Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование структуры и функций Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума методом люминесценции и ЭПР

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Котельникова, Раиса Алексеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ДИССЕРТАЦИИ

ВВЕДЕНИЕ. . в

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Современные представления о строении и механизме действия Са2+-АТФазы СР. . ♦

2. Исследование Са2+-АТФазы СР методом люминесценции.

3. Исследование-структуры Са2+-АТФазы методом спиновых зондов.

ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

1. Основные реактивы «••*••••».*•••••

2. Выделение СР •••••••.•••.••••

3. Получение Са2*-АТФазы

4. Определение АТФазной активности

5. Исследование кинетики затухания фосфоресценции эритрозина и эозина

6. Определение степени гидрофобности нитроксильных радикалов

7. Исследование собственной фосфоресценции СР

8. Измерение флуоресценции триптофановых остатков

СР и Са2+-АТФазы

9. Регистрация спектров поглощения исследуемых препаратов •••••

10. Исследование действия биологически-активных соединений на мембрану СР и Са2+-АТФазу методом ЭПР.

11. Метод химической модификации триптофановых остатков с помощью N -бромсукцинимида

12. Определение тиоловых групп СР и Са2+-АТФазы методом Эллмана-Бенеша

ГЛАВА Ш. ИЗУЧЕНИЕ СТРОЕНИЯ КАТАЛИТИЧЕСКИ-АКТИВНОГО

ЦЕНТРА Са2+-АТФазы МЕТОДОМ ТРИПЛЕТНЫХ ЗОНДОВ

1. О методе фосфоресценции • • •

2. О методе триплетных зондов

3. Определение локализации каталитически-активного центра Са2+-АТФазы относительно мембраны СР

Определение взаимного расположения мест связывания АТФ, Мф, , Са2+ в каталитически-активном центре Са2+-АТФазы СР

ГЛАВА 1У. ИССЛЕДОВАНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ ТРИПТОФАНОВЫХ ОСТАТКОВ В МЕМБРАНЕ СР И Са2+-АТФазе

1. Определение вклада отдельных триптофановых остатков Са2+-АТФазы в собственную флуоресценцию

2. Исследование локализации триптофановых остатков в районе активного центра Са2+-АТФазы СР

3. Исследование взаимного расположения триптофановых остатков Сас -АТФазы и мест связывания ионов Са^т методом флуоресценции

Участие триптофановых остатков Са -АТФазы СР в механизме активного транспорта Са^т

5. Определение взаимного расположения триптофановых остатков и мест связывания ионов Са2+ и Мс|. в Са2+-АТФазе СР

6. Исследование взаимодействия АТФ с Са2+-АТФазой СР по изменению параметров фосфоресценции триптофановых остатков фермента

ГЛАВА У . ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ МЕХАНИЗМА

ДЕЙСТВИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА МЕЖРАНУ СР И Са2+-АТФазу

1. Исследование механизма действия неорганических соединений платины и палладия на везикулы СР

2. Изучение механизма взаимодействия комплексов платина-альбумин и палладий-альбумин с Са2+-АТФа-зой СР

3. Исследование механизма действия 5-сульфо-8-меркап-тохинолиновых производных платины и палладия на препараты Са2+-АТФазы СР

Изучение механизма действия на мембраны СР психотропных соединений .•

5. Исследование влияния соединений Ве на мембраны

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование структуры и функций Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума методом люминесценции и ЭПР"

Транспортные АТФазы играют существенную роль в организме. Их функция заключается в осуществлении активного транспорта ионов и протонов через мембраны против градиента концентрации за счет химической энергии АТФ. Транспортные АТФазы обеспечивают протекание таких важных биологических процессов, как проведение нервного импульса, запасание информации в нервной клетке, сокращение мышц, стимуляция процессов биосинтеза и т.д. В силу этих причин в последнее время возрос интерес к изучению транспортных АТФаз - их строения, молекулярной организации и механизма их действия. Однако на пути биофизических исследований этих ферментов встречается ряд трудностей, в частности, транспортные АТФазы представляют собой белковые компоненты, функционирующие лишь в составе мембран. Это условие затрудняет получение их в кристаллической форме и применение для изучения этих ферментов наиболее информативного физического метода рентгеноструктурного анализа. Использование других физических методов ( ЯМР, ЭПР, оптической спектроскопии) часто бывает весьма ограничено в силу сложности строения изучаемых объектов и малых концентраций получаемых препаратов.

В связи с этим при исследовании молекулярной структуры и принципов действия мембранных ферментов возникает потребность в разработке и применении новых физических методов и подходов, позволяющих получать необходимую информацию.

Объектом исследования настоящей работы является транспортная Са2+-АТФаза СР.Изучение строения и механизма действия Са2+-АТФазы представляет большой научный интерес по целому ряду причин. Во-первых, этот фермент выполняет одну из важнейших функций в организме: поддерживает низкий уровень внутриклеточного

М) за счет активного переноса Са2+ через мембрану при высоком уровне этого иона в окружающей среде (3*10"^ М). Это обеспечивает осуществление мышечной подвижности, стимуляцию процессов биосинтеза, проведение нервного импульса и ряд других биологических процессов /6/. Во-вторых, Са2+-АТФаза представляет собой самую простую систему биоэнергетического сопряжения: с помощью этого фермента, состоящего из одной полипип-тидной цепи, химическая энергия АТФ превращается в энергию осмотической работы по переносу ионов Са2+ из области меньшей в область большей концентрации. В-третьих, Са2+-АТФаза представляет собой пример мембранного фермента, изучение которого полезно для понимания общих закономерностей функционирования транспортных АТФаз и других мембраносвязанных белков.

К настоящему моменту сформулирована принципиальная схема химических процессов, происходящих в мембране СР с участием Са2+-АТФазы; зарегистрировано взаимодействие с ферментом ионов Са2+ и Мд. , участвующих в ферментативном процессе. По результатам исследований составлена блок-схема работы фермента /10,18/. Однако конкретные данные о пространственной организации функционально важных активных групп, о пространственном расположении каталитически-активного центра, о расположении отдельных аминокислот, об участии их в каталитической реакции Са2+-АТФазы, в 2+ активном транспорте Са т получить с помощью традиционных методов флуоресценции и ЭПР до настоящего времени не удавалось.

В связи с этим в настоящей работе развивается оригинальный метод исследования биологических систем - метод фосфоресценции. До последнего времени явление собственной фосфоресценции белков при изучении биологических объектов применялось довольно ограниченно. В имеющихся работах исследовались такие параметры собственной фосфоресценции биологических объектов, как форма и амплитуда спектров в зависимости от изучаемого объекта и условий эксперимента /7,8/, Однако эти исследования носили в основном качественный характер, в то же время такие параметры фосфоресценции, как времена жизни, изменяющиеся в диапазоне 10"^ - 10* с, скорость тушения триплетного возбужденного состояния позволяют существенно расширить информативность метода при изучении биологических систем.

Задачи исследования настоящей работы:

1. Развитие оригинального метода триплетных зондов применительно к исследованию локализации каталитически-активного центра Са2+-АТФазы относительно липидной матрицы мембраны и мест связывания функционально-важных ионов па и Са •

2. Изучение пространственного расположения триптофановых

M 2+ остатков Сас -АТФазы СР отпосительно центров связывания Гш и Са2+ на основании анализа кинетики тушения собственной фосфоресценции белка парамагнитными ионами и исследование дезактивации возбужденного синглетного состояния триптофановых остатков белка ионами редкоземельных элементов.

3. Исследование изменения конформации Са2+-АТФазы в момент образования фермент-субстратного комплекса по изменению параметров собственной фосфоресценции фермента.

4-. Разработка методики определения квантового выхода флуоресценции отдельных триптофановых остатков мембраносвязанных ферментов на примере Са^ -АТФазы СР.

5. Выяснение механизма действия физиологически-активных соединений на мембрану СР с помощью физических методов люминесценции и ЭПР.

Предлагаемая диссертационная работа состоит из пяти глав.

Первая глава посвящена анализу современных сведений о строении и механизме действия Са&-АТФазы, полученных физическими методами люминесценции и ЭПР.

Во второй главе приводится описание методик, применяемых для решения поставленных задач.

В третьей главе с помощью триплетных зондов определяется локализация каталитически-активного центра Са2+-АТФазы относительно липидного бислоя мембраны СР и расположение центров связывания Са2+ и М(|, относительно АТФ.

Четвертая глава посвящена определению квантового выхода флуоресценции и пространственного расположения триптофановых остатков Са4"-АТФазы, их участия в формировании активного центра фермента и Са&т-транспортирующего канала. Эта задача решалась с помощью комбинации методов люминесценции, спектрофотометрии и химической модификации триптофановых остатков.

В пятой главе определяется механизм действия четырех групп важных биологически-активных соединений на мембрану СР и Са2+-АТФазу.

На основании полученных данных предлагается структурная модель Са2+-А1Фазы и анализируется изменение конформации фермента в момент образования фермент-субстратного комплекса. Исходя из данных о структуре фермента, полученных в диссертации, установлен механизм действия биологически-активных соединений на мембрану СР и Са2+-АТФазу.

Выполнение диссертационной работы проводилось в Отделении Института химической физики АН СССР, Черноголовка, в лаборатории кинетики ферментативного катализа.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Котельникова, Раиса Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Предложен новый физический метод для исследования молекулярной организации мембраносвязанных ферментов - метод трип-летных зондов; выбраны триплетные зонды эритрозин и эозин, конкурирующие с АТФ за место связывания в активном центре Са2+-АТФа-зы и характеризующиеся высоким квантовым выходом фосфоресценции; в качестве тушителей возбужденных триплетных состояний молекул, локализованных на белке, впервые используются парамагнитные ионы металлов и нитроксильные радикалы.

2. Методом триплетных зондов показано, что каталитически-активный центр Са2+-АТФазы СР экспонирован в водную фазу и не контактирует с липидами, ионы Мс^ и Са2+ имеют по два центра связывания на ферменте, расположенные на расстояниях 11,8 и 12,6 Й ог места присоединения АТФ в активном центре Са2+-АТФазы.

3. Установлено, что тушение собственной флуоресценции Са2+-АТФазы ионами редкоземельных элементов, в частности ТЬ , осуществляется в результате образования комплекса белка с ТЬ , а не в результате диффузионного взаимодействия хромофоров и тушителей. Предложена схема, описывающая этот процесс. Определено

-л расстояние от места сорбции | Ь до потушенных триптофановых остатков, которое не более 8 Й.

4. Методом фосфоресценции показано, что все фосфоресцирующие триптофановые остатки СР расположены в Са2+-АТФазе. Хромофоры, ответственные за 78 % собственной фосфоресценции^ белка находятся, на расстоянии 14 й от центров связывания Мф и практически все фосфоресцирующие триптофановые остатки - на расстоянии 12 Й от мест связывания Са2+.

5. Разработана методика для определения квантового выхода

- 119 флуоресценции отдельных триптофановых остатков мембраносвязан-ных ферментов на примере Са2+-АТФазы. Получено, что 8 из 12 флуоресцирующих триптофановых остатков Са2+-АТФазы имеют одинаковый квантовый выход флуоресценции, равный 0,03, 4 средний квантовый выход, составляющий 0,015, а оставшиеся 6 триптофановых остатков фермента не вносят вклад в собственную флуоресценцию белка. Установлена неоднородность окружения этих хромофоров.

6. Методом флуоресценции показано, что 4 триптофановых остатка участвуют в формировании каталитически-активного центра фермента,а остальные - в формировании Са2+-транспортирующего канала. С помощью теории обменно-резонансного переноса энергии установлены расстояния между DIHZ- группой и триптофановыми остатками активного центра, соответствующее 16 й, местом связывания АТФ и ближайшими 4 триптофановыми остатками, которое значительно меньше 14 й. Показано, что 6 триптофановых остатков Са2+-АТФазы расположены на расстоянии, ближе 12 Й, а 12 - на расстоянии, ближе 30 й от SH -группы каталитически-активного центра.

7. На основании полученных данных о структуре Са2+-АТФазы установлен механизм действия ряда биологически-активных соединений на мембраносвязанные ферменты: и K^PdCP^ конкурентно взаимодействуют с &W -группами активного центра, причем, - необратимо, а - обратимо;

5-сульфо-8-меркаптохинолинаты платины и палладия конкурентно и обратимо ингибируют гидролиз АТФ. При этом они взаимодействуют с триптофановыми остатками Са2+-АТФазы; психотропные препараты: мажептил, трифтазин, аминазин - разобщают гидролитическую функцию Са2+-АТФазы и Са2+-транспорти- г рующую, уменьшая при этом микровязкость мембраны СР; ионы бериллия ингибируют гидролиз АТФ, при этом они конку

КУ1 2 + рируют с ионами ПС|, за место связывания в активном центре фермента и уменьшают микровязкость липидного бислоя мембраны СР.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Транспортные АТФазы играют важную роль в организме человека, Они осуществляют перенос ионов через мембраны против градиента концентраций,

Са2+-АТФаза является важным представителем этого класса ферментов. Изучение ее структуры представляет собой одну из первостепенных задач биофизики.

Как уже отмечалось в литературном обзоре, к настоящему моменту сформулирована принципиальная схема химических процессов, происходящих в мембране СР с участием Са2+-АТФазы, зарегистрировано взаимодействие с ферментом ионов Са2+ и М^. , участвующих в ферментативном процессе. Однако, конкретные данные о пространственной организации функционально-важных групп, строении активного центра, об участии различных аминокислот в каталитической реакции Са -АТФазы, активном транспорте Саст до настоящего времени получены не были. Это объясняется, прежде всего тем, что Саст-АТФаза, как и все транспортные АТФазы, может функционировать лишь в составе мембран, что затрудняет получение этого фермента в кристаллической форме,а следовательно - применение наиболее информативного для этих целей метода рентгеноструктурного анализа. Применение других физических методов (ЯМР, ЭПР, оптической спектроскопии) весьма ограничено при изучении данного объекта, в силу сложности его строения и условий функционирования. В связи с этим, разработка новых физических подходов для изучения мембраносвязанных белков и, в частности, метода фосфоресценции является актуальной задачей биофизики.

Развиваемый в работе метод триплетных зондов позволяет регистрировать взаимодействие триплетно-возбужденных хромофоров

- 115 с тушителями при локальной концентрации последних, порядка, 1СГ^-1СГ^ М. В силу высокой чувствительности этого метода к обменным взаимодействиям с его помощью можно определять взаимное расположение взаимодействующих молекул на расстояниях до 15 8.

В работе было показано, что в качестве триплетных зондов для исследования Са^-АТФазы можно использовать ксантеновые красители: эозин и эритрозин, конкурентные обратимые ингибиторы АТФазной реакции данного фермента (константы ингибирования 1,1#1СГб М и 1,4#1СГб М соответственно). По регистрации изменения параметров фосфоресценции эритрозина в результате действия на фермент избытка АТФ показали, что эритрозин конкурирует с АТФ за место связывания в активном центре Саст-АТФазы.

Методом триплетных зондов по изменению кинетики затухания фосфоресценции эозина при действии на комплекс белка с эозином парамагнитных ионов Ми и Сс1 , конкурирующих за места связывания с М£ и Са2+ соответственно Я9,44/| было показано, что <» м 2+ й центры сорбции ПИ расположены на расстояниях 11,8 и 12,5 а, ионы Сс1 сорбируются на таких же расстояниях от места связывания эритрозина на белке. Таким образом, было установлено взаимное расположение Мс|., Са2+ и АТФ.

По изменению кинетики затухания собственной фосфоресценции белка показано, что в момент образования фермент-субстратного комплекса происходит конформационный переход в районе триптофа-новых остатков фермента.

Метод фосфоресценции позволил определить локализацию трип-тофановых остатков относительно мест сорбции ионов М^. и Са2+.

В диссертационной работе разработана методика определения квантового выхода флуоресценции отдельных триптофановых остатков мембраносвязанных ферментов с комбинированным применением мето

-116 дов оптической спектрофотометрии, флуориметрии и химической модификации* С помощью этой методики получено, что квантовый выход флуоресценции восьми триптофановых остатков Сас -АТФазы одинаков и равен 0,03, а средний квантовый выход четырех других флуоресцирующих хромофоров равен 0,015, оставшиеся 6 не вносят заметного вклада в собственную флуоресценцию белка.

С помощью этого же метода получено, что 4 триптофановых остатка Са2+-АТФазы защищаются одной молекулой эритрозина от действия модификатора и расположены на расстоянии, меньшем 14 Й от центра связывания эритрозина. Защиту четырех хромофоров одной молекулой красителя можно объяснить наличием гидрофобной щели, внутри которой расположены эти триптофановые остатки.

В дальнейшем эту методику (после незначительной модификации) можно применять для определения квантового выхода фосфоресценции триптофановых остатков белков.

При изучении механизма действия биологически-активных соединений на фермент было показано, что часть триптофановых остатков принимает участие в формировании АТФазного центра, а часть -в формировании Са^ -транспортирующего канала. На основании результатов, полученных в работе, и современных литературных данных предлагается структурная модель Са2+-АТФазы (рис.30).

Результаты, полученные при изучении молекулярной органир. . зации Сас-АТФазы, были ¡применены для выяснения механизма действия биологически-активных соединений на мембранные системы, знание которого можно использовать для предварительного отбора лекарственных соединений.

Следующим этапом в развитии метода фосфоресценции для изучения биологических объектов, вероятно, будет установление корреляции между параметрами окружения триплетно-возбужденных хро- ;

- 117 мофоров и фосфоресценции (форма и интенсивность спектров, выяснение механизма дезактивации фосфоресцирующих хромофоров в результате взаимодействия с парамагнитными ионами, установление связи термодинамических характеристик окружения триплетно-воз-бужденных молекул с параметрами фосфоресценции.

Предполагается, что этот метод окажется полезным при изучении структуры липидного бислоя мембраны С? и выяснении механизма переноса Са2+ внутрь везикул СР.

Рис. 30 Структурная модель Са2+-АТФазы КЖкХХЧ - триптофановые остатки. г

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Котельникова, Раиса Алексеевна, Москва

1. Авакян Э.А., Ритов В.Б., Азизова O.A., Максина А.Г., Суханов B.A«, Козлов Ю.В., Владимиров Ю.А., Швец В.И. Взаимодействие свободных жирных кислот с Са2+-зависимой АТФазой саркоплазматического ретикулума. - Биохимия, 1981, т. 46, № 5, с. 809-824.

2. Азизова O.A., Артемьева Л.Г., Владимиров Ю.А., Максина А.Г., Ритов В.Б. Изучение структурных перестроек в Сас -зависимой АТФазе при функционировании. Докл. АН СССР, 1979, т. 346, с. 214-216.

3. Алфимова Е.Я., Лихтенштейн Г.И. Изучение коформационных переходов в гемоглобине методом флуоресцентных меток. Биофизика, 1972, т. 179, № I, с. 49-54.

4. Бейли Д. Методы химии белков. М. Мир, 1965, с. 270-273.

5. Берлинер Л. Метод спиновых меток. М. Мир, 1979, 639 с.

6. Болдырев A.A. Биохимические аспекты электромеханического сопряжения. М. МГУ, 1977, 208 с.

7. Бурштейн Э.А. Собственная люминесценция белка. Природа и применение. Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР, сер. Биофизика, 1977, т. 7, 190 с.8« Владимиров Ю.А. Фотохимия и люминесценция белков. М. Наука, 1965, 232 с.

8. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М. Наука, 1980, 320 с.

9. Владимиров Ю.А., Ритов В.Б. Механизм работы Са-транспортной АТФазы в мембранах саркоплазматического ретикулума. В сб. "Биомембраны", Рига. Зинатне, 1981, с. 22-47.

10. Вульфиус Е»А., Коваленко В.А. Холинорецепторы. Итоги науки- 122 и техники ВИНИТИ АН СССР, сер. Биофизика, 1978, т. 8, 207 с.

11. Добрецов Г.Е. Метод флуоресцентных зондов в медицине и фармакологии. В сб. "Биомембраны". Рига. Зинатне, 1981, с. I33-I5I.

12. Добрецов Г.Е., Векшин Н.Л., Владимиров Ю.А. Различия пространственной организации белково-липидных комплексов мембран. Докл. АН СССР, 1978, 239, с. I24I-I244.

13. Донцов В.И., Захарова И.А., Томилец В.А. Экспериментальнаяи клиническая аллергия и иммунология. Чебоксары, 1978, в.2.

14. Ермолаев В.Л., Свешникова Е.Б., Шахвердов Т.А. Перенос энергии между молекулами и ионами переходных металлов. Успехи химии, 1975, т. 44, № I, с. 48-74.

15. Ермолаев В.Л., Свешникова Е.Б., Шахвердов Т.А. Изучение комплексообразования между органическими молекулами и ионами редкоземельных элементов в растворах методом переноса электронной энергии. Успехи химии, 1976, т. 45, te 10, с. 17531781.

16. Ермолаев В.Л., Бодунов E.H., Свешникова Е.Б., Шахвердов Т.А. Безызлучательный перенос энергии электронного возбуждения.-Л. Наука, 1977.

17. Есырев О.В. Роль транспортных АТФаз в электромеханическом сопряжении мышц.-Алма-Ата, Наука, 1983.

18. Золин В.Ф., Коренева Л.Г. Редкоземельный зонд в химии и биологии. М. Наука, 1980, 350 с.

19. Коробов В.Е., Чибисов А.К. Первичные фотопроцессы в молекулах красителей. Успехи химии, 1983, т. 52, tel, с. 43-71.

20. Котельников А.И., Кузнецов С.Н., Фогель В.Р., Лихтенштейн Г.И. Исследование микроструктуры биологических систем методом триплетных метокт-Мол. биол., 1979, т. 13, te I, с. 152-159.

21. Котельникова P.A., Татьяненко Л.В., Куликов A.B., Котельников А.И., Мельников A.A., Мошковский Ю.Ш. Исследование Сасrlcj. зависимой АТФазы саркоплазматического ретикулума методом парамагнитная метка-парамагнитный зонд. - Биофизика, 1979, № 2.

22. Котельникова P.A., Татьяненко Л.В., Меклер В.М., Котельниметодом триплетных зондов. Мол. биол., 1982, т. 16. № 6, с. 265-271.

23. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. М. Наука, 1976, 211 с.

24. Кузнецов В.А., Максина А.Г., Лившиц В.А., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Изучение Са2+-зависимой АТФазы СР с помощью избирательно-связанных спиновых меток. Мол. биол., 1981, т. 15, № 3, с. 668-679.

25. Лаврецкая Э.Ф., Татьяненко Л.В., Мошковский Ю.Ш., Райхман Л.М., Котельникова P.A., Васюкова Н.В. О некоторых механизмах действия психотропных препаратов на транспортные АТФазы. Фармакология и токсикология, 1980, № 3, с. 292-295.

26. Лившиц В.А. Использование эффектов СВЧ-насыщения для изучения медленного скачкообразного вращения в спектрах ЭПР нит-роксильных радикалов. Теоретическая и экспериментальная химия, 1977, т. 13, с. 363.

27. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биолоков А.И. Исследование каталитически-активного центра Ca ■ зависимой АТФазы саркоплазматического ретикулума2+i 124 гии* М. Наука, 1974, 256 с.

28. Мак-Глинн С., Адзуми Т., Киносита М. Молекулярная спектроскопия триплетного состояния. М. Мир, 1972, 448 с.

29. Максина А.Г., Азизова O.A., Артемьева Л.Г., Владимиров Ю.А., Кокорин А.И. Изучение расположения спин-меченых тиоловых групп относительно активного центра Са2+-зависимой АТФазы. -Докл. АН СССР, 1979, т. 247, с. 982-985.

30. Мартынов И.В., Стоянова Е.В., Юртанов А.И. Эфиры <Х -хлор- У- -нитро- ß -оксикарбоновых кислот. I. органической химии, 1982, т. 18, № 9, с. 1849-1852.

31. Меклер В.М., Котельников А.И., Лихтенштейн Г.И. Применение триплетных меток для исследования модельных и биологических мембран. Биофизика, 1982, т. 27, № 4, с. 641-645.

32. Меклер В.М., Котельников А.И., Лихтенштейн Г.И. Применение зондов, испускающих замедленную флуоресценцию, для исследования модельных и биологических мембран. Биофизика, 1983, т. 28, № 3, с. 461.

33. Молоканова И.П. Бериллиоз. М. Мир, 1972, с. 280.

34. Мошковский Ю.Ш., Татьяненко Л.В., Григорьев А.И., Райх-ман Л.М., Пивоварова Т.С., Тощева Т.М. Влияние солей бериллия на активность Са^т- Па зависимой АТФазы саркоплазматического ретикулума. - Фармакология и токсикология, 1979, № I, с. 59-63.

35. Паркер С. Фотолюминесценция растворов. М. Мир, 1972, 510 с.

36. Печатников В.А., Ивкова М.Н., Ризванов Ф.Ф., Плетнев В.В. Образование трансмембранного потенциала при гидролизе АТФ в СР. Биофизика, 1979, т. 24, № 3, с. 476-483.

37. Печатников В.А., Ивкова М.Н., Ризванов Ф.Ф., Плетнев В.В. Изменение мембранного потенциала и протонного градиентапри транспорте Са2+ в саркоплазматическом ретикулуме.- Докл. АН СССР, 1980, т. 250, с. 1255-1258.

38. Печатников В.А., Ризванов Ф.Ф., Ивкова М.Н., Плетнев В.В., Афанасьев В.Н. Исследование проницаемости мембран саркоплазматического ретикулума с помощью потенциал-чувствительных флуоресцентных зондов. Биофизика, 1980, т. 25, № 6, с. 1048-1055.

39. Прокопьва В.Д., Лопина О.Д., Болдырев A.A. Влияние температуры на флуоресценцию меток и зондов различной локализации, встроенных в препараты саркоплазматического ретикулума.- Биофизика, 1983, т. 28, № I, с. 40-44.

40. Райхман Л.М., Мошковский Ю.Ш., Лаврецкая Э.Ф. Влияние психотропных и противосудорожных препаратов на конформационные переходы в транспортной АТФазе. Фармакология и токсикология, 1975, № 6, с. 660-664.

41. Ритов В.Б. Влияние ацетилхолина и кофеина на функциональную активность фрагментированного саркоплазматического ретикулума. Биохимия, 1971, т. 36, с. 393-399.

42. Ритов В.Б., Мельгунов В.И., Комаров П.Г., Алексеева О.М., Акимова Е.И. Интегральные белки мембран CP скелетных мышц кролика и карпа. Докл. АН СССР, 1977, т. 233, № 4, с. 730733.

43. Татиколов A.C., Кузьмин В.А. Тушение триплетных состояний1. J 126 ароматических углеводородов стабильными азотокислыми радикалами. Докл. АН СССР, 1975, т. 233, № 2, с. 403-406.

44. Татьяненко Л.В., Лаврецкая Э.Ф., Лебедева О.И. Влияние психотропных препаратов на активность транспортной АТФазы саркоплазматического ретикулума из скелетных мышц кролика. -Фармакология и токсикология, 1977, № I, с. 12-17.

45. Татьяненко Л.В., Райхман Л.М., Лебедева О.И., Пивоварова Т.е., Мошковский Ю.Ш. Взаимодействие комплексов платины и палладияс тиоловыми группами Са2+-зависимой АТФазы саркоплазматического ретикулума. Вопросы мед. химии, 1977, т. 23, с. 43-45.

46. Andersen J.P., Pellemann P., Moller J.V., Devaux P. Immobilization of a spin-labelled fatty acid chain covalently at2+tached to Ca -ATPase from SR suggests an oligomeric structure. Biochemistry 1981, v. 20, No. 17, p. 4928-4936.

47. Araone A. Z-ray difraction study of binding of 2,3-diphos-phoglycerate to human deoxyhaemoglobin. - Hature 1972, v. 237, Ho. 5351, p. 146-148.

48. Arrondo J.L.P., Chapman D., Elliot D.A., Jaskowska A., Restall C.J., Weber W.V. Some physico-chemical factors which2+limit the activity of Ca -ATPase in vitro. J. Physiol. 1981, v. 318, p. 37-38.

49. Benesch R.E., Lardy H.A., Benesch R. The sulfhydryl groups of crystalline proteins. - J. Biol. Chem. 1955, v. 216, Ho. 2, p. 663-676.

50. Bishai P., Kuntz E., Augenstein L. Intra- and intermolecular factors, affecting the excited stetes of aromatic amino acids. - Biochim. biophys. acta 1967, v. 140, p. 381-394.

51. Burkli A., Cherry R.J. Rotational motion and flexibility2+ 2+of Ca -Mg -dependent adenosine-5*-triphosphatase in SR.-Biochemistry 1980, v. 20, Ho. 1, p. 138-145«

52. Champeil P., Rigand J.L., Claude M.G.B. Calcium translocation mechanism in sarcoplasmic reticulum vesicles, dedused from location studies of protein-bound spin-labels. - Proc.

53. Natl. Acad. Sei. USA 1980, v. 77, No. 5, p. 2405-2409.

54. Chiron C.A., Longworth J.W., Ramachandran N. Triplet-triplet energy transfer in 0< -trypsin. - Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1973, v. 70, No. 12, p. 3703-3706.

55. Corvalko C.M., Corvalko A.P. Fluorimetric Monitoring of calcium binding to SR membranes. - Bioehim. biophys. acta 1977, v. 468, No. 1, p. 21-30.1. Oj,

56. Dean W.J., Gray R.D. Transient kinteics of a Ca -induced change from membraneassociated and solubilized Sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase. - J. Biol. Chem. 1980, v. 255, No. 16, p. 7514-7518.

57. Hasselbach W., Migava A. The inhibition of the calcium transport ATPase in the SR by fluorescamine. Evidence for an oligometric functional unit of the calcium transport system. - Z. Naturforsch. 1980, Bd. 35, No. 11-12, S.1005-1011.

58. Jacobsberg L.B., Kantrowitz E.R., Lipsomb W.N. Interaction of tetraiodfluorescein with Asparate Transcarbamylase.

59. J* Biol. Chem. 1975, v. 250, Ho. 24, p. 9238-924-9.

60. Jardetzky 0. Simple allosteric model for membrane pumps. - Nature 1966, v. 211, p. 969-970.

61. Katsumato J., Suzuki 0«, Oya M. Changes in the mean distance between tryptophan and fluorescence probe in thelabelled sarcoplasmic reticulum membranes induced by detergents. PEBS Lett. 1978, v. 93, No. 1, p. 58-60.

62. Kirino Y., Higashi K., Matsu M., Shimisu H. A spin-label study of protein-lipid interaction in SR of rabbit sceletal muscle. - J. Biochem. 1981, v. 89, No. 3, p. 975-978.

63. Kotelnikov A.I., Pogel V.R., Mekler V.M., Kochetkov V.V., Likhtenstein G.I. Use of triplet label - a new method for protein and membrane investigation. - Studia biophys. 1982, v. 91, No. 1, p. 53-54.

64. Lunmann M.S., Cassvell A.H., Haynes D.H. Kinetics of Chlortetracycline permeation in fragmented ATPase-rich Sarcoplasmic reticulum. - Membrane Biochem. 1980, v. 3, No. 4» p. 291-315.

65. MacLennan D.H., Seeman P., lies G.H. Membrane formation by the adenosine triphosphatase of sarcoplasmic reticulum.

66. J. Biol. Chem. 1971, v. 246, p. 2702-2710.

67. Mac Lennan D.H., Resolution of the calcium transport system of sarcoplasmic reticulum. - Can. J. Biochem. 1975» v. 53, p. 251-261.

68. Martin K.B., Richardson P.S. Lanthanides as probes for calcium in biological systems. - Quart. Revs. Biophys. 1979, v. 12, Ho. 2, p. 181-209.

69. Meissner G., Young R.C. Proton promeability of sarcoplasmic reticulum vesicles. - J. Biol. Chem. 1980, v. 255, No. 14, p. 6814-6819.

70. Pick Uri Dynamic interconveretion of phosphorylated and non-phosphorylated intermediates of the Ca-ATPase from Sarcoplasmic reticulum, followed in a fluorescein-labelled enzyme. -FEBS Lett.1981, v. 123, No. 1, p. 131-136.

71. Restall C., Luis J.,,Arrondo R., Elliot D.A., Jaskowska A.,

72. Weber W.V., Capman D. Protein rotation, enzyme activity2+and phot oxidation a»f SH groups in. SR Ca -ATPase. Biochim. biophys. acta 1981, v. 670, No. 3, p. 433-440.

73. Rosenberg B., Van Camp L., Trosko J.E., Mansour V.H. -Platinum.compounds: A.new class of potent antitumour agents. -Nature 1969, v. 222, No. 5191, p. 385-386.

74. Sande T.E., Witkop B. Determination of the tryptophan content of proteins with N-bromsuccinimide. - Methods in Enzymology 1967, v. 11, p. 498-506.

75. Shamoo A.E., Ryan T.E., Stewart P.S., MacLennan D.H. Localization of ionophore activity in a 20000 dalton fragment of the adenosine triphosphatase of Sarcoplasmic reticulum - J. Biol. Chem. 1976, v. 251, p. 4147-4154.

76. Shamoo A.E., Goldstein D.A. Isolation of ionophores from ion-transport systems and their role in energy transduction. - Biochim. biophys, acta 1977, v. 472, p. 13-53.

77. Shamoo A.E., Scott T.L., Abramson J.J. Molecular mechanism of Ca2+-transport in sarcoplasmic reticulum Ca2+-Mg2+-ATPase. - Z. Physiol. Chem. (Hoppe-Saylers) 1978, Bd. 539, S. 325.

78. Skon J.C., Estmann M. Eosin-a fluorescent probe of ATP-binding to the (Na+-K+)ATPase. - Biochim. biophys. acta 1981, v. 647, Ho. 2, p. 232-240.

79. Steiner R.P., Kolinski R. The phosphorescence of oligopeptides, containing Tryptophane and Tyrosine. Biochemistry 1968, v. 7, Ho. 3, p. 1014-1018.

80. The Proteins Chemistry. Biological Activity and Methods. Eds. H.Neurath, K.Bailey, N.Y.: Acttd.Press, Inc., 1953»

81. Thomas D.D., HidaLgo C. Rotational motion of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1978, v. 75, No. 11, p. 5488-5492.

82. Verjovski-Almeida S. Heterogeneity of tryptophanyl residue in the sacroplasmic reticulum ATPase probes by fluoroescence energy transfer between protein and fluorescent ionophore. -J. Biol. Chem. 1981, v. 256, No. 6, p. 2662-2668.- 133

83. Verjovski-Almeida S., Silva J.L. Different degrees2+of cooperarivity of the Ca -induced changes in fluorescence intensity of solubilized sarcoplasmic reticulum ATPase. -J. Biol. Chem. 1981, v. 256, No. 6, p. 2940-2944.

84. Waldmeyer J., Horkidis K., Geacintov N. Relative contributions of tryptophan and tyrosine to the phosphorescence emission of human serum albumin at low temperatures. -Photochem. Photobiol. 1982, v. 35, p. 299-304.

85. Wasserman P.M., Lentz P.J. The interaction of tetraiodo-fluorescein with Aspartate Transcarbamylase and its isolated catalytic and regulatory subunits• - J. Biol. Chem. 1975, v. 250, No. 24, p. 9238-9249.

86. Yamada S., Ikemoto N. Reaction mechanism of calcium-ATP-ase of sarcoplasmic reticulum. - J. Biol. Chem. 1980, v. 255, p. 3108-3119.

87. Yamamoto N., Hasai M. Donkan potential in sarcoplasmic reticulum vesicles, measured by using a fluorescent cyanine dye. - J. Biochem. 1980, b v. 88, p. 1425-1435.

88. Yip B.P., Rudolf P.B. Interaction of tetraiodofluorescein with yeast hexokinase. - J. Biol. Chem. 1976, v. 251, No. 22, p. 7157-7161.

89. Yu Byung,P., Masoro E.J., Downs J.»Wharton D. Spin-label study of the Sulfhydryl groupa of SR. - J, Biol. Chem.1977, v. 252, No. 15, p. 5262-5266.

90. Выражаю благодарность своим руководителям Ю.Ш.Мошковскому и Л.В.Татьяненко за постоянное внимание и помощь в работе.