления этих недостатков в работе теоретически и экспериментально развит подход, основанный на использовании обшдацх сигналов ЭПР поглощения в ус-

довиях достаточно сильного СВЧ насыщения. В качестве чувствительных к вращению параметров выбраны, факторы СВЧ насыщения ком понент т.ектра: где 1Д0 - интенсивности

компонент «1 = 1,0,-1 в насыщающем (1^) и ненасыщающем СВЧ по-л,5* (Н10).

Уменьшение времен V или Т^ приводит к уменьшение всех величин , однако отношения изменяются для

отих случаев по разному;'с уменьшением они возрастают, &

уменьшением Т^ падают (рис.I),что дает возмочшость изучать движение и магнитную релаксацию.

Рис.1. Примеры расчет шх зависимостей факторов СВЧ насыщения (^=0,32 гс) от времени корреляции вра-щзнип при разных Т^ и от Т]- при разных Г. 1/ГТ1 =3гс

А »2 зЗб^ГС'.^аАу,

=?гс; ^ - О,С ' "'«/г-^'КГ гц

ЧГ(мкс)

рв гю* ш*

%-Нс'Ч

Описанный подход был применен для изучения вращательной по; пижности радикала I в глицерине. Независимыми тестами было показано, что характер вращения радикала близок к скачкообр&зноцу. Использование параметров 2(т) при разных Н^ позволило определит! параметры "сверхмедленного" вращения (анергию активации, гидро-динммческий радиус) и оценить времена Т^ при разных температу-

* Л

Анализ расчетных зависимостей £ IV) для различных значений Т^.Т^, ШТЛ Д!^ показывает,что параметры несколько менее

чувствительны к движению {Т£ Ю-4 с) и более чувствительны к изменению Тт, чем обычно используемые параметры ¿/4 «ли Н /Н сигналов У/ (рис.2).Однако, важным достоинством этого метода является сохранение высокой чувствительности по концентрации и возможность определять параметры "сверхмедленного" вращения в многокомпонентных спектрах ЭПР.

Анализ анизотропии вращения по спектрам ЭПР ПН.Биологичвс-. киа и. искусственные мембрши представляют собой существенно анизотропные структуры. Однако, во многих работах с использованием ЭШ' СПН холемулярше движения в этих системах анализируются в рамках изотропной модели. С целью выявления качественны*. а^екти!

- го -

анизотропии "сверхмэдленного" вращения в работе были проведены расчеты форда си-гнилов VL , и U/ для предельно анизотропного - одноосного вращения зондов вокруг глазных осей ^ и А тензоров (Х,У, 2 ) и для иэоаропного вращения.

Зависимости И'/Цъ) для сигнала ' оказались качает венно аналогичны для Х,У и изотропного вращения (рис.2); замет-кие отличия имеют место только для " £ " анизотропии вращения, причем форм® кривой ¿71 (f) в этом случае хорошо согласуется с экспериментальной зависимостью ^ /¿' от температуры для опин-кеченой стеариновой кислоты ( Snhih t д/, I9B0). а ,с)с <5"

■/¡¡i \ Рис.2. Зависимости па-'

раметров CJt и С/С второй гармоники поглощения от времени корреляции врад;ения(а) и зависимости от С/С для изотропного ( ) и одноосных вращений зонда вокруг « и й <jt осей Х,У

В отличие от параметра Ll'jL ' центральная область спектра (параметр С/С) более чувствительна к "Хн_и "У" анизотропии вращения. Времена корреляции, определенные из "изотропных" калибровочные зависимостей с/С ( Т? ), близки к истинным для "У-вращв-ния и могут отличаться s 50-100 раз для "Xя и "2 " вращения, причем отношение 'Ьъ/ч? немонотонно зависит от

Для идентификации ИХ", "У" и изотропного вращения в работе предложено .использовать пари значений ¿"/1 , С/С, которые согласно расчету образуй1 различные зависимости-при изменении Т" (рис.2-6). Однако, при неопределенности в значениях компонент

такой подход дает лишь качественную информация о харак: эре анизотропии вращения.

Экспериментальное исследование подвижности радикалов Ни Ш в смесях атанол-х-лицерин показало, что точки l"/L , с'/с дей-стзитально группируются в отдельные зависимости для каждого зонда, пркчвц длк зонда III в отличие от зонда II они скещеда в прагую часть каадракта, что согласно расчету соответствует "X* анизотропии вращении.

Исследование анизотропия цолекуляркых вращений с поморья ЗПР СПН в 2 tía диапазоне СДО. В этом разделе показано, что резкое увеличение чувствительности к анизотропии "свертмедленного" вращения достигается в 2мы диапазоне, где полностью разделены зигналы от канонических ориентация Х,У,2 .

В спектрах первой гармоники поглощения ( ) в условиях ]ВЧ насыщения при вращении вокруг оси X с уменьшением ^ возрастают амплитуды У и Z компонент, но почти не меняется амплитуда < компоненты. Аналогично, при вращении вокруг оси У возрастают змплитy\fi X и 2 .

Форма 'гинфаэных сигналов Ц и Vj чувствительна к вращении з временам Т-й ICT^c, но хариктер изменений качественно одинаков для вращений вокруг осеП Х,У, Ъ и при изменении Tj.Напротив , квадратурные компоненты U¿ и V/ весьма чувствительны к шиэотропии вращения, причем в отличие от V^ амплитуду в кано-мческих сриентациях, изменяющихся при данном вращении, падают з уменьшением С . Природа этих эффектов (см.стр.7) состоит у!я сигналов V¡_ в частичном снятии СВЧ насыщения, а для сигна-los V2 и 14 - в уменьшении запаздывания при уменьшении Т ,, JecbMa существенно, что влияние врал!ОНИя на форму сигналов ^ i t^ не эквивалентно влиянию Tj, что дало возможность гутем вы tío-ja соответствующих спектральных параметров построить алгзритш

определения изменений f и Tj..

С помощью этих подходов был проведен анализ температурных )ависимостеЯ спектров \'L , , U/ , V¿ , V¿' радикалов УП и fill в t - бутиябенэоле вблизи температуры стеклования, «экером-ш; в совместной работе с Криничным и др. /43/. Показано, что 1ля зонда УШ резкие изменения в спектрах и Ц в интер'лле !60-170°К обусловлены в основном ^азморат-ивалием врацения вок->уг длинной оси молекулы 10~°с при 160°и1"г10"7с при 170°). 1ля радикала УП наряду с увеличенная частоты вращения, в том ;е интервале температур существенно уменькается время спин реше-■очной релаксации (T^/Tjq - 0,1+0,2), связанное полидимону с 'ысокочастоткыми, но ограниченными по амплитуде либрадияия.

О возможности разделения частотных и амплитудных, параметров юлекулярноео врздепия с помелья ЭПР СПЦ. Эти параметры обычно рудно разделить в линейной спектроскопии магнитного резонанса, оскольку обусловленное вращением усреднение магнитной анизо-ропии зависит как от частоты, так л аыплитудм ррацения.

В настоящем разделе показано, что если яограниченное"|5радо-

ние достаточно быстрое, его можно отличить от медленного "неограниченного" вращения, используя ЭПР Cull. Эта возможность основана на том что спектры ЭПР ПН шло чувствительда к быстроц/ вращению в узком конусе ориентации, но Еесьма чувствительны к медленному неограниченному вращения. Так, например, линейные спекг4 1

медленного вращения («с =4,'о'Ю~Сс, в и быстрого

ограниченного вращения ( ГС =0, 9 -21°) близки по форме, в частности,расщепления 2A'2i кеаду,крайними экстремумами у них совпадают. Однако, параметры ГШ для отих.случаев резко различны:

2 равен соответственно 1,7 и 4,27, a f/i-'- 0,27.и 1,36. Резкие различия параметров Ш сохраняются, если медленное и быстрое вращения являются одноосными: при замене непрерывной диффузии на скачкообрааьое вращение; варьировании времен Tj- и Tj>; переходе от однородного уширения к неоднородному.

Условия применимости ; иного подхода зависят, очевидно, от амплитуды и частоты ограниченного врааения ( 'hr ). Расчеты в рамках модели, включающей оба параметра 0 и %г , показали,что с уменьшением %г отношение ^/l сначала падает, как для "неограниченного вращения (рис.2-а) однако при (д - 10-30°) снова возрастает, достигая или превшая исходное значение.Именно при этих значениях Т ограниченного вращения его можно отличить от медленного "неограниченного" вращения. Применение этого подхода рассмотрено в гл.11.

Глава II. ВСТРАИВАНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДОНАША СПИНОВЫХ ЗОНДОВ В ЛЕНШРОВСКИХ ^ЛЬТИСЛСШ ЛЯПЯДОЗ.

Ленгмзровские цультислои липидов (Ж1) благодаря высокой степени ориентация л стабильности могут служить удобными моделя-' ми липидных областей (в особенности гельн$аз) мембран. Кроме того, они представляют большой самостоятельный интерес как перспективные материалы молекулярной электроники. В связи с этим важными задачами являются изучение структуры ЛМ, а также закономерностей встраивания и'молекулярной динамики примесных ыо-чкул з ГЛ.

В настоящей главе для решения этих задач впервые применен метод спинового зонда, В ЛМ отеаринозой кислоты и её солей Ва и U встраивали спин-ыеченыо аналоги жирных кислот IX,X, а такие холестаиовый зонд У1. При выяснении механизма молекулярных переориентация оказалось весьма полезным применение ЭПР СПИ б сочетании с линейной ЭПР спектроскопией. В §5 этой главы на ос-

новании расчетов спектров Э11Р Ш для анизотропных и ограниченных вращений "проведен енализ динамики зондов в гель-фазе фосфо-липидов с использованием литературных экспериментальных данных.

Фазовая микрогетерогенносгь ЛМ стеарята Ва-стеариново^ кислоты. Изучение "линейных" спектров Э11Р спин-меченых JLM с различными соотношениями обоих компонентов, при ориентация* нормали Ш (Л..) параллельно и перпендикулярно магнитно»^ полю показало, что они представляют собой суперпозицию двух сигналов! изотропного и анизотропного, для которого сильная угловая зависимость сохраняется до температуры плавления ДМ. Оба сигнла резко различаются по вращательной подвижности зондов (соответственно Т-1(Г^с к r> ICT^c при ЗЮ°К) и по кинетике растворения при инкубации JI!.i в органическом растворителе (полупериоды соответственно 15с и 103с). Отношение интенсивностей этих сигналов зависит от соотношения компонентов Ba(it)^u HSt в JIM.

Из полученных результатов и данных ИК спектроскопии /Ю.А. Бобров, Л.Д.Сагинов/ следует, что Ji'.i фаэовэ гетерогенны, причем в них имеются микрофазы стеариновой кислоты (растворяюдиеся О органическом растворителе) л микрофазы комплекса Во(St)z- HSt , которым отвечает анизотропный сигнал; изотропный триплет соответствует повидимому неупорядоченным межфазным границам.

Ориентация;и конформация спиновых зондов в ЛИ. [Моделирование спектров ЭПР зондов в ориентации «it Н (рис.3) показало, что анизотропный сигнал состоит на самом деле из двух триплетов с одинаковыми константами СТВ (Ajj»9,2rc), но разными значениями j?ii : 5?«1' » Существование этих компонент

iV"

Рис.3. Спектры ЭПР зонда IX в цультислоэ Ва( St )г~Ъ it после "скелетизацли'Чвздер-кявания в органическом растворителе) 20 сек а/пИ Н— эксперимент, ••••• расчет, б/л1Н, —-эксперимент,

----расчет для ^U-AiT^'^j1)

..... расчет для ^¿¿^¡Щ/)

обусловлено повидимому двумя локализациями зонда в фазе комплекса Ba(St), - HSt с различной ориентацией относительно ЛМ.

Поскольку a pi^u неизвестна компонены тензоров А и J , за-висяя^ие от полярности локального окружения, была развита прибли-

- И -

яенная самосогласованная процедура для одновременного определения ориентации главных осей А, § тензоров относительно нормали {в ) и самих значений этих тензоров. Удовлетворительное согласно экспериментальных и расчетных спектров получено лишь при условии, что двум локализациям зонда отвечают не только рагные ориентации ( <?"'' = 79°,Л ), но и

разные поляркости окружения (рис.3), а именно первой из них - • неполярное (кг2 =-33,8гс, ^ч* »2,0104), а второй - полярное (Агг»37,0гс, $хх - 2,0091)..

Знание углов 0 , ^ позволило проанализировать возможные конформации зонда при двух способах его встраивания в ЛЫ. Испол! зуя данные по геометрии амидной группы зонда IX, конформеров пиперидиново*го кольца, были получены общие выражения для углов повор^ .'а вокруг связей С-С и , смежных с амидной связью, дающие экспериментальные значения углов В и $ .

Расчеты показали, что для первой локаллзации зонда возмоаоа 4 конформации (4 набора углов поворота, вокруг С-С и С-Ы связей из них энергетически более выгодной конформации соответствует трено форма амидной группы. Для второй локализации зонда возможно б гонформаций .4 все они соответствуют цис-форме.Повидимому,. два способа ориентирования зонда в ЛЫ обусловлены цис-транс изомерией амидной группы, а влияние ш^рицц проявляется в стабили-ееции углов поворота вокруг ординарных связей.

Результаты конформационного анализа и значения полярности окружения зонда в двух его локализациях позволяют построить модели его расположения в ЛЫ. В первой локализации благодаря вытянутой трансоидной конформации N'0 группа зонда оказывается за пределами полярной области бислоя, попадая в гидрофобное окружение. Для второй локализации НО группа находится в полярной части бислоя (рис.4).

Вращательная подвижность спиковьг зондов в ЛМ. Температурные изменения спектров ЭПР имеют следующие особенности': отсутствие сдвигов линий в ориентации И Н, уменьшение расщепления с рсстоы температуры и появление компонент, соответствующих быстро^ одноосному вращению зонда в ориентации п1. Н; слабая темпе ратурная зависимость форш спектров ЭПР ПН, свидетельствующей об отсутствии эффектов переноса СВЧ насыщения.

Уменьшение 2А^ с ростом температуры и одновременно отсутствие сдвигов в ориентации и ПН свидетельствует о том, что в обоих локализациях зонда его вращокие существенно одкоосно, с

/

>

■ <>

\

<

< ' к '

(ул = л, у

Л Т Л 7 ^

/ >

Рис.4. Модель встраивания зонда IX в цультислой стеарата Ва - стеариновой кислоты.

о

сью вращения,перпендикулярной ЛЫ.

Для установления характера вращения зондов были проведены асчеты спектров ЭИР и ЭПР П11 в рамках различных моделей движе-ия:

) медленное "неограниченное" по углу одноосное вращение удовлет-орительно описывает ф-зрцу линейных спектров. Однако, найденные а основе этой модели значения Т (Ю-7- Ю~ас) по крайней мерз а 3-4 порядка меньше значений Т , следующих из форш спектров ПР ПН.

) другая "предельная" модель движения - случайные вращения в глог )ы секторе, юирина которого ( 4 ) растЗт с температурой, та модэль качественно правильно описывает форму спектров ЭПР ПН, цнако, для "линейных" спектров при высоких температурах на даёт цовлетворителиюго согласия с экспериментом.' ) модель, использующаяся для описания реориентаций в молекуляр->гх кристаллах (Китайгородский,1971): быстрые либрации молекулы нутри потенциальной лш и редкие переходы между ямами. Расчет эрш спектра э этом случае аналогичен предыдущему; шим яаля'0Т~ 1 только способ усреднения спин гамильтониана; поэтоьу и о дан-эй модели не удается достичь согласия с .экспериментом.

Неудовлетворительное согласие этих (и некоторых других) мо-5лей, в которых используется единый набор динамических параметре , приводит к необходимости учета распределения по параметрам эащательноЯ подвижности. Расчет показывает, что форма спектра к этом случае зависит от модели движения. Так, модель "ноограни-!нного" вращения с временами корреляции в интервале 10~5-10"^о | средними значениями 10"7-10~®с) противоречит экспериментальном

спектрам ЭПР ГШ. Поскольку вторая и третья модели приводят к формально одинаковом/ математическому описание (в рамках у сред НОШГ--0 спин гамильтониана), выбор между ниш нельзя сделать путем моделирования отдельных спектров ЭПР. Однако, вторая модель представляется менее адекватной, поскольку она предсказывает зависимость среднего значения от* температуры в виде УТ, в то время как экспериментальная зависимость существенно более сильная.

Для количественной оценки параметров подвижности и их рас пре^,единил выбрана простая зависимость потенциальной энергии о угла поворота зонда в виде потенциальной нш глубинойЬ и шири ной, соответствующей средней амплитуде колебаний внутри ямы

(Л ). Для простоты учитывалось только распределение по Ьг в в. .до гауссовой функции. Для зависимости (Т) получены урав нения:

- сг- -г ИТ > -г - % .

из которых определены средние значения 1Г и ширины ямы. Для зонда IX они составляют 13,7^0,5 кдж/моль и4,9°, а для зонда X - Ю,В±0,7 кдж/моль и о0. Несколько меньше значение V для зонда X свидетельствует о внутримолекулярном вкладе в молекуля] цув подлинность зондов. Значения V и Д близки к соогветству» щим значениям для молекулярных кристаллов. Учет распределения 1 1Г позволил получить хорошее согласие для линейных спектров 1 всем температурном интервале и качественное согласие для спектров Э11Р.ПН. Ширина распределения по V составляет для зонда I) 5 кдж/моль при 255°К и возрастает до 9 кдж/моль при ЗЮ°К.

Из полученных данных.следует, "то по своим динамическим х рактеристикам ЛК ближе к молекулярным, а не жидким кристаллам; существенным результатом является также обнаружение не тгчько фазовой, но и мелкомасштабной динамической гетерогенности, обус ловяонной повидиыоцу обратимым рсоулорядоченигм в ЛЫ.

Анализ спектров ЭПР М спичоацу апнцов в мул ьти слоях ЗюсФс лидчг.оа. Для сравнения с Ж с помощью теории, изложенной в §§7, Э гл.1 гфоанализироЕаш экспериментальные спектры ЭПР ПН спин-юченнх фосфолипидов и холестерина в гель-фазе фосфолиплдов (Л-йМА, , И а£ ( 1900). 3 фоофолишдеск слоях в отличи

оу ЛЬ\ в близких температурим* интервалах обнаруживается эффекта

1й перенос СВЧ насыщения, свидетельствующий о наличии "неогра-шенного" вращения в плоскости слоя с частотами 10^-10® шидимому различия в молекулярной подвижности в этих системах »условлен« различиями в степени гидратации (существенно боль->й для цультислоев фосфолилидов) и соответстнс-нпо в строении >лярних областей цультислоев.

Глава III. "СВЕРХМЕ ДЛЫИЫЕ" ВРАЩЕНИЯ СПИНОШХ ЗОНДОВ В

ПОЛИМЕРАХ.

Полимеры обычно рассматривает как простые модели биологичео !х макромолекул. Целы) настоящей главы било выяснение возможнос-!Й ЭПР СПН (в сочетании с линейной ЭПР. спектроскопией) в изу^о-1И молекулярной динамики стеклообразного состояния. Другой ао-!кт работы бил связан с изучением-связи-между вращательной |ДВижностью и кинетикой, реакций, в полимерах.

Вращательная подвижность и динамическая гетерогенность _я юрдых• полимерах. В качестве объектов.'.исследования были выбраны |лимеру. разной структуры-, отличающиеся температурам стеклпва-я (Тс ):• натуральный: каучук -{ИК,Т(,=203°Ю, полиметилметакрилат >'.КА,376°), полистирол (00,371?) и. частично псликристаллический лиэтилен (ПЭ,250°) а качестве спиновых зондов - радикалы II -I У.'

Времена корреляция "сверхмедденнчх" вращений определяли с мощьч различных1 спектральных-параметров Z!"\ il'/L , С/'С, каменных для каждого зонда в .'эталонных системах (смесях этанол-ицэрин). Кроме.того, методами • линейной спектроскопии огфеделя-времена т в области быстрых и медленных'вращений.

Для всех э<5ндов обнаружено, что температурные зависимости емен корреляций в пирокои.интервале температур,, включая Т , овлетворятельно описазавтсп уравнением Аррениуса (рис.5).Од-ко, вблизи и нихе Тсаначения , определенные из линейных ектроя ЭПР с помощью параметра 2к'гг , систематически ним знаний Т .определенных из спектров ЭПР ГЛ.Эти различия,как покивает расчет, нельзя обьяснять возможными .огаибками в определении (например, за счет температурной зависимости полярности окру-)ия зондов), а также отличным от изотропного характером их вра-тп. Указанные различия обусловлены ловидкмому распределениеv временам корреляции вращения зондов вблизи и ниже Т . При наши такого распределения методы ЭПР СГИ дают средние значения , а из линейных спектров, вблизи границы их чувствительности

к вращение, определяется более высокочастотная область этого распределения.•

Рис. 5. Температурные зависимости времен корреляции вращения спиновых зондов в полиыетилмэтакрилате (а) и полиэтилене (б). Значения о , й получены методами "линейной" Э11Р спектроскопии; © , А - усредненные значения Т , измеренные с помощью различных параметров ПН ( , 1*/и . С'/С). Пунктирные линии -характерные времена ос , р , У релаксационных процессов.

О наличии распределения.по Ф свидетельствует также существенное уменьшение параметра 2А'г¡. с ростом СВЧ мощности,поскольку для динамически однородных систем согласно расчету и эксперименту различия по к'2г при больших и малых Н^ отсутствуют или имеют другой знак. Ширина распределения по Т" , оцененная из данных ЭПР СПИ н линейных спектров, увеличивается вблизи и ниже Тс, достигая более двух порядков.

. Сопоставление'частот вращений спиновых зондов с частотами релаксационных процессов в полимерах определенным методами ЭПР и диэлектрической релаксации (см.рис.5), показывает, что при высоких температурах для зондов III и 1У в НК и Ш значено ^ . близки х частотам сегментальных движений ( ) повидимоод вследствие того, что размеры этих радикалов близки к размерам кинетических сегментов полимера,.(3-4 звена)} для ШМА и ПС частоты попадают в область между частотами р и И релаксационншс процессов. При низких температурах значения полученные из линейных спектров, существенно превышают частоты релаксационные процессов, .что связано повидимоыу со структурной неоднородностью полимера,' \ наличием "пор" и полостей. . ■ , "

Аррениусовские зависимости 'V (Т) характеризуют средние фаметры молекулярной подвижности, определенные и модели изст-зпного вращения. Анизотропия "сверхмедлейных" вращений зондов ¡учена в рамках подхода, изложенного в гл.1. Найдено, что эа-юимости L/l от С/С для. зондов II и III четко разделяются, зичем расхождение между ними сильнее, чем для изотропных рас->орителей. Характер вращения зонда III качественно одинаков в «личных полимерах и при различных температурах,соответствуя icTpoiß' вращению вокруг длинной оси (X). Вращение радикала II 1кже анизотропно, причем ось быстрого вращения поиидимоку шзка к У. Существенно, что анизотропия вращения, как и арре-(усовские зависимости '£(Т) не меняются при перехода через >чку стеклования, т.е. движение зондов определяется не кооле-1тивноЙ, а мелкомасштабной динамикой полимерных цепей.

Изучение молекулярной динамики и кинетики фотосенсибилизи-¡панного восстановления в пластифицированных полимертк ыатри-IX. Проблема зависимости скорости химической реакция от динами-I среди имеет принципиально« значение. Для полимерных сред осо-!й интерес в этой связи пред товляет мало изученная область ¡верхмедленных" молекулярных вращений. В настоящей работо пройдено 'параллельное исследование кинетики восстановления элокт-)нного акцептора •(дихлорфенолиндрфенола) и вращательной Под-(жности в пленках поливинилового спирта, пластифицированных яличными концентрациями глицерина*',

иотосенсибилизкрованное антрахинон 2,6-дисулъфонатом (АД5) ^становление акцепторов (Фомин,Мордвинцев,1979) иключи^т в 1честве основных стадий образованна триплетного состояния АДС ), семихинонного радикала АДС~при отрыве атома Н от молекулы трицы (2), диспропорционированив АДС (3) и взаимодействие аД, и АДСН^ с акцептором (4 и Ь). Обнаружено, что скорость диспро-рционировпния (кэ) не зависит от концентрации глицерина и раэ-' , Ю^.Г^с"^, в то время как скорость восстановления акцептора эрастает от I до 10^

По спектрам ЭПР и ЭПР ПН зонда XI с использованием различ-х спектральных параметров обнаружено распределение по временам рреляции вращения, ширина которого и среднее значение умень-отся с ростом концентрации пластификатора (Г), Количественное поставление значений г. и Vпоказывает, что при малых Г(Г62СФ) рреляция между ними является существенно более сильной, чем нейная: максимальное изменение на два порядка сопровожда-

Кинетику реакции изучали в совместной работе с П.И.Мордвкнцевым

етол увеличением к на три порядка, й то жа время при измене нни Г от 40 до &05С корреляция меаду к и близка к линейной что согласуется с имеющимися теоретическими представлениями, рааьитыми для однородных систем. Суперлинейный характер связи jttiXfly к и ГС при медленных движениях в матрице обусловлен поаиднмому вмроким распределением по временам корреляции враще кия в_полимере в стеклообразном или близком к стеклообразному состояниях. Вклад » кинетику реакции -дают;.молекулы (или микрообласти полимера) с наибольшей подвижлjCTto, в то врем» как методами"ЭПР СШ-регистрируются некото'-ые средние nci распределение) значения t . С ростом Я? уменьшается распределение п Т. и связь между к и t приближается к линейной. Суцественн что молекуля- ия подвижность в матрице влияет на кинетическую стаций,- а не связана с диффузионными ограничениями при столкно вениях реагентов. Действительно, число столкновений для радика лов АДР и близких к ним ..о размеру ЛДСА> во всяком случае боль вв или равно кэ и, следовательно, не может лимитировать реакци восстановления с константами скоростей k_j — Таким образом динамическая гетерогенность, обнаруживаемая с помощью ЭПР СШ, Южвт сущестерчно влиять на характер евд.я между молекулярной подвижностью и кинетикой реакций в полимерной ма*ркце.

Глава 1У. ВРАЩАТЕЛЬНАЯ ПОД МОСТЪ И РЕЛАКСАЦИОННЫЕ ПАРАМ!

FU СПИН-1ЕЧШХ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ

Применение ЭПР СПН к глобулярным белкам, структура и дина мика которых imifuiee изучены - необходимый этап при исследова или динамики мембранных белков. Для спин-меченых белков возникает ряд новых проблем по сравнению со спиновыми зондами:1)рас чёт формы спектров ЭПР ГШ в модели непрерывной, вращательной диффузии; 2) установление характера движения метки относительн белка и влияния этого движения на спектры ЭПР ПН; 3) измерение параметров ПН в сложных спектров Э^ при наличии сигналов от слабо иммобилизованных на белке меток; 4) определение релаксационных параметров спик-мече1!ых белков, данные о которых .факт: чески отсутствуют.

Расчет Форш спектров ЭПР ПН путем решения временных уравнений Клоха. Существующие метода расчета основаны на решении стационарных уравнений Лиувилля или уравнений Блоха. В этом ра; деле изложен другой подход, основанный на непосредственном кнт< гриронании временных уравнений Блоха. Преицущаством его являет!

зможность получения из периодического рювпяп лобнх модуля-окных гармоник сигнала ЭПР ( /¿л. , I*, ), я. также применимость я нестандартных методов регистрации "евврхмздлонннх" ррадониЯ.

Численное решение уравнений Елоха с учетом изотропной пра-талыюй диффузии проводилось по неявной разностной схема медом матричной прогонки на каждом временном слозх/. Время вида нп периодическое решенио возрастает с увеличением Т^, но або'зависит от Т^ и амплитуд СВЧ поля и модуляции. Последнее растеризует достоинство данного метода расчета, поскольку ационарнне метода основаны на разложениях в ряд по гармони-м модуляция,! сходимость которого существенно умэньиается с стой Нт .

В работа исследовали глобулярные белки разного молекулярно-ввса и фор!ш охсигемоглобин человека - < 1180^) • бычий сыворсточ-Я альбумин (ЕСА), миозин, а в качество спиновых меток - связы-ющиеся.с'цистеиновыми остатками белков радикалы Х1У - ХУШ и нда 1У, XII, XIII, сорбирующиеся на молекуле ОСА.

Относительное движение матки, ковадентно связанной с бел-м. Для,изучения характера э-ого движения проведено теорети-скоэ моделирование, линейных спектров ЭПГ спин-мечекьпс Нг^ и А,', изученных в зависимости от вязкости, температуры и йммоби-зации белка, Для повышения спектрального разрешения использо-на двйтврироганная мотка ХУ1.

При увеличении вязкости, понижении.температуры ила иммеби-зац>ш белка, снимающим "вращательное" уЕЯренне, в спектрах ЭПР четливо-проявляются экстрецды, соответствующие каноническим иентацияа тензоров. | к А, Как показывает модалирова-

е, эти спектры нельзя опясать в модела анизотропного волчка удич и:,цр.,1977) и в модели медленного изотропного вращения тки относительно белка.(КяПвяряЯнен,1975). Отсутствие аксиаль-й симметрии усредненных по относительному,движении тензоров £ К можно, объяснить в рамках модели, в которой метка совершает Рсличенные угловые осцилляции (а не вращения) относительно яка. Значения усредненных компонент, найденные при моделирова-:{, соответствуют водному окрукенио метки и позволяют, оценить еднеявадратжтые амплитуды ориентационных флуктуация (для оса 2 и составляют 10,19 и 25°) при температурах 0°20са 40ЭС).

Расчеты проводились в совместной работе о Т.П.Кулагиной я А.Н.Ивановой.

Сравнение спектральных параметров меток ХУ и ХУI на Нв02 показывает, что,заметный вклад (с; ЗК5) в ориентационше флуктуации вносят конформационше перехода п пиперидииовом кольце.

дополнительная информация об относительном движении метки црлучена из увирокия линий ЭПР.". Путем моделирования спектров найдзно.,.что ширина линии, не связанная с вращением белка, растет с увеличением вязкости, причем в интервале 1-3,Ь сп — линейно. Анализ различных.кеханизмоа.уширения-показал, что эта зависимость обусловлена-ловидиыому двумя процессами: диффузионным -движением -матки в ограниченном телесно« угла и.усреднением изотропного распределения по полярности окружения за .счет образования и разрыви.Н-связоП, ' ' " - й

Ирпог.ьзо' ■ тие » М-ект СВЧ^асыщонця» для ^изучения "с.верх-уеу-^ншх* '.вращении:' глобулярных- белков. В этом раздала изучена применимость изложенного в гл.1 подхода.к^спин-меченым глобулярным белкам. Как и ¡для спиновых; зондов показано,' что факторы СВЧ насыщения чувствительны кгвремен&м корреляции вращения белка ^ при.оптимальных'значениях условий регистрации..

, Исслпдозшша зивискностей ¿'"Ыачя ■меток различной струк-созывающихся-ковалгьть., с НвС^,:1СА и миози-' ном; и зондов 1У,ХЩХШ, сорбирдтацяхек .на-молекуле .Ш^варьи-^. рэванде кокной с'ш* и темперьту^ы,-; иэыо-!яы;их амплитуду ориен-т&цроиньк флуктуация моток,.показало, что при наличии ¡движения катки относительно белка сохраняется'чувствительность-параметров к вращения б«лка до времен карреля!^и;10~^с. Преицу--' ¡цество этого подхода по ^-сравнению с квадратурным* сигналами поглощения и ■ дисперсии ( 1<У к ) ■ состоит в сохранении высокой чуосг-вительтстя по.концентрации спинов и возможности ре-. гистрацки "сверхмодленных",вращений в присутствии сигналов от ' слабо иммобилизованиях на белке моток.

Определение ролакоационшх параметров спин-мечешх бел лов.

, Эта задача важна не только для {орректного определения времен корреляции вращения, но представляет и самостоятельный интерес, поскольку времена Т| и могут характеризовать . скальное окружение белка в мосте присоединения матки. В настоящей работе для решения этой задачи проводилось теоретическое моделирование параметров ПН первой и второй гармоники поглощения ( а1'*), *■ /Ь ), а также ширины компоненты ^ =+1 в отсутствие ( аН„ ) и при наличии СВЧ насыщения ( Л И ) (рис.6).

Независимо величины Т., определяли из анализа формы кемпонен-

ты т-+1 в модели свергни гаусс-'лоренц.С отой целью били проведены численные расчеты синглетнык сигналов поглощении при различных соотношениях гауссовой и лоренцевой ширин и построены номограммы дчя определения этих ширин из соответствующих параметров 1]ормь- линии .

iQM Ь* .'.¿И" io-* ÍD-« io*

Рис.6. Сравнение экспериментальных^ 1-4 j и расчетных (Ь-В'л параметров, спектров ЗПР дял HaCg,спин-леченого■ маткой К/,-

Для спин-меченого меткой X/ HpOg с использованием сбоях подходов найдено,что в интервале 3 10" <T¿10~% Tj возрастает от ^ 3,5 до 10 икс,a Tg изменяется.немонотонно: при значениях 3-10**-'з Г2 возрастает от' 60 до 120 не,а при '£> 3• IQ"''с падает до <10 по. , Исследования влияния кислорода и дейтерирования метки покэзатш,

что для времен ^ > Ю~ьс зависимость Т^Т) не. связана' нам взаимодействием с 0^,а взаимодействие с-протонами метальных групп не влияет на величину Т2»Зависимость Т^Т) существенно злабее теоретической,соответствующей.' механизму электрон-ядерного ципольного взаимодействия с

Важно отметить,что величины Т| зависят не от времени коореля-даи вращения белка как целого,а от более быстрого относительного 1виженип- метки и ее взаимодействия с кислородом,на которые влия-зт вязкость окружения. Действительно, если остановить вращение 5елка путем его осаждения или адсорбции на носителе,но оставить зодное окружение с низкой вязкостью,то величина IV уменьшается з,о 6 мке,т.е. до значения,меньшего,чем при 'С =10 с,а при помещали иммобилизованного белка в среду с высокой вязкостьл снова воз-эастает. Зависимость ) при малых значениях Т обусловлена

с обмен-

-

вкладом вращения белка кик целого, а при больших И (больших бяэксстях)- зависящим от вязкости относительным движением метки.

Зависимости параметров ¿''^ и ¿'/л дт 'V для разных спин-меченых белков качественно аналогичны, но количественно заметно отличаются. Эти различия, как показывают теоретические оценки, обусловлены не анизотропией вращения белка, а различиями в релаксационных параметрах. Величины Т^, в частности, зависят от структуры мотки и локального окружения белка: для мотки ХУ на НвС^ и БСА г>ти величины совпадают ( ■ [/¿'И^ ПРИ ? СПЬ но значительно отличаются для миозина (1,0 гс). В то же время на НбО^ величины I/К Т2 для меток О' и ХУ1 одинаковы, но заметно отличпются для четки ХУП1. Эти различия сохраняются и в случае, когда врпщение белка как целого, не влияет на -форму спектра. Таким образом, релаксяционше характеристики спин-мечешх белков повидимоь\у могут быть полезными параметрами локального белкового окружения. '

Глава У. ВИЛРЖОЛаШЛРКАЯ ПОДВИЖНОСТЬ ■ И АССОЦЩИЯ Са ЗАВХИМОЙ 'АТС-азы САРКОШ1АЗЗ,1ЛТ№1ЕСКОГО- РЕТИКУЛУМА

Са-АТСази - основной интегральный белок мембран саркоплаз-матического ретикулума'(СР) - осуществляет тралспорт ионов Са за счот энергии гидролиза АТФ. Целью настоящей работы было изучение вращательной подвижности Са-АТйазы в ке^ивных мембранах СР и протеолипосомах и установление связи между подвижностью белка, ферментативной активностью и характеристиками липидного окружения. Кроме того, в р&боте был развит новый подход для определения степени ассоциации белков в нативной мембране и изучена связь между ассоциацией и транспортными характеристиками Са-АТФазы. Да.,ее, ввиду функциональной значимости 5Н групп в Са-АТФазе методом ЭПР исследовалось наличие близлежащих ¿Н групп в молекуле белка.

Исследования проводились на везикулярных фрагментах СР (Ритов.1982), протеолглосомах из дипельмитоил- и яичного лецитина, полученных в гр.В.Б.Ритова, и препаратах белка, солюбили-знрованных в не!Унных детергентах. Наряду со спектрами ЭПР и ЭПР ПН исследовались АТФазная активность, скорость закачки Са внутрь везикул СР и пассивная проницаемость ионов Са.

Селективное связывание спиновых меток с 5Н группами Са-АТ-¿г-ры. Для этой цели была изучена кинетика связывания меток ХУ к

на кинетической кривой выбраны два участка, соответствуете наиболее, я наименее реакцвоноспособным (в данных условиях) ' SH группам ( SHj и ¿Н2), АТФазная активность после печения падала не более, чем на 20%. Параметры локального окружения uf -ток на этих 5Н группах - доступность паратгнитным уширяющим агентам разного знака и анаону локорбата; полярность окружения а вращательная подвюгнос-ъ существенно различны.

Из фрагментов СР, меченых по обеим 5H группам, били вцде-лвкц препараты очищенной Са-АТФазы. Степень связывания к спектральные параметры меток на обеих 'Л группах не изменялись,откуда следует, что ьмтки локализованы на Са-АТФазо, а не других белках СР.

Расположение меток на белке относи.ольно активного центра было определено по величине их спин спинового взаимодействия о конами Mtr+ завещавшими Мд в комплекса с АТФ в активном центре Са-АТФазы. Расстояния NO-i.in для ôHj и ЗН2 групп лежат в- кнтеовалах 14,5 - 17 й и 1Ь,5 - 19 8.

Ьр&щательная подвижность спиновых меток, саязаниых с Са-

АТФазрй. Параметра подвияности меток, связанных с обонмя H

группами, несколько варьирует для разных препаратов (см.ниже).

Типичные значения Т . определенные с использованием факторов

СВЧ насыщения л в качестве эталонной снстеш - спин-меченого

9 А

миозина, составляет 3,2 ■ IO~'c а 1,2 • 10 - для меток на SHj

5Hg группах при 20°. Эти значения могут быть обусловлены различными движениями, в которых участвует метка. Вращение везикул СР как целого дает пренебрежимо малый вклад в значения f " . Исследование» действия сшивающего реагента глутарового альдегида (ГА) показало, что вклад относительного движения меток также незначителен.

Ранее (Thomas etai 1978) была показана возможность иодмфака-цяв котками 5Н групп третьего типа, ( SH3); при этой активность фермента падала до Ъ0%. Время корреляции вращения этих ниток, определенное нами с поиощьв параметра , значите*оно превышав? значения для меток на и SH^ группах (с ^ ¡.о*^ 0 )

Различия в значениях Т для маток на разных SH группах4 могут быть обусловлены анизотропией вращения Са-АТФазы в иембра-нэ я различной ориентацией радикальных фрагментов меток относительно оси анизотропии вращения. Однако, исследование специально приготовленных ориентированных мембран СР не обнаруяло заметной ориентации веток относительно мембран.. Кроме того, свяек-

- 2е -

тканая чувствительность меток на $Н| я грутм* к действию субстратов и температуры (см.ниже) показывает, что различия в значениях обусловлены не анизотропией вращения белка, а тем, что метки по крайней мере на йН^ и группах регистрируют внутримолекулярную подвижность в различных областях белка. Более низкая вращательная подвижность метки на ЬН3 группе повидимоцу отражает вращение белка как целого в мембрана.

Вывод о наличии внутримолекулярной подвижности в Са-ЛТФазе в том ко диапазоне времен корреляции подтверждается данными других методов (деполяризация фосфоресценции, ШР и др.).

Связь внутримолекулярной подвижности с ферментативной активностью. О значении внутримолекулярной подвижности (и возможно, движения всего белка) для работы фермента свидетельствует тот факт, что при образовании сшивок под действием ГА резко падает АТФаэная активность. К аналогично»^ результату приводит адсорбция везикул СР на целлюлозных фильтрах, сопровождающаяся резким затормаживанием вращательной подвижности Са-АТФазы.

Более тонкая корреляция между активностью и подвижностью обнаружена при сравнении мембран СР, выделенных из разных особей. Оказалось, что значения и активности варьируют для разных препаратов, но наблодается корреляция: большим значениям ^ соответствуют в среднем большие значения активности. Возможно, вариация этих величин обусловлена вариацией липидного состава мембран (Бурлакова с соавт.,1971).

Действие субстратов и температуря. В присутствии АТО или вцетилфосфата (и в отсутствие Са'*+) увеличивается подвижность метки, связанной с группой, но не меняется подвижность натки БН-э групге. Это изменение подвижности сохраняется в избытке конов Са, стабилизирующем фосфорялироваиную форцу форманта (ЕР) и ушньпается в процессе ферментативной реакции повидимоцу за счет уменьшения концентрации форм Е ' АТФ и ЕР.

Для. метки на группе наблвдается излом в температурной зависимости подвижности, положение которого ( - 20°) совпадает с изломом в температурной зависимости активности; для меток на ¿¡¡2 группах такой излом отсутствует.

Влияние субстратов и температура обнаруживается только с помощь» эффектов СВЧ насыщения. Различия в чувствительности к этим факторам для меток на и ЗЬ^ группах свидетельствуют о локальном характера соответствующих конформационных изменений в белке.

Изучение рН зависимости подвижности и сопоставление её с >Н зависимостью активности (Болдырев, ГЭ77) показало отсутствие :орреляции между этими параметрами. Повидимому, изменение зарядового состояния белка влияет главным образом на химические ¡тадии гидролиза АТ5.

Влияние лип.чдного окружения на внутримолекулярную подвид-; ■ость к активность Са-..Г$азы. Связь между этими параметрами 13учона на прстеолипосоиах из ди..лльмитоиллецитина (ДПЛ) и янч-юго лецитина (ЯЛ) с молярным соотноиением лиг.ид/белок 30:1 и 00:1*/. Параллельно, с псиоцьв зондов У и XX регистрировали якровязкость липидного окружения.

Прежде всего было показано, что подвижность метки на 5Н| руп"в Са-АТФази в ЯЛ-протеолипосомах не меняется при увелнчо-ии в 10 раз концентрации белка в"мембране, в то время как икровяэкость липидного окружения возрастает в 1,6-2 раза.Этот езультат подтверждает вывод о внутримолекулярной природе пад-ижносуи Са-АТФазы.

• Из сравнения данных для протеолипосом из ЯЛ и ДПЛ следует, то подвиянрсть спин иэченого полярного фрагмента белка зависит т природы липида. Так, уманьпение подвижности метки при перехо-э от ЯЛ а ДПЛ (рис.7> нельзя объяснить только изменением ляпид-ой вязкости, поскольку даяа больпее относительное изменение арамзтра 2Агг зонда 7 при разбавлении протеолипосом из ЯЛ а влияет на подвижность белка..

При заизнэ ЯЛ на ДПЛ изменяется температура структурной грестройки в белка, что проявляется в ¿сдвиге излома на темпера-¡грной зависимости 'V (рис.7). Это означает, что сегментальная г.бкость цокот рэгулирозаться изменением липидного окружения

Рис.7. Температурные зависимости частоты вращения метки Х1У, связанно,, с 5Н| группой и фермента-

тизной активности Са-АТФази .(А) в протеолипосом» *.ЯЛ -'.АТОаэа (30:1 и 300:1)гТ"1 (1)и А(2).ДПЛ-АТФаза(30;I):

сг -i

(3) и А^\Вдо,«ша

определили с помощь« параметра е7с с«гнала У^'

/Исследозлнкя проводились совместно с В,Б,Ритоаци и Ц.ЛЛлчзоьэЛ.

гидрофобной части белка. Сравнение температурных эаяисимостей АТФазноЙ активности и подвижности белка и липидов для ЯЛ и ДШ1 ттротеолипосом показывает, что в окружении,из ненасыщенных (шдких) липидов активность зависит от подвижности полярного фрагмента, а в окружении из насыщенных липидов она лучше корродируется с подвижностью гидрофобного фрагмента белка, регистрируемой с помощью липидного зонда У в аннулярном слое вокруг белка. ;

Ассоциация Са-АТРазы о мембране саркопдазматического рети-кулууьч. Этот вопрос - один из центральных в понимании структуры и функционировании Са-АТФазы. В, настоящем - разделе разработан подход для изучения Ассоциации Са-АТ£азц'(и других мембранных белков), основанный-на-регистрации спин спинового взаимодействия иег.ду метками,: связанными с -белком •''длинными" ножками (мотки типа XIX), расположенными,на соседних молекулах белка. Это взаимодействие обнаруживается по зависимости виртш и формы компонент СТН от количества1 )■ связанных, с-белком меток.-в интервале О I *■' I. ¡¡оказано, что указанная зависимость, несвязана с гетерогенностью. связывшшя или взшшодойствием. маток на одной молекула белка, а'также но может быть результатом диффузиошшх столкновений, спин-моченых белков или статического двпольного взаимо-действая. Зависимость дН( у ) обусловлена взаимодействием между. метками», белковых ■ ьссоциатах, которые ра* рушаотся детергентами, т.е. является-жзковалентшкл.

Путем вычитания" на ЭВ!< определены степень ассоциации Са-АТС-азы в моыбраиа СР и форма "агрегатного", сигнала (рис.8) .Доля ыономероа ( <*-') составляет'при 37°, 20° и 15° соответственно 34,

Рис.б.Форгл кошопонти (>»=+1 спектра ЗЯР,-котки XIX,связанной с Са-АТ$азо0:^ =0,1 (I), 5 =0,95 (2), сигнал от"агрзгатоз". белка с гауссовой сиркной, как у "моно-керного" сигнала (3).

20 и 11%. Форма "агрегатного" сигнала свидетельствует о сравнительно слабом взаимодействии спиновых меток; расстояние мелщу

метками на соседних- молекулах белка не превышает 25-30 Полученные значения близки к данным других методов.

При выяснении функциональной роли обратимой ассоциации Са-АТФазы обнаружено симбатноз уменьшение скорости закачки ионоъ Са и ассоциации белка после обработки мембран СР малыми, носо-лпбилизирующими добавками дезоксихолата Л'а . Уменьшение скорости закачки вызвано не уьеличением пассивной проницаемости мембран СР, а повидимоцу нарушением работы кальциевого насоса. Возможно, что это нарушение связано с уменьшением ассоциации белки, которая влияет на сопряжение транспорта и гидролиза АТФ внутри мономера Са-АТФазы.

Обнаружение и исследование близлежащих 5Н групп Са зависимой УГФазы. Метод обнаружения таких групп основывался на способности нитрозильных соединений двухвалентного железа образовывать комплексы с двумя остатками цистеина г с , дающие ха-

рактерные- спектры ЭПР (Ванин и др.,1977). В работе показано, что аналогичные спектры возникают при взаимодействии с Са-АТФазой, причем в нативных мембранах в образовании ферронитрозильно^о комплекса №Ш участвуют максимально 3 5Н группы, а для солю-билизированной в детергенте мономерной формы белка - две 5Н группы. Этс означает, что ФНК образуется не только с йп группами на одной молекуле белка, но и путем координации ¿И групп от соседних молекул Са-АТ£азы.

Исследование влияния образования ФНК на функционирование Са-АТФазы показало, что блокирование "парных" ЗН групп вызывает ингибирование гидролиза АТФ, а связывание третьей ¿Н группы -разобщение гидролиза и транспорта Са^+. Исходя из этих и литературных данных, можно предположить, что"парныбн 5Н группы находятся в домене Д?, причем одна из них вероятно принадлежит остатку третья ЗН группа повидкмоцу также находится в Д^ или в Са связывающем домене (где имеется только ~ 70).

Форма спектров ЭПР ФНК различна для внутри и межмоле^уляр-ных комплексов, чувствительна к конформациокным состояниям Са-АТФазы, реализующимся а ходе ее рабочего цикла, а такжо дейс*эив детергентов я температуры. Эти данные псказывато возможности использования ЗНК в качестве бифункциональных спиновых меток нового тина для регистрации конформационкых изменений в Са-АТЗаэь.

Глава У1. КШ«Я=МАЦИОННАЯ 'ПОДВИЖНОСТЬ И АССОЦИАЦИИ РОДОПСИНА В ФОТОРЕЦЕГО'ОРНОИ МЕМБРАНЕ

Первичные стадии зрительной рецепции протекают в фоторецеп-торных мембранах (ФМ), основным интегральный белком которых является родопсин. К началу этой работы оставался невыясненным, ряд принципиальных вопросов, существенных для понимания функционирования родопсина; структура и динамика его гидрофильной области, ответственной за взаимодействие с периферическими белками СМ, и характер изменений на этой .поверхности при фотолизе родопсина; возможность ассоциации родопсина в фоторецепторной мембране в темноте и при фотолизе; природа структурных изменена в ФМ при повреждающем действии видимого света. Для решения этих задач в работе была применена ЭПР СПН в сочетании с 'линейной ЭЩ спектроскопией и рядом биохимических и спектральных методов.

Селективное связывание спиновых меток на молекуле родопсина

Изучение кинетики связывания меток Х1У и XIX с,4М показало, что в темноте, модифицируются две 511 группы родопсина. С целы локализации меток на белке была изучена их доступность парамагнитными уширяющим агентам ) и проведен ограниченный протеолиз спин меченого родопсина папаином с последующей регистрацией сигналов ЭПР от фрагментов протеолиза, разделенных методом гель-электрофореза. Из полученных данных следует, что обе 5Н группы находятся с цитоплазматической стороны в гидрофильной области родопсина, во фрагментах Р.^ и ^26' Сопоставление со схемой расположения родопсина в.. (Овчинников и др.,1982 показывает, что более реакционноспособная (.5%) группа принадлежит остатку С-у 5-316, о. другая 5Н группа ( 5Н3) - остатку Ср- 140. '

Ваано отметить, что связывание меток по этим остаткам но изменяет кинетики образования и спада функционально важного кетародопсина II и способности опсина к регенерации с ретиналем.

Дшамака спиновых .леток , связанных с родопсином. Влияние . протоолиза. Знаний кинетических констант связывания меток позволило из экспериментальных спектров ЭПР реконструировать на ЭВМ индивидуальные спектры меток, связанных с каддой из ¿Н 1'рупп. Подвижность обеих меток Х1У и XIX в районе цис-140 выло, чом для цис-316. При отщеплении С-концевого фрагмента £¡/$"322— Л&.-348, а затем петли 0,1и-~237 -241 изменяется подвижность

метки Х1У на обоих остатках цистеина. Изменение подвижности в районе -140, удаленного по аминокислотной последовательности

от С-конца, позволяет предположить, что эти участки на самом доле сближены в пространственной структуре нативного родопсина. Это предположение подтверждают данные, полученные для "длинных" меток XIX. Резкое увеличение их подвижности прй отщеплении конца означает, что в нативноы родопсине их подвижность отери-чески ограничена эти фрагментом.

Обратимая ассоциация родопсина-в СМ в темноте.Проблема агрегации родопсина имеет принци. яальное значение в связи с возможным формированием ионных каналов его олигомерами. В данном разделе с помощью трех независимых методов: I) по уменьшение "сберхмедленной" вращательной подвижности "жестко" связанной о белком метки Х1У; 2) по увеличению спин спинового взаимодействия меяду метками XIX (что проявляется в снятии СВЧ насыщения в кх спектрах ЭПР); 3) путем химических сшивок обнаружена обратимая ассоциация родопсина с локальным максимумом в узком интервале рН 7,2 - 7,8. Для обеих меток эти рН зависимости не связаны с конформационными изменениями белка, поскольку они исчезают в присутствии дигитонина, устраняющего агрегацию белка, но мало изменяющего его конформацис.

Степень ассоциации родопсина возрастает при низких (/¡<0,1) и высоких (/< > 0,3) ионных силах аналогично поведение обратных величин растворимости глобулярных белков. Зависимость ассоциации от рН и ионной силы показывает, что она обусловлена в основном элект ростатическими взаимодействиями между гидрофильными умает-камй молекул родопсина.

Фотоиндуцированные изменения в молекуле родопсина при образовании метародопсина II. Структурные перестройки родопсина при фотолизе играют.основную роль в его функционировании. Ранее эти изменения не удавалось обнаружить методом ЭПР для "жестко" связанных с белком спиновых меток. В настоящей работе это оказалось возможным благодаря регистрации непосредственно кинетики спектральных изменений в условиях СВЧ насыщения (рис.9). Аналогично были определены фотоиндуцированные изменения для "длинных" меток XIX при СВЧ насыщении и в его отсутствие.

Исследование природы этих изменений показало, что дляюба-кх меток на обоих цистеинсвых остатках они обусловлены увеличением вращатольной подвижности.

Сопоставление с параллельно проведенными оптическими измерениями, рН зависимости фотооткликов ( Д1/1), резкое падение

сеет же-1гО 4с-7 о"

«о с««

О.» «,2 1.6 2,0

число меток/мол. родопсина

Рис.9. Зависимость индуцированного светом увеличения амплитуды ■компоненты »» =+1 спектров ЭПР мотки Х1У в условиях СВЧ насыщения от степени модификации родопсина метками: I - суспензия $М, 2 - в присутствии 2% дигитонина. Сплошная линия соответствует расчетной зависимости. Слева - примеры кинетики изменений амплитуды при фиксированном значении магнитного юля в ответ ка включение желтого (фильтр МС-12) и синего (фильтр 5С-7) света.

величин А1/1 в присутствии гидроксиламина, влияние желтой и синей подсветки доказывают, что увеличение вращательной подвижности шток происходит при образовании метародопсина II.

Из анализа зависимостей Д1/1 от числа связанных с белком каток определены относительные изменения времен корреляции ( ) меток на каждой -5Н группе: 21-2455 на Ср-316 и

24-30% для -140 для метки Х1У и 8-11$ и 14-18?, для метки XIX. Увеличение вращательной подвижности "жестко" связанных меток повидимоцу обусловлено разрыхлением экспонированных в водную фазу участков белка, что коррелирует с данными других катодов.

Об ассоциации родопсина а состоянии метародопсина II.

Хотя при обраяовании метародопсина II подвижность маток возрастает ( <0), что не может быть результатом ассоциа-

ции белка, нельзя исключить отрицательного вклада в суммарное значение Л1/1 за счет ассоциации. Ряд специально про-

веденных экспериментов свидетельствует, однако, об отсутствии такой ассоциации: I) б присутствии дигитонина, устраняющая агрегацию родопсина, величины Al/l для меток Х1У и XIX не зоз-растиюг, а уменьшаются; 2) действие дкгитонкиа на взлизины

л 1/1 для "длинных* меток XIX не зависит от количества их на белке, что свидетельствует-Л5 отсутствии спин спинового взаимодействия между'метками при образовании метародопсина П;3)фо-тооткликина метках XIX в отсутствие СБЧ насыщения и в его присутствии примерно одинаковы, хотя'за счет ассоциации они должны быть разного знака или существенно различаться по ве-личи-нр • 4) величины д1/1 линейно зависят от числа связанных мв*">н XIX,хотя при агрегации родопсина эти зависимости должны быть суперлинеиными. Линейная зависимость величин л1/1 от доля обесцвеченного родопсина также говорит о независимых структурных перестройках в каждой молекуле родопсина при фотолизе.

Влияние протеолиза на индуцируемые светом структурное изменения а молекуле родопсина. Ограниченный протеолиз папаином был применен для выяснения роли отдельных доменов белка прг его перестройке в метародопсин II. Из анализа зависимостей величин

4 I/I от степени протеолиза и числа связанных меток с использованием кинетических констант связывания были определены величины фотоиндуцированных изменений подвижности отдельно для меток на <?yJ~3l6 и Cy¡ -140 для каждого протеолитического фрагмента белка (см.таблицу ).•

Из полученных данных следует, во-первых, что фотоиндуциро-ванные перестройки вблизи остатка C^s -НО чувствительны к отщеплению С-кокца. Этот результат согласуется с отмоченным ранее влиянием С-конца на подвижность меток Х1У и XIX, связанных с этим остатком в темновом родопсине и свидетельствует о пространственной близости этих участков белка.

Во-вторых, конформационные изменения, регистрируемые "кест-'ко" связанными метками Х1У, не ослабляются, а наоборот несколько возрастают при отщеплении С-конца и пентапептидной neiwi, Особый интерес представляет тот факт, что конформационные изменения в результате изомеризации ретиналя, расположенного в гидрофобной зоне фрагмента Pj<>, передаются на поверхн~сть валентно не связанного с ним фрагмента ?2б, к остатку cyS -140. Невидимому, такая передача осуществляется за счет вандервальсовых

Таблица

Фотоиндуцированные изменения времен -корреляции вращения "коротких" (Х1У) И "длинных" (XIX) меток, связанных с родопсином и

'его фрагментами

Полипептид

Метка Х1У

цис-316

цис-140

Метка, XIX

цис~31б цис-140

Родопсин Гз4

Г26 Г12

36^2 17±5

4ßi3

24^2 52±4 ■ 45^3

14±2

е±5

3±2

25-4 24^3 2il

взаимодействий ыезду оС ~ спиралями родопсина, а возрастание фотооткликов обусловлено компактизациой и увеличением кооперативное™ в изолированных доменах.

Из данных по влиянию протеолиза на подвижность "длинных" меток XIX следует, что при переходе в метародолсин II для метки, связанной с -316, уменьшается взаимодействие с С-концом и пентапептидной петлей. Для изменения подвижност i метки, связанной с ¿у!-140, существенно в основном взаимодействие с петлей, так как только при её отщеш:знии фотсотклик резко падает.

Нообряулмпя агрегация родопсина по,", действием видимого света. В настоящем раздело исследованы структурные изменения в С!.! под действием больших доз видимого света, приводящих к повреждении органов зрения. Параллельно с подзкгностью родопсина регистрировали шкровязкоеть липидного слоя с помощью зонда XIII. Кроме того, измеряли уровни перекисного окисления яипидов по концентрации ыалоновго диальдегида (ЫДА) и окисления ¿11 групп белка, а также концентрацию олигонзрных форм родопсина - методом

электрофореза.*'"

При длительном освещении iM. форма линейках спектров ЭПР

ттки Х1У но меняется, но возрастают параметры к i-'/L спектров ЭПР ПИ. Симбатно происходит накопление МДА. и окисление SH групп (ряс. 10). После обработки 5М дтитонином фотоокисление зц групп происходит с еще большей скоростью, однако изменения в

х/ Измерения проведены » совместной работе /II/ И.Д.Пого*еиой и И.Федорович.

спектрах ЭПР ПН отсутствуют. Из этих результатов следует, что рост параметров ПН вызван не увеличением Т| за счет расходования кислорода при фотоокислении ®4, а уменьшением вращательной подвижности сипн-моченого родопсина (рис.Ю), причем это умен вение подвижности не связано о образованием внутримолекулярных сшивок при окислении оН групп.

"В

9

60 80

Время освещения ,мин

Рис.10. Структурные изменения в й! при освещении видимым светом, освещенность Х.б'Ю^лк.рЙ 8,0;20°С .А - изменение времени корреляции вращения метки Х1У, связанной с родопсином (1-3) ч числа

5Н гругт (4,5); 1,4 - нативные ФМ; 3 - 5.'.!, предобработанные ПХЫВ (модифицировано 5 £Н групп на молекулу белка); 2,5 -экстраты родопсина в Iдигитонине. В - зависимость параметров (1-3) идН,,'1>(4) зонда У,введенного в ФМ от временя освещения; 1,4 - нативные ФИ, а - в присутствии КГ^М дибунола, 3 -после предварительной модификации ПХМБ.

Уменьшение подвижности спкн-мзченого родопсина нельзя объяснить и изменениями в липидном слое £М, так как микровжэкость этого слоя при длительном освещении <Ш уменьшается. Таким образом, падение вращательной подвижности спин-меченого родопсина обусловлено его агрегацией. Этот вывод, а также необрат мый характер агрегации подтверждаются данными гель-электрофореза, белков Ш в присутствии додецилсульфата //в.: при длительном облучении уменьшается доля мономерных форм и возрастает концентрация олигсмерных форм родопсина.

Для выяснения природы образующихся агрегатов родопсин перед облучением модифицировали 5Н реагентами различной структуры. Оказалось, что модификация гидрофильными 5Н реагентами ( Ц-матил малеимидом, метками) не влияла на агрегации, в т время как блокирование- п~хдор меркурбензоатом 5 "гидрофобных"

Н групп родопсина полностью ее предотвращало (рис.10), т.е. олигомеры образуются за счет 5-5 связей между 'гидрофобными" $Н группами белка.

Обнаруженное увеличение подвижности в липидном слое также снимается предобработкой 11ХМБ, т.е. оно вызвано агрегацией белка повидимому за счет уменьшения числа беяок-ятидшх контактов при образовании агрегатов.

Структурше изменения при-фотоокисяении 5М существенно отличается-от изменеиий при темновом Г-е асхорбат зависимо»! окислении 5!,'., что повидимому связано с различной:эффективностью окисления лигыдое и белка в этих,процессах;,так, при/одинаковой степени олигомеризации в случае тешового окисления микровязкость л..пидой не падает, а возрастает; вращательная подвижность белка-уменьшается значительно сильнее, чем при фотоокисле'нм»\сС/'и'1> соответственно 20 и 3) вследствие агрегации а повышения вязкости липидного окружения.

Влияние агрегации на локальную конФормацИоннуто подвижность в родопсине. Вращательная подвижность - метки, связанной с <^>-140 ■ при фотоокислеиии ® падает в значительно большей степени, чем у. мегки, связанной с- <^3-316; соответственно в 5,6 и 2,7 раза. Поскольку при затормаживании вращения всего белка изменения величин /Г для меток ка .обоих остатках должны Сыть, близки,этот • результат означает, что агрегация белка сопроас дается внутримолекулярными перестройками, приводящими к уменьшению локальной подвндности белка, более выр'жонному вблизи остатка цис-140. Учитывая,'что агрегация родопсина приводит к потере его способности к регенерации (Погожева, 1985), можно предположить, что уменьшение внутримолекулярной'подвижности родопсина может быть одним из основных механизмов его инактивации.

, ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом,, в работе развиты новые экспериментальные и теоретические подходы для изучения "сверхмедленных" молекулярных вращений в диапазоне времен корреляции 10С помощью этих подходов получен ряд существенных результатов для модельных систем: определены частоты и анизотропия молекулярных вращений спиновых зондов в стеклующихся органических жидкостях и полимерах, выявлены динамическая гетерогенность и корреляция между вращательной подвижностью и скоростью реакций в стеклообразных .полимерных матрицах; установлены характер встраивания и механизм

переориентация примесных молекул в ленгмировских цультислоях липидов.

Основное внимание в диссертации уделено исследованию интегральных мембранных белков:'Са зависимой АТФазы в мембранах сар--коплазматического ретикулума и протеолипосомах, и родопсина в фоторецепторных мембранах. Именно использование ЭПР СГ1Н в сочетании с обычной ЭПР с. зктроскопией позволило получить для этих систем новую, трудно доступнуг другими физическими методами информацию о пространственной структуре внутримолекулярной подвижности, конформационных перестройках, белок-белковых и болок-липидных взаимодействиях, а также выявить в ряде случаев связь мелццг этими параметрами и функциональными характеристиками мембранных белков.

Перспективы дальнейших применений ЭПР СПИ к исследованию ■биомембрал, как нам представляется, связаны, во-первых, с развитием аппаратурных возможностей (в частности, использованием имг.. льсных методов и 2мм диапазона СВТ!), а также с применением специальных, селективных и изотопно замещенных спиновых меток.

основные вывода

1. Развиты методы расчета спектров ЭПР с переносом СВЧ насыщения нитроксильных спиновых меток и зондов в модели скачкообразного вращения в интервале времен корреляции с. Сформулированы физические механизмы чувствительности к "сверх-медлекным" вращениям и предложены модуляционные метода регистрации этих движений.

2. Теоретически и экспериментально развит подход для регистрации "Сверхмедлечных" вращений спиновых меток и зондов в диапазоне 10"ГС ¿Ю^с, основанный на измерении факторов СВЧ насыщения первой гармоники сигнала поглощения. Преимуществами метода при исследовании биомембран и белков являются сохранение чувствительности по концентрации спиноз и возможность определения частот вращений в сложном спектре в присутствии оигнелов от слабо иммобилизованных меток.

'3. Теоретически и экспериментально развиты подхода для определения анизотропии "сзерхме,пленных" молекулярных вращений го спектрам ЭПР ПИ в Зек и 2мм диапазонах СВЧ. С помощью утих подходов обнаружены эффекты размораживания анизотропных вращений и увеличения скорости спин решеточной релаксации для ряда нитрп-

- за •

ксильких радикалов в стеклующихся органических жидкостях.

4. Предложен и теоретически обоснован подход для разделения амплитудных и частотных параметров молекулярного вращения, основанный на одновременном анализе спектров ЭПР ПН и линейных ЭГГР спиновых меток и зондов.

5. С помощью спиновых зондов обнаружена фазовая гетерогенность в ленгмюровоких цультислоях стеарата бария и стеариновой кислоты. Определены ориентация и конформация зондов и предложена модель их расположения в »^гльтислое.

6. В результате теоретического моделирования линейных спектров ЭПР и спектров ЭПР ПН спиновых зовдов в рамках различных моделей молекулярного вращения выявлен характер их движения в ^ультяслое: быстрые колебания в потенциальной яме и случайные повороты из неч. Определены амплитудные и частотные параметры этого движения и показано наличие висящего от температуры распределения по глубинам потенциальных-ям. По своим динамически м параметрам ленгмюровские мультислои близки к молекулярным,

а нэ жидким кристаллам.

7. В полимерах вблизи и ниже точки стеклования обнаружено распределение по временам корреляций вращзния спиношх зондов, ширина которого увеличивается при понижении температуры. Абсолютные значения времен корреляции соответствуют мелкомасштабной динамике полимерных цепей.

8. В пластифицированных полимерных матрицах обнаружена супердинойноя корреляция ме-ду средними частотами вращения спиновых зондов и константами скоростей фотосзнсибилизированно-го восстановления в области "сверхыедленных" и медленных вращений и линейная корреляция в области быстрых вращений.

9. Развит подход для расчета спектров ЭПР ПН спин-мечегшх белков в• модели•непрерывной вращательной диффузии, основанный на непосредственном интегрировании временной сиатет уравнений Блоха. Путем моделирования линейных спектров ЭПР и спектров ЭПР Ш! определены релаксационные параметры спиновых юток. Показано, что эти параметры и их зависимость от вязкости характеризуют локальное белковое окружение меток.

10. Из анализа "линейных" спектров ЭПР дейгерозамеценной спиновой метки установлен характер её движения относительно белка, представляющего собой ограниченные по углу вращательные переориентации. Оценены амплитудные и частотные параметры этогс движения.

11. Изучена молекулярная 'динамика Са зависимой АТФазы в натнвных мембранах саркоплаэматического ретикулума и протеолипо-сомах из посторонних липидов с помощью спиновых меток, избирательно связанных с различными 5Н группами белка. Показано, что регистрируемая по спектрам ЭПР ПН подвижность лежит в микросекундном диапазоне времен корреляции и по крайней мере для меток на некоторых 5Н групп ;х обусловлена внутримолекулярной подвижностью полярного фрагмента бел "а. Эта подвижность неодинакова в различных участках белка, не зависит от его концентрации в мембране, но чувствительна к взаимодействию с субстратами и лилид-ному окружению. Внутримолекулярная подвижность коррелирует с ферментативной активностью при выделении фермента из разных источников, иммобилизации, варьировании липидного состава и температуры.

12. 1 азвит новый подход для изучения ассоциаций белков в мембране, основанный на регистрации спин спинового взаимодействия :1еяду метками, слабо йммобилизованниш на соседних молекулах белка. Определена степень ассоциации Са-АТФазь; в мембране саркоплаэматического ретикулума при нескольких температурах. Показано, что уменьшение степени ассоциации под действием малых концентраций детер1 ;нта сопровождается уменьшением скорости закачки ионов Са, что вызвано не пассивной утечкой этих ионоз, а нарушением работы Са насоса,

13. С помощью ферронитрозильных комплексов обнаружены близлежащие 5Н группы в Са-АТФазе СР, связывание которых ингибируе'. активность фермента. Показана чувствительность форш спектра ЭПР ферронитрозильного комплекса с Са—АТФ&зой к конформационноьф* состоянию белка, действии детергентов и температура, что позволяет использовать утот комплекс как спиновую метку нового типа для регистрации информационных изменений в Са-АТФазе,

14. Проведено селективное связывание спиновых меток и установлена их локализация на молекуле родопсина путем ант. за спектров ЭПР от протеолитических фрагментов спин меченого белка. Модификация родопсина метками по остаткам С^-НО и С^З-316 не нарушает его функциональных свойств: кинетики образования -распада метародопсина II и способности к регенерации.

15. Обнаружена обратимая агрегация родопсина в фоторецепто-рной мембране в темноте с максимумом агрегации при фигиояогччес-

ких значениях рН. Зависимость агрегации от рН и ионной-силы сви-

детельствует о преобладающем электрлстатическом характере белок белковых взаимодействий. Показано, что при образовании под действием света метародопсина II степень ассоциации белка не изменяется.

16. По спектрам ЭПР и ЭПР ПН спиновых меток, сильно и слабо иммобилизованных на молекуле родопсина, обнаружено увеличение вращательной подвижности меток при образовании метародопсина II, Исследование влияния протеолиза показало, что наряду с "разрыхлением" структуры белка эти изменения обусловлены смещением" С-концевого фрагмента от областей связывания метек. Конформа-ционные изменения в этих областях, индуцируемые фотоизомеризацией ретиналя, сохраняются при расщеплении родопсина на два валентно не связанных фрагмента.

IV. При.длительном освещении фоторецепторных мембран обнаружено уменьшение вращательной подвижности спин-меченого родопсина, обусловленное его необратимой агрегацией. Показано, что агрегаты образуются за счет межмолекулпрных дисульфидных сшвок между "гидрофобными" цнетеиновиш остатками. В отличие от темне-• вого окисления фотоокисление <51,Î сопровождается уменьшением микровязкости липидного слоя вследствие уменьшения белок-липидных взаимодействий при агрегации. Обнаружены изменения в нутрий-молекул ярн ей подвижности родопсина при его необратимой агрегации, . которые являются возможной причиной утраты его способности к регенерации.

Основные результаты диссертаций изложены в следующих публикациях: -г

1. Лившиц S.A. Медленное анизотропное вращение в спектрах электронного парамагнитного резонанса яитроксильных радикалов./Д. физич. >П1М. -I97l. . -Т. ЬО. -№3.-С.606; полностью депонировано в ВИНИТИ з . № 2876-75 от 9.12.1975.

2. Livuhitg V.A. Slow ani во tropic tufflbling in ESR spec'tra o.i ni-troxyl radicale.// J.Magn.Ses.-1976.-V.2A.P Э07-Э13

3. Лившиц В.А. Использо" яние эффектов СВЧ насыщения для изучения медленного скачкообразного вращения нитроксильньк радикалов.// Теор. и экспер.хим.-1977.-ТЛЗ.-КЗ.-€.363-370.

4. Ливгшц S.A. Применение модуляционных методов для изучения, ксдаетих вращений нйтроксильных радикалов./Двор, и экспер.хим.-1977. -Т. 13. -JP6, -С. 780-780..

5. Livshite V.A,(Kuzjieteov V.A. Spin label. study of slow wolecu-•!вг «tattone ty.u&e of ESR saturation effecte.//ln "Magnetic re-

eariarioe and related phenoaenA.Proceedings ol' the XX Congress ¿»rBas.-T-eiiirm.-i^s.-f.sie

ô.Uvohita Y.A.. .Krinichni V.I i.Kuznetsov A.N. A study of the character of molecular rotation of nttroxyl radicals in liquids by ESfl and dielectric relaxarion methods.// Chem.Phya.Lett.-1977.-V.45.-?.541-543

7. Лившиц В.А..Криничный В.И..Кузнецов A.M. Исследование характера быстрого броуновского вращения нитроксильных радикалов в жидкостях методами диэ~ектрнческой релаксации и ЭПР.//К.физич. хим.-1977.-Т. ÍjI.-С.2120-21?!.

Ö-. Анциферова Л.И. ,Вассерман A.M. .Иванова А.Н.,Лившиц В.А., Назймец U.C. Атлас спектров электронного парамагнитного резонанса спиновых меток и зондов.ff\k.-Наука.-1977.-C.IôO.

9. Лившиц В.А..Кузнецов В.А. Изучение сверкмедлекных вращений белков путем использования эффектов с-ерхвысокочастотного ньоыщения в их спектрах ЭПР. - Мол.биол.//1900.-Т.14.-Й.-

С. 162-189

10. Кузнецов В.А.,Ыаксина А.Г..Лившиц В.А.,Азизова O.A.,Владимиров Ю.А. Изучение Ca**4" зависимой АТФазы саркоплазматичес-кого ретикулума с помощью избирательно связанных спиновых меток . /Д'юл.биол. -IS8I. -Т. 15. -»3. -С. 668-679.

11. Погожева И.Д..Кузнецов В.А..Федорович И.Б..Лившиц В.А.. Островский М.А. Агрегация молекул родопсина при поврезде щем действии света на фоторецепторные мембраны.//Биофизика.-1981.-Т,2о.-№4.-С.592-700.

12. Лившиц 3.А..Погожева И.Д. .Кузнецов В.А..Федорович И.Б., Островский М.А. исследование агрегации молекул родопсина в фоторецепторных мембранах с использованием ЭПР спектроскопии переноса СВЧ насыщения././Тезисы докл.1 Всесоюзн.биофизич.съезда. -Ы.-1982.-Т.2.-С.78-79.

13. Лившиц В.А. ЭПР .спектроскопия переноса СВЧ насыщения в исследовании молекулярной подвижности белков в биомембранах.// Тезисы пленарных докладов I Всесоюзн.съезда.-M.-1962.-С.Í&9,

14. Лившиц В.А..Кузнецов В.А..Иванова Т.О. Исследование обратимой агрегации Ca зависимой АИазы саркоплазматического ретикулума методов спиновых меток./Дезисы докл.1 Всесоюзн.биофизич. съезда. -T.I.-С.233-234. t

15. Кузнецов В.А..Максима А.Г..Лиажиц Б.А..Азчзова O.A..Владимиров Ю.А. Исследование кснфсрчяциокноП подвижности Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума методов ЭПР спектроскопии переноса СВЧ насыщения.//Тезисы докл. I Всесовэн.биофкздч.съззда.-К.-1982.-T.I.-С.237.

16. Погокева И.Д..Кузнецов В.А..Ливгоиц'В.А..Федорович И.Б., Островский К.А. Обратимая,' зависимая от р!! агрегация молекул родопсина в фотдрецепторных мембранах.//До,кл. AH CCCP.-I98I.-Т.260.-№5.-С.1254-1258.

17. Бобров ¡O.A. »Лившиц В.А. Исследование ориентированных муль-тислоев липидов методом спинового зонда.I.Микрогегерогенность и молекулярная диффузия в двухкомпонентных слоях стеарата бария-стеариновой кислоты./Д.физич.хим.-1962.-Т.йо.-Ш.-

С .1703-1707.

1С. Липшиц В.А.,Бобров ¡O.A..Сатинов Л.Д. Исследование ориентированны* ленгморовских мультислоев липидсв. Сравнение данных ЗПР от разных зондов и ИК спектроскопии./Дезисы докл. Бее союзной конференции по нитроксильним'-радикалам.-Черноголовка.-I9Ö2.-C.I0Q-I0I.

19. Лившиц В.А. Изучение мембранных белков-методом спиновых меток./Деэиеы докл.Всесоюзн.конференции'по нэтроксильним; ра- *• дккалам.-Черноголовка.-I9S2. -С.85-86.

20. Лившиц В,А..Кузнецов В.А..Варшзкова И.П. »Вассерман A.M. .Сьерхмодденныа вращения спиновах зондор в твердых полимерах.- ' Високомол. соед.-I9S2. -Т. 24-А. . -С. 1085-1093.,

21.Дздали A.A. »Вассерман 'A.M. ,1^узнецов В.А. .Смирнов D.H., Иржак В.И.»Лившиц В.А..Розенберг Б.А, Исследование движений спинового зонда в опоксидных смолах методом ЗГ? спектроскопии с переносом насыщения./Дезиса докл.Всесогозн.коиф.по нагро-ксильшы радикалам.-Чзрногг ловка.-1982.-С.77. -

22. БаршякоЕа И,Г..Кузнецов В.А.»Лившиц В.А.»Вассерман A.M. Исследование свсрхмсддетшх движений спинового зонда в по-лнь-.орах./Дезиш докл.Всесоюэн.конф.по нитроксильным радикалам.-Черноголовка. -1982. -С .76.

23. Лившиц В.А. Применение ЭПР спектроскопии переноса насыщения для изучения молекулярной подвижности мембранных белков.// Иол. биол. -1983. -Т. 17. -Н. -С. 714-725.

24. Ритое В.Б. .Цурзахметова К.И. .Лившиц В.А. .Кузнецов В.А.. Азизоза O.A..Максина А.Г. Конформационная подвижность и ферментативная активность Са-АТФазы -саркоплазматического ретикулу-кз. //Биохимия. -1983. -Т. 40. ~№3. -С. 415-424.

25. Погояева И.Д. .Кузнецов В.А.»Лившиц В.А.»Федорович И.Б., Островский H.A. Исследование методом ЭПР спектроскопии переноса насыщения фотонндуцированных изменений в фоторецепторкых мембранах палочек сетчатки./Дезисы докл.1(5-й коиф.ФЕБ0.-М.-I9S4.-C .344.

26. Лившиц В.А. .Бобров Ю.А. Анизотропное пращен'ие спиновых зондов в спектрах Э1ТР с переносом СВЧ насы'цения./Деэисы докл. Всесоюзн.конф.по магнитному резонансу в конденсяровантдс средах (физические аспекты).-Казань.-1984.-Ч.П.-С.124.

27. Бобров Ю.А.,Лившиц Б.А. Ориентация и вращательная подвижность спиновых зондов в ленгмюрозских культислоях липядоз.// Тезисы докл.Всесоюзнл^нф.по магнитному резонансу в конденсированных средах (физические .спекты).-Казань.-1984.-Ч.II.--С.Г25.

20. Погожева И.Д..Кузнецов,В.А..Лившиц В.А..Федорович И.5., Островский 41.А. Исследование агрегации молекул родопсина при повреждающем действии света на фотор*цепторные мембраны.//Гв-зигм докл.II Всесоюзного симпозиума по применению магнитного резонанса в биологии и медицине',-Звенигород,-1981.-С.273-274.

29. Иогожева И.Д. .Кузнецов В.А..,Лившкц Б.А. .Федорович И.В., Островский М.А. Фотоиндуцированкые изменения в гидрофильной обл, ли молекулы родопсина. Исследование методом ЭЯР спекгро-скогии с переносом насыщения.//Биологические мембраны.-1985.-Т. 2. -№. -С. 880-896. ,

30. Погожева И.Д..Кузнецов Б.А,.Лившиц 3.А..Островский ,ч.А. Конформаг онная подвижность и взаимодействие доменов родопсина. //Биологически в 'мембраны.-1985.-7.2.-5Р9.-С.897-905.

31. Кулагина Т.П. .Иванова А.Н..-Лившиц В.А. .Кузнецов В.А. ' Исследование сверхмедяегеых вращений глобулярных белкой методом ЭПР спектроскопии с переносом насыщения..//Тезисы докл.II Всесоюэн.симпозиума по применению магнитного, резонанса в о'ио--логин и медицине.-Звенигород.-1981.-С.Й93-294.

32. Иванова Т.О.'»Лившиц Б.А. .Кузнецов В.А. Исследование влияния магнитного поля на ферментатигнув активность и транспорт ионов Са зависимой АТФязой саркотлазматического ретикулума.// Биофизика. -1984.-Т.29,-М.-С.697, статья• полностью депоннрмт-на в адата за » 2443-04 от 18.04.1984.. '

33. Бобров В.А.,Лившц Б.А. Определение орияктации и конформа-цки спиновых зондов ь ленгмюровекнх 1<ульт1'.слоях лигсндо». Бчо- ' $кзйха.-1984.--Т.29.-№4.-С.696, статья яозг»ос?ьв деионвровм» в' ШШ за '¿445-М.

34. Бобров Б,А. .Лившиц В.А. Молекулярная подвижность спкьойцх зондов в ленгашровских мультислоях дипидов.//Биофизика,-1984.-

Т.29.-М.-0.596, статья полностью депонирована в ШМТИ за !Й444-84,

35. Лкскиц В.А.,Бобров Ю.А. Анализ анизотропии вращения спиновых 'зондов по спектрам ЭП? с переносом насыщения.//Тоср. и экспер. хим.-1905.-Т. 22. -'КЗ.-С. 331-336.

36. Лившиц В.А,.Кузнецов В.А. Относительное движение спиновой метки,ковалентко связанной с белком./Д.физич.хим.-1906.-Т.60.-№.-С.1304-1306.

37. Лившиц В.А.,Бобров Ю.А..Кулагина Т.П. О возможности разделения амплитудных и частотных параметров молекулярного вращения с помощью ЭПР спектроскопии с переносом СВЧ насыщения.//Ж.физич. хим.-1966.-Т. 60.-.W.-С Л817-1820.

ЗП. Кулагина Т.П.. .Иванова А.Н.,Лившиц В.А. Изучение медленных молекулярных вращений спин меченых белков методом ЭПР спектроскопии перекоса насыщения.!.Расчет формы спектров путем решения временных ¿'равнений Блоха./А.фиоич.хим.-1987.-Т.61.-№5.-С. 1616-1620.

39. Лившиц В.А..Кузнецов В.А..Кулагина Т.П. Изучение медленных молекулярных вращений спин меченых белков методом ЭПР спектроскопии переноса насыщения.П.Релаксационные параметры

■ спиновых меток./Д.фиэич.хим.-1987.-Т,61.-Х,'6.-С.1621-1С28.

40. Лившиц В.А. Конформэционная подвижность и ассоциация мембранных белков.//В кн. Метод спиновых меток и зондов. Проблеш и перспективы.-Под ред..4.М.Эммануэля.-М.-Наука.-1986.-С.79-105.

41. Лившиц В,А..Иванова Т.О. .Кузнецов В.А. Исс едование обратимой ассоциации Са зависимой АТФазы в мембране- саркоплаэмати-чсского ретикулума методом пиновых меток. //Известия. АН СССР,-Сер. биол, -I9BS. - £6. -С. 857-865.

• 42. Афонин В.В..Кузнецов В.А.,Бэгар В.А..Лившиц В.А. Исследование близко расположенных SH групп Са, Mg зависимой АТФ-аги саркопле.зыатичоского ретикулума ¿.помощью избирательно связывающих с белком нитрозильных комплексов железа. Биологи-ческио мо мбр аны.-Т.2.-1988.~Т.5.-МI.-С.1145-1151.

43. Кршшчный В. И. .Гринберг О.Я. .Дубинский А.А.,Ли вптц В.А., Бобров Ю.А..Лебедев Я.С. Исследование анизотропных молекулярных сращения с помощь® ЭПР спектроскопии с переносом СВЧ насыщения в 2мм диапазоне СВЧ.//Биофизика.-1987.-Т.32.-IR3.-С.534-535.статья полностью депонирована в ВИНИТИ за $ 1497-3-87,

44. Афонин Б.В..Кузнецов В.А. «Лившиц В.А. Обнаружение и исследование "парных" SH групп Са зависимой АТФазы сарцоплазмати-ческого р? т яхулуиа.//Г е о и сы докл.Советско-Швейцарского сиыпозн-

, ума "Екоясгкчвекяе мембраны". Структура и функции".-Рига.-1988.-C.23I.

45. Лившиц В. А., Погожева И. Д., Кузнецов В. А., Ост-

и-ч-кий М. А. ЭПР спектроскопия с переносом насыщения в сследовании молекулярной динамики родопсина в фоторе-епторных мембранах. // В кн. «Биомакро.чолекулы в методе п.шовых меток и зондов».— М.— Наука.— 1988.— С. 127—

оо. '

•46. М-:тпинцеп П. И., Кузнецов В. А., Лившиц В. А. Ис-

ледоганпе к

инетики фотосенснбилизированного восстановле-и молскулчрпг.г; динамики в полимерных матрицах. // К. физич. хим.— 1989,— Т. 63.— № 12,—С.

¡9569. По-и. в печать 11.12.89 г. Заказ 715. Объем 2 п. л. Тир. 100.

Типография МАТИ. Ульяновская, 13.