Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм температурного разобщения Са-насоса саркоплазматического ретикулума

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизм температурного разобщения Са-насоса саркоплазматического ретикулума"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ГЕЙМОНЕН Эрика Рейновна

УДК 577.152.361

МЕХАНИЗМ ТЕМПЕРАТУРНОГО РАЗОБЩЕНИЯ Са-НАСОСА САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО PET И КУЛ УМА

03.00.04 — Биохимия

Автор ефер ат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель! кандидат биологических наук,

доцент А.М.Рубцов

Официальные оппоненты» доктор Оологических наук

A.С.Каирельянц доктор биологических наук

B.В.Архшенко

Ведущее учреждение - Институт экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН

часов на

Защита состоится 1992г. в

V '

заведении Специализированного Совета Д.053.05.32 при Московском государственной университете имени М.В.Лоионоаова по адресу: г.Ыосква 119899, Ленинские горн, Биологический факультет.

С даооертацией мсяно опнакоыатьея в библиотеке Биологического факультете МГУ.

Автореферат разослав __1992г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, ~

к.б.н. Ю.Н.Лейкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. Саркоплазматпчвский ретикулуы (CP) скелетных мышц, играющий ключевую роль в регуляции мышечного сокращения, представляет собой замкнутую систему циотерн и трубочек, пронизывающих саркоплазму в непосредственней близооти от миофиб-рилл. В ответ на деполяризацию сарколеммы из терминальных цио-

терн CP через специфические Са-каналы в цитоплазму выбрасывается ?.

Ca , инициирущий образование актомиозинового комплекса и со-

2+

кращение мышц (Wartonosl, 1984). Повышение концентрации Ca в

цитоплазме активирует локализованную в продолговатых трубочках

2+

ретикулума Са-АТФазу, которая обеспечивает аккумуляцию Ca во внутреннее пространство ретикулума, что приводит к снижению его концентращга в цитоплазме и к расслаблению мышц (Ineei, 1985). Таким образом, CP скелетных мышц представлен двумя морфологически и функционально различающимися структурами: терминальными цистернами, непосредственно контактирующими о мембранами Т-сиоте-мы (тяжелая фракция ретикулума), и продолговатыми трубочками, окружающими миофибриллы (легкая фракция ретикулума). Если терминальные цистерны содержат Са-каналы и обеспечивают быстрый выброс 2+

Ca из ретикулума, то основной функцией продолговатых трубочек, богатых Са-АТФазой, является АГФ-зависимое поглощение Са2+.

Са-АТФвза CP относится к E^-Eg типу (или Р-типу) ион-транс-портирупцкх АТФаз, т.е. в ходе реакционного цикла фермент фоо-форилируется и претерпевает ряд конформационныг переходов. В настоящее время основные аспекты функционирования Са-АТФаэы достаточно хорошо изучены, известна ее первичная структура (Maclenmn, 1990) и предсказана возможная доменная организация и упаковка в мембране ретикулума (Stokee, Green, 1990). Тем не

менее, процесс сопряжения гидролиза АТФ о переносом ионов Са2+ через мембрану до конца не ясен. Предполагается, что связывание АТФ и фоофоршшрование Се-АТФазы в активной центре в гидрофильном домене так изменяет конформацию гидрофобного трансмембранного домена, что становится возможным перенос ионов Са через мембрану (Ineei, De MelB, 1989).

Исследования последам лет позволяют считать, что Са-каналы терминальных цистерн являются не единственной структурой, спо-ообной обеспечить выход Са из СР. Так, не связанный о Са-ка-налами путь выхода Са был обнаружен как в тяжелой (Rubteov et al, 1988), так и в легкой фракциях CP (Gould et al., 1987). Предполагается, что выход Са из ретикулума может обеспечиваться самой Са-АТФазой за счет образования каналов в области белок-белковых контактов в олигомерных ассоциатах фермента, либо за счет "внутреннего" разобщения Са-насооа, при котором нарушается взаимодействие между находящимися в гидрс*|ильном домене активным центром Са-АТФазы и Са-проводящим каналом, формируемым (»-спиральными учвстками гидрофобного домена молекулы фермента.

Известно, что кратковременное нагревание везикул CP до 42-45°С приводит к резкому снижению е<М; активности работы Са-насоса (Eletr, Inest, 1972). Анализ причин этого явления, называемого в дальнейшем терморазобщением, может '!ит' полезен для выяснения ' возможных путей выхода Са из леп.ой фракции СР. которые могут играть определенное физиологическое значение в регуляции обмена Са в мышечных клетках в норне или при патологии.

Цель в задача исследования, Целью настоящей работы было комплексное изучение функциональных нарушений работы Се-насоса и изменений физико-химических свойств белков и липидов мембран

ретикулума вследствие терморазобщения, для чего были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать влияние терморазобщения на работу Са-насосэ СР в разных рекиыаю функционирования.

2. Оценить возможные изменения барьерной функции мембран ретикулума в результате термообработки.

3. Проанализировать конформационное состояние и конформа-ционную подвижность гидрофильного и гидрофобного доменов молекулы Са-АТФазы после терморазободения.

4. Изучить влияние термообработки на структурное состояние лихшдного бислоя мембран СР.

5. Исследовать характер белок-белковых и белок-липидных взаимодействий в нативных й термообработанных препаратах ретикулума разными методами.

Научная новизна работы. Установлено, что кратковременная температурная обработка везикул СР в среде о ЭГТА приводит к необратимому снижению эффективности работы Са-насоса, не затрагивая при етом гидролитической активности фермента. Такое падение еф-фективности не связано о "внутренним" разобщением Са-насосв, а является результатом выхода из везикул уже аккумулированного кальция за счет резкого увеличения проницаемости мембран ретикулума для втого иона.

Исследование доступности и кинетических характеристик БН-групп и тушения собственной флуоресценции Са-АТФазы тушителями разной природы показало, что гидрофильный домен молекулы фермента после термообработки не изменяет свою конформацию, и Са-АТФаза может легко переходить в состояния Е2, Е^АТФ, Е^а и фосфори-лироваться. В гидрофобном домене Са-АТФазы происходят определен-

ныв изменения, которые связаны с конфорыационными переотройками втого домена и кластеризацией молекул Са-АТФазы в мембранах ретикулума.

Показано, что термообработка снижает микровязкость гидрофобной зоны липидного бислоя мембран СР.

Разработаны и применены методические подхода для измерения поверхностного потенциала мембран СР. Установлено, что основной вклад в отрицательное значение поверхностного потенциале вносит белок Са-АТФазы. Термообработка везикул ретикулума приводит к снижению величины поверхностного потенциала и к изменению влияния ионов на етот параметр.

Показано, что кратковременная температурная обработка приводит к образованию агрегатов, состоящих из молекул Са-АТФазы, причем часть из них имеет мекмолекулярные ковалентные связи. С использованием бифункциональных сшивающих агентов установлено, что термообработка везикул СР приводит к кластеризации белков в мембранах ретикулума.

Научно-практическая значимость работы. На основании анализа полученных данных по изучению функциональных свойств Са-насоса и структурного состояния липидного бислоя мембран СР выяснены причины снижения вффективности рабств Са-насоса при температурном разобщении. Снижение эффективности ргботы Са-насоса является результатом увеличения проницаемости мембран ретикулума для Са , которое происходит вследствие структурных перестроек и агрегации белка в мембране.

Полученные результаты используются при чтении спецкурса "Биохимия мембран" на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ, а разработанные методические подходы могут быть использованы

при изучении других транспортных АТФаз и мембранных ферментов.

Апробация рябого. Результаты работы были доложены на научном семинаре кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, не Всесоюзной конференции "Магнитный резонано в биологии и медицине" (Звенигород, 1990) и на 8-ой международной конференции молодых ученых (Рига, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы.

' Структура и объеи работи. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит стр. машинописного

текста, таблиц, ^ рисунков. Список литературы

включает т источника.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Мвтераалы я методы исследования

Препараты легкой фракции саркоплазиатического ретикулума выделяли из белых скелетных мышц кролика методом дифференциальной центрифугирования (Ритов и др., 1977).

Концентрацию белка определяли о Кумасси бриллиантовым голубым G-250 по методу Спектора (Speotor, 1978).

Температурную обработку фрагментов CP проводили в среде, содержащей 100 мМ К01, 20 Ш HOPS (рН 7,0), 50 мкМ ЭГТА и 5 мг/мл белке СР. Пробы инкубировали в водяной-бане при 45°С в течение 0,5-10 минут, посла чего охлаждали в ледяной бане.

Определение активности Са-АТФазы и скорости аккумуляции

2+

Са—проводили методом непрерывной регистрации рН в присутствии оксалата в слабо звбуференной среде (Болдырев и др., 1969). Среда инкубации оодержала 100 id( КС1, 5 М Kg012, 3 мМ АТФ, 2 Ш

имидазол (pH 6,8-7.0) и 2-10 Ш оксалат натрия. Реакцию начинали введением в пробу 150-250 мкг белка СР.

Определение активноети Са-АТФаза в отсутствие окоалвта о

ионофором А23187 проводили в среде следующего состава: 80 мМ KCl,

50 мМ MOPS (pH 7,0) 5 мм MgCl2, 1 мЫ ЭГХА, 2 мМ фосфоенолтгруват,

0,3 мг/мл НАДН, 5 ед. пируваткиназы, 10 ед. лактатдегидрогеназы,

2.5 мМ АТФ. Реакцию начинали добавлением в пробу объемом 1 мл

2+

10-20 мкг белка СР. Пооле этого добавляли Ca до конечной концентрации 1 мМ, затем - ионофор А23187 - 1 мкг (Andereon, Murphy, 1983). Активность рассчитывали по углу наклона линейных участков графика, используя коеффициент молярной экотинкции НАДН 6,22 • 10 М-1 ом~1. Коэффициент сопряжения рассчитывали как отношение скоростей гидролиза АТФ в присутствии и в отсутствие А2Э187.

Измерение скорости пассивного выхода Ca—л Везикулы CP

iC Л L

нагружали , инкубируя их 12-20 чаоов в растворе, содержащем

100 мМ KCl, 20 мМ MOPS (pH 7.0) и 5 мМ Са012, содержащего 450аС12 ("10000 орш/нмоль) при 0°С (Rubtaov, Murphy, 1988). Затем аликвоты суспензии везикул разбавляли в 50 раз в ореде, содержащей 100 мМ KCl, 20 мМ MOPS (pH 7,0) и 1 MM ЭГТА. Через определенные промежутки времени реакцию останавливали добавлением равного объема раотвора, содержащего 20 мМ IeClj и 40 bN Mf012. Пробы фильтровали через фильгцк "Зупрог" и измеряли радиоактивность высушенных фильтров.

Модификацию БН-груяп препаратов саркоплазматического ретикулума проводили с использованием НЕД-хлорида (4-хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазола) в среде, содержащей 100 мМ KCl, 1 мМ ЭГТА, 20 mV имидазол (pH 7,0), 0,75 мМ НЕД-хлорид и 200 мкг/мл белка ретикулума (Лотшна и др., 1979). Расчет количества

SH-групп и констант скорости их модификации проводили, как описано ранее (Рубцов, 1982).

Флуоресцентные исследования проводили на спектрофлуориметре "Hitaohi У-3000" в среде следующего состава! 100 мМ К01, 10 мМ MOPS (рК 7,0) и 1 мг/мл белка ретикулума (Лущак, Вжосек, 1984, Рубцов и др., 1989). При исследовании тушения флуоресценции Са-АТФазы использовали гидрофобные (пирен и • риодипин) и гидрофильный (KI) тушители. Расчет констант Штерна-Фольмэра проводили стандартным методом (Лакович, 1986).

Исследование структурного состояния липидной фазы мембран ретикулума проводили методом ЭПР-спектроскопии с помощью спин-меченых производных стеариновой кислоты, содержащих нитрсксильный радикал в жирнокислотнсй цепи на различном удалении от карбоксильной группы. Метиловый ефир стеариновой кислоты MePASL-1,14 позволял рассчитывать время корреляции вращения зонда, характеризующее микровязкость гидрофобной, зоны мембраны. Свободная спин-меченая стеариновая кислота HTASL-12,3 позволяла рассчитывать парвметр порядка, характеризующий состояние наружной полярной области мембран (Fung, Jonson, 1984). Измерения проводили на ЭПР-спектрометре "Varían Е-4" в растворе, содержащем 100 мМ КС1, 0,25 мМ ЭГТА и 25 иМ имидазол (рН 7.0). Концентрация белка составляла 1 мг/мл, конечная концентрация зондов - 2-10"^ М.

Протеолипосомы с разной концентрацией белка в мембране получали методом разведения белка липидом (Ритов, Щербакова, 1982).

Исследование поверхностного потенциала мембран ретикулума проводили двумя методами. В первом случае использовали рН-инди-катор нейтральный красный, способный связываться о мембранами CP и, соответственно, позволяющий получать информацию о величине рН в

приыембранном слое. Зависимость оптической плотности раствора нейтрального красного при 530 нм (пик поглощения протонированной формы) от pH раствора линейна в области pH 6,8-8,0, что позволяет построить калибровочный граф» для фиксированной концентрации краоителя. Учитывая разницу в величине оптической плотности при 530 им в среде, содержащей и не содержащей везикулы CP, и зная количество связавшегося с мембранами индикатора, можно рассчитать pH в примембранном слое раствора. Далее величина поверхностного потенциала рассчитывалась по формуле, получаемой из уравнения Больцмана:

« РНЬ + !Ра/б0в,

где рНа и pHb - pH растворов непосредственно у поверхности мембраны и в удаленной от поверхности водной фазе раствора, ve -поверхностный потенциал (Barber, 1980). Во втором случае для определения поверхностного потенциала использовался положительно заряженный спиновый зонд CAT 10 (4-- (N,К-диметил-И-децил)-2,2,6,6-тетраметилшшеридилашоний бромид), связывание которого с мембранами определяется величиной их поверхностного заряда, а количество связанного о мембранами и оставшегося в растворе зонда легко рассчитать из спектра ЭПР (Caiieo, Hubeil, 1981). Измерения проводили в среде, содержащей 15 »A* нмадазол (pH 7,0) 5 мкЫ нейтрального красного или 10~* М САГ1С и 1 mi'/мл белка СР. " •• Обработку мембран ре тику дума сшивающими агентами проводили в ореде, содержащей 100 ыМ MOPS (pH 1,?.) 1 мМ Са012> 2 мг/мл белка СР. В качестве сшивающих агентов использовали о-фенантролин меди (Murphy, 1976) и 1,5-дафтор-2,4-динитро<5ензол (Shaltiel, Tsuer-Finkeletein, 1971). Электрофорез проводили по методу Лэммли, используя 3% концентрирующий и 3-15Х градиентный разделяющий гели

(ЬаепгаИ, 1970). ,

Статистическая обработка. В тексте обсуждаются различия о достоверностью р<0,05 по критерию Стьюдента.

Результат в обсуадение

Влияние термообработки на вффективнооть работы Са-наооса. При нагревании везикул оаркоплазматйческого ретикулума при 45°С в присутствии ЭГТА эффективность работы Са-насоса падает пропорционально времени инкубации (Рис. 1). Уже через 1 мин происходит достоверное снижение коеффициента Са/АТФ, а дальнейшее увеличение времени инкубации до 6 мин приводит к полному разобщению Са-наооса. При этом гидролитическая активность фермента не изменяется.

100

Рае. 1. Влияние продолжительности термообработки на скорость пиролизе АТФ (■) и не коэффициент Са/АТФ (•) Са-наоооа СР.

Последующее охлаждение и хранение препаратов ретикулума пра 0°д ив восстанавливает способности Са-АТФазы аккумулировать Са2+, *.». разобщение Са-наооса являетоя необратимым. Важно отметить.

что терморазобщение наблюдается только при наличии в среде инкубации ЭПА, в добавление ионов Са в микромолярных количествах защищает Са-насоо от терморазобщения. Таким образом, терморазобщению подвергается фермент в Е^-конформяции, в Е^-кон-формация является устойчивой к температурной обработке.

Поскольку разобщение Са-насоса может быть вызвано двумя

главными причинами: внутримолекулярным нарушением сопряжения гид-

2+

ролиза АТФ и переноса ионов Са через мембрану или увеличением

2+

проницаемости мембран для ионов Са , были поставлены эксперименты, позволяющие сделать выбор между этими возможностями.

При рН-метрической регистрации активности Са-насоса, когда ореда измерения содержит оксалат-ион, свободно проникающий через мембраны СР, концентрация Са внутри везикул быстро достигает величины, достаточной для выпадения в ооадок оксалата кальция. В результате этого концентрация внутреннего кальция в ходе эксперимента невелика и поддерживается на постоянном уровне, а

изменяя концентрацию оксалата в среде, можно изменять

24-

концентрацию внутреннего Са в везикулах ретикулума.

Анализ влияния концентрации оксалата (Рис. 2) на величину

коэффициента Са/АТФ (т.е. анализ зависимости эффективности работы

Са-насоса от концентрации внутреннего кальция) показал, что как в

термообработанных, так и в коя^хм! льх препаратах увеличение

0 1

концентрации оксалата (снижение концентрации внутреннего Са ) приводит к увеличению коэффициента Са/АТФ. Это говорит о том, что и после термообработки работа Са-АТФазы находится под контролем

?1. рА.

внутривезикулярного Са , т.е. Са переносится через мембрану ретикулума. Из рисунка видно, что как до термообработки, так и после нее, максимальная величина Са/АТФ одинакова и равна 2. Это

означает, что при гидролизе каждой молекулы АТФ в обоих случаях переносится два иона кальция. Следовательно, термообработка не

Зг

(Са/АТФ) ^^

2 ^^^

макс ____—^

6[Са2£н1, икМ

Рис. 2. График зависимости коэффициента (Са/АТФ)"1 от концентрации виутреннего Са , используемый для определения максимальной величины Са/АТФ и значения К^ для выхода Са , для препаратов нативного (В) и гермообработанного (•) СР.

приводит к "внутреннему" разобщении Са-насоса, а связана, вероятно, с увеличением выхода аккумулируемого Са из везикул ретикулума. Действительно, в результате температурной обработки препаратов СР снижается ^ для выхода Са нз везикул. Так как воледотвие термообработки может меняться проницаемость мембран ретикулума для оксалата, мы проанализировали влияние терморазобщения на работу фермента в его отсутствие.

Для етого активность Са-АТФазы измеряли в сопряженной системе, используя ионофор А23187 (АМегаоп, Ыигрйу, 1983). Данная оистема регистрации активности Са-АТФазы удобна тем, что в отсутствие Са-ионофоров гидролиз АТФ ингибируется внутренним Саа+, так как внутренний объем везикул СР очень мал, и в первые секунды реакции концентрация внутреннего Са достигает высоких значений, ингибирувдих Са-ваооо. Скорость гидролиза АТФ в данном случав

определяется скоростью утечки ионов из везикул СР. Как видно из Рио. 3, гидролиз АТФ в иопользуемой снотеме резко активируетоя ионофороы А23187. Соотношение скороотей гидролиза АТФ в присутствии и в отсутствие ионофора А23187 называется степенью сопряжения (Anderson, Murphy, 1983). При сравнении контрольного и

Ряс. 3. Регистрация гидролиза АТФ контрольными (1) и термообработаншши (2) препаратами СР в сопряженной сиси теме.

термообработанного препаратов СР можно отметить, что скорость

Са-зависимого гидролиза АТФ в отсутствие ионофора у. термо-

2+

обработанных везикул выше, т. е.утччка Са из везикул после

термообработки возрастает. ■ .

Проведенные эксперименты по определению активности Са-наооса

двумя методами позволяют заключить, что термообработка приводит к

2+

значительному увеличению скорости выхода Са из везикул ретикулума.

Необходимо отметить, что как снижение ко&ффициента Са/АТФ щш рН-метрической регистрации активности Са-насоса, гак и

Таблица 1.' Влияние термообработки на активность Са-АТФазы СР и протеолипооом

контроль термообработка

рН-метрия! Са/АТФ активность, мкыольф^мин'мг 1.4 3,2 |+|+ I 0.2 0.3 0,7 3.4 + + 0,2 0,2

сопряженная системе: нативные везикулы СР активность, мкмольФн/мин.мг без А2Э187 о А23187 отепень сопряжения протеолипосомы активность, мкмольФн/иин-мг

0,38 3,64 9.6 + + 0,05 0.1 0,2 0.90 3,80 4.2 + + + 0,06 0,06 0,2

без А23187 о А23187 степень сопря!:ения 0,23 2,12 9.4 + + 0,07 0.1 0,3 - 0,88 1,88 2,15 + + + 0,07 0,1 0,2

снижение степени сопряжения при' регистрации ферментативной активности в сопряженной системе (Таблица 1), позволяют говорить об изменении проницаемости мембран СР для Са2* в ходе работа Са-насооа. Таким образом, наблюдаемое увеличение проницаемости мембран для Са после термообработки может быть связано с нарушениями в барьерной функции мембран, которое имеет место во время функционирования ферменте, когда Са-АТФаза гидролизувт АТФ я может находиться в разных конфоркационных состояниях.

р+

Для того, чтобы оценить проницаемость мембран СР для Са в условиях, когда Са-ваеос не. рвботает, измеряли пвосивную

Л 1 " 1Г р»

проницаемость везикул для Са После их нагрузки эСа . Из Рис. 4 видно, что везикулы тёрмообработанных препаратов изначально имеют меньшую емкость, чем контрольные, к практически весь кальций из везикул выходит уже в первые секунда измерения. Следовательно, термообработка везикул СР приводит к увеличению пассивной проницаемости мембран для ионов Са. .

Чтобы оценить возможное участие минорных белковых компонен-

Рис. 4. Регистрация выхода ^Са из пассивно нагруженных везикул саркоплазматического ретикулума в контроле ( • ) и после термообработки (■).

tob СР в проявлении терморазобщения, встраивали белок Са-АТФазы в протеолипосомы из яичного лецитина. Иопользуемый метод реконструкции позволял удалять практически все минорные белковые компоненты СР, и получать протеолипосомы, содержащие только белок Са-АТФазы. Термообработка таких протеолипосом также приводит к снижению эффективности работы Са-насоса (Таблица 1).

Таким образом, полученные данные позволяют считать, что причиной терморазобщения Са-наооса СР является повышение проницаемости мембран для Ca. Такое повышение проницаемости может быть связано о изменениями конформационного состояния самой Са-АТФазы и/или характера белок-белковых или бвлок-липидных взаимодействий в мембранах СР, так как протеолипосомы, содержащие только Са-АТФазу я фосфолигшды, также подвержены терморазобщекшо.

Характеристика конформационного состояния и конформационной подвижности молекулы Са-АТФазц. Для оценки конформационного состояния гидрофильного домена молекулы Са-АТФазы анализировали доступность и кинетические характеристики БН-грулп фермента о помощью НЕД-хлорида. Известно, что доступные для етого агента SH-группы локализованы именно в гидрофильной части молекулы Са-АТФазы, а другие белковые компоненты мембран СР не содержат 5Н-групп, взаимодействующих о НЕД-хлоридом (Рубцов, 19В2). Конфор-мационную подвижность гидрофильного домена молекулы Са-АТфазы оценивали, стабилизируя фермент в одном из промежуточных конфор-мационных оосюяний реакционного цикла с помощью соответствующих

лигандов. Са-АТФаза фиксировалась в состоянии Е2 (в присутствии

р,

ЭГТА), Е^-АТФ я E^Cs (в присутствии АТФ И Ca , соответственно)

о 1

и (в присутствии АТФ и Ca одновременно).

Как видно из Таблицы 2, кинетические характеристики доступных для НБД-хлорида SH-групп Са-АТФазы значительно различаются при изменении конформационного состояния фермента. Однако достоверных различий в количестве SH-групп мевду контрольными и термообра-боганными препаратами СР не обнаружено. Можно сделать ■вывод, что конформационная подвижность гидрофильного домена Са-АЗФазы., содержащего активный центр, не нарувается после терморазобщения. Это хорошо согласуется о тем фактом, что гидролитическая активность Са-АТФазы не изменяется после термообработки.

Конформационное состояние гидрофобного домена -молекулы <Са-АТФазы исследовали флуоресцентными методами. Известно, что собственная флуоресценция препаратов СР обеспечивается флуоресценцией триптофанильных остатков Са-АТФазы, которые локализованы именно в гидрофобной части молекулы фермента (Möller dt вЪ,

Таблица 2. Кинетические параметра модификации БН-групп

саркоплазматического ретикулума ЛШД-хлоридом в контроле (А) и после термообработки (Б). Я, Ы1 и И^- общее количество вН-групп и

количество йН-групп быстрого и медленного типов, соответственно, в

моль/10^ г белка; к и к - константы скорости модификации 12

быстрого и медленного типов, соответственно, в мин .

Состав среды Препарат N «1 к1 »2 V

Без А 10,0 0.137 0,018 ........

добавок Б 10,0 6,2 0,136 3,8 0,018

+ 0,5 мМ ; А 11,0 7.0 0,161 0,019

СаС12 Б Ц.1 7,4 0,162 3,7 0,019

+ 3 мМ А ИД М 0,077 Й.З 0,019

АТФ Б 10.3 3.3 0,070 7,0 0,020

+ (0,5 мМ СаС^ А 10,2 0 10,2 0,016

+ 3 мМ АТФ) Б 10.2 0 10,2 0,016

1984). Анализ влияния тушителей на флуоресценцию триптофанильных. оотатков Са-АТФазы показал, что гидрофильный тушитель К1 влияет на флуоресценцию обоих препаратов белка практически одинаково (Таблица 3). В то хе время константы Штерна-Фольмера, характеризующие доступность фдуорофоров для тушителей, достоверно различаются для контрольных и терыообработанных препаратов при использовании гидрофобных тушителей пирена и риодипина. Увеличение констант Штерна-Фольмера для термообработанных препаратов . .СР свидетельствует об ограничении доступности для них триптофанильных : оотатков. Это может быть результатом конформационных изменений гидрофобного домена молекулы Са-АТФазы и/или результатом-агрегации фермента в мембране.

Аналогичные результаты подучени щи исследования процеооа ' безызлучатёльного индуктивно-резонансного переноса энергии о фдуорофоров Са-АТФазн на пирен, локализованный в гидрофобной зоне ,

Таблице 3. Константы Штерна-Фольмера для тушения собственной

флуоресценции триптофанильных остатков Са-АТФазы СР разними тушителями.

К, (М-1)

тушители:

контроль термообработка

К1 О,+9 * 0,01 0,52 ~ 0,01

риодипин 0,41«105 0,49 «Ю®

пирен • 0,49-106 0,57«106

мембраны. Как видно из Рис. 5, интенсивности флуоресценции мономерной и в кошерной форм пирена при возбуждении его через белок Са-АТФази для контрольных препаратов выше, чем для термообработанных. Это свидетельствует о снижении содержания

Рис. 5. ' Зависимость интенсивности вызванной флуоресценции мономерной (А) и эксиыерной (Б) форм пирена при возбуждении флуоресценции белка Са-АТФазы при 285 нм от концентрации зонда в контрольных (•) и термообработанных (■) препаратах СР.

пирена в непосредственном окружении Са-АТФазы (в пределах радиуоа Феротера), что также говорит об изменении конформации гидрофобного домена белка и/или его кластеризации в мембране.

Таким образом, анализ конформационного состояния молекулы Са-АТФазы показывает, что гидрофильный домен своих свойств в результате терморазобщения не изменяет, а в гидрофобном домене происходят незначительные, но достоверные перестройки, которые могут быть связаны с изменением его конформации и/или с кластеризацией белка Са-АТфазы в мембране.

Анализ структурного состояния лшшдноЯ фазы мембран СР.

Поскольку термообработка можэт влиять на структурное состояние

липидов мембран СР, было проведено его исследование с помощью

ЭПР-спектроскошш. Показано, что после термообработки достоверно

снижается время корреляции вращения спинового зонда MePASL-1,U (о —ю — 1

12,63 до 10,60-10 с ), локализованного в гидрофобной зоне мембраны ретикулума, что свидетельствует о снижении микровязкости окружения етого зонда. Такое же снижение микровязкости происходит при увеличении температуры в образцах нативных мембран СР на 8-Ю°С, т. е. температурная обработка оказывает значительное влияние на упаковку жирнокислотных цепей фосфолипидов мембран ретикулума. Параметр порядка, характеризующий подвижность спинового зонда HFASL-12,3, в термообработанных препаратах по сравнению с контролем уменьшается недостоверно (о 0,713 до 0,708), т.е. структурные перестройки не затрагивают упаковки полярных голов фосфолипидов мембран СР.

Одной из возможных причин снижения микровязкости гидрофобной зоны биологических мембран являетоя разделение фаз, т.е. кластеризация мембранных белков. Извеотно, что интегральные мембранные

белки, в частности Са-АТФаза, оказывают существенное структурирующее действие на прилегающий слой так называемых аннулярных липидов. В мембране CP доля таких аннулярных липидов составляет около 60Я от общего количества, т.е. в ретикулуме агрегация Са-АТФазы в кластеры приводят к заметному снижению общей микровязкости липидов. Полученные нами данные о снижении микровязкости в результате термообработки позволяют считать агрегацию одной из основных причин наблюдаемых изменений.

Одним из интересных и перспективных, о нашей точки зрения, подходов к изучению процесса кластеризации белков в биологических мембранах является анализ поверхностных электрических свойств мембраны, поскольку белки вносят существенный вклад в поверхностный заряд мембран, а суммарный поверхностный потенциал определяется плотностью и равномерностью распределения зарядов на мембране (Barber, 1380). Этот подход был использован для характеристики влияния термообработки на електрические свойства поверхности мембран ретикулума. Проведенные предварительные эксперименты о использованием фосфолшшдных липосом, протеолипосом, содержащих белок Са-АТФазн, и нативных везикул ретикулума показали, что основной вклад в отрицательные значения поверхностного потенциала мембран CP вносит сам белок Са-АТФазы (данные не представлены). Необходимо отметить, что данные, полученные о использованием двух зондов различной природа - {^-чувствительного индикатора нейтрального красного и спинового зонда, CAT10, были практически идентичны. Сравнение контрольных и термообработанных препаратов показало, что термообработанные препараты имеют меньшие значения поверхностного потенциала, чем контрольные (Рис. 6), что может свидетельствовать об вгрэгации белка Са-АТФ азы, так

как кластеризация белков существенно изменяет распределение и плотность заряда на мембране. При титровании обоих препаратов

р I

ионами Са поверхноотный потенциал термообработанных препаратов изменяется от отрицательных до положительных значений.

1Рв,мВ

Рис. 6. Изменение поверхностного потенциала контрольных (■) и термообработанных (А) препаратов СР после титрования их кальцием.

а контрольных - только до нейтральных значений (Рио. 6). Изменение знака поверхностного потенциала с отрицательного на положительный наблвдаетоя и при титровании кальцием нативных везикул СР в присутствии ионофора А23187. что еще раз указывает на зна-

. Ох

читальное увеличение проницаемости мембран ретикулумв для Са в результате термообработки. Твким образом, показано, что основной вклад в величину поверхностного потенциала вносит белок мембран ретикулума. Термообработка снижает поверхностный потенциал, око-

рее всего,' за счет кластеризации Са-АТФазы. При етом изменяется ?+

характер влияния Ca на поверхностный потенциал мембран, что связано с увеличением проницаемости мембран СР для Сас .

Анализ олигомерного состояния Са-АТФазы в мембранах саркоплазмагического регикулума. Поскольку изложенные выше данные, полученные о помощь» ряда методических подходов, позволяют говорить о кластеризации белка Са-АТФазы в мембранах СР в результате термообработки, необходимо было проанализировать олиго-мерное состояние фермента более прямым методом. Подходом, отвечающим втиы требованиям можно считать^ использование бифункциональных сшивающих агентов, которые образуют ксвалентные связи между близко расположенными белками. Как видно из Рис. 7, посредством »лектрофоретического' разделения белков СР в термообработанных препаратах выявлены дополнительные белковые полосы с молекулярными массами около U0, 240, 280 и 310 кД. при етом значительная честь белка не входит в гель' (на Рис. 7 не показано). Появление белковой полосы - 140 кД связано, скорее всего, с образованием внутримолекулярных сшгеок в молекуле Са-АТФазы, что приводит к изменению електрофоретической подвижности етого бедка (Roes, Molntoeh, 1987). Полосы с молекулярными массами 240, 280 и 310 кД соответствуют димерам и, вероятно,- тримерам Са-АТФазн,„ различия в електрофоретической подвижности которых связаны с разным числом внутримолекулярных сшивок в молекулах входящих в их состав мономеров. Олигомеры с большей молекулярной массой в гель не входят. Детальный анализ содержания минорных белковых компонентов СР на електрсфореграммах показал, - что термообработке не изменяет их количества, т.е. высокомолекулярные комплексы представляют собой олигомеры.

состоящие только из молекул Са-АТФазы. Образующиеся после термообработки связи являются ковалентными, так как они не разрушаются после обработки додецилоульфатом натрия. Добавление р-меркаптовтанола и дитиотрейтола в ходе термообработки или после нее не изменяло картину. Только инкубация термообработанных препаратов с (5-меркаптоетанолом в концентрации 50 мМ при 100°С

Рис. 7. Электрофореграммы белков СР:

1 - контрольные везикулы;

2 - термообработанные везикулы;

3 - контрольные везикулы, обработанные о-фенантролином меди в течение 2 мин.

Обработка контрольных везикул сшивающими "агентами приводит к образованию высокомолекулярных олигомерных комплексов, которые по молекулярным массам близки к наблюдаемым в термообработанных препаратах (Рис. 7). Увеличение времени инкубации мембран со сшивающими агентами показало, что характер дальнейшего сшивания у контрольного и термообработанного препаратов различается (Рис. 8, А). В термообработанных везикулах СР Са-АТФаза изначально частично ошитв и к 30 мин сшивается около 85* белка Са-АТФьзы. Нативный белок сшивается медленнее (около 3055 за 30 мин реакции). Как упоминалось выше, значительная часть белка не входит в гель, и щм

уменьшало количество сшивок.

240 кД . ! —

>

140 ■

юо ад чщитщг

1 2 3

инкубации со сшивающими агентами количество высокомолекулярных агрегатов увеличивается, причем в терыообработанннх препаратах быстрее, чем в контрольных, параллельно о убыванием количества

белка Са-АТФазы (Рис. 8).__

площадь пика,»/, , , .............

' '*» площадь пика (Б)

100

20 30 инкубации, мин.

10 20 30' время инкубации, мин.

Рис. в. Изменение количества Са-АТФазы (А) и ее полимерных продуктов (Б) на електрсфореграммах в контрольных (•) и термообработанных (в) препаратах саркоплазматического ретикулума.

Таким образом, термообработка СР индуциирует кластеризацию белка Са-АТФазы в мембранах ретикулума. При етом часть молекул фермента оказываются ковалентно сшитыми друг с другом; обнаружены также и внутримолекулярные сшивки. Поскольку вновь образующиеся связи трудно доступны для {3-меркаптовтанола и дятиотрейтола, и свойства гидрофильного домена практически не изменяются, можно предположить, что сшиваникг- подвергаются внутримембраннне гидрофобные домены молекулы Са-АТФазы. По-видимому, кластеризация Са- АТФазы является главной причиной резкого увеличения проницаемости мембран СР для Са2+, т.е. терморазобщения.

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что причиной разобщения Са-насоса, индуцированного кратковременной температурной обработкой мембран СР при

2 1

45°С, является увеличение проницаемости мембран для ионов Ca .

2. Температурная обработка не наменяет гидролитической активности Са-АТФазы и не влияет на конформвционное состояние гидрофильного домена молекулы фермента.

3. Терморазобщение Са-насоса CP сопровождается структурными перестройками, затрагивающими гидрофобный домен Са-АТФазы.

4 В результате термообработки снижается микровязкость липидаой фазы и уменьшается величина поверхностного электрического потенциала мембран СР.

5. Кратковременная температурная обработка приводит к образовали» белковых кластеров, состоящих из молекул Са-АТФазы, устойчивость -которых обусловлена образованием межмолекулярных связей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Геймонен Э.Р., Рубцов A.M., Хомутов Г.Б. Влияние термообработки на структурное состояние липидного бислоя и функционирование Са-насоса саркоплазматического ретикулума. В сб. Всесоюзн. конф. "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Звенигород, 1990, 0.111.

2. Geiraonen E.R. Conformational changes of Barooplaemio retioulum Ca-ATPa.ee oonneoted with thermounooupling ol Ca-pump. In: Abstraots of 8th Conference pf Young Scientists on Organic and Bioorganio Chemistry, Riga, 1991, p.136.

3. Геймонен Э.Р., Рубцов A.M., Болдырев A.A. Механизм температурного разобщения Са-насоса саркоплазматического ретикулума! изменение функциональных свойств и структурного ооотояния молекул^ фермента. Биохимия, 1993. (в печати).