Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие аннексинов с белковыми компонентами мембран саркоплазматического ретикулума

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие аннексинов с белковыми компонентами мембран саркоплазматического ретикулума"

На правах рукописи

КРАСАВЧЕНКО КИРИЛЛ СЕРГЕЕВИЧ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АННЕКСИНОВ С БЕЛКОВЫМИ КОМПОНЕНТАМИ МЕМБРАН САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени ккандидата биологических наук

Москва - 2005 г.

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Мельгунов Владимир Игоревич

кандидат биологических наук, профессор

Крашенинников Игорь Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

док юр биологических наук, профессор

Белозерский Михаил Андреевич Рубцов Александр Михайлович

Ведущая организация:

Институт Экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра РАМН.

Защита диссертации состоится « 40 » ноября 2005 г. в ^& часов

на заседании диссертационного совета Д 501.001.76

при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова

по адресу: 119992, Москва, ГСН-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ Физико-Химической

биологии им. А.Н. Белозерского, лабораторный корпус А, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » октября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук ¿¿е/*

Н.О. Калинина

2-Ollt

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Аннексины — мультигенное семейство Са2+-зависимых фосфолипидсвязывающих белков. Белки этого семейства находят у всех эукариот, они присутствуют во всех тканях организма, однако биологические функции этих белков до сих пор однозначно не установлены. Обнаружено участие аннексинов в таких процессах, как мембранный транспорт, слияние внутриклеточных секреторных пузырьков с плазматической мембраной в ходе экзоцитоза, организация структурных доменов мембран, транспорт ионов, адгезия клеток, проведение сигнала, а также наличие у аннексинов противовоспалительной и антикоагулянтной активности [Moore, Dedman, 1982, Romish, Paques, 1991, Gerke, Moss, 1997, 2002]. Функция аннексинов в мышечной клетке до сих пор окончательно не установлена.

Несмотря на то, что аннексины являются периферическими белками мембраны, которые взаимодействуют с ними через Са2+ -мостики, аннексины, по-видимому, способны и иным образом взаимодействовать с фосфолипидными везикулами и биологическими мембранами. При этом часть аннексинов остается связанной с мембранами, несмотря на экстракцию ЭГТА и высвобождается только после обработки неионным детергентом Триюном Х-100 [Raeymaekerset al.,1985]. Не исключено, что эта способность аннексинов связана с их функционированием.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что в скелетных мышцах присутствуют такие представители семейства аннексинов, как аннексии А6, А5, A4 и A3. Основная доля приходится на аннексии А6, значительно меньше А5, A4 и A3 находятся лишь в небольшом количестве. Аннексины в скелетных мышцах локализуются в саркоплазматическом ретикулуме [Melgunov et al., 1990], поэтому изучение аннексинов саркоплазматического ретикулума может оказаться пролезным для установления тонких механизмов регуляции мышечного сокращения.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучить взаимодействие аннексинов А5 и А6 с различными компонентами мембран саркоплазматического ретикулума.

Исходя из поставленной цели, были сформулированны следующие задачи:

1) разработать и наладить метод получения высокоочищенных препаратов аннексинов А5 и А6;

2) изучить влияние ионов двухвалентных металлов на опосредуемую аннексинами

агрегацию липосом; РОС. НАЦИОНАЛЬНА »

БИБЛИОТЕКА j С Пете 09 И» 5

3) выяснить, образуют ли аннексины саркоплазматического ретикулума формы, связанные с мембранами Са2+-независимым образом;

4) проверить, способны ли аннексины А5 и А6 прочно связываться с мембранными везикулами, не содержащими белков;

5) оценить влияние аннексинов А6 и А5 на активность основного фермента саркоплазма] ического ретикулума - Са2+-зависимой АТФазы;

6) провести поиск белков мембран саркоплазматического ретикулума, связывающихся с аннексином А6.

Научная новизна работы. В настоящей работе было впервые продемонстрировано существование прочно-связанных, детергент-нерастворимых форм аннексинов в саркоплазматическом ретикулуме, иммунологически не отличающихся от детергепт-растворимых форм. Показано, что по гидрофобности прочно-связанные аннексины не отличаются от обычных форм. Образование детергент-нерастворимых форм аннексинов также было продемонстрировано в модельной системе, на липосомах, не содержащих белков. Обнаружено, что аннексии А6 увеличивает активность Са2+ -зависимой АТФазы саркоплазматического ретикулума. Методами лиганд-блоп инга и аффинной хроматографии был проведён поиск белков саркоплазматического ретикулума, связывающихся с аннексином А6. Методом лиганд-блоттинга было установлено, что А6 не связывается с Са2+ -зависимой АТФазой и другими интегральными белками мембран саркоплазматического ретикулума. Методом аффинной хроматографии были обнаружены три белка из числа периферических белков мембран саркоплазматического ретикулума, связывающихся с аннексином А6 в присутствии ионов Са2+.

Практическая ценность работы. Результаты работы могут быть использованы в фундаментальных исследованиях при изучении молекулярных механизмов мышечного сокращения. Разработанные методические подхода по получению меченых ИТС аннексинов могут быть использованы при идентификации клеток на ранних стадиях апоптоза.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на IV и V Европейских симпозиумах по калыщй-связывающим белкам в нормальных и трансформированных клетках (Перуджа, Италия, 2-5 мая 1996 г., Мюнстер, Германия, 30 июля- 2 августа 1998 г.) и XI и XII Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов», Москва ( 2004 и 2005 г.).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения,

выводов и списка цитированной литературы, включающего fST- наименований. Работа изложена на страницах машинописно! о текста, содержит^? рисунков и

3 таблиц. Основное содержание работы Материалы и методы исследования

Поликлональные антитела против аннексинов А5 и А6 (aL5 и Lip6) были получены от доктора Б. Пепински (Blake Pepinsky, Biogen Inc, USA). В работе использовались меченные пероксидазой IgG против IgG кролика (Институт им. Гамалеи). Мембраны саркоплазматичсского регикулума выделяли по методу [Kulaev, Melgunov, 1996]. Липосомы готовили при помощи ультразвуковой обработки суспензии фосфолипида. Одномерный электрофорез выполняли по методу [Laemmli, 1970.]. Иммуноблотинг проводили по методу [Towbin et al., 1979.]. Оценку гидрофильно-гидрофобных свойств белков проводили по методу [Bordier, 1981.]. Активность Ca2t -зависимой АТФазы определяли, инкубируя фермент с АТФ и определяя неорганический фосфат после инкубации. Концентрацию неорганического фосфата определяли по модифицированному методу Беренблюма-Чейна [Kulaev, Melgunov, 1996]. Концентрацию белка в пробе определяли по модифицированному методу [Bradford, 1976.], [Schaffner, Weissman, 1973.] и методу с биуретовым реактивом [Кочетов, 1970].

Результаты и обсуждение

Выделение препаратов аннексинов. Аннексины выделяли из препарата Са2+-связывающих белков, сорбируя их на липосомы в присутствии Ca2t и десорбируя буфером, содержащим ЭГТА. Препарат Са21-связывающих белков выделяли, экстрагируя белки из кле-i очною roMoieHaia ЭДТА, осаждая Са2+-связывающие белки из экстракта в присутствии Са2+ и затем персрастворяя их в буфере с Э1ТА. Этот метод позволял получить высокоочищенный препарат суммарных аннексинов.

Выделение аннексинов из мышечной ткани затруднено тем, что в мышцах помимо аннексинов, содержится большое количество других Са24-связывающих белков, загрязняющих конечные ЭГТА-экстракты из скелетных мышц. Поэтому в препаративных целях мы выделяли аннексины из печени, в которой так же, как и в мышцах, содержатся аннексины А6 и А5, не отличающиеся ни по изоэлектрической точке, ни по молекулярной массе от мышечных аннексинов и выявляющиеся иммунологически теми же антителами. Так же в печени содержится в незначительном количестве аннексии A4.

12 3 4

Рис. 1. Выделение очищенных препаратов аннексинов А5 и А6. 1) Молекулярные маркеры (94, 67,45 и 30 кДа); 2) Препарат суммарных аннексинов печени: 3) Очищенный препарат аннексии А6; 4) Очищенный препарат аннексина А5.

При электрофорезе в денатурирующих условиях в выделенных препаратах аннексинов выявлись две группы белков: одна - дублет в районе 67 кДа и вторая - с Mr 32-36 кДа (рис.1, дорожка 2).

Известно, что аннексии А6 при электрофорезе в денатурирующих условиях даёт именно дублет в области 67 кДа, в составе которого находятся две изоформы А6, образдванные в результате альтернативною сплайсинга [Gerke, Moss, 2002] Остальные аннексины при электрофорезе в денатурирующих условиях дают полосы в районе 32-36 кДа.

Препарат суммарных аннексинов разделяли методом гель-хроматографии на Сефадексе G-100. Белок с колонки элюировался (рис. 2) тремя пиками. Первый пик содержит белок, дающий на форезе полосу в районе 34 кДа, второй пик - полосу в районе 67 кДа, а третий дает на форезе две полосы с молекулярными массами 33 и 35 кДа. Очевидно, первый пик содержит гетеротетрамср аннексина А4 с белком семейства S100, с молекулярной массой около 80 кДа. второй пик содержи! аннексии А6, а третий - изоформы аннексина А5, обраюванные в результате альтернативного сплайсинга [Gerke, Moss, 1997]. Фракции, содержащие аннексины А6 и А5 объединяли. Полученные препараты аннексинов проверили методом иммуноблотинга. Препарат, содержащий белок с молекулярной массой 67 кДа окрашивался антителами к аннексину А6, a upenapai,

60 70 80 90 100 110 № фракции

Ряс. 2. Гель-хроматография аннексинов печени. 1) Пик гетеротетрамера аннексина А4 и белка БЮО; 2) Пик аннексина А6; 3) Пик аннексина А5. На вставках - аннексины, выявленные антителами к 2) аннексину А6, 3) аннексину А5.

содержащий белки с молекулярной массой 33 и 35 кДа - антителами к аннексину А5. Полученные таким образом препараты аннексинов А5 и А6 не содержали примесей (рис. 1 дор. 3 и 4) и были использованы для дальнейшей работы.

Влияние ионов двухвалентных металлов на опосредуемую аннексинами агрегацию липосом. Опосредуемую аннексинами агрегацию липосом определяли по изменению поглощения при длине волны 540 нм, в суспензии липосом в буфере, содержащем соответствующий катион. Реакцию инициировали добавлением препарата аннексинов. В результате выяснилось, что опосредуемая аннексинами агрегация липосом может быть вызвана не только ионами Са2+. Способность опосредовать эту реакцию снижается в ряду Сс12+>Ва2+, 5г2+>Са2+»Мп2+>№2+»Со2+(рис 3). Максимальная агрегация липосом наблюдалась в присутсвии Сс12+, Са2+, Ва2+ и 8г2+.

[Ме2>](гее(цМ)

Рис. 3. Влияние ионов двухвалентных металлов на опосредуемую аннексинами агрегацию липосом. По оси абсцисс - поглощение при длине волны 540 нм, по оси ординат концентрация свободного иона

Обнаружение прочно-связанных форм аннексинов. Субфракционирование скелетных мыши кролика в присутствии Са2+ приводит к переходу части аннексинов в такое состояние, когда они перестают экстрагировагься 2 мМ ЭДТА и солюбилизируклся лишь при последующей экстракции 10 мМ ЭДТА и 2 % Тритоном Х-100[Акшюуа е1 а1., 1996]. Для оценки специфичности эффекта, вызываемого Са2+. были исследованы мембраны, выделенные в присутствии Ва2+. В качестве контрольных мембран брали препараты, полученные стандартным способом, без добавления экзогенных катионов, и препараты, полученные после обработки Са2+.

а> 2 X ■0 1 яш амш №

5 ев

X £ ' MBffi ..шнрмяк 1'ваш

е- м В « S ° е ¿5 '■и ■К :

со ЙЙШ мв

й шн «в»

Экстракты после обработки < с <т> «г> е К" £ j ШРР -'п.-

5 ЩШМш

£ JBIHBB як

й ' вша

fe шшш :ЯМН

8 я»

5 мМЭГТА —в ' шш

t

: ^ .7- • ' ,, »

'1—1- -

- j 'ЧТг-Л**' л5 fe "it

• --------J. "Wr^ggs Ж . в V Г

Рис. 4. Выявление аннексинов в экстрактах мембран саркоплазматического ретикулума. Экстракты получали последовательной обработкой мембран 5 мМ ЭГТА, и буфером, содержащим 5мМ ЭГТА и 1% детер!ента (OG - октилглюкозид, SC - холеат натрия, ТХ - Тритон Х-100, NP - Нонидет Р-40, СН - CHAPS, BR - Бридж 35). Проявление антителами к аннексину А5.

Финальные £ шшш шшш ЯН

шшш■ ■■В '

i % шшт вне

of Ci О тшт ■ш ■■1

ы ПК шш

сз о

Экстракты после обработки 1 % детергент+5мМ ЭГТА ш шшт ■ш

§ . ^Iggggg»«.,... ■к

ш ШВ- шш

швшнз" ШЩИШЮ

и : ЯШ

в : тшттт ШЯШшШ ШШШ '

1% детергент S ; жмг ШШШ'

5 Щшш ; «ияр» шш

< % ШШШ ■ш'

и ^JMtBllliflfl^ Uli ^

и .. ШШШ

S IM

"^f^ * V T'V * \

Рис. 5. Выявление аннексинов в экстрактах мембран саркоплазматического ретикулума. Экстракты получали последовательной обработкой мембран 1% детергентом, и буфером, содержащим 5мМ ЭГТА и 1 % детерген га (OG - октилглюкозид, SC — холеат натрия, ТХ - Тритон Х-100, NP - Нонидет Р-40, СН - CHAPS,BR - Бридж 35). Проявление антителами к аннексину А5.

Рис. 6. Выявление аннексинов в экстрактах из мембран саркоплазматического ретикулума. Экстракты получали последовательной обработкой мембран 5 мМ ЭГТА, и буфером, содержащим 5мМ ЭГТА и 1% детергента (ОС - октилглюкозид, БС - холеат натрия, ТХ - Тритон Х-100, NP - Понидет Р-40, СН - CHAPS.BR - Бридж 35). Проявление антителами к аннексину А6.

§ н

О! -а - я

I й ;

1|

ч •а х

о

X

о Ь

о *

в а

2

> а\

г

I

Ж о я

и ■к о

0 X

1

О

у>

Ю 73

I

01 •а 8

2 ®

щ 3

3 э

1

X о

0

от тз

е.

О)

1

о »

а

5 §

Ь ся О

£ о\ ■о

о4 1а

I I

о г

п

а

г

X

я

ь

л X

в

X X

л

X X о я

я

■я к

25

к и X

л

3 е>

4 в

Экстракты после обработки

Финальные осадки

В первом варианте опыта сначала проводили стандартное выделение аннексинов, для этого мембраны экстрагировали буфером, содержащим ЭГТЛ. Загем для выявления прочно связанных форм аннексинов мембраны повторно экстрагировали буфером, содержащим и ОПТА, и детергент. Экстракты использовали для последующего Вестерн-блотиш а с моноспецифическими поликлональными антителами к аннексинам А5 и А6 (рис. 4, 5, 6,7)

Результаты иммунохимического анализа вполне определенно свидетельствуют о том, что прочно связанные формы аннексинов А5 и А6 практически полностью высвобождаются из мембран после одновременного воздействия хелатиругощего агента и детергента При этом присутствие Ва2* при выделении мембран вызывает почти такой же эффект, как и обработка С'а2+. В обоих случаях часть связанных с мембранами аннексинов становится недоступной для хелатирующих агентов. Все иссчедонанные нами детергенты, а именно тритон Х-100, октилглюкозид, холеат натрия, нонидет Р-40, CHAPS и бридж 35, достаточно эффективно экстрагировали прочно связанные аннексины А5 и А6 из мембран. Таким образом, получаются две фракции аннексинов: одна может элюироваться из мембран хелатирующим агентом, а вторая остается связанной с мембранами, несмотря на интенсивную промывку ЭГ1А Для солюбилизации такой устойчивой к ЭГТА фракции требуется добавление неионных или ионных детергентов.

Поскольку при экстракции буфером с детергентом и ЭГТА переход белков в раствор был обусловлен суммарным воздействием сразу двух факторов, в эту фракцию, скорее всего, переходипи аннексины, прочно связанные и с мембранами клетки, и с так называемым «цитоскелетом мембран»Г Luna, Hitt, 1992].

Поэтому далее представлялось целесообразным раздельно исследовать взаимодействие аннексинов с <одитоскететными» и с мембранными структурами Для этого мы изменили последовательность обработки мембран. В этом случае первую экстракцию проводили в присутствии одного из детергентов, который должен был в первую очередь воздействовать на липидный бислой мембраны и солюбилизировать те белки, которые непосредственно связаны с мембраной. Для высвобождения белков, несолюбилизируемых детергентами, нерастворенный материал («цитоскелег») обрабатывали далее буферами, содержащими не только детергент, но и ЭГТА, чтобы условия обработки совпадали с условиями повторной экстракции в первом варианте опыта.

35-л»

33

12 12

Рис. 8. Поведение аннексинов V и VI при индуцированном температурой разделении фаз в Тритоне Х-114. а) Контрольные мембраны, б) Мембраны, выделенные в присутствии Са2+; 1) водная фаза, 2) фаза, обогащенная детергентом.

В результате, несмотря на го, чю при такой постановке опыта в экстракт с детергентом переходи! основная часть белка мембран, часть аннексинов по-прежнему солюбилизируется только после обработки буфером с ЭГТА и детергентом. Это относится и к аннексину А5, и к аннексину А6. Следует особо отметить, что при этом некоторое количество аннексина А5 вообще не эксгрш ируется из мембран и выявляется даже в нерастворимом остатке. После выделения мембран в присутствии Ва2+ образование прочло связанных форм аннексина А5 особенно усиливается. В этом случае ни один из исследованных детергенюв не способен полностью его экстрагировать.

В качестве одного из возможных объяснений образования прочно связанных форм одного и того же аннексина было высказано предположение о том, что прочно связанные формы отличаются по гидрофобное™ о г белков, выделяемых обычным способом с применением хелатирующих агентов.

Для проверки этого предположения мы провели индуцированное темперагурой разделение фаз по меюду Бордье. Последующее иммунохимическое выявление аннексинов А5 и А6 (рис 8), показало, что аннексины А5 и А6 из мембран, выделенных в присутствии Са2+, веду г себя точно так же, как и аннексины, выделенные из контрольных мембран. При этом они, в основном, остаются в водной фазе и не переходят в фазу, обогащенную детергентом Это говорит о том, что гидрофобность аннексинов А5 и А6 не возрастает настолько, чтобы эти белки могли непосредственно встраиваться в фосфолипидные структуры мембраны.

Таким образом, нами было установлено, что часть аннексинов саркоплазматического ретикулума ведёт себя нетипичным образом, а именно - связавшись с мембраной Са2+-зависимым образом переходит в прочно-связанное состояние, не солюбилизируется хелаторами и требует для растворения обработки неионным детергентом. Это позволяет предположить, что в результате действия какого-то до сих пор не усгановленного механизма значительная часть аннексинов, связавшихся с мембраной в присутствии Са2\ переходит в состояние, независимое от наличия Са2+ в среде, и начинает вести себя как интегральные белки мембраны. Не исключено, что эта способность аннексинов связана с их функционированием в саркоплазматическом ретикулуме

Образование прочно-связанных форм аннексинов может быть объяснено либо тем, что аннексины взаимодействуют с детергент-устойчивыми доменами мембран, либо тем, что они взаимодействуют с какими-либо белками мембран. Для проверки того, могут ли аннексины А5 и А6 переходить в прочно связанное сосюянис при взаимодействии с мембранами, лишенными белков, нами был проведен эксперимент с липосомами из азолектина типа 11-5. В препарат суммарных аннексинов добавляли липосомы в присутствии Са2+, после чего экстра1 ировали белки с липосом либо буфером, содержащим ЭГТА, либо буфером, содержащим Тритон Х-100 Оказалось, что в обоих вариантах опыта на липосомах остаются несолюбилизированные аннексины Казалось бы, таким образом удалось показать образование прочно связанных форм аннексинов в системе, где мембраны не содержали посторонних белков. Однако, при этом на липосомах остается меньше одной десятой части аннексинов, в то время, как в опыте с мембранами саркоштзматического ретикулума около половины аннексинов А5 и А6 переходили в прочно-связанное состояние после обработки Са2+. Из этого можно сделать вывод, что одного липидного компонета не достаточно для образования аннексинами Са2+-независимой связи с мембраной

Влияние на активнос!ь Са2+-АТФазы. Влияние аннексинов на активность Са2*-АТФазы саркоплазматического ретикулума, оценивали по изменению активности фермента после инкубации с очищенным препаратом анпексина А6 или А5 Для определения активности АТФазы фермент инкубировали в среде с АГФ, после чего определяли концентрацию неорганического фосфата по методу Беренблюма-Чейна в модификации Мельгунова.

Аннексины не оказывали влияния на активность Са2+-А'ГФазы, если их вносили в среду непосредственно перед определением. Так же они не влияли на активность АТФазы после 10 и 30 минут инкубации. Аннексины оказывали влияние на активность Са2+-АТФазы лишь после предварительной инкубации в течение часа при 37°С. Инкубация в течение 90 и 120 мин, в

Активность (% от нормы)

120- ид.о

100.0 айн

10°" щ

80- ^^Л

во- ^В

■

20- f^ty, ^Н 0l_J±idJ-

1 2 3

Варианты опыта

Рис 9. Влияние аннексина А6 на активность Са2+-АТФазы саркоплазма! ического ретикулума. Варианты опыта: 1 - без прединкубации; 2 - активность фермента определяли после часовой прединкубации при 37°С без аннексина А6; 3 - активность фермента определяли после часовой прединкубации при 37°С в присутствии аннексина А6.

сравнении с часовой инкубацией, не давала дополнительного эффекта. Поэтому в дальнейшем мы проводили предварительную инкубацию АТФазы с аннексинами в течение часа Молярное соотношение аннексии А5.АТФаза в инкубационной смеси было выбрано равным 30:1, поскольку такое соотношение используется в ряде работ по взаимодействию АТФазы с белками f ] Молярное соотношение аннексии А6:АТФаза было равно 15:1, т.к. в огличие от аннексина А5 аннексии А6 содержит не четыре, а восемь «аннексиновых повторов» [Gerke, Moss, 1997].

Для предотвращения агрегации и выпадения в осадок, препараты аннексинов содержали ЭГТА. Однако, известно, чю избыток ЭПА в среде приводи! к остановке Ca2t-насоса. В этих условиях доступный свободный кальций связывается хелатом, но концентрация АТФ и других реагентов сохраняется на прежнем уровне. При этом наблюдается отток Са2+, вызванный разобщением Са2+-ЛТФазы. Чтобы избежать этого, мы сначала путем диализа переводили препарат в буфер, по составу практически не отличающийся от среды инкубации Са2+-АТФазы. Оставшийся небольшой избыток ЭГТА непосредственно в ходе опыта нейтрализовывали добавлением СаСЬ- При этом концентрация свободного Са2+ в среде инкубации, рассчитаная по программе WinMaxC, изменялась лишь незначительно (с 13,8 мкМ до 15,8 мкМ). Активность АТФазы все равно несколько снижалась (до 91 % от исходной).

340 290

170 140

•105

63

55

45

(37)

30

И-94 |-<-66

<-45

-31

Рис. 10. Электрофоре 1ичсские разделение интегральных и периферических белков мембран саркоплазматического ретикулума. Стрелками указаны молекулярные массы, кДа 1) Интегральные белки, разделение в градиентном геле с концентрацией полиакриламида 8-16%. 2) Периферические белки, разделение в 10% акриламидном геле. Правая дорожка - молекулярные маркеры.

В этих условиях предварительная инкубация АТФазы с аннексином А6 восстанавливала активность фермента и даже увеличивала ее по сравнению с исходным шачением (до 115 % от исходной). Предварительная инкубация с аннексином А5 не оказывала влияния на активность АТФазы.

Такое действие А6 на активность АТФазы может иметь несколько объяснений

Во-первых, А6 может взаимодействовать с мембраной саркоплазматического ретикулума, формируя в ней Са2+-канал[(ю1сгак е! а1., 2001]. Но, при рН выше 6,0 А6 не обладает канальной активностью, а в нашем эксперименте рН был равен 7,0. Кроме того, поскольку в среде присутствовал ионофор. саркоплазма гический ретикулум был

разобщенным, и появление еще одного кальциевого канала не могло повлиять на активность АТФазы.

Во-вторых, аннексии А6 может взаимодействовать непосредственно с АТФазой, хотя то, что активность АТФазы менялась всего на 25% ставит под сомнение такую гипотезу. Кроме того, А6 можег связываться не с АТФазой, а каким-либо другим белком саркоплазматического ретикулума и влиять на активность АТФазы опосредованно.

Поиск белков саркоплазматического ретикулума, связывающихся с аниексином А6. Для поиска белков-мишеней были выбраны методы аффинной хроматографии и лиганд-блоттинга. Взаимодействие аннексина А6 с интегральными белками мембран саркоплазматического ретикулума, к которым относятся и Саг+-зависимая АТФаза, составляющая до 80% общего содержания белка и рианодиновый рецептор и другие белки было изучено методом лиганд-блоттинга. Взаимодействие аннексина с периферическими белками мембран саркоплазматического ретикулума было оценено методом аффинной хроматографии.

Поиск белков-мишеней среди интегральных белков мембран саркоплазматического ретикулума. При проведении лиганд-блоттинга, препарат интегральных белков мембран саркоплазматического ретикулума разделяли электрофоретичсски и переносили белковые полосы на нитроцеллюлозную мембрану. После этого фильгр в присутствии Са2+ инкубировали либо с препаратом аннексинов, которые потом выявляли специфическими антителами, либо с препаратом меченных ИТС аннексинов, для выявления которых потом фильтр облучали ультрафиолетом. Препарат меченных ИТС аннексинов А5 и А6 был изготовлен по разработанной нами методике. Для контроля антителами обрабатывали мембраны, не инкубировшшые с аннексинами. Методом лиганд-блоттинга не удалось обнаружить взаимодействия аннексина А6 с какими-либо интегральными белками саркоплазматического ретикулума. В то же время, анпексины А5 и А6 эффективно связывались с эндогенными аннексинами, входящими в состав саркоплазматического ретикулума, о чем можно было судить по более интенсивным полосам соответствующих белков, в сравнении с контрольными мембранами.

То, что аннексины не связывались с белками в ходе лиганд-блоттинга, можно объяснить тем, что белки, после электрофореза но Леммли и переноса на нитроцеллюлозный фильтр денатурировали.

1 2 В

Рис 11. Электрофореграмма фракций, полученных при элюции периферических белков легкой фракции саркоплазматического ретикулума с аффинной колонки (с

аннексином А6 в качестве лиганда). 1 - белковые маркеры; 2 - белки, элюированные ЭГТА; 3 - белки, элюированные Тритоном Х-100. Гели окрашивали серебром.

Поэтому полученные данные не опровергают однозначно гипотезу о том, что аннексины могут связываться с какими-либо интегральными белками мембран саркоплазматичсеского ретикулума. В го же время, денатурация в ходе электрофоретического разделения и электропереноса не нарушила структуру молекул аннексинов настолько, чтобы препятствовать связыванию аннексинов друг с другом. Такое связывание, или агрегация аннексинов в присутствии ионов Са2+ описана рядом авторов [Kaetzel et al.,2001, Gerke, Moss, 2002]. В целом, результаты лиганд-блоггинга позволяют если не утверждать категорически, то с некоторой долей вероятности сказать, что белков, ' связывающихся с аниексииами среди интегральных белков саркоплазматического

ретикулума нет.

Поиск белков-мишеней среди периферических белков мембран »■> саркоплазматического ретикулума. Периферические белки получали, обрабатывая

препарат мембран саркоплазматического ретикулума буфером, содержащим 0,6 М КС1. Препарат периферических белков пропустили через аффинную колонку из Affigel 15 с иммобилизованным А6, после чего промыли колонку буфером нанесения. При этом около десятой части периферических белков связалось с колонкой.

Связавшиеся на колонке белки элюировали сначала градиентом ионной силы (от 150 до 500 мМ №С1). потом градиентом комплексона (от 1 мМ до 5 мМ ЭГТА), потом 5 мМ ЭГТА, и, наконец, градиентом неионного детергента (от 0 % до 2% тритона Х-100) (рис. 10).

На основе данных электрофореза можно достаточно уверенно утверждать, что при пропускании ЫаС1 с колонки не элюировались какие-либо белки.

При элюции как ЭГТА. так и тритоном Х-100 с колонки сходили два белка, с Мг 66 и 63 кДа. При элюции тритоном Х-100 с колонки также сходил белок с Мг 35 кДа.

Поскольку белки с молекулярными массами 66 и 63 кДа элюировались как при обработке хелатирующим агентом, так и при обработке детергентом, можно предположить, что для их связывания с молекулами аннексина А6 важны и ионы Са2+ и гидрофобные взаимодействия. Возможно, что эти белки экспонируют гидрофобные участки молекулы, связывая ион Са2*, подобно многим Са2+ связывающим белкам. Белок с молекулярной массой 35 кДа, видимо, связывается с аннексином А6 только гидрофобными взаимодействиями.

Во всяком случае, можно сказать, что эти белки не являются ни иммобилизованным А6, ни его протеолитическими фрагментам, поскольку они должны были бы сойти с колонки при элюции градиентом ЫаС1, чего не наблюдалось в наших экспериментах.

Выводы.

1) Впервые показано, что аннексины саркоплазматического ретикулума после предварительной обработки Са2+ образуют прочно связанные формы, для солюбилизации которых требуется как хелатор, так и детергент. При этом гидрофобность молекул аннексинов не меняется.

2) Обнаружено, что при взаимодействии с липосомами, не содержащими белков, часть аннексинов также образует прочную связь При этом количество переходящих в прочно-связанное состояние аннексинов гораздо меньше, чем при взаимодействии с природными мембранами. Обнаружено, что опосредуемую аннексинами а1регацию липосом кроме ионов Са2+, способны запускать ионы Ва2+, Бг24, Мп2+, №2+, Со2< и С<Г+ При этом способность ионов металлов индуцировавать опосредуемую аннексинами агрегацию, снижается в следующем порядке: Сс12+> Ва2+, Бг2^ Са2+» Мп2+> №2+» Со2+.

3) Установлено, что предварительная инкубация с аннексином А5 не влияет на активность Са2+-зависимой АТФазы сапкоплазматического ретикулума, а предварительная инкубация с аннексином А6 увеличивает ее.

4) Выяснено, что аннекснны А5 и А6 не связываются с интегральными белками мембран саркоплазматического ретикулума скелетных мышц.

5) Продемонстрировано, что аннексии А6 связывается с тремя периферическими белками мембран саркоплазматического ретикулума с молекулярными массами 35,63 и 66 кДа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Akimova E.I., Nabokina S.M., Melgunov V.I., Krasavchenko К. S. Tightly bound forms of annexins VI and V in rabbit skeletal muscles. (1996). Abstracts IV Europ. Symp. on Calcium Binding Proteins in Normal and Transformed Cells, Perugia, Italy, May 2-5, p.159.

2. Krasavchenko K. S., Akimova E.L, Melgunov V.T. Overlay assays do not reveal any interaction of annexins V and VI with major proteins of rabbit sarcoplasmic reticulum and sarcolemma. (1998). Abstracts V Europ. Symp. on Calcium Binding Proteins in Normal and Transformed Cells, Nordkirchen/Muenster, July 30- August 2, р.122а.

3. Красавченко K.C., Акимова E. И., Мельгунов В. И. Образование прочно связанных форм аннексинов V и VI в мембранах скелетных мышц кролика, выделенных в присутствии ионов бария. (1999). Биохимия, гом 64, вып. 10, с. 89 -96.

4. Melgunov V.I., Akimova E.I., Krasavchenko К. S.Effect of divalent metal ions on annexin-mediated aggregation of asolectin liposomes. (2000). Acta Biochimica Polonica, Vol. 47, No 3, p. 675 - 683.

5. Красавченко K.C., Акимова E. И., Мельгунов В. И. Стабилизирующее действие аннексинов на активность Са2+ -АТФазы саркоплазматического ретикулума в присутствии комплексонов. (2004) Материалы XI Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов», Москва, Россия, сгр. 72-73.

6. Красавченко К С. Поиск белков-мишеней для аннексина аб. (2005). Материалы XII Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов», Москва, Россия, схр. 111-112.

Подписано в печать 06.10.2005 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 119 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

«20 085

РНБ Русский фонд

2006-4 20772

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Красавченко, Кирилл Сергеевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. OIHOl' ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Липск'сппм.

2.1.1. Общее строение аннексинов.

2.1.2. Распространение в природе.

2.1.3. Номенклатура.

2.1.4. Свойства аннексинов.

2.1.4.1. Взаимодействие аннексинов с ионами кальция.

2.1.4.2. Взаимодействие аннексинов с ионами других металлов.

2.1.4.3. Взаимодействие аннексинов с липидными бмслоямн.

2.1.4.4. Взаимодействие аннексинов с белками.

2.1.5. Возможные биологические функции аннексинов.

2.1.5.1. Аннексины в мембранном траффике и организации структурных доменов мембран.

2.1.5.2. Аннексины и ионные каналы.

2.1.5.3. Функции аннексинов вне клетки.

2.1.6. Аннексии: А5.

2.1.7. Аннексии А6.

2.2. Саркоилазматнческнн peiнкулум.

2.2.1. Са2*-ЛТРаза.

2.2.2. Рианодиновый рецептор.

2.2.3. Другие белки саркоплазматичсского ретикулума.

2.2.4. Аннексины в саркоплазматическом ретикулуме.

3. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Объект исследования.

3.1.2. Антисыворотки.

3.1.3. Белковые маркеры.

3.2. Общие параметры.

3.2.1. Температурные условия.

3.2.2. Центрифугирование.

3.3. Вспомогательные методы.

3.3.1. Приготовление липосом.

3.3.2. Концентрирование белков в полиэтиленгликоле.

3.3.3. Мечение аннексинов флуоресцеин-изотиоцианатом.

3.4. Нрепарлтшшые методы.

3.4.1. Выделение фрагментов сарконлазматического ретикулума из скелетных мышц кролика.

3.4.2. Выделение периферических белков сарконлазматического ретикулума.

3.4.3. Выделение суммарных аннексинов из скелетных мышц кролика.

3.4.4. Выделение суммарных аннексинов из печени кролика.

3.5. Хроматографнчсасне методы.

3.5.1. Гель-фильтрация аннексинов.

3.5.2. Аффинная хроматография.

3.6. Элсктрофорегическис методы.

3.6.1. Приборы для электрофореза.

3.6.2. Приготовление и заливка гелей.

3.6.3. Приготовление проб.

3.6.4. Режим проведения электрофореза.

3.6.5. Фиксация и окрашивание гелей после электрофореза.

3.6.5.1. Окраска ПЛЛГ при помощи Кумасси R-250.

3.6.5.2. Окраска белков при помощи нитрата серебра.

3.6.6. Высушивание гелей.

3.7. Пммунохнмнчсскпс методы.

3.7.1. Состав фосфатно-солевого буфера.

3.7.2. Определение рабочего титра антител и их специфичности.

3.7.2.1. Раститровка антител.

3.7.2.2. Оценка специфичности антител.

3.7.3. Метод иммуноблотинга.

3.7.3.1. Фракционирование образцов.

3.7.3.2. Перенос фракций из геля на фильтр.

3.7.3.3. Иммунное выявление антигенов на фильтре.

3.7.4. Лиганд-блотинг.

3.8. Аналитические методы.

3.8.1. Оценка гидрофильно-гидрофобных свойств белков.

3.8.2. Определение опосредуемой аннексинами агрегации липосом.

3.8.3. Определение концентрации неорганического фосфата.

3.8.4. Определение активности Са2'-ЛТФазы.

3.8.5. Определение концентрации белка.

3.8.5.1. Определение концентрации белка биуретовым методом.

3.8.5.2. Определение концентрации белка по модифицированному методу Брэдфорд.

3.8.5.3. Определение концентрации белка в пробе с использованием амилового. черного.

4. н; ши.тлты II оксуждмии-:.

4.1. Oiimimiiuiiiiii мсгоднкн выделении аннсксниов.

4.1.1. Оптимизация методики получения бесклеточных экстрактов из скелетных мышц.

4.1.1.1. Ионообменная хроматография аппекеппов.

4.1.2. ВЕлделение аннексинов из печени.

4.1.2.1. Получение и характеристика препарата суммарных анпекеннов.

4.1.2.2. Получение очищенных препаратов аннексинов Л5 и А6.

4.2. Влшпшс попов двухвалентных металлов па опосредуемую аннсксппамн агрегацию лппосом.

4.3. Гетерогенность анпекеннов в бескл сточных экстрактах, нндунпрусман iioiiumii Са2*.

4.4. Обнаружение разных форм индивидуальных анпекеннов в препаратах клеточных мембран.

4.5. Влшпшс аннскспшш А5 п Л6 на активность Са2+-АТФазы саркоплазматпческого ретпкулума.

4.5.1. Выделение очищенных препаратов мембран саркоплазматпческого ретикулума.

4.5.2. Оценка влияния аннексина А6 на активность Са2+-АТФазы саркоплазматпческого ретикулума.

4.6. Образование прочно-евпзаппых форм апиекеппов па мембранах, не содержащих белков.

4.7. Поиск белков саркоплазматпческого ретпкулума, снизывающихся с аннекеппом А6.

4.7.1. Поиск белков-мишеней среди интегральных белков мембран саркоплазматпческого ретикулума.

4.7.2. Поиск белков-мишенеп среди периферических белков мембран саркоплазматпческого ретикулума.

5. ВЫВОДЫ.

6. Цитированная литература.

СПИСОК" ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИИ лл - акриламид

ЛТФ - аденозии трифосфат

БСЛ - бычий сывороточный альбумин дтт - дитпотрейтол

МГ.Л- N, N'-метилен-бисакриламид иллг- полиакриламидный гель пэг - полиэтилснгликоль

CP - саркоплазматичсский ретикулум

СФ - спектрофотометр

ФМСФ- фенилметилсульфонилфторид

Трис - трис(п1дроксимет11л)ам1июметан

ТХУ - трихлоруксусная кислота эгтл- этиленгликоль-бис(-ампноэтиловый офир)-Ы, N, N', N'-тетраацегат эдтл- этилендиамин- N, N, N', N'-тетраацетат

APS - персульфат аммония

Dx - поглощение при длине волны А. им

PBS- фосфатно-солевой буфер

SDS - додецилсульфат натрия

TEN1ED - N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамин

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие аннексинов с белковыми компонентами мембран саркоплазматического ретикулума"

Кальций играет важнейшую роль во многих процессах жизнедеятельности. Одной из основных функций кальция в живых организмах является участие в передаче сигнала и регуляции различных клеточных функций. В живых клетках существует сложная и развитая система поддержания концентрации кальция на необходимом уровне и восприятия колебаний его концентрации. Действие Са21" реализуется через работу множества Са2+-связывающих белков. Одними из эгих белков являются аннексины.

Аннексины — мультигениое семейство Са2+-зависимых фосфолипид-связывающих белков. Отличительной особенностью белков этого семейства является способность Са2+ зависимым образом связываться с природными и модельными фосфолипидпыми мембранами. Белки этого семейства находят у всех эукариот, они присутствуют во всех тканях организма, однако биологические функции этих белков до сих пор однозначно не установлены. Обнаружено участие аннексинов в таких процессах, как мембранный транспорт, слияние внутриклеточных секреторных пузырьков с плазматической мембраной в ходе экзоцитоза, организация структу рных доменов мембран, транспорт ионов, адгезия клеток, проведение сигнала, а также наличие у аннексинов противовоспалительной и антикоагулянтной активности (Moore, Dedman, 1982, Geisowet al., 1984, 1987, Burgoyne, Geisow, 1989, Romisch, Paques, 1991, Creutz, 1992, Gerke, Moss, 1997, 2002, Gerke et al., 2005). Функция аннексинов в мышечной клетке до сих пор окончательно не установлена.

В скелетных мышцах кальцием регулируется их основная функция - сокращение. Саркоплазматический ретикулум служит внутриклеточным депо кальция. Концентрация кальция в цитоплазме клетки регулируется кальциевыми каналами и активными переносчиками, в том числе Са^-АТФазои саркоплазматического ретикулума, а также Ca2t-связывающими белками (они также принимают участие в транедукции кальциевого сигнала).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что в скелетных мышцах присутствуют такие представители семейства аннексинов, как аннексии А6, А5, А4 и A3. Основная доля приходится на аннексии А6, значительно менее представлен А5, а А4 и A3 находятся лишь в небольшом количестве. Аннексины в скелетных мышцах локализуются в сарконлазмагическом ретикулуме (Melgunov et al., 1990), поэтому изучение аннексинов саркоплазматического ретикулума может оказаться пролезпым для установления тонких механизмов регуляции мышечного сокращения.

Одним из направлении таких исследований может быть изучение взаимодействия аннексинов с компонентами мембран сарконлазматического ретикулума. Так, например, крайне интересной является способность образовывать прочные, Са^-независимые связи с мембранами (Raeymaekerse al.,1985). В таком случае аннексины перестают экстрагироваться растворами хелаторов и требуют для солюбнлизацни обработки детергентами. Механизм образования аннексинами таких связей в различных тканях остается неизученным, хотя можно предположить, что в нем могут принимать участие как белковые, так и липидные компоненты мембран, а также, возможно, ионы других, помимо Са2\ двухвалентных металлов.

Поэтом}', целю настоящей работы было изучить взаимодействие аннексинов А5 и А6 с различными компонентами мембран сарконлазматического ретикулума.

Исходя из поставленной цели, были сформулированны следующие задачи:

1) разработать и наладить метод получения высокоочшценных препаратов аннексинов А5 и А6;

2) изучить влияние ионов двухвалентных металлов на опосредуемую аннексинами агрегацию липосом;

3) выяснить, образуют ли аипексины сарконлазматического ретикулума формы, связанные с мембранами Са2+-независимым образом;

4) проверить, способны ли аннексины А5 и Аб прочно связываться с мембранными везикулами, не содержащими белков;

5) оценить влияние аннексинов А6 и А5 на активность основного фермента сарконлазматического ретикулума - Са2<-зависимой АТФазы;

6) провести поиск белков мембран сарконлазматического ретикулума, связывающихся с аииексином А6.

В связи с конкретностью задач, стоящих перед нами, в обзоре литературы мы решили ограничиться рассмотрением только тех работ, которые были наиболее близки к теме наших исследований.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Аннексины

Аннексииы представляют собой мультигснпос семейство кальций- и фосфолипид-связывающих белков, характеризующихся также общими структурными особенностями. В присутствии Са24" аннексииы переходят из растворенного состояния в связанное с мембраной, содержащей отрицательно заряженные фосфолипнды. Аннексииы повсеместно встречаются во всех трех царствах эукариот и высоко консервативны по своей структу ре, что может указывать на выполнение ими какой-то фундаментальной функции.