Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование модельных и биологических мембран методом триплетных зондов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Меклер, Владимир Маркович

ВВЕДЕНИЕ.Стр.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

§ I. Изучение поступательной диффузии молекул в мембранах.

§ 2. Применение триплетных меток и зондов в биологических исследованиях.

Глава П. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

§ I. Основные реактивы

§ 2. Регистрация кинетики затухания замедленной люминесценции

§ 3. Липосомы и биологические мембраны

§ 4. Встраивание зондов и меток в мембраны

§ 5. Удаление кислорода из исследуемых растворов.

§ 6. Обработка и интерпретация экспериментальных результатов по кинетике тушения триплетных зондов в мембранах.

Глава Ш. ВЫБОР МЕМБРАННЫХ ТРИПЛЕТНЫХ ЗОНДОВ

§ I. Фосфоресцентные зонды.

§ 2. Зонды испускающие аннигиляционную замедленную флуоресценцию.

Глава ГУ, ИССЛЕДОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ МЕМБРАН

§ I. Зонды - тушители триплетных молекул.

§ 2. Исследование локализации эритрозина в липосомах из яичного лецитина

§ 3. Изучение диффузионной подвижности молекул в липосомах.

§ 4. Применение явления сенсибилизации замедленной флуоресценции для регистрации столкновений зондов в мембранах.

Глава У. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАННЫХ СИСТЕМ

§ I. Изучение локализации активного центра Са,М^ зависимой АТФазы в саркоплазматическом ретикулуме.

§ 2. Исследование структуры белков липидного матрикса мембраны саркоплазматического ретикулума.

§ 3. Изучение локализации хинонного кольца убихинона

О - 10 в ли по с омах из дипальштоилфосфатидилхолина.

§ 4. Изучение локализации гемовых групп цитохромов

Р-450 и в микросомальной мембране.

§ 5. Исследование межбелковых взаимодействий методом триплетных меток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование модельных и биологических мембран методом триплетных зондов"

Важнейшая биологическая роль мембран в настоящее время общецризнана. С функционированием мембран связаны такие ключевые биологические процессы как фотосинтез, окислительное фосфорилирование, проведение нервного импульса и т.д.

Для изучения мембран разработано большое количество разнообразных физико-химических методов. Однако ввиду чрезвычайной сложности биомембран информация, получаемая традиционными методами, часто бывает недостаточной для понимания молекулярной природы биологических явлений. В связи с этим наряду с повышением точности и надежности известных экспериментальных подходов постоянно создаются принципиально новые биофизические методы, нередко основанные на результатах последних достижений фундаментальных физических исследований.

В последние годы широкое распространение в биологии получили методы физических меток и зондов, в первую очередь методы флуоресцентных и спиновых меток и зондов ^. По установившейся терминологии метками, в отличии от зондов, называют соединения, ковалентно присоединяемые к исследуемому объекту. При исследовании мембран разделение меток и зондов по этому признаку часто является условным. Поэтому в данной работе везде, кроме особо оговариваемых случаев, вместо "метки и зонды" использовали термин "зонды".

Методы зовдов играют большую роль в изучении структуры и свойств биологических мембран. Очень большое число работ посвящено изучению микровязкости мембран и подвижности отдельных молекул в мембранах путем исследования вращательной и поступательной диффузии спиновых и флуоресцентных зондов. Однако такие варианты метода зондов применимы, как правило, только к изучению сравнительно быстрых процессов, характерные времена которых соизмеримы с собственными характеристическими временами спиновых и флуоресцентных зондов. Время жизни возбузденного син-глетяого состояния флуоресцентных зондов обычно составляет Ю^-Ю""^ сек /I/, время спин-спиновой релаксации нитроксильных радикалов, определяющее форму линии спектра ЭПР при стандартном о до варианте метода ЭПР, в мембранах находится в пределах 10 -10 с.

2,3/. Таким образом исследование динамических процессов даннып -9 ми методами ограничено диапазоном характерных времен 10 -10 с.

При изучении мембран часто возникают задачи связанные с регистрацией более медленных цроцессов, таких как, например,диффузия в жестких мембранах, вращательная диффузия белков в мембранах, медленные конформационные перестройки, столкновения диффундирующих белков и других мембранносвязашшх компонентов. Одним из путей изучения сравнительно медленных цроцессов является црименение в качестве зовдов молекул хромофоров, возбужденных в триплетное состояние - так называемых триплетных зондов /4,5/. Время жизни триплетного состояния многих молекул в жидких растворителях составляет десятки миллисекунд, а в твердых матрицах достигает нескольких секунд /6/. Поэтому триплетные зонды могут быть удобным инструментом при исследовании про

6 X цессов с характерными временами 10 - 10 с. Однако большое значение делает триплетные состояния очень чувствительными к тушащим цримесям и в первую очередь к молекулярному кислороду. Чувствительность спектроскопических методов регистрации триплетных молекул обычно значительно ниже, чем широко распространенного метода флуоресценции. Трудности, связанные с применением спектроскопии триплетных состояний в мембранологии, по-видимому, являются причиной того, что основные работы в этой области посвящены методически наиболее цростой задаче исследования вращательной диффузии мембранных белков. Работы, связанные с изучением поступательной диффузии с помощью триплетных зондов, в настоящее время практически отсутствуют. В тоже время данный подход может стать полезным дополнением к существующим методам исследования мембран. В принципе его можно использовать при решении следующих основных задач:

I. Изучение микровязкости и структуры мембран путем регистрации кинетики диффузионно-контролируемых взаимодействий триплетных зондов.

Изучение кинетики диффузионных взаимодействий с помощью спиновых и флуоресцентных зовдов часто используется цри исследовании микровязкости мембран. Однако для того, чтобы зарегистрировать эту кинетику на фоне коротких характеристических времен данных типов зондов, в мембрану приходится вводить большие количества взаимодействующих соединений. При этом их локаль

-Т ные концентрации в мембранах достигают 10 М и выше, что может нарушить нативную структуру мембраны. Применение триплетных зондов позволяет на несколько порядков снизить концентрацию в водимых веществ и практически исключает возможность повреждения мембран.

Анализ кинетики диффузионно-контролиру емых процессов является также распространенным способом изучения структуры белково-липидной матрицы /1,2/. Однако из-за быстрой дезактивации возбужденных состояний спиновых и флуоресцентных зондов перемещения зондов за время жизни возбужденного состояния сравнительно малы. Даже для наиболее долгоживущего флуоресцентного зонда пирена среднеквадратичное смещение возбужденной молекулы в мембрао нах составляет 20-40 А /I/. Это существенно ограничивает пространственные масштабы изучения структуры мембран с помощью флуоресцентных и спиновых зондов. С другой стороны существующие методы изучения макроскопических перемещений (восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания, фотокорреляционная спектроскопия, импульсный ЯМР в градиенте поля) позволяют регистрировать перемещения протяженностью не менее нескольких микрон и требуют жесткой фиксации мембраны. Поэтому данные методы применимы для исследования диффузии только в клеточных и в крупных модельных мембранах.Структуру мембран большинства внутриклеточных органелл и многочисленных мембранных систем, получаемых в виде небольших везикул, таким способом исследовать нельзя.

Как легко подсчитать, среднеквадратичное смещение триплетной молекулы в латеральной плоскости мембраны за время жизни триплетного состояния Ю~4с цри коэффициенте диффузии 4 10*~§м2 т о с составит 400 А . Отсюда следует, что применение триплетных зондов, позволяющее изучать такие сравнительно большие перемещения в мембранах любого размера, дает возможность ликвидировать существующий разрыв между крупномасштабными методами изучения поступательной диффузии и методами спиновых и флуоресцентных зондов.

2. Определение локализации функциональных групп биологических молекул в мембранах.

Многие биомолекулы имеют в своем составе химические соединения, являющиеся хорошими тушителями триплетных состояний различных хромофоров. В число таких групп тушителей входят гем, порфирин, флавин, хиноны, различные ионы переходных металлов и т.д. Как правило, диффузионное тушение триплетных состояний происходит по механизму обменно-резонансного переноса энергии или переноса заряда, то есть в результате обменных взаимодействий /7/. В отличии от диполь-дипольных взаимодействий, эффективно дезактивирующих возбужденные синглетные состояния, обменные взаимодействия быстро убывают с расстоянием. Поэтому тушение триплетных состояний происходит цри непосредственном контакте триплетной молекулы с тушителем. Благодаря этому исследование кинетики тушения зраплетных зодцов, локализованных в разных частях мембраны, можно использовать для определения локализации соответствующего биологического тушителя или хромофора. Необходимая для экспериментальной регистрации дезактивации триплетных зондов концентрация тушащих центров не превосходит обычную физиологическую концентрацию многих белков тушителей в мембранах.

3. Исследование кинетики диффузионных контактов мембранных белков.

Известно, что многие биохимические реакции протекают в ходе диффузионно возникающих контактов мембранных белков /8/. В настоящее время отсутствуют экспериментальные методы изучения кинетики таких контактов. Дня решения этой задачи можно пометить одни из белков триплетной меткой, а другие - меткой тушителем. Столкновения белков можно изучать и регистрируя замедленную ; флуоресценцию, испускаем^ в цроцессе триплет-триплетной аннигиляции связанных с белками меток. При исследовании белок «белковых контактов, в принципе, могут быть использованы собственные хромофоры и тушащие группы белков.

4. Изучение процесса переноса электронов.

Многие биологические молекулы, способные тушить триплетнне состояния, функционируют в мембранах в качестве переносчиков электронов. Процесс переноса электронов, также как и тушение триплетных состояний, связан с перекрыванием волновых функций взаимодействующих центров. Поэтому тушение триплетных зондов,в известной степени может моделировать перенос электронов /9/.

Целью настоящей работы является разработка метода исследования строения и динамических свойств мембран с помощью триплетных зондов.

Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав и заключения.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Меклер, Владимир Маркович

Основные результаты, полученные в диссертационной работе, состоят в следующем:

1. В модельных и биологических мембранах зарегистрирована замедленная люминесценция более чем 20 соединений, которые могут быть использованы как мембранные триплетные зонды. Впервые предложено использовать в качестве мембранных зондов соединения, испускающие аннигиляционную замедленную флуоресценцию. Времена .жизни возбужденных триплетных состояний, применявшихся в работе триплетных зондов в модельных и биологических мембранах составляют 10"^ - Ю-*3 с.

2. На примере изучения кинетики тушения триплетных состояний зондов в фосфатидилхолиновых липосомах показано, что метод триплетных зондов может быть использован для исследования локализации и подвижности в мембранах молекул триплетных зондов и тушителей триплетных состояний. Тушение триплетных зондов в липосомах из ДШ?Х при 30°С регистрируется при введении в липосо

4 ^ мы одной молекулы тушителя (ферроцена) на 10 - 10 молекул фосфолипидов. Концентрации самих триплетных зондов, необходимые 7 для регистрации замедленного свечения, также невелики - 10 с

- 10 М. Применение таких низких концентраций взаимодействующих молекул позволяет практически исключить возможность повреждения мембраны при встраивании зондов.

3. Триплетный зонд эритрозин встраивается в АТФазный ак

На основании исследования кинетики тушения фосфоресценции эрит-розина тушителями различной полярности сделан вывод о том, что тивный центр саркоплазматического ретикулума

АТФазный центр экспонирован в водную фазу и не контактирует с липидным бислоем.

4. В мембранах СР изучена кинетика взаимодействий триплетных зондов между собой и с гидрофобным тушителем ферроценом. Сделан вывод о том, что в саркоплазматическом ретикулуме существуют протяженные участки липидного бислоя, свободные от значительных црепятствий для диффузии зондов. Характерные размеры таких участков не меньше 20 гол.

5. Хинонное кольцо встроенного в липосомы из дипальмитоил-фосфатидилхолина убихинона & -10 при 45°С эффективно тушит триплетные состояния зондов, локализованных в полярных и гидрофобных областях липосом. Тушение триплетных состояний эритрозина происходит также при 30°С, т.е. при температуре ниже температуры плавления ДПФХ (41°С). Сделан вывод, что хинонное кольцо Ц (2 -10 может находиться как в гидрофобных, так и в полярных частях липосом.

6. Цитохромы в^ и Р45о не тушат аннигиляционную замедленную флуоресценцию гидрофобных триплетных зондов в микросо-малькой мембране. Из этого результата следует, что гемовые группы этих белков не контактируют с неполярной частью липидного бислоя.

7. На цримере исследования межбелковых взаимодействий

Г) Г) молекул Са , АТФазы саркоплазматического ретикулума показано, что триплетные метки могут быть использованы для изучения динамических белок-белковых контактов в мембранах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты, изложенные в диссертационной работе, свидетельствуют о том, что метод триплетных зондов открывает новые возможности при изучении динамических свойств мембран и локализации отдельных мембранных компонентов. Эти возможности появляются благодаря чувствительности триплетных молекул к сравнительно редким динамическим взаимодействиям с другими молекулами, обладающими тушащими или сенсибилизирующими свойствами. Например, как отмечалось выше, триплетные зонды позволяют регистрировать кинетику тушения возбужденных состояний в липосомах л ^ при введении в липосомы I молекулы тушителя на 10 -10 молекул фосфолипида.

Основным параметром, определяющим чувствительность триплетных зондов к редким столкновениям является время жизни трип-летного состояния ( Т^ г). В данной работе удалось подобрать значительное количество соединений, молекулы которых в различных модельных и биологических мембранах имеют % т в пределах 10 - 5 10 с. Такие сравнительно длинные времена жизни возбужденных состояний позволяют изучать вязкостные свойства мембран путем регистрации кинетики диффузионно-контролируемых процессов, в мембранах с повышенной вязкостью. При этом концентрации вводимых в мембраны соединений, необходимые для регистрации динамических межмолекулярных взаимодействий, на 2-4 порядка меньше, чем концентрации применяемых с аналогичной целью спиновых и флуоресцентных зондов. Использование низких концентраций триплетных зондов и зондов тушителей позволяет практически исключить возможность повреждения структуры мембраны при встраивании зондов. Как показано в работе, применение триплетных меток дает возможность регистрировать даже такие медленные процессы, как диффузионные взаимодействия молекул, ковалентно присоединенных к мембранным белкам.

Преимущества триплетных зондов при изучении динамических взаимодействий хорошо иллюстрирует следующий пример. В недавно вышедшей работе /140/ подробно исследовалось тушение флуоресценции жирнокислотных производных антрацена различными убихинонами в фосфолипидных липосомах. Авторы обнаружили, что убихиноны с длинными изопреновыми цепочками слабо тушат флуоресценцию. В частности тушение флуоресценции убихиноном (3 -10 не удалось обнаружить даже цри отношении молярных концентраций убихинона &- 10 и фосфолипида 1:20. В то же время в главе 5 диссертации показано, что взаимодействия антраценовых жирнокислотных зондов с убихиноном (3-10 в липосомах регистрируются по тушению АЗФ, с большим запасом по чувствительности, цри введении в липосомы I молекулы убихинона (3 -10 на 300 молекул липида.

Среди предложенных в работе триплетных зондов имеются гидрофобные, полярные и амрпатические соединения с различными размерами и энергиями синглетных и триплетных уровней. Возможность црименения большого числа соединений в качестве зондов связана, в первую очередь, с широко применявшимся в работе методом регистрации триплетных молекул с помощью измерения испускаемой ими аннигиляционной замедленной флуоресценции (АЗФ). В то же время цри малой интенсивности АЗФ измерения замедленной флуоресценции часто осложняются из-за артефактных сигналов, возникающих цри попадании в фотоумножитель быстрой флуоресценции, спектрально совпадающей с АЗФ. В связи с этим введение в регистрационную установку оптического затвора, не пропускающего быструю флуоресценцию, должно значительно расширить возможности метода триплетных зондов. Важными условиями дальнейшего совершенствования предлагаемого метода являются также направленный синтез триплетных меток и меток тушителей с различными спектральными и химическими свойствами, применение более избирательных и мощных источников возбуждения хромофоров, а также использование современной техники автоматической обработки регистрируемых сигналов.

Одним из наиболее перспективных приложений метода триплетных зондов представляется исследование локализации тушителей и хромофоров в мембранах. Как отмечалось выше, тушителями триплетных состояний зондов могут быть различные биологические соединения,обладающие окислительно-восстановительными свойствами или имеющие триплетный уровень с низкой энергией. Полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что локализацию тушащих центров биологических молекул можно изучать как в модельных липосомах, так и в природных мембранах. Полезную информацию можно получить и изучая локализацию искусственно вводимых в мембраны тушителей и хромофоров. Это, прежде всего, относится к исследованию локализации биологически активных соединений. Исследование доступ ности присоединенной к белку метки для взаимодействия с другими молекулами позволяет также сделать выводы о локализации данного белка в мембране. Таким путем можно, например, выяснить находится ли данный белок в мембране в виде мономера или же в комплексе с другими белками.

Значительный интерес может представить применение триплет-ных зондов для исследования мембранной цроницаемости. Известно, что Мп^+, Со^+, Т1+ и редкоземельные ионы способны в некоторых транспортных системах заменять природные ионы или ингибиро-вать их транспорт. С другой стороны, вышеперечисленные ионы способны тушить люминесценцию возбужденных молекул, а Т1+ и некоторые редкоземельные ионы к тому же сами люминесцируют. Исследования взаимодействия этих ионов со специально подобранными триплетными зондами может сыграть важную роль в изучении механизмов мембранного транспорта.

Кроме применявшихся в диссертационной работе в качестве зондов ароматических молекул в дальнейших исследованиях можно использовать неполярные комплексные соединения переходных металлов. Некоторые соединения такого типа испускают в растворах долгоживущую люминесценцию. Интересная особенность многих люми-ноесцирующих комплексных соединений состоит в том, что их возбужденные состояния практически не тушатся по механизмам переноса заряда и триплет-триплетного переноса энергии, но могут тушиться по механизму диполь-дипольного переноса энергии /99, 100/. Такое сочетание длинного времени жизни с дальнодействую-щим диполь-дипольным механизмом тушения может обеспечить зондам данного типа определенные преимущества цри изучении локализации интенсивно окрашенных молекул.

В заключение отметим, что все применявшиеся триплетные зонды испускают быструю флуоресценцию. Благодаря этому триплетные зонды можно одновременно использовать и как флуоресцентные зонды. В качестве тушителей некоторых триплетных зондов могут применяться стабильные нитроксильные радикалы, за которыми удобно следить методом ЭПР. Такой комбинированный подход к изучению мембран, неоднократно применявшийся в диссертационной работе, позволяет получать информацию в широком диапазоне характеристических времен и значительно расширяет возможности каждого в отдельности взятого метода.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Меклер, Владимир Маркович, Черноголовка

1. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. "Флуоресцентные зонды в исследованиях биологических мембран". М., НаукаД980, 320 с.

2. Лихтенштейн Г.И. "Метод спиновых меток в молекулярной биологии". М., Наука, 1974, 256 с.

3. Кузнецов А.Н. "Метод спинового зонда". М., Наука, 1976,210с.

4. Cherry R.J. "Protein mobility in membranes". FEBS Lett., 1975, v.55, No.1, p.1-7.

5. Котельников А.И., Кузнецов C.H., Фогель В.Р., Лихтенштейн Г.И. Исследование микроструктуры биологических систем методом триплетных меток. Мол.биол.,1979,т.13,И, с.152-159.

6. Мак-Глинн С., Адзуми Т., Киносита М. Молекулярная спектроскопия триплетного состояния. М., Мир, 1972, 448 с.

7. Ермолаев В.Л., Бодунов Е.Н., Свешникова Е.Б., Шахвердов Е.А. Безызлучательный перенос энергии электронного возбуждения. Д., Наука, 1977, 311 с.

8. Капрельянц А.С. Динамические белковые ансамбли в биологических мембранах. Биохимия, 1982, т.47, № 6, с.883-895.

9. Лихтенштейн Г.И. Многоядерные окислительно-восстановительные металлоферменты. М., Наука, 1979, 323 с.

10. Котельников А.И., Фогель В.Р., Лихтенштейн Г.И. и др. Исполь зование явления дезактивации возбужденных триплетных состояний для исследования строения и электронной цроводимости белков. Мол.биол. ,1981, т. 15, Ш, с.281-289

11. Hauaka G. Plasto and ubiquinone as translocators of electrons and protons through membranes. A facilitating role of isoprenoid side chain. FEBS Lett., 1977, v.79, No.2, p.345--347.

12. Hackenbrock C.R. Lateral diffusion and electron transfer in the mitochondrial inner membrane. Trend.Biochem.Sci., 1981, v.6, No.6, p.151-154.

13. Pastan J.H., Willingham M.C. Journey to the center of the cell: role of the receptosome. Science, 1981, v.214,1. No.4520, p.504-509.

14. Мид Дж. Свободнорадикальные механизмы повреждения липидов ии их значение для клеточных мембран.- В кн. Свободные радикалы в биологии. М., Мир, 1979, т.1, с.68-88.

15. Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт. М., Мир, 1980,341 с.

16. МсName M.G., McConnel Н.М. Transmembrane potentials and phospholipid flip-flop in excitable membrane vesicles. Biochemistry 1973, v.12, No.16, p.2951-2958.

17. Alwattar A.H., Michael D.L., Birks J.B. Diffusion controlled rate process. in Organic molecular photophysics, N.-Y.-L., John Wiley and Sons, 1975, p.403-456.

18. Donner M., Bouchy M., Virio M.-L., Andre J.-G. Spectrofluori-metric methods for the measurements of the so called "micro-viscosity" of lipid structures. Biochimie, 1981, v.64, No.11--12, p.961-965.

19. Weaver D.L. Note on the interpretation of lateral diffusion coefficients. Biophys.J., 1982, v.38, No.3, p.311-313.

20. Ивков В.Г., Берестовский Г.И. Липидный бислой биологических мембран. М., Наука, 1982, 224 с.21« Romberg R.D., McConnell Н.М. Lateral diffusion of phospholipids in a vesicle membrane. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1971, v. 68, No.10, p.2564-2568.

21. Ulmius J., Wennerstrom H., Lindblom G., Arvidson G. Proton NMR :bandshape studies of lamellar liquid crystalls and gel phases containing lecithins and cholesterol. Biochim.Biophys. Acta, 1975, v.389, No.2, p.197-202.

22. Cullis P.R. Lateral diffusion rates of phosphatidylcholine in vesicle membranes: effects of cholesterol and hydrocarbone phase transition. PEBS Lett., 1976, v.70, No.1,p.223-228.

23. Buraell E.E., Chillis P.K., De Kruiff B. Effects of tumbing and lateral diffusion on phosphatidylcholine model membrane P31-NMR line shapes. Biochim.Biophys.Acta, 1980, v.603, No.1, p.63-69.

24. Kuo A.L., Wade C.G. Lipid lateral diffusion by pulsed nuclear magnetic resonance. Biochemistry, 1979» v.18, No.11, p.2300-2308.

25. Devaux P., McConnel H.M. Lateral diffusion in spin labeled phosphadylcholine multibilayers. J.Am.Chem.Soc., 1972, v.94, No.13, p.4475-4481.

26. Trauble H., Sackman E. Studies of the crystalline-liquidcrystalline phase trantions of lipid model membranes. III.

27. Structure of steroid lecithin system below and above lipidphase transition. J.Am.Chan.Soc., 1972, v.94, No.13,p.44994510.

28. Devaux P., McConnel H.M. Equality of the rates of the lateral diffusion of phosphatidylcholine and phosphatidyl-ethanolamine in rabbit sarcoplasmic reticulum. Ann.N.Y. Acad.Sci., 1973, v.222, p.489-496.

29. Seigneuret M., Davoust J., Nerve P., Devaux P. Lipid-lipid and lipid-protein collision rates in membranes. Determination by evaluation of spin-spin interaction betweenand 14N spin labels. Biochimie, 1981, v.63, No.11-12,p.867871.

30. Kasumi A., Subszynski W.K., Hyde J.S., Oxygen transport parameter in membranes as deduced by saturation recovery measurements of spin lattice relaxation time of spin labels. Pro с.Nat.Acad.USA, 1982, v.79, No,6, p,1854-1858.

31. Омельяненко В.Г., Михайлов A.M., Торчилин В.П., Смирнов В.К., Гольданский В. И. "Свободнорадикальная метка новый подходк исследованию динамики липидных систем". Мол.биол.,1981, т.15, Ж, с.54-61.

32. Prye L.D., Edidin H. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.

33. J.Cell Sci., 1970, v.7, No. 2 , p.319-335.

34. Poo M., Cone R.A. Lateral diffusion of rodopsin in the pho-toreceptore membrane. Nature, 1974, v.247, No.5441, p.438--441.

35. Teissie J., Tocane J.-P., Baudras A. A fluorescence approach of the determination of translational diffusion coefficients lipids in phospholipid monolayer at the aii>»water interface. Eur.J.Biochem., 1978, v.83, No.1, p.332-341.

36. Axelrod D., Koppel D.E., S chl es singer J. Mobility measurements by analysis of fluorescente photobleaching recovery kinetics. Biophys.J., 1976, v.11, No.9, p.1055-1069.

37. Peters R., Brunger A., Schulten K. Continuous fluorescence microphotolysis: A sensitive method for study of diffusion processes in single cell. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1981, v.78, No.2, p.962-966.

38. Lepock J.R., Thompson J.E., Kruuv J., Wallach D.F.H. Photo-induced crosslinking of membrane proteins by fluorescein isothicyanate. Biochem.Biophys.Res.Com., 1978, v.85,1. No.1, p.344-350.

39. Sheetz M.P., Koppel D.E. Membrane damage caused by irradiation of fluorescent concanavalim A. Pro c.Nat .Acad. Sei .USA, 1979, v.76, No.7, p.3314-3317.

40. Wolf D.E., Edidin M., Draysten P.R. Effect of bleaching light on measurement of lateral diffusion in cell membranes bythe fluorecsence photobleaching recovery method. Proc.Nat. Acad.Sei.USA, 1980, v.77, No.5, p.2043-2045.

41. Koppel D.E., Sheetz M.P. Fluorescence photobleaching does not alter the lateral mobility of erytrocyte membrane glycoprotein. Nature, 1981, v.293, No.5828, p.159-161.

42. Weisman m.b."Fluctuation spectroscopy" in "Annual Review of Physical Chemistry". 1981, v.32, p.205-233.

43. Fahey P.F., Koppel D.E., Barak L.S. et al. Lateral diffusion in planar lipid membranes. Science, 1977, v. 195, No.4275,p.305-306.

44. Nicoli D.F., Briggs J., Elinys V.B. Fluorescence imunnoassay based on long time correlation of number fluctuations. Proc. Nat.Acad.Sei.USA, 1980, v.77, No.8, p.4904-4908.

45. Forster Th., Kasper К., Ein Konzentrationsumschlag der Fiuoreszens des Pyrens.

46. Z.Electrochem., 1955, v.59, No6 j).977- 981.

47. Паркер С. "Фотолюминесценция растворов", 1972, М. ,Мир, 510 с

48. Donner M. Kinetics of partly diffusion controlled reactions. VII pyrene excimer formation in erythrocyte membranes. Biochem.Biophys.Ees.Com., 1980, v.97, NoO, p.1183-1191.

49. Sackmann E. Application of excimer as optical probes onmembranes research. Z.Phys.Chem.N.F. 1976, v.101, No.2,p.391416.

50. Литвинов И.О., Образцов B.B. "Изучение вязкости свободных и связанных с белком липидов в мембранах.Биофизика", 1982, т.27, М, с.81-86.

51. Дергунов А.Д., Капрельянц А.С., Кабашев А.А. и др. Существование слоя пограничных липидов в реконструированной системе гидрофобный белок-чяипид". Биохимия', 1982, т.47, В 2, с.296-304.

52. McGrath А. Б., Morgan C.G., Radda G.K. Phot о bleaching. A novel fluorescence method for diffusion studies in lipid systems. Biochim.Biophys.Acta, 1976, v.426, No.2, p.173-185.

53. Капо K., Kawazuni H., Ogawa Т., Sumamuto J. Fluorescence quinching in liposomal membranes. Exiplex as a probe for investigation artificial lipid membranes properties. J.Phys. Chem., 1981, v.85, No.15, p.2204-2209.

54. Melnik R.L., Haspel H.C., Goldenberg M., Grecnbaum L.M., Weinstein S. Use of fluorescent probes that form intramolecular eximers to monitor structural changes in model and biological membranes. Biophys.J., 1981, v.34, No.3» p.449-515.

55. Бурштейн Э.А. Собственная люминесценция белка. В кн.: Итоги науки и техники. Серия "Биофизика", т.7, 1977, 190 с.

56. Cheng С., Thomas J.К., Kupla С.P. Dynamics of pyrene fluorescence in Escherichia Coli membrane vesicles. Biochemistry, 1974, v.13, No.6, p.1135-1139.

57. Lo M.M.S., Garland P.B., Lamprecht J., Barnard E.A. Rotational mobility of the membrane bound acetylcholine receptor of torpedo electric organ measured by phosphorescence depolarisation. FEBS Lett., 1980, ▼.111, No.2, p.407-412.

58. Greinert R., Staerk H., Stier A., Weller A. E-type delayed fluorescence depolarisation. A technique to probe rotational motion in the microsecund range. J.Biochem.Biophys.Res. Methods, 1979, v.1, No.2, p.77;:83.

59. Nobuyuki W., Yoshimasa T. Delayed luminescence of pyrene in phosphatidylcholine dispersions. Biochim.Biophys.Acta, 1981, v.647, No.1, p.155-158.

60. Jonson P., Garland P.B. Fluorescent triplet probes for measuring the rotational diffusion of membrane proteins. Biochem.J., 1982, v.203, No.1, p.313-321.

61. Garland P.B., Moor C.H. Phosphorescence of protein bound eosin and eritrosin. Biochem.J., 1979, v.183, N0.3, p.561--572.

62. Vadas E., Melancon P., Braun P.E., Galley W.C. Phosphorescence, studies of the interaction of myelin basic protein with phosphatidilserine vesicles. Biochemistry, 1981, v.20, No.11, p.3110-3116.

63. Dixit B.P.S.N., Moy V.ï., Vanderkooi J.M. Reactions of excited state cytochrome e. derivatives. Delayed fluorescence and phosphorescence of zinc, tin and metall-free cytochrome c at room temperature. Biochemistry, 1984, v.23, No.9,p.2103-2107.

64. Lavorel J. Luminescence. In: Bioenergetics of photosynthesis. 1975, N.Y., Acad.Press, p.233-317.

65. Bolt J., Turro N.J. New probes for surfuctant solutions: phosphorescent labeled detergents. Photochem.Photobiol., 1982, v.35, No.3, p.305-310.

66. Kotelnikov A.I., Fogel V.R., Mekler V.M., Kochetkov V.V.,1.khtenstein G.I. Use of triplet label a new method forprotein and membrane investigation in solutions. in tes.

67. Confer."Water and water solutions in biological Systems",1. Bled. 1981.

68. Austin R.H., Chan S.S., Jovin T.M. Rotational diffusion of cell surface components by time resolved phosphorescence anisotropy. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1979, v.76, No.1, p.5650--5654.

69. Wang J., Hogan M., Austin R.H. et al. Molecular motion of ША as measured by triplet anisotropy. Pro с. Nat. Acad. Sci.

70. USA, 1982, v.79, No.12, p.3518-3522.

71. Wang J., Hogan M., Austin R.H. DNA motions in the nucleo-some core particle. Proс.Nat.Acad.Sci.USA, 1982, v.79, No.19» p.3886-5890.

72. Wagner R., Carrillo N., Junge W. et al. Conformational changes of the isolated ferredoxin NADP - oxidoreductase upon nucleotide binding as revealed by the triplet lifetime of bound eosin - SCN. FEBS Lett., 1981, v.131, No.2,p.335-340.

73. Horie 2?., Vanderkooi J.M. Phosphorescence of tryptophan from parvalbumin and actin in liquid solution. FEBS Lett., 1982, v.147, No.1, p.69-73.

74. Мажуль B.M., Б^молаев Ю.С., Конев С.В. "Триптофановая фосфоресценция цри комнатной температуре новый метод изучения структурного состояния биологических мембран и белков в клетке.Ж.прикл.спектр.,1980, т.32, №5, с.903-908.

75. Fleishman D.E. Delayed fluorescence and the reversal of the primary photochemistry in Rhodopseudomonas viridis. Photochem.Photobiol., 1974, v.19, No.1, p.59-68.

76. Шин И.В., Фогель В.Р., Котельников А.И., Лихтенштейн Г.И. Исследование структуры и внутримолекулярной динамики фотоактивного пигмент белкового комплекса эозин-казеин.Биофизика, 1982, т.27,ЖЕ, с.5-9.

77. Шин И.В.,Котельников А.И. »Лихтенштейн Г.И. Кинетика реакций фотопереноса электрона в комплексе эозин-казеин. Биофизика, 1982, т.27, Л2, с.208-211.

78. Razi-Nagvi К., Behr J.-Р., Chapman D. Methods for probing lateral diffusion of membrane components: triplet-triplet annigilation and triplet-triplet energy transfer. Chem.Phys. Lett., 1974, v.26, No.3, p.440-444.

79. Huang C.H. Studies on phosphatidylcholine vesicles: Formation and physical characteristics. Biochemistry, 1962, v.8, No.1, p.344-353.

80. В.Б.Ритов, В.И.Мельгунов, Л.Г.Комаров и др. Интегральные белки мембран саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика и карпа. ДАН СССР, 1977, т.233, №4, с.730-733

81. Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Spectrometric method of determination of protein concentration. J.Biol.Chem., 1951, v. 193, p.265-¿71.

82. В.Б.Ритов Влияние ацетилхолина и кофеина на функциональную активность фрагментированного саркоплазматического ретикулума, Биохимия, 1971, т.36, Ш, с.393-400.

83. Ритов В.Б. Молекулярная организация и механизм функционирования Са^+~ зависимой АТФазы саркоплазматического ретикулума.

84. В сб.Итоги науки и техники, серия Биологическая химия, М., ВИНИТИ, 1977, т.II, с.5-78

85. Есыр ,8в О.В. Роль транспортных АТФаз в электромеханическом сопряжении мышц. Алма-Ата, Наука, 1983, 285 с.вб.Барузина Г.И., Менгазетдинов Д.Э. и др. Выделение и свойства цитохрома Р-450 из микросом печени кролика.Биохимия,1979, т.44,№5, с.1049-1057.

86. Cherry R.J., Cogoli A., Oppliyer М., Shneider G., Semeneza G., A spectroscopic technique for measuring slow rotational diffusion of macromol ecul es. I Preparation end properties of a triplet probes. Biochemistry,1976,v.15,No.17,p.3653

87. Weltman J.K., Szaro R.P. et al. N-(3-pyrene)malimide: a long time lifetime fluorescent sulfhydryl reagent* J»Biol. Chem., 1973, v.248, Ho.9, p.3173-3177,

88. Справочник химика.M., Химия, 1964, т.З, 1008 с

89. Peterson J.A., Ebel R.B. et al. temperature dependence of cytochrome P-450 reduction. A model for NADPH cytochrome P-450 interaction. J.Biol.Chem., 1976, v.251-, No.13,p.4010-4016.

90. З^ницкий H.H., Каминский B.A., Тимашев С.Ф. Методы физико-химической кинетики.M.,Химия,1972, 198 с.

91. Owen C.S. Two-dimensional diffusion theory: cylindrical diffusion model applied to fluorescence quenching. J.Chem. Phys., 1975, v.62, No.8, p.3204-3207.

92. Hardt S.L. Rates of diffusion controlled reactions in one, two and three dimensions. Biophys.Chem., 1979, v.10, No.3-4, p.239-253»

93. Axelrod D. Lateral Motion of membrane proteins and biological functions. J.Membr.Biol., 1983, v.75, No.1, p.1-10.

94. Врунов П.А., Каминский В.Б., Тимашев С.Ф. О кинетикие рекомбинации активных центров. Теор.эксп.химия, 1974, т.10, №3, с.380-384

95. Левин С.В. Структурные изменения клеточных мембран.Л,Наука, 1976, 224с.

96. Bakstrom H.L., Sandros К. The quenching of the long-lived fluorescence of biacetyl in solution. Acta Chem.Scand., 1958, v.12, No.5, p.823-832.

97. Золин В.Ф., Коренева Л.Г. Редкоземельный зонд в химии и биологии. М.,Наука, 1980, 282с.

98. Ермолаев В.А. .Свешников Е.Б. ,П1ахвердов Т.А. Изучение комплексообразования между органическими молекулами и ионами редкоземельных элементов в растворах методом переноса электронной энергии.Успехи химии,1976, т.45, M0,c.I753-I78I

99. Balzani V., Moggi L., et al. Quenching and sensitization processes of coordination compounds. Coord.Chem.Rev., 1975, v.15, Ho.4, p.321-433.

100. Ю1. Меклер B.M. »Котельников А.И. »Лихтенштейн Г.И. Применение зондов, испускающих аннигиляционную замедленную флуоресценцию для исследования модельных и биологических мембран. Биофизика, 1983, т.28, №3, с,503-504.

101. Parker С.А., Hatchard C.G. Delayed fluorescence from solutions of anthracene and phenanthrene. Proc.Roy.Soc., v.269, »0.1339, p.574-584.

102. ЮЗ. Бартлон Д., Койл Д. Возбужденные состояния в органической химии.М., Мир, 1978, 446 с.

103. Engel P.S., Woods T.L., Page M.A. Quenching of excited triplet sensitizers by organic peroxides. J.Phys.Chem., 1983, v.87, No.1, p.10-13.

104. Чибисов А.К. Перенос электронов в фотохических реакциях. Успехи химии,1981, т.50, №7, с.1169-1196

105. Crysochoos J., Grossweiner L.J. Plash photolysis of several aromatics by ultraviolet light and visible light in the presence of eosin Y. Photochem.Photobiol., 1968, v.8, No.3, p.193-208.

106. Арчаков А.й. Оксигеназы биологических мембран.M.,Наука, 1983, 56с.

107. Коробов В.Е. »Чибисов А,К. Первичные фотоцроцессы в молекулах красителей. Успехи химии, 1983, т.52, ЖЕ, с.43-71.

108. Birks J.B. Photophysics of aromatic molecules. 1970, L., Wiley-Interscience, 496.

109. Gorner H., Schulte-Frohlinde. Observation of a triplet state of azulene generated by energy transfer in solution. J.Photochemistry, 1981, v.16, No.9, p.169-177.

110. Freed J.H., Fraenkel G.K. Theory of linewidth in electron spin resonance spectra. Chem.Phys., 1963, v.39, No.1,p.226-230.

111. Tank D.W., Wu E.S., Meers P.K., Webb W.W. Lateral diffusion of gramicidin С in phospholipid multibilayers. Biophys.J., 1982, v.40, No.2, p.129-135.

112. Котельникова Р.А., Татьяненко Л.В.,Маклер В.М.,Котельников А.И., Исследсв ание каталитически активного центра CsTmc^ зависимой АТ„Фазы саркоплазматического ретикулума методом триплетных зондов.Мол.биол.1982, т.16, }&6, с.1188-11932+

113. Inesi G., Kuzzmack М., The Са т dependent ATPase of sarcoplasmic reticulum, in: Biomembrane structure and function. NrY.L., 1984, p.355-410.

114. Stephens E.M., Grisham C.M. The structure and mechanism2+of the sarcoplasmic reticulum Ca -ATPase: a bio-inorganic perspective, in: Advances in inorganic biochemistry, N.-Y. L., 1982, p.263-288.

115. Scandella C.J., Devaux P., McConnell H.M. Rapid lateral diffusion of phospholipids in rabbit sarcoplasmic reticulum. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1972, v.69, No.8, p.2056-2060.

116. Laggner P. Lateral diffusion of lipids in sarcoplasmic reticulum membranes is area limited. Nature, 1981, v.294, No.3839, p.373-374.

117. KLausner R.D., Kleinfeld A.M., Hoover R.L., Karnovsky M.J. Lipid domains in membranesï evidence derived from structural perturbations induced by free fatty acids and lifetime heterogeniety analysis. J.Biol.Chem.,,1980, v.255, N0.4, p.1286-1294.

118. Лаврецкая Э.Ф., Татьяненко Л.В., Мошковский Ю.Ш. и др. О некоторых механизмах действия психотропных препаратов на транспортные АТФазы. Фармакология и токсикология, 1980,Ш, с.292-295

119. Ленинддер А. Митохондрия, М., "Мир", 1966, 274 с.

120. Mitchell P. The protonmotive 0 cycle: a general formulation. FEBS Lett., 1975, v.59, No.2, p.137-139.

121. Rich P.R. Electron transfer reactions between quinols and quinones in aqueous and aprotic media. Biochim.Biophys. Acta, 1981, v.637, No.1, p.28-33.

122. Kongaley P.В., Feigenson G.W. H-NMR study of the location and motion of ubiquinones in perdeuterated phosphatidylcholine bilayers. Biochim.Biophys.Acta, 1981, v.635, No.3, p.602--618.

123. Чибисов A.K. Триплетные состояния и их участие в фотохимических реакциях переноса электрона.Химия высоких энергий 1976, т.10, ЖЕ, с.3-24

124. Арчаков А.И. Оксигеназы биологических мембран. 1983,М., Наука, 54 с.

125. Enoch H.G., Fleming P.Y., Stritmatter P. The binging of cytochrome bjj to phospholipid vesicles and biological membranes. J.Biol.Chem., 1979, v.254, No. 14 , p.6438-6443.

126. Ludi H., Hasselbach W. Fluorescence studies on N-(3-pyrene) maleimimide labeled sarcoplasmic reticulum. ATPase in native and solubilised membranes. Z.Naturforsch., 1982, V.37C,1. No.11,12, p.1170-1179.

127. Ludi H., Hasselbach W. Excimer formation of ATPase from sarcoplasmic reticulum labeled with N-(3-pyrene)maleinimide. Eur.J.Biochem., 1983, v.130, No.1, p.5-8.

128. Yantorno R.E., Yamamoto Т., Tonomura Y., Energy transfer between fluorescent dyes attached to Ca2+ Mg2+ ATPase in the sarcoplasmic reticulum. J.Biochem., 1983, v.94, No.4, p.1137-1145.

129. Лившиц В.А., Кузнецов В.А., Иванова Т.О. Исследование обратимой агрегации Са-зависимой АТФазы саркоплазматического ретикулума методом спиновых меток.-Тезисы стендовых докладов I Всесоюзного биофизического съезда, М., 1982, т.1, с. 233-234.

130. Katsikas H., Quinn P.J. Fluorescent probe studies of the distribution of ubiquinone homologues in bilpyers of dipalmitoylglycerophosphocholine. Eur. J. Biochem., 1983, v.131, No.3, p.607-612.