Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Флуоресцентный зонд 4-диметиламинохалкон: свойства и использование для обнаружения внутриклеточных липопротеинов в лейкоцитах крови

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Флуоресцентный зонд 4-диметиламинохалкон: свойства и использование для обнаружения внутриклеточных липопротеинов в лейкоцитах крови"

На правах рукописи

Гуларян Самвел Кииович

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ ЗОНД 4-ДИМЕТИЛАМИНОХАЛКОН: СВОЙСТВА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЛИПОПРОТЕИНОВ В ЛЕЙКОЦИТАХ КРОВИ

03.00.02 -биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в ФГУ "Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Росздрава", лаборатория биофизических методов диагностики

Научный руководитель: д.ф.-м.н., чл.-корр. РАМН, профессор

Добрецов Геннадий Евгеньевич

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор Потапенко Александр Яковлевич

д.ф.-м.н., профессор Кукушкин АпешщфКднспииинович

Ведущая организация: институт химической физики им. H.H. Семёнова

Российской Академии Наук

Защита состоится г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.057.01 при ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава по адресу: 119992, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1-а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава

Автореферат разослан »¿¿^(-¡¿Ц 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

syt^JP1^ Мурина М. А.

к -узг

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Среди физических методов, применяемых для

исследования структуры и свойств биомембрм, липопротеинов и белков, важное место занимает метод флуоресцентных зондов. Его достоинством является техническая простота, высокая чувствительность, а также возможность изучения очень маленьких количеств и объемов биологического объекта вплоть до одной молекулы. Небольшие изменения в свойствах объекта могут сдвинул спектр флуоресценции зонда на десятки нанометров и изменить интенсивность его флуоресценции в сотня раз. При этом из-за малого размера его молекул и невысокой концентрации зонд вызывает минимальные нарушения нативной структуры исследуемого биологического объекта.

4-диметиламинохалкон (ДМХ) является одним из самых чувствительных зондов. Эти его свойства можно использовать для решения медико-биологических задач. Как известно, атеросклероз сопровождается накоплением липопротеинов (мицеллярных форм липида) внутри клеток эндотелия сосудов. Вместе с тем оставалось неясным, происходят ли подобные процессы в клетках крови, и вообще - существуют ли мицеллярные липид-белковые комплексы в лейкоцитах крови. Этот вопрос можно было попытаться выяснять, используя способность ДМХ различать белок-шшндные комплексы различной структуры.

Флуоресценция ДМХ (как и других зондов), указывая на различия или происходящие изменения биологических объектов, тем не менее очень часто не позволяла понять, что именно изменилось: какова физическая сущность перестроек окружения зонда в мембране или липопротеине. Однако в последние годы появились методы, позволяющие существенно продвинуться вперед в понимании этого вопроса. К ним относятся квантово-химические расчеты в сочетании с современной мощной компьютерной базой, а также методы наблюдения за возбужденными состояниями молекул в реальном масштабе времени с разрешением 10"'° - 10"13 сек. Поэтому появилась возможность сделать ДМХ более ясным физическим инструментом исследования мембран и липопротеинов, тем самым расширив диапазон его потенциальных применений в качестве зонда.

Цель и задачи работы. Основная цель работы - изучить оптические свойства флуоресцентного зонда ДМХ и использовать его для выяснения структуры внутриклеточных белок-липидных комплексов п лейкоцитах крови человека. Исходя из этой цели, были сформулированы и решались следующие задачи:

(1) исследовать оптические свойства молекулы ДМХ, привлекая для этого квантово-хэдшческие расчеты, разрешенную во времени флуоресцентную спектроскопию, фсмтосекувдные измерения переходных спектров поглощения,

(2) исследовать свойства ДМХ как флуоресцентного зонда для изучения липидов и белково-липидных комплексов,

(3) изготовить установку для разрыва клеточной мембраны лейкоцитов с целью исследующего выделения субклеточных фракций,

(4) изготовить проточный цитофлуориметр для измерения флуоресценции единичных клеток,

(6) исследовать структуру внутриклеточных белок-липидных комплексов лейкоцитов крови человека.

Научная новизна работы.

1. Впервые проведен кваятово-химический расчет молекулы ДМХ и оценены возможности тепловых конформационных изменений молекулы. Результаты верифицированы кристаллографическим анализом.

2. Проведено подробное систематическое исследование оптических сдойств ДМХ. Впервые показано наличие синглет-трнплетных переходов в возбужденной молекуле ДМ"Х, которые являются причиной низкого квантового выхода флуоресценции в неполярных средах. Высказана гипотеза, объясняющая совокупность оптических свойств ДМХ: предполагается, что они определяются конформационной лабильностью молекулы; првчбм полярные среды стабилизируют плоскую конформацию молекулы (с которой свсзая высокий выход флуоресценции), тогда как в неполярных средах молекула не является плоской, испытывает вращения вокруг одинарных связей, что облегчает без азлучательные переходы и снижает выход флуоресценции в сотни раз.

3. С помощью проточного цитофлуориметра, специально изготовленного для решения этой задачи, впервые удалось исследовать флуоресценцию ДМХ в единичных клетках крови: лейкоцитах, эритроцитах и тромбоцитах.

4. Использование специально сконструированного пресса, позволяющего проводить субклеточное фракционирование лейкоцитов без применения химических агястов и нарушения целостности основных внутриклеточных оргаиелл, показало, что флуоресценция ДМХ в лейкоцитах связана, прежде всего, с липидными компонентами клеточных органелл.

5. Данные, полученные с помощью этих двух установок, а также опыты по без ызлучательному переносу энергии между зондами указывают на возможность

существования в гранулоцитах крови человека липопротеи ноподобных частиц. Д14Х использован для оценки их количества, размеров и липядного состава.

Практическое значение работы.

1. Изготовлена уникальная установка дня разрушения плазматической мембраны лейкоцитов крови человека.

2. Изготовлен проточный цитофлуориметр, позволяющий исследовать липилые компоненты клеток крови с помощью зонда ДМХ или иных зовдов.

3. Проделанная работа позволила:

• показать, что по флуоресцентным параметрам зонда ДМХ можно разлшппь мицеллярные и ламеллярные липидные структуры

• обнаружить и охарактеризовать внутриклеточные липопротеиноподобные частицы в лейкоцитах крови человека,

• на основе безызлучательного переноса энергии разработать тест для определения внутриклеточных липопротеинов.

Апробация работы. Основные результаты, вошедшие в диссертацию, были представлены в виде докладов на Всесоюзной школе-семинаре «Люминесцентные и светооптические методы исследования клетки», Чебоксары, 1990 г., на ,/ов международной конференции "Методы флуоресцентной спектроскопии", Берлин, 15'97 г., на П°" съезде биофизиков России, Москва, 1999 г., на 3*" Всероссийской школе-симпозиуме «Динамика и структура в химии и биологии», Черноголовка, 2005 г., а также на ежегодных научно-практических конференциях НИИ ФХМ в 1997,2000,2002, 2003 и 2004 годах.

Публикации. По результатам работы опубликовано 9 статей в рецензируемых научных журналах.

Структура и объём работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты исследований, заключение, выводы и сшсок цитированной литературы. Работа изложена на 141 странице, содержит 54 рисунка и 9 таблиц. Библиография содержит 201 ссылку на работы отечественных и зарубежных авторов.

Содержание диссертации

Часть 1. Обзор литературы

В обзоре рассмотрены следующие вощюсы. 1. Оптические свойства флуоресцентного зонда 4-диметиламинхалкон (ДМХ) и их связь со структурой молекулы и свойствами окружения. 2. Метод флуоресцентных зондов в исследованиях физико-химической структуры липидного бислоя: особенности метода в исследованиях биологических объектов. 3. Липидный состав и метаболизм клеток крови, внутриклеточные липопротеины.

Часть 2. Результаты исследоианий

Глава 1. Материалы и методы исследований

Объекты исследований. Мембранные везикулы - липосомы - получали из яичного фосфатидилхолина и холестерина (Aldiich, США) по методу, предложенному Batzri S., 1973,. Липопротеины низкой и очень н изкой плотности (ЛНП и ЛОНП) выделяли из сыворотки крови здоровых доноров ультрацентрифугированием согласно Havel R.J., 1955. Содержание фосфолшщца определяли по Vaskovsky V.E., 1975, общего белка - по Lowry О.Н., 1951. Лимфопиты из тимуса крысы получали по методу Bloom B.R., 1971. Лимфоциты из крови человека выделяли центрифугированием периферической крови доноров на градиенте плотности фюсолл-верографина по методу Roos D., 1970. Гранулоциты крови человека выделяли центрифугированием лейкоцитарной суспензии, полученной после осаждения эритроцитов и тромбоцитов цельной крови с помощью раствора декстрана в градиенте плотности фиколл-верографина по методу Фихман Б.А., 1967. Субклеточные органеллы лимфоцитов: ядра, митохондрии, клеточные мембраны и растворимые белки цитозоля, - получали ультрацентрифугированием суспензии клеток после разрыва клеток на специально сконструированном прессе (глава 2) по методу Allan D., 1970. Содержание белка и фосфолипида определяли так же, как в случае липопротеинов, суммарное количество нуклеиновых кислот измеряли по методу Peters D.L., 1979.

Измерения. Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре DU-7 (Beckman, США), а флуоресцентные измерения при стационарном возбуждении -на спекгрофлуориметрах MPF-4 и F-4000 (Hitachi, Япония). Регистрацию кинетики затухания флуоресценции проводили методом счёта фотонов при импульсном возбуждении в пучке синхротронного излучения ускорителя Super-ACO на

измерительной станции SA-1 (Университет Огиау, Франция). Спектры фосфоресценции регистрировали на спектрофлуориметре MPF-4 при помощи фосфоресцентной приставки для измерений при температуре жидкого азота (-196°С). Динамику фотоиндуцированных спектров поглощения регистрировали на установке, созданной в лаборатории кинетической лазерной спектроскопии ИХФ им. H.H. Семенова РАН (зав. лаб. проф. О.М. Саркисов) совместно с Ф.Е. Гостевым.

Флуоресценцию зондов в единичных клетках регистрировали на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ И-2 (ЛОМО, РФ) и специально изготовленном проточном цитофлуориметре (детали - в главе 2).

Флуоресцентные зонды. В экспериментах использовали зонды К-68 (4-(5-фенилоксазолил-2)-1-певтадецилпиридиний), ДМХ (4-диметиламинохалкон), синтезированные Б.М. Красовицким и сотр. (институт монокристаллов, Харьков, Украина), ДСП-12 (4-(и-диметнлам1 шостирил)-1 -додецшширцдииий п-толуолсульфонат), ДСМ (4-(п-диметиламиностирил)-1 -метилпиридиний п-толуолсульфонат), синтезированные ГЛ. Дубуром и сотр. (институт органического синтеза АН Латвии) и 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен ("Serva", Германия). Структурные формулы этих зондов приведены на рис.1.

ДСМ: п=1 ДСП-12: п=12

ДМХ

К-68

ДФГТ

Рис.1. Используемые в работе флуоресцентные зонды.

Квантово-химическиs расчеты проводили с помощью программы HyperChem v.5.0. (Hjfiercube, Inc., США) на компьютере HP Kayak ХМ600, 2-CPU P Ш-733 MHz. Расчеты koi [формации зонда ДМХ проводили в приближении Борна-Оппенгеймера для единичной молекулы в вакууме. Потенциальную Энергию основного состояния ДМХ рассчитывали неэ* лирическим методом (crè initio) в базисе атомных орбиталей 3-21G**. Возбужденное сосгзяние (сила осциллятора, положение триплетных уровней) рассчитывали по;уэмпирическим методом РМЗ.

Глав» 2 диссертации посвящена описанию экспериментальных установок, созданных специально для исследования клеток крови с помощью флуоресцентных зондов. В этой главе приводятся схемы и описание принципа работы двух установок: пресса для разрушения цитоплазматической мембраны изолированных лимфоцитов и проточного цитофлуориметра.

Механический пресс для разрушения цитоплазматической клеточной мембраны необходим для получения субклеточных органелл без использования детергентов, ферментов или иных химических агентов. В установке реализована идея, предложенная Wright В.М. в 1974 году.

Проточный цитофлуориметр изготовлен специально для регистрации интенсивности флуоресценции зонда ДМХ в лейкоцитах крови человека: конструкция прсточной камеры (принцип Steen Н.В., 1981) и оптическая схема установки (длина волны возбуждения флуоресценции, размер фотометрируемого участка и скорость протока «легочной суспензии) оптимизированы для решения поставленной задачи.

Глава 3. Исследование оптических свойств ДМХ

'15

I

►'А

ч

г

8 С *

Рис.2. Нумерация атомов и обозначения диэдральных углов в молекуле ДМХ.

ДМХ проводили неэмпирическими

/ Третья глава диссертации состоит из

С1в двух разделов. В первом разделе приводятся результаты квантово-химических расчетов для единичной молекулы зонда ДМХ » вакууме. Квантово-химические расчеты геометрии основного (S0) состояния методами Хартри-Фока (ab initio) и

полу эмпирическим методом РМЗ в базисе атомных орбиталей 3-21G . Результаты,

полученные разными методами, в целом близки к друг к другу (рис.2). Все использ>емые методы предсказывают пленарную ("плоскую") конформацию молекулы.

Рис.3.

Эквипотенциальная поверхность для сочетанного поворота вокруг углов Р, у и 8 в молекуле ДМХ в основном состоянии, соответствующая полному изменению вращательной энергии (по отношению к плоской конформацин) на 1 ккал/моль. На рисунке показаны 5 сечений этой поверхности горизонтальными плоскостями.

Достоверность расчетов была проверена с помощь» экспериментальных данньп, полученных Н.Е> Жухлистово4 (институт Кристаллографии РАН) и В.Е. Заводником (физик с -химический институт ш. Карпова) методом рентгеновской кристаллографии. Сравнена: результатов расчета и эксперимента показало, чгз метод Хартри-Фока доволыо точно описывает

внутримолекулярные силы в молекуле ДМХ.

Поэтому данный метод был использован для расчета конформационной лабильности молекулы, т.е. для расчета поверхности потенциальной энергии молекулы ДМХ в зависимости от изменения конформацин молекулы. Результаты расчетов показали, что энергетический барьер выхода молекулы из плоского состояния, т.е. ее поворотов вокруг одинарных С-С связей, невысок: барьеры вращения на 20-40 градусов не сшсьно превышают кТ. Более того, при сочетанием вращении вокруг одинарных связей возмо:кны ситуации, когда, поворот вокруг одних углов облегчает вращение вокруг других. Потому в работе были проведены расчеты поверхности потенциальной энергии ДМХ для сочетании* внутримолекулярных поворотов вокруг углов а, р, у и 8. Как можно видеть (рис. 3), при комнатной температуре, молекулы ДМХ могут представлять собой семейство конформеров, где углы р, у и 8 сочетало отклоняются на 20 и даже 30° от "плоской" конформацин.

С помощью полуэмпирического метода РМЗ (С1) были рассчитаны длины волн и силы осцилляторов электронных переходов возбужденного состояния зонда ДМХ я его конформеров. Результаты расчетов показали, что для "плоской" конформацин :.снда

наиболее длинноволновым синглетным переходом (во—81) является п-п электронный переход. Его свойства: сила осциллятора и положение (длина волны) - зависят от внутримолекулярного вращения вокруг связей С-С (рис. 4-левый). Так, при повороте вокруг угла Р на 45° сила осциллятора падает на 27 %, а длина волны перехода смещается в коротковолновую область на 5,5 нм. Расчеты показали, что в возбужденном состоянии зонда ДМХ существуют триплетные уровни. Их положение, т.е. расстояние до уровня во, также изменяется при изменении конформации молекулы (рис. 4-правый). Так как

Эмрлм торга дЕ, ашйшь Угол поворота, гдо

Рис.4. Слева: Изменение силы осциллятора молекулы ДМХ при вращении вокруг связей С-С и N-0. Повороты вокруг связей на углы а, Э, у и 8 выражены в виде энергии (АЕ, юсал/моль), необходимой для поворота. По оси ординат - соотношение сил осциллятора "неплоского" (/) и "плоского" (/"ь,) конформеров. Справа: Рассчитанная разница энергий (АЕ) между уровнями в Т в молекуле ДМХ для разных ее конформаций. Разница энергий выражена в виде длины волны соответствующего перехода (нм).

триплетные уровни расположены ниже э-ровня в!, то "они могли бы быть источником фосфоресценции с длинами волн 580-635 нм и причиной тушения флуоресценции зонда.

Второй раздел главы 3 посвящен исследованию оптических свойств флуоресцентного зонда ДМХ в органических растворителях. Известно, что как параметры поглощения (коэффициент молярной экстннкции, положение максимума спектра), так и параметры флуоресценции (квантовый выход и положение максимума) зависят от свойств окружения зонда, однако физическая природа процессов, определяющих эту зависимость, оставалась неясной.

Длина волны, нм

Рис.5. Дифференциальные переходные спекгры поглощения ДМХ (50 мкМ) в гексане после импульсного возбуждения (308 нм, 0,07 пс) Время задержки зондирующего импульса: >: -03 (1); 0 (2); 0,1 (3); 0,2 (4) и 0,5 пс (5); Ь: 1 (1); 2 (2); 3 (3); 5 (5); и 15 пс (5); с: - 0,1 (1); 200 (2) и 600 пс (3).

Ранее было показано, что флуоресценция ДМХ тушится протондонорными группами. Однако даже в апротонных растворителях квантовый выход флуоресценции ДМХ, изменяясь в сотни раз, никогда не превышает 0,26. Понимание механизмов, лежащих в основе наблюдаемых изменений, могло бы расширить использование зонда в биофизических исследованиях. В работе показано, что величина Стоксова сдвига спектров ДМХ линейно зависит от функции ориентационной поляризуемости Лшшерта (/"(Д п)) для всех 12 исследованных растворителей. Этот результат указывает на

неспецифический (универсальный) характер взаимодействий молекулы зонда с молекулами окружения. Кроме того, показано, что время жизни возбуждённого состояния ДМХ в серии растворителей, в том числе протондонорных тушителей флуоресценция ДМХ

пропорционально квантовому выходу флуоресценции.

Это также указывает на отсутствие специфических процессов, вызывающих статическое тушение флуоресценции. Эксперимент с четырьмя растворителями -производными бензола, молекулы которых о«ень похожи по размерам и структуре, -показал, что динамическое тушение флуоресценции ДМХ в этих растворителях не зависит ни от вязкости, ни от специфики химических групп, а связано с дипольным моментом молекул растворителя. Все перечисленные факты указывают на то, что как процессы

сольаатохромии и сольватофлуорохромии, так и тушение флуоресценции ДМХ могут был г связаны каким-то универсальным механизмом, основой которого является полярность молекул окружения зоцца.

Для выяснения этого механизма были исследованы процессы, происходящие в возбужденном состоянии молекулы зонда ДМХ в растворителях различной полярности. Исследование спектров поглощения ДМХ проводили в неполярном растворе гексана (рис. 5) и полярном ацетонитриле (рис. б) методом фемтосекундной фото индуцированной спектроскопии. В растворе гексана в течение первой пикосекунды после прихода

1 - Мл^Л

т «о 900 520 540 мо

Длина волны, нм

Р1К1.6.

Дифференциальные переходные спектры поглощения ДМХ (25 мкМ) в ацетонитриле после импульсного возбуждения (308 нм, 0,07 пс). Время задержки зондирующего импульса: а: -0,4(1); 0(2); 0,1(3); 0,2(4); и 0,3 пс (5) Ь: 03(1); 0,4(2); 0,5(3); и 0,6 (4). Вггавка: релаксационная кривая поглощения при Х<«-160 нм в пикосекундной шкале.

возбуждающего импульса (Х-308 нм; 70 фс) происходит релаксация Франк-Кондоновских уровней и формируется пик 465 нм, который соответствует переходам с Б) на более высокие уровни 8а (рис. 5-а). Далее интенсивность пика 465 нм начинает снижаться. Одновременно возникает новый пик поглощения в области 570 нм (рис. 5-Ь). Это дайт основание предполагать, что те молекулы ДМХ, которые за 1 пс перешли в состояние с максимумом поглощения 465 нм, за последующие 20 пс перешли в состояние с максимумом поглощения 570 нм. Так как время жизни возбужденного состояния ДМХ в гексанс, судя по низкому выходу флуоресценции (менее 0,01), не превышает 50 пс, то, по-видимому, полоса 465 нм соответствует переходам из состоя -

ния S i, а затухание пика 465 нм объясняется исчезновением молекул в состояшш Si. Интенсивность пика 570 нм, напротив, существует веб время наблюдения 600 пс (рве. 5-с). Вероятно, молекулы ДМХ перешли из состояния Sj в долгоживущее тришетное состояние; и новый пик поглощения 570 нм соотвепггвует триплет-трипле-шому поглощению. В пользу этого говорит также отрицательная полоса в спектре поглощения в области 400 нм, которая хорошо видна через 600 пс после возбуждения (рис. 5ч:) и, очевидно, является результатом снижения заселённости состояния S0; по-видимому, возбудившиеся молекулы не вернулись обратно на 80 за 600 пс. Отсутствие восстановления заселённости уровня S0 свидетельствует о том, что переход из состояния Si в триплет является основным путём дезактивации возбужденного состояния Si ДО4Х в неполярной среде - гексане.

Совершенно иначе протекают процессы в возбуждённом состоянии ДМХ в растворе полярного апротонного ацетонитрила. Пик 460 нм (Si), сформировавшийся за 0,5-0,6 пс после фотовозбуждения (рис. б-а), постепенно снижается с постоянной времени около 500 пс (рис. 6 - вставка). При этом не появляется никакого нового пика поглощения. Вероятно, в полярном растворителе возбуждённые молекулы ДМХ уя'е не переходят в триплетное состояние. Более того, в ацетонитриле не видно отрицательной полосы поглощения при 400 нм, которая была видна в гексане: вероятно, населёи ость уровня S0 восстанавливается за 600 пс наблюдения. Это также свидетельствует в пользу того, что основная часть возбужденных молекул не перешла в триплетное состояние. Примерно через 0,5 пс после возбуждения на спектрах видно появление отрицательной полосы в области 520-550 нм, которой не было до возбуждения молекул ДМХ (рис. 6-Ь). Следовательно, источником этой отрицательной полосы является дополнительный свет. Время жизни этой отрицательной полосы соответствует времени жизни состояния St (пик 460 нм) - примерно 500 пс, - и времени затухания флуоресценции ДМХ в растворе ацетонитрила (около 550 пс). Положение максимума этой полосы тахже находап-ся в области максимума спектра флуоресценции (537 нм). По-видимому, это - вынужденное испускание света молекулами ДМХ в состоянии Si, т.е. испускание, индуциротанное импульсом зондирующего света.

В полярных апротонных средах интенсивность флуоресценции ДМХ во многз раз выше, чем в неполярных, однако выход флуоресценции, тем не менее, не превышает 0,26 (в ацетонитриле - 0,11). Следовательно, кроме излучательных переходов S0-* Si дмжны быть другие причины дезактивации Si. Так как перехода в триплетное состояв и е не обнаружено, то остаётся предположить, что снижение выхода флуоресценции в полярных средах объясняется безызлучательными переходами Si-> S0.

Данные, полученные с помощью метода фемтосекундной фотоиндуцированной

спектроскопии, позволяют оценить порядок величин констант скоростей процессов

дезактивации возбужденного состояния в] в полярных и неполярных средах:

Табл. 1. Константы скоростей процессов дезактивации возбужденного состояния в] флуоресцентного зонда ДМХ в апротонных растворителях различной полярности: неполярная среда - гексан; полярная среда - ацетонитирил. Результаты получены в растворах с концентрациями 50 и 25 мкМ, соответственно. Длина волны возбуждающего импульса 308 им, длительность -

Среда Константа к, скорости излучательного перехода 8)-» сек-1 Константа скорости интеркомбинационной конверсии в1-> Т, сек-1 Константа скорости внутренней конверсии в>, сек-1

неполярная 2-10» -3-10" «3-10"

полярная 2-10« «2-10» -2-10»

Как видно из таблицы, за снижение флуоресценции ДМХ в растворителях различной полярности отвечают различные процессы. Однако есть общие закономерности: как в полярных, так и в неполярных средах квантовый выход флуоресценции ДМХ зависит от темпергяуры - флуоресценция снижается с ев ростом. Так как константа безызлучательных переходов зависит от температуры - К/Т), - то процесс температурного тушения можно рассматривать как активационный. Квантовый выход флуоресценции равен:

1 кч(Т) к0д ■ ехр(-АЯ/ЯТ+ГДУ/ЯТ)

тогда Ъ к" к ; (2)

1 е J 1 к(г) 1 Я Т Я (3)

График зависимости 1п(1/0-1) от 1/Т позволяет определить Аррениусовскую энергию активации температурного тушения флуоресценции ДЕ, которая соответствует энтальпийной части некоторого барьера (рис. б). Как видно из рисунка, АЕ почти однозначно связана с полярностью среды, снижаясь от 5,8 в неполярных средах до 2-3 ккал/моль в более полярных. В связи с этим можно предположить, что 5,8 ккал/моль - это

Рис.6.

Энергия активации температурного тушения флуоресценции ДМХ в растворителях разной полярно с ги. Растворители: 1- этилбензол, V. -анизол, 3 - бензиловый спирт, * -ацетофенон, 5 - ацетон, б - 1Ш-диметилформамид.

0.1 0.2 0,3

Функция полярности Щп)

энергия активации перехода 8|->Т в неполярных средах, а 2-3 ккал/моль - внутренней конверсии в^Во в полярных. Действительно, прямые измерения константы перехода 8|—>Т в гексане, проведённые методом фемтосекунцной фотоиндуцировгдоой спектроскопии в диапазоне температур от -10 до +50°С (рис.7), показали, что энгргия активации, равная 6,0 ±0,1 ккал/моль, практически совпадает с данными по тушению флуоресценции Что является причиной безызлучательных переходов? Как полшают [Rettig W.,2000], в подобных молекулах переходы в нефлуоресцирующее состояние ускоряются в результате вращения вокруг связей. Эксперименты показали, что в неполярных растворителях коэффициент молярной экстинкции ДМХ изменяется |5олее чем на 30% в диапазоне температур от -10 до 60°С: при снижении темпертуры экстинкцил растёт, а при повышении падает. Действительно, как показали квантэво-химические расчёты, сила осциллятора ДМХ максимальна именно в плоской конформации и снижается на десятки процентов при врвдении вокруг связей С-С. Возможно, что и в данном случае применима Аррениусовская зависимость, тогда можно рассчитать энергию активации процессов, приводящих ^изменению экстинкции ДМХ. На рисунке 8 приведена зависимость энергии активации процесса, приводящего к падению экстинкции, от полярности растворителя, как видно эта зависимость линейная. Полученный результат ещё раз свидетельствует в пользу того, что полярная С]хда стабилизирует "плоскую" конформацию, которая, вероятно, характеризуется максимальной экстинкцией и является оптимальной для флуоресценции. В неполяршк же средах конформация не стабилизирована, быстро изменяется в результате тепловых вращений вокруг одинарных связей.

Рис.7

Аррениусовская зависимость постоянной времени

интеркомбинационной конверсии (г) ДМХ в растворе гексана от температуры. Наклон прямой соответствует ЛЕвш 6 ккая/молъ. Результаты феитосекундной фотоивдуцированной спектроскопии.

Рис.8

Зависимость энергии активации (АЕ,) падения экстинкции в четырех растворителях -производных бензола. По оси абсцисс - дипольный момент молекулы растворителей: 1 - этилбензол; 2 - анизол; 3 -бензиновый спирт; 4 -ацетофенон.

Дипольный момент молекулы растворителя, Девай

Таким образом, различные оптические свойства ДМХ: температурные сдвиги спектров поглощения, изменениям экстеякции и квантового выхода флуоресценции в растворителях различной полярности ДМХ - можно попытаться объяснить с единых позиций:

(а) молекула ДМХ сама по себе, без влияния среды, может легко принимать разные конформации благодаря вращению вокруг связей на большие углы;

(б) в неполярных средах молекула зонда не "плоская" - происходят тепловые вращения вокруг одинарных связей - отсюда низкие значения коэффициента экстинкции. После фотовозбуждения молекула испытывает быстрый переход в триплетное состояние и, соответственно, получается низкий выход флуоресценции,

(в) в полярных средах сольватная оболочка стабилизирует "плоскую" конформацию зонда, и в результате экстинкция увеличивается, а выход флуоресценции возрастает в десятки и сотни раз по сравнению с неполярными средами;

(г) солъватная оболочка из полярных молекул растворителя и, соответственно, "плоская" конформация молекулы ДМХ формируются еще в основном состоянии, до поглощения кванта света.

Глава 4. Использование зонда ДМХ для исследования мицеллярных и

ламеллярных липидных структур в лейкоцитах крови

В первом разделе главы 4 рассматриваются вопросы, посвященные флуоресценции

зонда ДМХ в модельных липидных мембрана* - липосомах. Ранее было показано, что

интенсивность флуоресценции и спектры флуоресценции ДМХ различаются в модельных

и биологических мембранах разного химического состава.

В настоящей работе предстояло выяснить, какова природа таких различий

флуоресценции: связано ли это с изменением соотношения связанных с липидом молекул

зонда и несвязанных молекул, находящихся в суспензии и частично потушенных водой, от

состава мембран или с изменением квантового выхода флуоресцирующих молекул? Для

того чтобы ответить на этот вопрос, были измерены параметры связывания ДМХ с

мембраной. Для этого использовали два способа: по изменениям собственной

флуоресценции ДМХ при его связывании и во безызлучательному переносу энергии с

дифенилгексатриена (ДФГТ) на ДМХ. Преимущество второго метода заключается в том,

что о количестве связанного ДМХ судят не по его флуоресценции, которая зависит от

квантового выхода, а прямо измеряют его концентрацию в мембране с помощью

безызлучательного (Фёрстеровского) переноса энергии с зонда-донора (ДФГТ),

расположенного в мембране. Параметры связывания зонда ДМХ с модельными

липидными мембранами из смеси яичного лецитина и холестерина, рассчитанные

различными методами, приведены в таблице 2.

Таблица 2. Параметры связывания зонда ДМХ с модельными липидными мембранами из смеси яичного лецитина и холестерина, измеренные двумя способами: методом Клотца по собственной флуоресценции ДМХ [1] и по безызлучательному переносу энергии ДФГТДМХ [2].

мембрана кс,и1 це нтры связывания / липид (моль/моль) метод определения

лецитин 23-Ю5 1:24 [1]

лецитин +10 % холестерина 3,4-105 1:29 [2]

лецитин + 30 % холестерина 7,2-103 1:23 [1]

2,6-105 1:27 И

Как видно из таблицы, присутствие холестерина значительно уменьшает константу связывания зонда ДМХ с мембранами. В то же время интенсивность флуоресценции связанного ДМХ растет при увеличении концентрации холестерина, а спектр флуоресценции сдвигается в коротковолновую область. Как показывают результаты, примденяые в этом разделе работы, спектр поглощения и коэффициент молярный эксншкции ДМХ в мембране практически не зависят от содержания холестерина. Ранее предполагалось, что локализация зонда ДМХ в бислойных мембранах гетерогенна, разные мол5;<улы зонда попадают в окружение различной полярности, и это порождает две компоненты в спектре флуоресценции: коротковолновую и длинноволновую: коро"коволновая и длинноволновые компоненты спектра флуоресценции отражают вклад различных по окружению популяций зонда в мембране [Добрецов Г.Е., 1978]. Вероятно, что рост флуоресценции ДМХ в липосомах содержащих холестерин связан с увеличением квантового выхода в одной из этих популяций, который в свою очередь происходит из-за стабилизации "плоской" конформации этих молекул зонда за счвт стерических взаимодействий с молекулами холестерина.

Поскольку зонд так чувствителен различиям в структуре липидной фазы мембран, была предпринята попытка использовать этот зонд для изучения лейкоцитов периферической крови человека. Однако прежде чем приступить к исследованию флуоресценции ДМХ в живых лейкоцитах, необходимо установить, с какими внугриклеточными структурами связывается зонд. ДМХ - липофильный зонд, и множество косвенных наблюдений указывают на его преимущественную локализацию именно в липидных структурах клетки. Мы попытались получить прямые данные о локализации флуоресцирующих молекул зонда в клетках. В связи с этим во втором разделе четвертой главы проведено детальное исследование вопроса о том, с какими компонентами клетки связана флуоресценция ДМХ: с липидами, белками или нуклеиновыми кислотами. С помощью специально изготовленного пресса из суспензии лимфоцитов тимуса крысы были получены фракции внутриклеточных органелл: ядра, митохондрии, фракция цитоплазматической мембраны и мембран эндоплазматического ретшеулума, а также суспензия растворимых белков цитозоля.

40 50 М [ФП], шхЫп

500 1000 1500 2000

[белок], нкг/мл

Рис.9.

Зависимости интенсивности флуоресценции ДМХ (4 мкМ) в суспензиях субклеточных фракций (изолированные ядра, фракция митохондрий, везикулы из обрывков плазматических и ретикулярных мембран, растворимые белки цитозоля) от концентрации фосфолипидов (а), белка (б) и нуклеиновых кислот (в). Флуоресценция измерена при 510 нм. Представлены данные трех экспериментов.

Основным достоинством

использованного в работе чисто механического метода

субклеточного фракциониров: а сия является возможность избегать применения детергентов и ферментов для выделения фракций: они могли радикально изменить сродство зонда к субклеточном органеллам. Каждая из :пих фракций отличалась по количественному отношению п^Лх основных компонент

биоматериала: лшщд, белок и нуклеиновые кислоты. Напримгр, весовое отношение

белок/фосфолипид во фракции митохондрий равно 3,5 при оч<нь низком содержании нуклеиновых кислот. Напротив, содержыие нуклеиновых кислот в "ядер*ей" фракции составляло около 50% а белка и фосфолипида примерно по 25% от общей массы. В этих биохимически гетерогеншх фракциях внутриклеточ)их

органелл измерялась

флуоресценция ДМХ.

Было проведено 3 эксперимента, в каждэм регистрировали интенсивность флуоресценции в максимуме спектра ДМХ и с помобц.ю аналитических методов определяли

биохимический состав каждой фракции. Результаты приведены на рисунке 9. Как видно, высокая корреляция флуоресценции зонда наблюдается только с содержанием фосфолшщдов (рис. 9-а): г = 0,86 ± 0,Н. Наличие корреляции достоверно с высокой степенью (р-0,01). С количеством белка (рис. 9-6) и нуклеиновых кислот (рис. 9-с) корреляции практически нет: г = 0,33 ± 0,47 иг» 0,46 ±0,14 соответственно.

Этот контраст представляется тем более убедительным, что субклеточные фракции не являются биохимически чистыми: "ядерная" содержит ядерную мембрану (примесь фосфолшщда), а мембранные фракции содержат белок. Все эти данные говорят в пользу того, что основным клеточным материалом, с которым связана флуоресценция ДМХ, являются липидсодержащие органеллы. Проведенные эксперименты позволили перейти к изучению лейкоцитов крови. Так как процедура выделения лейкоцитов (лимфоцитов, нейтрофилов и т.д.) из цельной крови неизбежно сопровождается потерей значительного количества клеток (до 50%) и, следовательно, возможна неконтролируемая селекция, то задача исследования единичных клеток непосредственно в нефракционированной периферической крови представлялась нам весьма актуальной. Однако флуоресценция ДМХ в единичных клетках никогда ранее не исследовалась из-за того, что под мощным потоком возбуждающего света (например, в люминесцентном микроскопе) наблюдается "выгорание" флуоресценции, связанное, по-видимому, с транс-цис изомеризацией молекул ДМХ. Постоянная времени этого процесса - около десяти секунд. Для того чтобы избежать этого артефакта регистрации флуоресценции, был изготовлен проточный цитофлуориметр. Время прохождения каждой клеткой фотометрируемого участка в цитофлуориметре - около 10 мкс. Создание этого прибора позволило: во-первых, избежать "выгорания" флуоресценции ДМХ, а во-вторых, использовать для исследований цельную периферическую кровь.

В третьем разделе четвертой главы приводятся результаты исследований клеток крови, окрашенных зондом ДМХ. На рисунке 10 (кривая 3) приведена типичная гистограмма распределения клеток крови человека по флуоресценции зонда ДМХ, полученная на созданном приборе. На гистограмме можно выделить три популяции клеток, значительно различающихся по среднему значению интенсивности флуоресценции. Для того чтобы выяснить происхождение этих популяций клеток, гистограмму разлагали на составляющие (рис.10, кривые 1 и 2) и определяли количество клеток в пиках, как площадь под аппроксимирующими гауссовыми кривыми.

Риели.

Аппроксимация пиков 1 и 2 гистограммы клеток крови гауссовыми функциями: кривая 1 и 2 соответственно, 3 -экспериментальная кривая распределения (пунктир). По оси абсцисс отложена интенсивность флуоресценции ДМХ (Г в логарифмическом масштабе). По оси ординат -количество клеток (Л/). Концентрация зонда 10 мкМ.

Полученные данные сравнивали с результатами гематологических

анализов мазков крови здоровых доноров. Исследование крови 20 здоровых доноров показало, что пик 1 соответствует граиулоцитам, а пик 2 -лимфоцитам. Дополнительные

эксперименты показали, что оставшиеся, наиболее слабо флуоресцирующие клетки представлены тромбоцитами и эритроцитами. Гистограммы распределения клеток крови по флуоресценции зонда ДМХ были измерены в группе здоровых доноров из 37 человек.

Среднее значение различий флуоресценции между популяциями лейкоцитов ( Р'граиул/Рлшф) в этой группе доноров составило 3,5 раза. Так как флуоресценция ДМХ в клетках связана с количеством липида, а лимфоциты и гранулоциты различаются по количеству общего липида в 2 раза, то различия в 3,5 раза необходимо как-то объяснить. Эти различия не удавтся объяснить неодинаковым содержанием холестерина в мембранах гранулоцитов: напротив, в гранулоцитах отношение холестерин/общий липид ниже, чем в лимфоцитах ( 0,52 моль/моль против 0,68), so опыты с модельными мембранами (см. выше) показали, что холестерин увеличивает, а не уменьшает интенсивность флуоресценции. В гранулоцитах спектр флуоресценции ДМХ сдвинут в синюю сторону (495 нм) по сравнению с лимфоцитами (505 нм), что также не соответствует содержанию холестерина в мембранах. Вместе с тем максимум флуоресценции ДМХ в липопротеинах очень низкой плотности приходится как раз ни область 495 нм. Все эти факты позволили нам предположить, что внутри гранулоцитов могут содержаться липидные частицы, напоминающие липопротеины плазмы крови.

Каким образом можно обнаружить внутриклеточные липопротеиновые частицы? Если их содержание невелико, то любые метода фракционирования могут привести к их

потере или разрушению Традиционные методы исследования структуры липцах)держащих органелл клетки, как правило, не позволяют обнаружить такие мелкие объеиы как липопротеины или повреждают как саму клетку, так и исследуемые оргавеллы. Между тем в последние годы был предложен метод изучения пространственной структуры липидных органелл, основанный на безызлуч ательном переносе энергии между липофильными флуоресцентными зондами [Добрецов Г.Е., 1982]. С помощью этого метода удалось измерить площадь поверхности липидных мембран в живых лейкоцитах крови человека. Исследованиям лейкоцитов крови человека с помощью метода безызлучательного переноса энергии посвящен четвёртый раздел главы 4. Идея этого метода проиллюстрирована на рисунке 11. Если зонд (в данном случае ДМХ) связывается не только с поверхностью липидных структур, но и погррсается в ядро липопротеиновых частиц, то можно использовать безызлучательный переюс энергии на поверхностный зонд-акцептор (А). В липидном бислое донор находеггся близко от двух поверхностей с акцепторами, и в результате возможен эффе ктивный перенос энергии (потому что Ферстеровский радиус переноса сравним с расстоянием между двумя поверхностями бислоя). В липопротеинах же, радиус которых намного превышает Ко, расстояние от утонувшего в них ДМХ до поверхностного акцептора велико, и перенос энергии идет плохо.

Яо Рис.11

Принцип обнаружения

мицеллярных частиц с помощью безызлучательного переноса энергии между гидрофобным зондом-донором ф) и поверхностным акцептором (А) в ламеллярных (/) и мицеллярных (2) липидных структурах.

Такой подход представлял уникальную возможность обнаружить внутриклеточаые липопротснны прямо в живой клетке и таким образом избежать артефактов, связанкъгх с нарушением структуры клеток собственными литическими ферментами после е£ гнбси. Для ДМХ как донора подобным акцептором являете» зона ДСП-12, который локализуется на поверхности липида благодаря наличию положительного заряда.

Однако положительный заряд зонда создает проблему его взаимодействия с электрическими полями клетки. Наличие трансмембранных полей приводит к тому, что концентрации зонда-катиона на внутренней поверхности плазматической мембраны в 10, а митохондриальной - 5000 - 10000 раз выше его концентрации во внешней среде [Добрецов Г.Е., 1989]. Следовательно, если в случае электрофэретического переноса ^ад-акцептор будет накапливаться внутри митохондрий, то результаты безызлучателхгого переноса энергии будут ошибочными. Для того чтобы исследовать влияние трансмембранных электрических потенциалов на распределение зондов внутри живой клетки, были проведены специальные эксперименты. Эффективность безызлучател! в ого переноса энергии регистрировали в лимфоцитах, трансмембранный потенциал которых был "сброшен" при помощи протонофора карбоншщианид-м-хлорфенилгидршона (С1ССР) и в среде с высоким содержанием калия, деполяризующей плазматическую мембрану клеток. Эксперименты показали, что сами зонды оказывают деполяризующее воздействие на трансмембранные поля клетки, и, в результате, опыт с использовал яем переноса энергии для изучения структуры липидсодержащих органелл в живой клетке возможен и трансмембранные поля не являются помехой. Чтобы проверить вывод о поггенциалнезависимом распределении зонда-акцептора, на первом этапе был проседей следующий эксперимент: перенос энергии между зондами ¿ЦЛХ-»ДСП-12 был изме]х:н в модельных липидных мембранах и лимфоцитах. Крива:! эффективности тушения флуоресценции в этих объектах сравнивалась с теоретической кривой переноса энергии между зондами ДМХ->ДСП-12, рассчитанной ранее в нашей лаборатории Куреком Н.К. для бислойной мембраны. Результаты показали, что перенос г модельных мембранах гдёт практически так, как и предсказывает теория: расхождения не превышают 12%. Экспериментальная кривая тушения ДМХ акцептором ДСП-12 в лимфоцитах тас же оказалась всего на 20% ниже теоретической кривой. Для тгасого сложного объекта как живая клетка нет оснований придавать особое значение таким небольшим расхождении. В суспензии гранулоцитов также был измерен перенос энергии с ДМХ на ДСП-12. Однако в этом случае возникло резкое расхождение как с теоретической кривой, описывающей

0 2 4 6 8

О»

Рис.12.

Тушение флуоресценции зонда-донора ДМХ (0,4 мкМ) при добавлении зонда-акцептора ДСП-12 в смесях клеток с липопротеинами. Температура 22°С.

Концентрации липидя в клетках и липопротеинах (мкг/мл), указана в скобках: 1 - лимфоциты (32,3); 2 -гранулоциты (23); 3 - ЛОНП (17); 4,5 - смесь лимфоцитов и ЛОНП; липиды ЛОНП составляли 6% (4) и 12% (5) от суммы всех липидов.

мембранную модель распределения зондов, так и с экспериментальной кривой, полученной для лимфоцитов (кривая 1); эффективность безызлучательного переноса энергии в гранулоцитах была ниже в 22 раза, чем в мембранных моделях (различия достоверны). Полученные результаты означают, что в лимфоцитах и липосомах расстояние между областями, где локализуется зонд-донор ДМХ, и поверхностями мембран, где локализуется акцептор ДСП-12, близко или меньше Д, (3,4 ± 0,1 им). Эта ситуация характерна для всех исследовагяых ранее мембран. Напротив, в гранулоцитах ДМХ значительно удален от поверхносте й с ДСП-12, чего в мембранах быть не может. Следовательно, есть основание утверждать, что в гранулоцитах есть липиды, организованные не только в виде мембран, но и в виде липидсодержащих частиц типа липопротеинов, где ДМХ удалён от поверхности с акцептором в глубь липидного ядра частицы, как это схематически показано на рис. 11 (справа). Если предположить, что мицеллярные структуры липидов грануле цитов похожи на липопротеины плазмы крови, то можно провести модельные эксперименты на смесях лимфоцитов, которые теперь можно рассматривать как объект с ламеллярными (мембранными) липидными структурами, с липопротеинами. Как видно из рис.12, добавление в суспензию лимфоцитов липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП) резко снижает эффективность переноса энергии (кривые 4 и 5). Когда количество липида ЛОНП достигает примерно 12% от общей массы лшшда лимфоцитов, кривые тушения

практически совпадают в этой смеси (кривая 5) и в гранулоцитах (кривая 2). В чистых ЛОНП перенос энергии становится ещё ниже. Липопротеины низкой плотности не дают подобного эффекта - вероятно, из-за малого радиуса частиц ЛНП (10 им) по сравнению с ЛОНП.

Таким образом, вся совокупность полученных данных: различия в средних значениях флуоресценции гранулоцитов и лимфоцитов в 3,5 раза, данные о положениях максимума спектра флуоресценции ДМХ в этих клетках, а также результаты безызлучательного переноса энергии - получает1 простое объяснение, если предположить, что гранулоциты, в отличие от лимфоцитов, содержат достаточно крупные лшщдные частицы. Эти частицы, возможно, напоминают сывороточные липопротеины очень низкой плотности. Их небольшое количество (около 10% от общего липяда клетки), по-видимому, не позволяло обнаружить их другим« существующими методами.

вывода

1. Проведены квантово-химические расчеты молекулы флуоресцентного зонда ДМХ (4-диметиламинохапкона). Они показаги, в частности, что в молекуле ДМХ минимум потенциальной энергии соответствует плоской конформации, однако возможны вращения вокруг связей С-С на десятки градусов с порогом ниже кТ. Результаты квантово-химических расчетов подтверждены рентгеноструиурным анализом. В результате указанной свободы вращений популяция молекул ДМХ при комнатной температуре должна представлять собой смесь плоских и неплоских ковформеров, существенно различающихся оптическими свойствами. Эти выводы подтверждены спектроскопическими данными.

2. Проведено исследование кинетики процессов в возбужденной молекуле ДМХ с временным разрешением 10"" - 10"" сек. Установлено, что помимо флуоресценции происходят безызлучательная дезактивация возбужденного состояния в результате внутренней конверсии Si—So и перехода в триплет Si-T. В неполярных средах ДМХ имеет очень низкий выход флуоресценции (менее 0,01) в результате быстрого перехода (5-10"12 сек) в триплетное состояние. В полярных средах перехода в триплет не происходит, выход флуоресценции составляет 0,2-0,3, но не достигает единицы из-за конверсии Si-So. Предполагается, что полярные среды стабилизируют плоскую конформацию ДМХ, наиболее благоприятную для флуоресценции, тогда как в неполярных средах проявляется конформационная лабильность молекулы ДМХ, которая облегчает переходы в триплет. Показано, что протондонорные труппы тушат флуоресценцию динамическим

механизмом, скорее всего путем образования водородной связи с кетогруппой воз^ткденной молекулы ДМХ.

3. Для определения локализации ДМХ в клетках была изготовлена установка контролируемого механического разрыва плазматической мембраны лейкоцитов с целью получения субклеточных ор-анелл. С ее помощью показано, что флуоресценция ДМХ из суб) легочных органелл сильно коррелирует (г =0,83) с содержанием фосфолипидов в этих орпшеллах и не корррелир/ет с белками или нуклеиновыми кислотами, то есть ДМХ является зондом на липидные структуры лейкоцитов.

4. Прижизненно измерена площадь поверхности раздела мембраны/вода в живом лимфоците периферической крови человека, которая равна 3550±250 мкм2. Для этого использован безызлучательный перенос энергии между флуоресцентными зондами-катионами, локализующим ися на границе раздела мембраяа/вода. Доказано, что трансмембранные электрические поля живой клетки не мешают измерению площади поверхности таким методом.

5. Результаты использования безызлучательного переноса энергии с ДМХ как дон эра энергии привели к заключению о возможности существования немембранных -мигсллярных - липидсодержащих частиц в гранулоцитах крови человека. В лимфоцитах таюпс частиц не обнаружено

6. Для оценки распределения липидов между клетками крови изготовлен прогонный цитофлуориметр. Данные цитофлуорометрии также говорят в пользу существования немембранного липида в гранулоцитах.

7. Измерение безызлучательного переноса энергии в модельных смесях лейкоцитов и лвпопротеинов плазмы крови дает основание предполагать, что внутриклеточные мигеллярные липидные частицы по размеру значительно превосходят лшюпротеины низкой плотности плазмы крови (то есть имеют радиус значительно выше 10 им). Количество содержащегося в них липида сравнительно мало - около 10 % от всего липида граиулоцита. Состав липидсв этих частиц, оцененный по спектрам флуоресценции ДМХ, близок к составу липопротеинов очень низкой плотности плазмы.

Материалы диссертации отражены в следующих статьях:

1. Гуларян С.К., Светличный В.Ю., Добрецов Г.Б., 1991. Проточней цитофлуориметр для исследования клеток флуоресцентными зондами. Биофизика, т. 36, с.377. Статья полностью депонирована в ВИНИТИ за№ 6464-В90.

2. Гуларян С.К., Добрецов Г.Е., Светличный В.Ю., Курек Н.К., Косников В.В., Лихачёва Л.М., 1991. Измерение площади поверхности мембран лимфоцитов методом безызлучательного переноса энергии. Биологические мембраны, т. 8,1304-1313

3. Гуларян С.К., Светличный В.Ю., Добрецов Г.Е., Григорьев В.Б., Гусев С.А., Н'93. Установка для разрушения цитоплазматической мембраны лимфоцитов и характер образующихся субклеточных фракций. Биологические мембравы, т. 10,420-430

4. Гуларян С.К., Добрецов Г.Е., Курек Н.К., Светличный В.Ю., 1996. Исследование пространственной структуры липида в лейкоцитах крови человека методом безызлучательного переноса энергии, Биологические мембраны, т. 13,588-597

5. Гуларян С.К., Светличный В.Ю., Танцев С.Н., Казаринов К.Д., 1996. Изуч;иие клеток крови по флуоресценции зонда ДМХ. Исследование в проточном цитофлуориметре, Препринт № 3(614), Институт радиотехники и электроники РАН, 30 с.

6. Гуларян С.К., Светличный В.Ю., Добрецов Г.Е., 1997. Различие между клепсими крови по флуоресценции липофильного зонда 4-диметиламинохалкона. Исследование в проточном цитофлуориметре. Биологические мембраны, т. 14,324-331

7. Гуларян С.К., Добрецов Г.Е., Светличный В.Ю., 2003. Флуоресцентный зова 4-диметиламинохалкон: механизм тушения флуоресценции в неполярных срс^дх. Биофизика, т. 48,873-879

8. Гуларян С.К., Саркисов О.М., Добрецов Г.Е., Светличный В.Ю., Гостев Ф.Е., Антипин С.А., 2004, Флуоресцентный зонд 4-диметиламинохалкон: влияние полярнэли среды на динамику процессов релаксации в возбуждённом состоянии. Известия Академии наук, Серия химическая, № 8,1607-1610

9. Гуларян С.К., Добрецов Г.Е., Саркисов О.М., Гостев Ф.Е., Светличный В.Ю., 2005. Липофильный флуоресцентный зонд 4-диметиламинохалкон: ф актеры определяющие выход флуоресценции. Биофизика, т. 50,780-7(17

119100

РПБ Русский феи,

2006-4 15138

1

Подписано в печать -(ч.ло. 2005г. Формат 60x84/16. Заказ N«»8. Тираж <оа экз. П.л.^.У

Отпечатано в РИИС ФИАН о оригинал-макета заказчика. 119991 Москва, Ленинский проспект, 53. Тел. 1325128

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гуларян, Самвел Кимович

ВВЕДЕНИЕ 6 ЧАСТЬ 1. Обзор литературы

1.1. История синтеза и первые исследования ДМХ

1.2. Влияние химической структуры молекулы халконов на электронные спектры поглощения

1.3. Влияние химической структуры молекулы на флуоресцентные свойства халконов

1.4. Структура молекулы ДМХ

1.5. Спектральные характеристики ДМХ

1.6. Квантовый выход флуоресценции ДМХ

1.7. ДМХ как люминесцентный индикатор

1.8. ДМХ как флуоресцентный зонд для исследования биологических объектов 1 б

1.9. Исследования структуры мембран с помощью флуоресцентных зондов

1.9.1. Модель гетерогенных мест связывания зонда в мембране

Кластерная модель" структуры мембран

1.9.2. "Релаксационная модель" структуры липидного бислоя

1.9.3. Модель "TWICT"

1.10. Локализация зондов в липидном бислое.

Физико-химическая структура мембаны

1.11. Флуоресцентный зонд ДМХ в исследованиях липопротеинов и клеток

1.12. Клеточный состав крови 26 1.12. Липидный состав клеток крови

1.14. Способность клеток крови к синтезу липидов

1.15. Внутриклеточные липидные частицы клеток крови

ЧАСТЬ 2. Результаты исследований

Глава 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Реактивы и среды

2.2. Приготовление липосом и лишщных шаров

2.3. Выделение липопротеинов

2.4. Выделение клеток

2.4.1. Лимфоциты из тимуса крыс

2.4.2. Лимфоциты из периферической крови человека

2.4.3. Гранулоциты из периферической крови человека

2.5. Субклеточное фракционирование

2.5.1. Сканирующая электронная микроскопия

2.5.2. Трансмиссионная электронная микроскопия

2.6. Аналитические методы

2.6.1. Определение белка

2.6.2. Определение нуклеиновых кислот

2.6.3. Определение фосфолипида

2.7. Флуоресцентные зонды

2.8. Флуоресцентные измерения

2.8.1. Флуоресцентная микроскопия

2.8.2. Регистрация стационарных спектров флуоресценции

2.8.3. Регистрация безызлучателыюго переноса энергии

2.8.4. Проточная цитофлуорометрия клеток

2.8.5. Регистрация кинетики затухания флуоресценции

2.9. Спектрофотометрические измерения

2.10. Измерение фосфоресценции

2.11. Фемтосекуидная абсорбционная спектрофотометрия

2.12. Измерение кондуктометрического объёма клеток

2.13. Квантовохимические расчеты

Глава 2. Создание экспериментальных установок для исследования клеток крови

2.2.1. Установка для разрушения цитоплазматической мембраны лейкоцитов

2.2.2. Проточный цитофлуориметр для исследования клеток мембранными флуоресцентными зондами

Глава 3. Исследование оптических свойств ЛМХ

3.1. Квантово-химические расчеты свойств молекулы ДМХ

3.1.1.Квантово-химические расчёты и кристаллографическое исследование конформации молекулы ДМХ в основном состоянии

3.1.2. Квантово-химические расчеты электронных переходов в молекуле ДМХ

3.1.3. Дипольный момент молекулы ДМХ в основном состоянии (jjg)

3.2. Оптические свойства зонда ДМХ в органических растворителях

3.2.1. Влияние растворителя на положение максимумов спектров поглощения и флуоресценции зонда ДМХ

3.2.2. Дипольный момент возбужденного состояния молекулы ДМХ (jie)

3.2.3. Квантовый выход флуоресценции ДМХ в органических растворителях

3.2.4. Влияние вязкости и дипольного момента молекулы растворителя на флуоресценцию ДМХ

3.2.5. Влияние полярности среды на динамику процессов релаксации в возбужденном состоянии. Фемтосекуидная спектроскопия

3.2.6. Фосфоресценция ДМХ в неполярной и полярной средах

3.2.7. Барьер перехода ДМХ из флуоресцирующего в нефлуоресцирующее состояние

3.2.8. Влияние температуры и полярности среды на спектр поглощения ДМХ

Глава 4. Использование ДМХ для исследования мицелляримх и ламмелярных липидпмх структур в лимфоцитах крови

4.1. Флуоресценция зонда ДМХ в модельных липидных мембранах (липосомах)

4.1.1. Спектры флуоресценции ДМХ в мебранах различного липидного состава

4.1.2. Определение параметров связывания ДМХ с липосомами

4.1.3. Коэффициенты молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции ДМХ в липосомах

4.2. Флуоресценция зонда ДМХ в субклеточных органеллах лимфоцитов

4.2.1. Субклеточное фракционирование

4.2.2. Разделение и биохимическая характеристика субклеточных фракций

4.2.3. Морфологическая характеристика выделенных фракций

4.2.4. Связь между интенсивностью флуоресценции ДМХ и биохимическим составом субклеточных фракций

4.3. Флуоресценция ДМХ в лейкоцитах периферической крови человека

4.3.1. Спектры флуоресценции ДМХ в лимфоцитах и гранулоцитах

4.3.2. Проточная цитофлуорометрия лейкоцитов, окрашенных зондом ДМХ

4.3.3. Флуоресценция зонда ДМХ в выделенных фракциях лимфоцитов и гранулоцитов

4.3.4. Разложение гистограмм клеток крови на составляющие. Сравнение результатов разложения с данными гематологического анализа мазков крови

4.3.5. Вклад эритроцитов и тромбоцитов в гистограмму распределения клеток крови по флуоресценции зонда ДМХ

4.3.6. Флуоресценция ДМХ в лейкоцитах крови здоровых доноров

4.4. Исследование пространственной структуры липида в лейкоцитах крови человека методом безызлучателыюго переноса энергии

4.4.1. Перенос энергии между молекулами флуоресцентных зондов

К-68 и ДСП-12 в лимфоцитах

4.4.2. Влияние трансмембранных полей лимфоцита на распределение зондов К-68 и ДСП-12 в клетке

4.4.3. Влияние зонда К-68 на катионаккумулирующую способность митохондрий лимфоцитов

4.4.4. Исследование пространственной струтуры липида в лейкоцитах по результатам переноса энергии между молекулами флуоресцентных зондов К-68, ДМХ и ДСП

4.5. Возможные причины различий флуоресценции ДМХ в лимфоцитах и гранулоцитах

Введение Диссертация по биологии, на тему "Флуоресцентный зонд 4-диметиламинохалкон: свойства и использование для обнаружения внутриклеточных липопротеинов в лейкоцитах крови"

Актуальность темы. Среди физических методов, применяемых для исследования структуры и свойств биомембран, липопротеинов и белков, важное место занимает метод флуоресцентных зондов. Его достоинством является техническая простота, высокая чувствительность, а также возможность изучения очень маленьких количеств (порядка 10'14 г) и объемов (порядка 10"13 см3) биологического объекта. Небольшие изменения в свойствах объекта могут сдвинуть спектр флуоресценции зонда на десятки нм и изменить интенсивность его флуоресценции в сотни раз. При этом из-за малого размера молекул и невысокой концентрации зонд вызывает минимальные нарушения натнвной структуры исследуемого объекта.

4-диметиламинохалкон (ДМХ) является одним из самых чувствительных зондов. Однако флуоресценция ДМХ (как и других зондов), указывая на происходящие изменения биологического объекта, тем не менее, очень часто не позволяла понять, что именно изменилось, какова физическая сущность перестроек окружения зонда в мембране или липопротеине. Вместе с тем в последние годы появились методы, позволяющие существенно продвинуться вперед в понимании этого вопроса. К ним относятся квантово-химические расчеты в сочетании с современной мощной компьютерной базой, а также методы наблюдения за возбужденными состояниями молекул в реальном масштабе времени с разрешением Ю"10 - 10"13 сек. Поэтому появилась возможность сделать ДМХ более ясным физическим инструментом исследования мембран и липопротеинов, тем самым, расширив диапазон его потенциальных применений в качестве зонда.

Поскольку в результате проведенной работы понимание оптических свойств ДМХ в липидах значительно возросло, была предпринята попытка использовать ДМХ для обнаружения внутриклеточных мицеллярных липидсодержащих структур непосредственно в живых клетках крови. Как известно, атеросклероз выражается в накоплении липопротеинов (мицеллярных форм липида) клетками стенки сосудов, однако было неясно, происходят ли подобные процессы накопления в белых клетках крови. Предполагалось, что ДМХ может быть использован для решения такой задачи.

Цель и задачи работы. Основная цель работы - изучить оптические свойства флуоресцентного зонда ДМХ и использовать его для выяснения структуры внутриклеточных белок-липидных комплексов в лейкоцитах крови человека. Исходя из этой цели, были сформулированы и решались следующие задачи:

1) исследовать оптические свойства молекулы ДМХ, привлекая для этого квантово-химические расчеты, разрешенную во времени флуоресцентную спектроскопию, фемтосекундные измерения спектров поглощения,

2) исследовать свойства ДМХ как флуоресцентного зонда для изучения липидов и белково-липидных комплексов,

3) изготовить установку для разрыва клеточной мембраны лейкоцитов с целью последующего выделения субклеточных фракций,

4) изготовить проточный цитофлуориметр для измерения флуоресценции единичных клеток,

6) исследовать структуру внутриклеточных белок-липидных комплексов лейкоцитов крови человека. ч

Научная новизна работы.

1. Впервые проведен квантово-химический расчет молекулы ДМХ и оценены возможности тепловых конформационных изменений молекулы. Результаты верифицированы кристаллографическим анализом.

2. Проведено подробное систематическое исследование оптических свойств ДМХ. Впервые получены данные о синглет-триплетных переходах в возбужденной молекуле ДМХ как причине тушения его флуоресценции в неполярных средах. Высказана гипотеза, объясняющая совокупность оптических свойств ДМХ: предполагается, что они определяются конформационной лабильностью молекулы; причём полярные среды стабилизируют плоскую конформацию молекулы (с которой связан высокий выход флуоресценции), тогда как в неполярных средах молекула не является плоской, испытывает вращения вокруг одинарных связей, что облегчает безызлучательные переходы и снижает выход флуоресценции в сотни раз.

3. С помощью проточного цитофлуорнметра, специально изготовленного для решения этой задачи, впервые удалось исследовать флуоресценцию ДМХ в единичных клетках крови: лейкоцитах, эритроцитах и тромбоцитах.

4. Использование специально сконструированного пресса, позволяющего проводить субклеточное фракционирование без химических агентов и нарушения целостности основных внутриклеточных органелл, показало, что флуоресценция ДМХ в лейкоцитах связана, прежде всего, с липидными компонентами клеточных органелл.

5. Данные, полученные с помощью этих двух установок, а также опыты по безызлучательному переносу энергии между зондами указывают на возможность существования в гранулоцитах крови человека липопротеиноподобных частиц. ДМХ использован для оценки их количества, размеров и липидного состава.

Практическое значение работы.

1. Изготовлена уникальная установка для разрушения плазматической мембраны лейкоцитов крови человека.

2. Изготовлен проточный цитофлуориметр, позвляющий исследовать липидные компоненты клеток крови с помощью зонда ДМХ.

3. Проделанная работа позволила:

- показать, что по флуоресцентным параметрам зонда ДМХ можно различить мицеллярные и ламеллярные липидные структуры,

- обнаружить и количественно оценить внутриклеточные липопротеиноподобные частицы в клетках крови,

- на основе безызлучателыюго переноса энергии разработать тест для определения внутриклеточных липопротеинов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Гуларян, Самвел Кимович

ВЫВОДЫ

1. Проведены квантово-химические расчеты молекулы флуоресцентного зонда ДМХ (4-диметиламннохалкона). Они показали, в частности, что в молекуле ДМХ минимум потенциальной энергии соответствует плоской конформации, однако возможны вращения вокруг связей С-С на десятки градусов с порогом ниже кТ. Результаты квантово-химических расчетов подтверждены рентгеноструктурным анализом. В результате указанной свободы вращений популяция молекул ДМХ при температурах выше 293° К должна представлять собой смесь плоских и неплоских конформеров, существенно различающихся оптическими свойствами. Эти выводы подтверждены спектроскопическими данными.

2. Проведено исследование кинетики процессов в возбужденной молекуле ДМХ с временным разрешенем Ю"11 - 1(Г13 сек. Установлено, что помимо флуоресценции происходит безызлучательная дезактивация возбужденного состояния в результате внутренней конверсии (Si-»So) и перехода в триплетное состояние (Si—>Т). В неполярных средах ДМХ имеет очень низкий выход флуоресценции (менее 0,01) в результате

1 "у быстрого перехода (5'10" сек) в триплетное состояние. В полярных средах перехода в триплет не происходит, выход флуоресценции составляет 0,2-0,3, но не достигает единицы из-за конверсии Si—>So. Вероятно, полярные среды стабилизируют плоскую конформацию ДМХ, наиболее благоприятную для флуоресценции, тогда как в неполярных средах проявляется конформационная лабильность молекулы ДМХ, которая облегчает переходы в триплетное состояние. Показано, что протондонорные группы тушат флуоресценцию динамическим механизмом, скорее всего путем образования водородной связи с кетогруппой возбужденной молекулы ДМХ.

3. Для определения локализации ДМХ в клетках была изготовлена установка контролируемого разрыва лейкоцитов с целью получения субклеточных органелл. С ее помощью показано, что флуоресценция ДМХ из субклеточных органелл коррелирует (г =0,83) с содержанием фосфолипидов в этих органеллах и не корррелирует с белками или нуклеиновыми кислотами, то есть ДМХ является зондом на липидные структуры лейкоцитов.

4. Прижизненно измерена площадь поверхности раздела мембраны/вода в живом лимфоците периферической крови человека, которая равна 3550±250 мкм2. Для этого использован безызлучательный перенос энергии между флуоресцентными зондами К-68 и ДСП-12, локализующимися на границе раздела мембрана/вода. Доказано, что трансмембранные электрические поля живой клетки не мешают измерению площади поверхности таким методом.

5. Использование этого метода в сочетании с переносом энергии ДМХ-> ДСП-12 позволило обнаружить существование немембранных - мицеллярных - липидсодержащих частиц в гранулоцитах крови человека.

6. Для оценки распределения липидов между клетками крови был изготовлен проточный цитофлуориметр. Цитофлуорометрия клеток крови, окрашенных ДМХ, также указывает на присутствие немембранного липида в гранулоцитах.

7. Измерение безызлучателыюго переноса энергии ДМХ-»ДСП-12 в модельных смесях лейкоцитов и липопротеинов плазмы крови дает основание предполагать, что внутриклеточные мицеллярные липидные частицы по размеру значительно превосходят липопротеины низкой плотности плазмы крови (то есть имеют радиус значительно выше 10 нм). Количество содержащегося в них липида сравнительно мало - около 10 % от всего липида гранулоцита. Состав липидов этих частиц, оцененный по спектрам флуоресценции ДМХ, близок к составу липопротеинов очень низкой плотности плазмы.

Автор выражает благодарность:

- своему коллеге и другу Светличному Вадиму Юрьевичу, который внес решающий вклад в изготовление экспериментальных установок, принимал участие в экспериментах, их обработке и обсуждении результатов и без которого выполнение этой работы было бы невозможным,

- своему научному руководителю Добрсцову Геннадию Евгеньевичу, который является автором многих идей, лежащих в основе этой работы и который стал главной движущей силой в оформлении и публикации всех приведенных в работе результатов,

- а также всему коллективу лаборатории биофизических методов диагностики и сотрудникам НИИ физико-химической медицины, которые принимали непосредственное участие в экспериментах и обсуждении результатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ДМХ - один из первых не только в нашей стране, но и в мире флуоресцентных зондов, использовавшихся для медико-биологических исследований. С помощью этого зонда за более чем 30-ти летний срок изучали структуру и свойства биологических мембран, белков, влияние лекарств, его использовали в криобиологических исследованиях. Чрезвычайно высокая чувствительность ДМХ к свойствам микроокружения позволила использовать его как индикатор структурных изменений в мембранах и липопротеинах.

Однако флуоресценция ДМХ (как и других зондов), указывая на происходящие изменения окружения, очень часто не позволяла понять, что именно изменилось, какова физическая сущность перестроек окружения зонда в мембране или липопротеине. В последние годы появились методы, позволяющие существенно продвинуться вперед в понимании этого вопроса. К ним относятся квантово-химические расчеты в сочетании с

127 современной мощной компьютерной базой, а также методы изучения возбужденных состояний молекул в реальном масштабе времени с разрешением Ю'10 - 10"13 сек. В нашей диссертационной работе эти современные методы были использованы для того чтобы лучше понять, как флуоресцентные параметры ДМХ связаны с физической структурой и динамикой микроокружения. В результате проведенных исследований зонд ДМХ как физический инструмент теперь является одним из наиболее изученных среди флуоресцентных зондов.

Поскольку в результате проведенной работы понимание поведения ДМХ в липидах значительно возросло, была предпринята попытка использовать ДМХ для исследования физических свойств внутриклеточных липидсодержащих структур непосредственно в живых клетках крови. Так удалось обнаружить в гранулоцитах внутриклеточные мицеллярные липидсодержащие частицы, а также оценить их размеры и липидный состав: судя по полученным данным, они являются некоторой аналогией липопротеинов очень низкой плотности плазмы крови человека. Они содержат лишь малую часть тотального липида клетки и, вероятно, поэтому не были в явной форме обнаружены ранее иными методами.

Для выполнения клеточных исследований были созданы две установки: пресс для разрушения лейкоцитов и проточный цитофлуориметр.

Совокупность полученных результатов значительно расширяет возможности дальнейшего использования ДМХ как биофизического инструмента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гуларян, Самвел Кимович, Москва

1. Авад А.С., Зоров Д.Б., Ягужинский Л.С., 1989, Механизм стимуляции дыхания митохондрии катионами ряда родамина, Биологические мембраны, т. 6,226-230

2. Авад А.С., Зоров Д.Б., Лгужинский Л.С., 1989, Система эндогенного разобщения в митохондриях, индуцирование высокими концентрациями катионов ряда родамина, Биологические мембраны, т. 6,231-234

3. Айдыралиев Р.К., 1988, Флуоресцентное зондирование плазмы крови, Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. биол. наук

4. Ахмадов Я.Ю., 1999, Диэлектрические параметры чистых жидкостей: Справочник, М.: изд-во МАИ, 856 с.

5. Баглаев Т.Н. Атауллаханов Р.И., Добрецов Г.Е., Кочина И.С., 1983, Определение площади поверхности и вязкости мембран Т- и В-лимфоцитов с помощью флуоресцентных зондов, Биофизика, т. 28, 142-143

6. Бакеева Л.Е., Деревянченко И.Г., Коношенко Г.И., Мохова Е.Н., 1983, Взаимодействие dis -Сз-(5) и этилродамина с митохондриями лимфоцитов, Биохимия, т. 48, 1463-1470

7. Бахшиев Н.Г., 1961, Универсальные межмолекулярные взаимодействия и их влияние на положение электронных спектров молекул в двухкомпонентных растворах. Оптика и спектроскопия, т. 10, № 6, 716-726

8. Бахшиев Н.Г., И.В. Питерская И.В., 1965, Универсальные межмолекулярные взаимодействия и их влияние на положение электронных спектров молекул в двухкомпонентных растворах. Часть 10, Оптика и спектроскопия, т. 19, 698-708

9. Бахшиев Н.Г., Питерская И.В., 1965, Универсальные межмолекулярные взаимодействия и их влияние на положение электронных спектров молекул в двухкомпонентных растворах. Часть 12, Оптика и спектроскопия, т. 20, 782-792

10. Бахшиев Н.Г., 1987, в кн. Введение в молекулярную спектроскопию. Л.: Изд-во Ленингр. Ун-та, 216 с.

11. Бахшиев Н.Г., 2001, Полуэмпирический расчет абсолютного сольватационного смещения электронных и колебательных спектров молекул при фазовом переходе газ-раствор, Оптика и Спектроскопия, т. 91, 721-727

12. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е., 19S0, в кн. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран, М., Наука, 320 с.

13. Воробьев А.И., 1985, в кн: Руководи со по гематологии, М., Медицина, 448 с.

14. Гуларян С.К., Светличный В.Ю., Доирецов Г.Е., 1991, Проточный цитофлуориметр для исследования клеток флуоресцентными зондами, Биофизика, т. , с.377. Статья полностью депонирована в ВИНИТИ за № 6464-В90.Г

15. Гуларян С.К., Добрецов Г.Е., Светличный В.Ю., Курек Н.К., Косииков B.Q., Лихачёва Л.М., 1991, Измерение площади поверхности мембран лимфоцитов методом безызлучательного переноса энергии, Биологические мембраны, т. 8, 1304-1313

16. Гуларян С.К., Светличный В.Ю., Добрецов Г.Е., Григорьев В.Б., Гусев С.А., 1993, Установка для разрушения цитоплазматической мембраны лимфоцитов и характер образующихся субклеточных фракций, Биологические мембраны, т. 10, 420-430

17. Гуларян С.К., Добрецов Г.Е., Курек Н.К., Светличный В.Ю., 1996, Исследование пространственной структуры липида в лейкоцитах крови человека методом безызлучательного переноса энергии, Биологические мембраны, т. 13,588-597

18. Гуларян С.К., Светличный В.Ю., Танцев С.Н., Казаринов К.Д., 1996, Изучение клеток крови по флуоресценции зонда ДМХ. Исследование в проточном цтофлуориметре, Препринт № 3(614), Института радиотехники и электроники РАН, 30 с.

19. Гуларян С.К., Светличный В.Ю., Добрецов Г.Е., 1997, Различие между клетками крови по флуоресценции липофильного зонда 4-диметиламинохалкона. Исследование в проточном цитофлуориметре, Биологические мембраны, т. 14, 324-331

20. Гуларян С.К., Добрецов Г.Е., Светличный В.Ю., 2003, Флуоресцентный зонд 4-диметиламинохалкон: механизм тушения флуоресценции в неполярных средах, Биофизика, т. 48, 873-879

21. Добрецов Г.Е., 1975, Исследование структуры белков методом флуоресцентных зондов, в кн.: Итоги науки и техники. Биофизика. М.: ВИНИТИ, т.6, 34-104

22. Добрецов Г.Е., Петров В.А., Деев А.И., Владимиров Ю.А., 1975, Распределение малых гидрофобных молекул в мембране. I. Искусственные липидные мембраны, Биофизика, т. 20, в. 6, 1014-1018

23. Добрецов Г.Е, Петров В.А., Владимиров Ю.А., 1978, Подвижность молекул воды в поверхностном слое мембраны, регистрируемая флуоресцентным зондом 4-диметиламинохалконом, Биофизика, т.23, в. 4, 629-632

24. Добрецов Г.Е., 1979, Флуоресцентные зонды: оптические свойства и взаимодействие с мембранами, в кн.: Итоги науки и техники. Биофизика. М.: ВИНИТИ, т.11, 101-189

25. Добрецов Г.Е., Спирин М.М, Чекрыгин О.В., Владимиров Ю.А., 1981, Флуоресцентные зонды производные жирных кислот. Глубина погружения хромофора в лнпидный бислой. Биоорганическая химия, т. 7, 606-612

26. Добрецов Г.Е., Спирин М.М., Кузнецов А.С., Попов А.В., 1983, Пространственная организация липопротеидов низкой плошости аорты человека (Изучение с помощью флуоресцентных зондов), Бюллетень Экспериментальной биологии и медицины, т. 10, 4547

27. Добрецов Г.Е., Баглаев Т.Н., Пефоь В.А., Киликовский В.В., Владимиров Ю.А., Косенкова С.Т., 1983, Флуоресценция лейкоцитов, окрашенных мембранным зондом, при злокачественных заболеваниях крови, Иммунология, № 2, 50-53

28. Добрецов Г.Е., 1984, Исследование пространственной структуры мембран и липопротеинов флуоресцентными ооидами. Украинский биохимический журнал, т. 56, 211-222

29. Добрецов Г.Е., Морозова Г.И., Баренбойм Г.М., 1985, Свободная энергия аккумуляции флуоресцентного зонда-катиона внутри митохондрий в лимфоците, Биофизика, т. 30, вып. 5,833-836

30. Добрецов Г.Е., 1989, Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов, М.: Наука, 277 с.

31. Добрецов Г.Е., 1996, Метод определения концентрации флуоресцентного зонда, связанного с биологическими объектами, Биофизика, т.41, вып.5, 1062-1067

32. Ельяшевич М.А., 2001, в кн. Атомная и молекулярная спектроскопия, М.: Эдиториал УРСС, 896 с.

33. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н., 1981, в кн. Динамическая структура липидного бислоя, М., Наука, 293 с.

34. Красовицкий Б.М., Болотин Б.М., в кн. Органические люминофоры, М.: Химия, 1984, 334 с.

35. Курек Н.К., Лапшин Е.Н., Иоффе Д.В., Миссюль Б.В., 1988, Исследование локализации флуоресцентных аналогов холестерина и его эфиров в липидных моделях мембран и липопротеинов, Украинский биохимический журнал, т. 60, 67-74

36. Курек Н.К., Лапшин Е.Н., Добрецов Г.Е., Тур И.Н., Афанасиади Л.Ш., 1989,4-5-(фенилоксазолил-2)-1-пентадецил. пиридиний флуоресцентный зонд для определения площади поверхности мембран и липопротеинов, Биологические мембраны, т. 6, № 7, 725732

37. Курек Н.К., 1991, Определение локализации флуоресцентных зондов в липидных объектах, Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. биол. наук

38. Лапшин Е.Н., 1984, Измерение геометрических параметров липидной фазы мембран и липопротеинов флуоресцентными зондами, Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. биол. наук

39. Лапшин Е.Н, Добрецов Г.Е., Красовицкий Б.М., Рухтин А.Н., Скрипкина В.Т., Курек Н.К., 1992, Флуоресцентный способ определения атерогенных липопротеинов, Клиническая лабораторная диагносшка, т. 56,40-43

40. Лебедева Н.Б., Зубрихина Г.П., Френкель М.А., Соловьева Е.А., 1985, Возможности применения автоматического анализа юра крови "Гематолог D" для дифференциальной диагностики гемобластозов, Гематология и трансфузиология, т. 30, 50-54

41. Лопухин Ю.М., Арчаков А.И., Владимиров Ю.А., Коган Э.М., 1983, в кн.: Холестериноз, М.: Медицина, 352 с.

42. Минкин В.И., Симкин Б.Я., Минаев P.M., 1997, в кн. Теория строения молекул. Изд. «Феникс», Р.-н-Д, 558 с.

43. Новгородов С.А., Гудзб Т.И., Мор Ю.Е., 1989, Трансмембранный потенциал регулирует неспецифическую проницаемость внутренней митохондриальной мембраны, Биологические мембраны, т. 6., 1053-1062

44. Непорент Б.С., Бахшиев Н.Г., 1960, О роли универсальных и специфических межмолекулярных взаимодействий во влиянии растворителя на электронные спектры молекул, Оптика и спектроскопия, г. ;■;. u.in. 6, 775-786

45. Никитина А.Н.,Федюнина Г.М. Умирзаков Б., Яновская Л.А., Кучеров В.Ф., 1973, Исследование некоторых свойств замещенных халконов и их винилогов в электронно-возбужденном состоянии, Оптика и спектроскопия, т. 34, вып. 2,289-293

46. Панов В.А., Андреев Л.Н., 1976, в кн. Оптика микроскопов. Ремонт и проектирование, Л.: Машиностроение, 430 с.

47. Петрухии А.Н., Антипин С.А., Гостев Ф.Е., Маревцев B.C., Титов А.А., Товбин Д.Г., Барачевский В.А., Строкач Ю.П., Саркисов О.М., 2000, Химическая физика, т. 19, 90

48. Питерская И.В., Бахшиев Н.Г., 1963, Количественное исследование зависимости спектров поглощения и флуоресценции сложных молекул в растворах от температуры, Известия Академии Наук СССР, Серия физическая, т.27, 623-627

49. Сороковой В.И., Добрецов Г.Е, Петров В.А., Никитина А.Н., Владимиров Ю.А., 1972, Диметиламинохалкон как люминесцентный краситель, чувствительный к конформационным изменениям в белке, Доклады Академии наук СССР, т. 206, N 2, 500502

50. Спирин М.М., 1982, Флуоресцентные тесты для исследования пространственной структуры, проницаемости и поверхностного заряда биологических мембран, Автореферат дисс. на соиск. уч. ст. канд. биол. наук, Москва

51. Сухоруков А.А., Задорожный Б.А., Лаврушин В.Ф., 1970, К вопросу о природе полос электронного спектра поглощения транс-халкона, Теоретическая и экспериментальная химия, т.6, вып. 5, 602-607

52. Фихман Б.А., 1967, в кн: Микробиологическая рефрактометрия, М., Медицина, 280 с.

53. Фримель X., 1979, в кн. Иммунологические методы, М.: Мир, 518 с. < 58. Фрейнфилд Е.Н., 1947, в кн. Гематология, Москва, 377 с.

54. Цукерман С.В., Масленникова В.П., Лаврушин В.Ф., 1967, Строение и люминесценция а,р-ненасыщенных кетонов, производных диметиланилина, Оптика и спектроскопия, т.23, в.3,396-402

55. Чучалин А.Г., Новиков Ю.К., Татарский А.Р., Шуркалин Б.К., Евсеев Н.Г., Добрецов Г.Е., 1983, Состояние клеточных мембран лимфоцитов у больных бронхиальной астмой, Иммунология, т. 4, 84-87

56. Alen J.D., Gudaitis A.V., 1960, Diluting fluid for electronic counting of leukocytes and hemoglobin determinations, J. Clin. Path., v. 33, 553-556

57. Allan D., Crumpton M.J., 1970, Preparation and characterization of plasma membrane of pig lymphocytes, The Biochemical Journal, v. 120,133-143

58. Ashcroft R.G., Coster H.G.L., Laver D.R., Smith J.R., 1983, The effects of cholesterol inclusion on the molecular organization of bimolecular lipid membranes, Biochimica et Biophysica Acta, v. 730,231-238

59. Badea M.G., DeToma R.P., Brand L., 1978, Nanosecond relaxation processes in liposomes, Biophys. J., v.1001, 197-212

60. Baiter A., Nowak W., Pavvelkiewicz W., Kowalczyk A., 1988, Some remarks on the interpretation of the spectral properties of PRODAN, Chemical Physics Letters, v. 143, 565-570

61. Barltrop J.A., Coyle J.D., 1975, in: "Exited States in Organic Chemistry", J.Wiley and sons, N-Y. 446 pp.

62. Bartes P.H., 1979, Numerical Evaluation of Cytologic Data. I. Description of profiles, Analytical and Quantitative Cytology, v. 1,20-28

63. Bartes P.H., 1979, Numerical Evaluation of Cytologic Data. II. Comparison of profiles, I Analytical and Quantitative Cytology, v. 1, 77-83

64. Bartes P.H., 1979, Numerical Evaluation of Cytologic Data. III. Selection of Features for Discrimination, Analytical and Quantitative Cytology, v. 1, 153-159

65. Bessis J., 1961, "The cell and their formation", in: The Cell Biochemistiy, Physiology, Morfology,N-Y- London, 1961, v. 5, 163-217

66. Bilot L., Kawski A., 1962, Z. Naturforsch., Teil A, v. 17, 621

67. Black W.B., Lutz R.E., 1954, Ultraviolet absorption spectra of chalcones. Identification of chromophores, J. Am. Chem. Soc., v. 77, p. 5134-5140

68. Blatt E., Sawyer W.H., 1985, Deth-dependent fluorescent quenching in micelles and membranes, Biochemica et Biophysica Acta, v. 822,43-62

69. Blatt E., Ghiggino K.P., Sawyer W.H., 1981, J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1, v. 77, 25512558

70. Bligh E.G., Dyer W.J., 1959, A rapid method of total lipid extraction and purification, Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, v. 37, 911-917

71. Blomstrand R., 1966, Fatty acid synthesis in human lymphocytes, Acta Chemica Scandinavica, v. 20, 1122-1128

72. Bloom B.R., Glade P.R., 1971, In vitro methods in cell-mediated immunity, N-Y., 242-243

73. Borenstain V., Barenholz Y., 1993, Characterization of liposomes and other lipid assemblies by multiprobe fluorescence polarization, Chemistry and physics of lipids, v. 64, 117-127

74. Burns C.P., Welshman I.R., Spector A.A., 1976, Differences in free fatty acid and glucose metabolism of human blood neutrophils and lymphocytes, Blood, v. 47,431-437

75. Coulter W.H., 1956, High speed automatic blood cell counter and cell size analyzer, Proc. Nat. Electron. Conf., v. 12, p.1034-1038

76. D'Angelo G., LaCombe M., 1961, A practical diluent for electronic white cell counts, Am. J. Clin. Path., v.34,220-223

77. DeToma R.P., Easter J.H., Brand L., 1976, Dynamic interactions of fluorescence probes with the solvent enviroment, Journal of the American Chemical Society, v. 98, 5001-5007

78. DeVoe R.J., Sahyun M.R.V., Schmidt E., Sadrai M., Serpone N., Sharma D.K.,1989, Canad.J.Chem., v.67,1565-1575

79. DiCesare N., Lakovvicz J.R., 2002, Chalcone-analogue fluorescent probes for saccharides signaling using the boronic acid group, Tetrahedron Letters, v. 43, 2615-2618

80. Dobretsov G.E., Petrov V.A., Mishijev V.E., Klebanov G.I., Vladimirov Yu.A., 1977,4-dimethylaminochalcone and 3-methoxybenzantrone as fluorescent probes to study biomembranes. I. Spectral characteristics, Studia Biophysica, B. 65, H.2, S. 91-98

81. Dobretsov G.E., Kurek N.K., Machov V.N., Syrejshchikova T.I., Yakimenko M.N., 1989, Determination of fluorescent probes localization in membranes by nonradiative energy transfer, Journal of Biochemica. and Biophysical Methods, v. 19,259-274

82. Dobretsov G.E., 1995, A method for determination of fluorescent probe-binding site interaction parameters, Physical Chemical Biology and Medicine, v.2, No. 3,143-149

83. Dobrowski J., Kirkor-kaminska E., Koput J., Siemiarczuk A., 1982, Excited and ground state conformations of p-dimcthylamino-benzaldehyde and p-dimethylaminoacetophenone, Journal of Luminescence, v. 27,339-335

84. Dubur G.Y., Dobrctsov G.E., Deme A.K., Dubure R.R., Lapshin E.N., Spirin M.M., 1984, Fluorescent probes based on styrylpyridinium derivatives: optical properties and membrane binding, J. Biochem. Biophys. Methods., v. 10, 123-134

85. Easter J.H., Brand L., 1973, Nanosecond time-resolved emission spectroscopy of a fluorescence probe bound to L-a-egg lecithin vesicles, Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 52,1086-1092

86. Easter J.H., DeTomaR.P., Brand L., 1976, Biophysical Journal, v. 16, 571-583

87. Easter J.H., DeToma R.P., Brand L., 1978, Fluorescence measurements of enviromental relaxation at the lipid-water interface region of bilayer membranes, Biochimica et Biophysica acta, v. 508, 27-38

88. Eisert W.G., Ostertag R., Niemann E.G., 1975, Simple flow microphotometer for rapid cell population analisis, Rev. Sci. Instrum., v. 46, 1021-1024

89. Elsbach P., 1959, Composition and synthesis of lipids in resting and phagocytizing leukocytes, J. Exp. Med., v. 110, 969-980

90. Evans W.H., 1978, Preparation and characterization of mammalian plasma membranes, Elsevier, North-Holland publishing Сотр.; Amstrd., N-Y., Oxford, 287 pp.

91. Fallon H.J., 1962, Leukocyte preparations from human blood: evalution of their morphologic and metabolic state, J. Lab. Clin. Med., v. 59, 779-791

92. Ferber E., Resch K., Wallach D.F.H., Imm W., 1972, Isolation and characterization of lymphocytes plasma, Biochimia et Biophysica Acta, v. 266,494-504

93. Fernandes M.S., Fromherz P., 1977, J. Phys. Chem, v. 81, 1755-1761

94. Fogelman A.M., Seager J., Edwards P.A., Hokom M., Popjak G., 1977, Cholesterol biosynthesis in human liphocytes, monocytes, and granulocytes, Biochemical and Biophysical Research Communication, v.76,167-173

95. Giardini J.R., 1972, Compozizione lipidica delle piastrini nel bambini e nell'adulto normale, Haematologica, v. 57,97-106

96. Gibson E.M., Jones A.C., Phillips D., 1987, 4-N,N-dimethylaminobenzonitrile: the absence of a fluorescence under jet-cooled conditions, Chemical Physics Letters, v. 136,454-459

97. Gostev F.E., Kachanov A.A., and Kovalenko S.A., 1996, Instrum. Experim. Techn., 39, 567

98. Gottfried E.L., 1967, Lipids of human leukocytes: relation to cell type, J. Lipid Research,v. 8,321-327

99. Gottfried E.L., 1968, Hereditary nonspherocytic hemolytic disease associated with altered phospholipids composition of the erythrocytes, J. Clin Invest., v. 47,1375-1378

100. Gottfried E.L., 1971, Lipid patterns in human leukocytes maintained in long-term culture, J. Lipid Research, v.12, 531-537

101. Gottfried E.L., 1972, Lipid patterns of leukocyres in health and disease, Seminars Hematol., v.9, 241-250

102. Grabowski Z.R., Rotkiewicz K., Siemiarczuk A., 1979, Dual fluorescence of donor-acceptor molecules and the twisted intramolecular charge transfer (TICT) states, Journal of Luminescence, v.18,420-424

103. Gratzel M.K., Kalyanasundaram K., Thomas J.K., 1974, J. Am. Chem. Soc. v. 95, 78697874

104. Grosland-Taylor P.J., 1953, A device for counting small particles suspended in water, Nature, v. 171,37-38

105. Harris J.R., 1985, The isolation of nuclear envelope from peripheral lymphocytes: an ultrastructural study, Micron and Microscopica acta, v. 16, 89-108

106. Hayhoe F.G.J., Quaglino D., 1980, in: Haematological Cytochemistry, Churchill Ling., Edinbrgh, London, N-Y, 66-90

107. Heytler P.G., Prichard WAV., 1962, A new class of uncoupling agents-carbonyl cyanide phenyl hydrazones, Biochemical and Biophysicai Research Communication, v. 7,272-275

108. Hui W., Minghua M., Hongzhi X., Yu F., Xiaohong Z., Shikang W., 2003, A study on the fluorescence quenching of modified p-cyclodextrin by transition metal ions in different solvents, ARKIVOC, ii, 173-181

109. Igal R.A., Coleman R.A., 1998, Neutral lipid storage disease: a genetic disorder with abnormalities in the regulatuion of phospholipids metabolism, Journal of Lipid Research, v. 39, 31-43

110. Ilich P., Prendergast F.G., 1989, Singlet adiabatic states of solvated PRODAN: A semiempirical molecular orbital study, J. Phys. Chem., v. 93,4441-4447

111. Jett M., Seed T.M., Jamieson G.A., 1977, J. Biol. Chem., v. 252, 2134-2142

112. Johns S.R., Willing R.I., Thulborn K.R., Sawyer W.H., 1979, Chem. Phys. Lipids, v. 24, 11-16

113. Johnson S.M., Robinson R., 1979, The composition and fluidity of normal and leukaemic or V lymphomatous lymphocyte plasma membranes in mouse and man, Biochimica et Biophysica1. Acta, v. 558,282-295

114. Kaever V., Szamel M., Goppel M., Resch K., 1984, Characterization and subcellular localization of nucleotide cyclases in calf thymus lymphocytes, Biochimia et Biophysica Acta, v. 776, 133-143

115. Katzenellenbogen E.R., Branch G.K., 1947, The spectra of the p-dimethylaminochalcones and of their ions, J. Am., Chem., Soc. V. 69, p.1615-1619

116. Kawski A., 1977, Thermochromic shifts of electronic spectra and excited state dipole moments, Asian J. Spectrosc. v.l, 27-38

117. Korkina L.G., Dobretsov G.E., Zimin Yu.I., Walzer G., Kogan E.M., Vladimirov Yu.A., 1982, Journal of Immunological Methods, v. 49, 179-183

118. Kosower E.M., Dodiuk H., 1976, Intramolecular donor-acceptor systems, J. Am. Chem. Soc., v. 98, p.924

119. Kuroki M., Kamo N., Kobatake Y., Okimasu E., Utsumi K., 1982, Measurement of membrane potential in polymorphonuclear leucocytes and its changes during surface stimulation, Biochimia et Biophysica Acta, v. 693(2), 326- 334

120. LaFemina J.P., Duke C.B., Paton A., 1987, Electronic structure and twisted intramolecularcharge transfer in dimethylanilines, J. Chem. Phys., v. 87, 2151-2157

121. Lapicola J.D., Edmondson S.M. Jr., 1988, Method for the volumetric differentiation of blood cells types, United States Patent, 4,745,071

122. Lakowicz J., Hogen D., 1981, Dynamic properties of the lipid-vvater interface of model membranes as revealed by lifetime-resolved fluorescence emission spectra, Biochemistry, v. 20, 1366-1373

123. Lakowicz J.R., Cherek H., Laczo G., Gratton E., 1984, Time-resolved fluorescence emission spectra of labeled phospholipid vesicles, as observed using multi-frequency phase-modulation fluorometry, Biochimica et Biophysica acta, v. 777, 183-193

124. Lakowicz J.R., 1999, in: Principles of fluorescence spectroscopy, N.-Y., Kluwer Publ., 698 pp.

125. Leb L., Crusberg Т., Fortier N., Snyder L.M., 1983, Evaluation of methods using adherence to substrate and density gradient for the isolation of human monocytes, Journal of Immunological Methods, v. 58, 309-321

126. Lee W.M.F., Klock J.C., Macher B.A., 1981, Isolation and structural characterization of human lymphocyte neutral glycosphingolipids, Biochemistry, v. 20, 3810-3814

127. Lentz В., Barenholz Y., Thompson Т.Е., 1976, Biochemistry, v. 15,4521-4528

128. Lelkes P.L., Miller I.R., 1980, Perturbation of membrane Structure by optical probes: I. Location and structural sensitivity of merocyanine 540 bound to phospholipids membranes, The Journal ofMembrane Biology, v. 52, 1-15

129. Lesslauer W., Cain J.E., Blaise J.K., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 69, 1499-1503

130. Lillie R.D., BurtnerH.J., 1953, Stable sudanophilia of human neutrophil leucocytes in relation to peroxidase and oxidase, J. Histochem. Cytochem., v. 1,8-12

131. Lison L., 1934, Sur de nouveaux colorants histologiques specifiques des lipids, C.R. Soc. Biol., v. 115,202-204

132. Von Lippert E., 1957, Spektroskopische bistimmung des dipolmoments aromatischer verbindungen im ersten angeregten singulet-tzustand, Z. Electrochem., v. 61, 962-975

133. Livesey A.K., Brochon J.C., 1987, Analyzing the distribution of decay constants in puls-fluorimetry using maximum entropy method, Biophys.J., v. 52, 693-706

134. Loos J.A., Roos D., 1974, Ficoll-isopaque gradients for the determination of density distributions of human blood lymphocytes and other reticulo-endothelian cells, Experimental Cell Research, v. 86,333-341

135. Lovett E.J., Schnitzer В., Keren D.F., Flint A., Hudson J.L., McClatchey K.D., 1984, Application of flow cytometry to diagnostic pathology, Laboratory Investigation, v. 50,115-140

136. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., 1951, Protein measurement with the Folin phenol reagent, v. 193,265-275

137. Luisetti J., Mohwald H., Galla H., 1979, Biochemica et Biophysica Acta, v. 522, 519-530

138. Lutz R.E., Jordan R.H., 1950, J. Am. Chem. Soc., v. 72, p. 4090, p.5058

139. Macgregor R.B., Weber G., 1981, Fluorophores in polar media. Spectral effects of Langevin distribution of electrostatic interaction, Proc. N.Y. Acad. Sci., v. 366, 140-154

140. Macher B.A., Klock J.C., 1980, Isolation and Chemical Characterization of Neutral Glycosphingolipids of Human Neutrophils, The Journal of Biological Chemistry, v. 255,20922096

141. Marks P.A., Gellhorn A., Kidson C., 1960, Lipid synthesis in human leukocytes, platelets and erythrocytes, The Journal of Biological Chemistry, v. 9,2579-2583

142. Mataga N., Kaifu Y., Kouizumi M., 1956, Solvent effects upon fluorescence spectra and the dipole moments of excited molecules, Bull. Chem. Sjc. Jpn., v/ 29,465-470

143. Matayoshi E.D., Kleinfeld A.M., 1981, J. Biophysics, v. 35, 215-235

144. Miras C.J., Legakis N.J., Levis G.M., 1967, Conversion of glucose to lipids by normal and leukemic leukocytes, Cancer Research, v. 27, part 1,2153-2158

145. Mokhova E.N., Rozovskay I.A., 1986, The effects of mitochondrial energetics inhibitor on the fluorescence of potential-sensitive dyes rhodamine 123 and DiS-C3-(5) in lymphocyte suspensions, Journal of Bioenergetics and Biomembranes, v. 18,265-276

146. Murafuji Т., Sugihara Y., Moriya Т., Mikata Y., Yano S., 1999, Structure and spectroscopic characteristics of 2'-diethylboryl-4"-dimethylaminochalcone bearing an intramolecular boron-oxygen coordinate bond, New J. Chem., v.23, 683-685

147. Novak W., Adamczak P., Baiter A., 1986, On the possibility of fluorescence from twisted intramolecular charge transfer states of 2-dimethylamino-6-acylnaphthalenes. A quantum-chemical study, Journal of Molecular Structure (Theochem), v. 139,13-23

148. O'Donnell R.T., Andersen B.R., 1985, Canine neutrophil plasma membrane markers, Biochimia et Biophysica Acta, v. 814,307-312

149. Parasassi Т., Conti F., Gratton E., 1986, Time-resolved fluorescence emission spectra of laurdan in phospholipid vesicles by multifrequency phase and modulation fluorometry, Cellular

150. V and Molecular Biology, v. 32,103-108

151. Parusel A.B.J., Schneider F.W., Kohler G., 1997, An ab initio study on excited and ground state properties of the organic fluorescence probe PROD AN, Journal of Molecular Structure (Theochem), v. 398, 341-346

152. Perugini S., 1954, Sul significato delPaffinita dei granuli neutrofili dei leucociti per I coloranti tipo Sudan, Experientia, v. 10, 381-385

153. Peters D.L., Dahmus M.E., 1979, A method of DNA quantitation for localization of DNA in metrizamide gradients, Analytical Biochemistry, v. 93, 306-311

154. Podo F., Blasie J.K., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 74, 1032-1036

155. Pratt H.P.M., Saxon A., Graham M., 1978, Membrane lipid changes associated with malignant transformation and normal maturation of human lymphocytes, Leukemia Research, v. 2,1-10

156. Rettig \V., Maus M., 2000, Conformational analysis of molecules in excited states. Ed. J.Waluk. Wiley-VCH: New York, 1-55

157. Roos D., Loos J.A., 1970, Changes in carbohydrate metabolism of mitogenically stimulated human peripheral lymphocytes, Biochimica et Biophysica acta, v. 222, 565-582

158. Rosenzweig A., Ways P., 1966, The oxidation of long-chain fatty acids by the formed elements of human blood, Blood, v. 27, 57-64

159. Rowan J.R.M., 1983, Blood cell volume analysis a new screening technology for \ haemotologist, Albert Clark and Company ltd., London. P.97

160. Shechan H.L., 1939, The staining ofleucocyte granules with Sudan black, B.J. Path. Bact., v. 49, 580-586

161. Shiuan D., Tu S.I., 1978, Fluorescent labeling of mitoplast membrane. Effect of oxidative phosphorylation uncouplers, Biochemistry, v. 17, 2249-2252.

162. Simmons A., Leaverton P., Elbert G., 1974, Normal laboratory values for differential white cell counts established by manual and automated cytochemical methods (HEMATOLOG D™), Journal of Clinical Pathology, v. 27, 55-58

163. Sklar L.A., Hudson B.S., Petersen M., Diamond J., 1977, Conjugated polyene fatty acids on fluorescent probes: Spectroscopic characterization, Biochemistry, v. 16, 813-828

164. Sklar L.A., Craig G.F., Pownall H.J., 1981,Induced circular dichroism of incorporated fluorescent cholesteryl esters and polar lipids as a probe of human serum LDL structure and melting, J. Biol. Chem., v. 256, 4286-4292

165. Slama-Schwok A., Blanchard-Dence M., Lehn J.-M.,1990, J.Phys.Chem., v. 94, 3894-3902

166. Steck T.L., 1972, in: Membrane molecular biology, cd. by Fox C.F., Keith A.D.: Sinaver Ass. inc. pub., Stamford, 76-113

167. Steen H.B., Lindmo Т., 1979, Flow cytometry: a high-resolution instrument for everyone, Science, v. 204,403

168. Steen H.B., 1980, Further developments of a microscope-based flow cytometer: light scatter detection and excitation intensity compensation, Cytometry, v. 1, 26-31

169. Steen H.B. Lindmo Т., Sarensen O., 1981, A simple, high resolution flow cytometer based on a standard fluorescent microscope, Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica, sec.A, supp. 274, Flow Cytometry IV, 31-33

170. Steen H.B., 1983, A microscope-based flow cytophotometer, The Histochemical Journal, v. 15, 147-160

171. Stein K.E., Marcus D.M., 1977, Glycosphingolipids of purified human lymphocytes, Biochemistry, v. 16, 5285-5291

172. Strickler S.J., Berg R.A., 1962, Relationship between absorption intensity and fluorescence lifetime of molecules, J. Chem. Phys., v.37 (2), p.814-822

173. Szmant H.H., Basso A.J., 1952, The absorption of substituted chalcones, J. Am. Chem. Soc.,v.74, p. 4397-4399

174. Tilley L., Thulborn K.R., Sawyer W.H., 1979, J. Biol. Chem., v. 254,2592-2594

175. Thomas J.F., Brannch G., 1953, The principal electronic absorption bands of the vinylogous series derived from benzylaldehyde and benzophenone, J. Am. Chem. Soc., v. 75, p. 4793- 4802

176. Van Der Meer M.J., Zhang H., Rettig W., Glasbeek M., 2000, Femtosecond fluorescence upconversion studies of barrierless bond twisting of auramine in solution, J. of Chemical Physics., v. 112, 2878-2887

177. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasendin I.M., 1975, A universal reagent for phospholipids analysis, J. Chromatogr., v. 114,129-141

178. Waggoner A.S., Stryer L., 1970, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 67, 579-589

179. Wang P., Du W., Wu S., 1992, A study on the spectra and photophysical behaviors of bis p-N,N-dimethylaminobenzylidene. ketone compounds, Acta Chemica Sinica, v. 50,1140-1144

180. Wang P., Wu S., 1995, Spectroscopy and photophysics of bridged enone derivatives: effect ^ of molecular structure and solvent, Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, v.86, 109-113

181. Wang Y., Eisenthal K.B., 1982, Picosecond dynamics of twisted internal charge transfer phenomena. The role of the solvent, J. Chem. Phys. v.71, 6076-6082

182. Weber G., Farris F.J., 1979, Biochemistry, v. 18, 3075-3078197. "Organic Solvents"1955, ed., by A. Weissberger, Interscience Pub. N-Y

183. Weizmann A., 1940, Zwitteron-structures in unsaturated carbonyl compounds, Trans. Farad., Soc., v. 36, 329-333

184. Westring D.W., Ladinsky J.L., Feick P., 1969, The volume distribution of human lymphocytes, Proceeding of the society for experimental biology and medicine, v. 131, 10771083

185. Williams N., Shortman K., 1972, The separation of different cell classes from lymphoid organs, The Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science, v. 50, 133-151

186. Wright B.M., Ednards A.J., Jones V.E., 1974, Use of a cell rupturing pump for the preparation of thymocyte subcellular fractions., Journal of immunological methods, v. 4,281296