Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свободнорадикальный механизм действия низкоинтенсивного лазерного излучения на лейкоциты

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Свободнорадикальный механизм действия низкоинтенсивного лазерного излучения на лейкоциты"

РГ6 од

На правах рукописи

2 3 ШОН ^

ЧИЧУК Татьяна Вячеславовна

СВОБОДНОРАДИКАПЬНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЛЕЙКОЦИТЫ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -1997

Работа выполнена в отделе медико-биологических исследований Государственного научного центра лазерной медицины МЗ РФ (Москва).

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Г. И. КЛЕБАНОВ, доктор медицинских наук, профессор Е. Ф. СТРАНАДКО.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор кафедры медицинской и

биологической физики РГ"Г/ А. Я. ПОТАПЕНКО.

Доктор медицинских наук, зав. лабораторией биофизических и

биохимических исследований клеток крови НИИ детской гематологии МЗ

РФ, профессор Л. Г. КОРКИНА.

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт физико-химической медицины МЗ РФ.

Защита состоится "_" _1997 г. в_ часов на

заседании Специализированного совета К.084.14.04 в Российском Государственном Медицинском Университете по адресу: 117869 Москва, ул.Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ по адресу: 117869 Москва, ул.Островитянова, д.1.

Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь специализированного

Совета, кандидат медицинских наук, доцент БУРОМСКИЙ И. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ктуальность темы. С развитием лазерной медицины расширяется область эименения низкоэнергетических лазеров, корректное использование которых требует атофизиологаческого и биофизического обоснования. Проблема механизма грапевтического действия низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) в эвременный период является наиболее актуальной в лазерной медицине и отобиологии [Козлов В.И. и др. 1993; Владимиров Ю.А. 1994]. Отсутствие внимания механизмов действия НИЛИ на биологические объекты приводит к t/тирическому выбору доз облучения при проведении лазерной терапии (ЛТ), в эзультате чего у части пациентов наблюдается обострение основного заболевания и азвитие побочных эффектов [Ernst Е. et al. 1993; Зверева К.В. и др. 1994, 1996; арбараш О.Л. 1996]. Кроме того не ясно, при каких заболеваниях целесообразно эименять ЛТ, а при каких противопоказанно. Очевидно, что такая ситуация эусловлена тем, что неизвестны механизм действия и хромофор лазерного ¡лучения. Существует множество гипотез о механизмах терапевтического действия ИЛИ [Девятков Н.Д. и др. 1987; Кару Т.Й. 1989; Горбатенкова Е.А. и др. 1989; Lubart . et al. 1990; Борисова A.M. и др. 1992], однако многие из них противоречивы, не здтверждены экспериментальными данными и ни одна из теорий не даёт полного зедставления о механизме терапевтического действия лазерного излучения, начиная г поглощения кванта света хромофором и заканчивая физиологическим ответом эганизма. Учитывая многообразие функций лейкоцитов, наибольший интерес эивлекает действие НИЛИ именно на эти клетки. Так рядом авторов было показано эзер-индуцированное изменение агрегационных свойств и интенсивности люминол-1Висимой хемилюминесценции лейкоцитов крови человека [Корочкин И.М. 1990; чпшидзе H.H. и др., 1992; Хомерики С.Г. и др., 1993; Щепеткин И.А. и др., 1993; змерики С.Г. и др., 1994; Сюч Н.И., 1995]. Исследование изменения функциональной ггивности лейкоцитов крови человека при действии НИЛИ становится особенно сгуальным в связи с их участием в регуляции микроциркуляции крови.

В настоящее время наиболее ярко проявляющимся и хорошо доказанным как в 1инике, так и в эксперименте патофизиологическим эффектом ЛТ является учшение микроциркуляции крови [Кручинина И.В. и др., 1991; Козлов В.И. и др., 391,1992; Палеев Н.Р. и др., 1993; Карандашов В.И. и др., 1994,1996]. Это позволяет

предположить, что в механизме ЛТ различных заболеваний существует скорее вс< одно общее звено, а не множество разнообразных механизмов для кажд< конкретного заболевания. При этом важная роль может принадлежать лейкоцитг Известно, что полиморфноядерные лейкоциты (ПМЛ) способны продуцировг широкий спектр биологически активных соединений, влияющих на тонус проницаемость сосудов (оксид азота, простагландины, лейкотриены, гистам! лизосомальные ферменты), агрегацию тромбоцитов (тромбоцитактивирующий факт< и др. [Пыцкий В.И., 1991].

Вопрос о природе акцептора лазерного излучения (ЛИ) остается открыть

M^i-tfionoo naanuuLiii ^дипмпатои из nnnv. уппилпгЬппя ппм ПТ аппииттга чипптии!

p.*.*.*.*,. ......— I----- ---..--j.-,-----... ------------- -.-п........

порфирины [Lubart R. et al. 1990, 1994; Friedmann H. et al. 1991; Владимиров Ю., 1994]. Это предположение основано на том, что порфирины могут поглощать свет красной области спектра. А в настоящее время в лазерной медицине наибол распространен гелий-неоновый лазер [Козлов В.И. и др., 1993; Барбараш О.Л. и д 1996, Петракова B.C. и др., 1997], генерирующий свет с длиной волны излученк равной 633 нм, т. е. в красной области спектра.

Необходимо отметить, что до сих пор исследование лазер-индуцированнс изменения функциональной активности лейкоцитов и изучение вклада порфиринов механизмы действия НИЛИ на биологические объекты проводились независимо др от друга, не изучена роль фотосенсибилизированных реакций в действии излучен ГНЛ на лейкоциты, учитывая что эндогенными фотосенсибилизаторами (ФС) мог быть порфирины.

В связи с вышеизложенным возникла необходимость исследовать изменен! активности лейкоцитов после облучения светом ГНЛ в присутствии экзогенных эндогенных ФС, в частности - порфиринов, и на основании полученных данж выяснить роль и участие фотосенсибилизированных свободнорадикальных (С реакций в механизмах действия НИЛИ.

Целью настоящей работы было установить особенности изменен! функциональной активности лейкоцитов при действии низкоинтенсивного лазерно излучения в присутствии эндогенных и экзогенных фотосенсибилизаторов, flj достижения поставленной цели были определены следующие задачи исследования 1. Изучить изменения функциональной активности лейкоцитов крови человека nf

олучении светом ГНЛ без и в присутствии экзогенного ФС.

, Исследовать изменения функциональной активности лейкоцитов при облучении зетом ГНЛ в присутствии аутологичной плазмы крови человека с экзогенным и/или ндогенными ФС.

Изучить изменения концентрации кальция в цитоплазме лейкоцитов при облучении зетом ГНЛ в присутствии экзогенного или эндогенных ФС.

, Исследовать механизм фотосенсибилизированного СР окисления липидов одельных мембран (липосом) и апо-В содержащих липопротеинов сыворотки крови эи облучении светом ГНЛ. Изучить способность ФС к связыванию с мембранами эпосом. Исследовать механизм фотосенсибилизированного гемолиза эритроцитов эи облучении светом ГНЛ.

, На основании полученных результатов сформулировать гипотезу о зободнорадикальном механизме действия НИЛИ на лейкоциты. аучная новизна. Научная новизна данной работы заключается в предложении и сспериментальном подтверждении свободнорадикального механизма зрапевтического действия НИЛИ. Механизм включает все звенья лечебного эффекта, ачиная от поглощения кванта света эндогенным хромофором (порфирином) и зканчивая изменением функциональной активности лейкоцитов крови, что в ззультате может приводить к таким эффектам, как изменение микроциркуляции и акгерицидный эффект. В работе показано, что облучение лейкоцитов крови светом ззера в присутствии экзогенных и/или эндогенных ФС приводит к модулированию ■меныиению или увеличению) активности этих клеток, зависимому от дозы облучения выражающемуся в их предстимуляции (прайминге). Подобные результаты получены первые, так как до этого эксперименты проводили или, облучая лазером лейкоциты зз ФС, или облучая в присутствии хромофоров другие виды клеток. Впервые показано зеличение концентрации ионов кальция в лейкоцитах после облучения клеток в эисутствии эндогенных ФС. Кроме того в работе представлен обширный сспериментальный материал, подтверждающий свободнорадикальный механизм гйствия лазерного излучения - это исследования фотосенсибилизированного СР <исления липидов модельных мембран (липосомы) и апо-В содержащих ипопротеинов сыворотки крови. Такое исчерпывающее исследование позволяет формулировать гипотезу одного из механизмов действия НИЛИ, что и было сделано.

Практическая значимость. Результаты исследования позволяют подойти i пониманию механизма действия НИЛИ на биологические объекты и могу способствовать научнообоснованному подбору доз облучения при проведении ЛТ Полученные результаты имеют практическую значимость и для проведени! фотодинамической терапии опухолей, позволяют более целенаправленж разрабатывать способы защиты от побочных эффектов данного вида лечения Следовательно результат данной работы будет служить для повышена эффективности лечения с помощью лазера и профилактики возможны: нежелательных последствий лазерной терапии.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на семинар« отдела медико-биологических исследований ГНЦ лазерной медицины МЗ РФ (1997),; также на 1-ом конгрессе Всемирной Ассоциации Лазерной Терапии (Израиль Иерусалим, 1996 г.), на 1-ой Всероссийской конференции фотобиологов (Россия Пущино, 1996 г.), на конференции SPIE (международное оптико-инженерное общество "Медицинское применение лазеров" (Австрия, Вена, 1996 г.), на Международно! конференции "Новые направления лазерной медицины" (Россия, Москва, 1996 г.), н; 2-ом Всероссийском симпозиуме "Фотодинамическая терапия злокачественны; новообразований" (Россия, Москва, 1997 г.), на Международной конференцж "Применение лазеров в биологии и медицине" (Украина, Киев, 1997 г). Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы описания материалов и методов исследования, результатов исследования и и; обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 215 источников из них 136 иностранных. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста Иллюстративный материал представлен 23 рисунками и 3 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Материалы и методы исследования.

В работе использовали производное гематопорфирина - Фотогем (Академи: тонкой химической технологии, Москва); сульфопроизводное фталоцианина алюмини; -Фотосенс (НИИ органических пигментов и красителей, Москва); протопорфирин К копропорфирин, зимозан, супероксиддисмутаза ("Sigma", США"); люминол, 2 тиобарбитуровая кислота, а-токоферол ("Serva", Германия); флуоресцентный зон,

fura-2 ("Calbiochem", Англия); ионол ("Aldrich", США); азид натрия ("BDH Chemicals Ltd", Англия). Остальные реактивы были отечественного производства квалификации "ос.ч.", "х.ч." и "ч.д.а.".

В работе использовались ПМЛ и плазма фови пациентов с бронхо-легочными (пневмония, бронхит, бронхиальная астма) или с онкологическими (базалиома, плоскоклеточный рак) заболеваниями. Всего обследовано 73 пациента в возрасте 23 -55 лет (средний возраст 39 ± 5,9). Диагнозы заболеваний были установлены на эсновании результатов комплексных клинических и клинико-лабораторных исследований: для бронхо-легочных заболеваний - на кафедре военно-полевой герапии Военно-медицинского факультета при РМАПО; для онкологических ¡аболеваний - в отделе фотодинамической терапии Государственного научного центра лазерной медицины.

ПМЛ крови выделяли по методу Boyum А. (1968) с некоторыми модификациями, /ровень функциональной активности ПМЛ, стимулированных опсонизированным шмозаном, определяли с помощью измерения люминол-зависимой (емилюминесценции (ЛХЛ) [Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., 1989].

Измерение фотолюминесценции внутривенно введенного Фотосенса в плазме срови человека осуществляли на спектрофлуориметре MPF-4 фирмы "Hitachi". Для эегистрации люминесценции использовали длину волны возбуждения - 630 нм, длину юлны флуоресценции - 680 нм. Измерение фотолюминесценции растворов Фотогема, фото- и копропорфирина, а также эндогенных порфиринов в суспензии ПМЛ и в шазме крови человека проводили на спектрофлуориметре Hitachi-850 с ^пользованием треугольной кюветы. Для регистрации люминесценции использовали (Лину волны возбуждения - 405 нм, длину волны флуоресценции - 620 нм.

Определение концентрации ионов кальция в цитоплазме лейкоцитов проводили ю известному методу [Орлов С. Н. И др., 1989; Авдонин П. В. И др., 1994], используя элуоресцентный зонд фура-2 и одноволновой метод регистрации флуоресценции цлина волны возбуждения - 340 нм, длина волны флуоресценции - 500 нм) на пектрофлуориметре Hitachi-850.

Апо-В содержащие липопротеины (апо-В ЛП) сыворотки крови выделяли ¡етодом осаждения в присутствии гепарина и ионов кальция [Burstein М. et al„ 1970].

Окисляемость апо-В ЛП в присутствии ионов Fe2* оценивали по тесту с ; тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

Общую фракцию липидов желтков куриных яиц экстрагировали по методу Folc J. et al. (1957). Фосфолипиды (ФЛ) осаждали путем преципитации их из охлажденног ацетона и использовали для приготовления многослойных фосфолипидных липосо (ПС) [Bangham A.D. et al., 1965]. Накопление продуктов липидной пероксидации процессе фотосенсибилизированного окисления ЛС оценивали по тесту с 2-ТБ [Asakawa T., Matsuchita S., 1980] и выражали в виде количества ТБК-активнь продуктов (ТБКАП) на литр реакционной среды.

Оценка гемолитических эффектов фотосенсибилизаторов проводилась н эритроцитах крови кролика методом турбидиметрии [Potapenko A. Y., 1991].

Облучение во всех экспериментах проводили in vitro светом гелий-неоновог лазера ЛА-2 (Россия) с длиной волны излучения 632,8 нм. Мощность излучени; которую определяли, используя дозиметр ИМ1-2 (Россия), составляла 13,5 мВт.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли методам вариационной статистики [Плохинский H.A., 1980] с соответствующими расчетами: вс результаты представлены в виде значений среднего арифметического ± стандартна ошибка среднего арифметического (M ± m).

2. Результаты исследования и их обсуждение.

2.1. Влияние лазерного облучения без и в присутствии экзогенных фотосенсибилизаторов на люминол-зависимую хемилюминесценцию лейкоцитов крови человека.

В данной серии экспериментов ПМЛ выделяли из крови больных с бронх! легочными патологиями (бронхит, пневмония). В ходе проведения исследования быт обнаружено, что облучение нестимулированных лейкоцитов светом ГНЛ в дозах с 0,025 до 0,5 Дж/см2 не приводило к изменению интенсивности ЛХЛ клеток. Однако eci после ЛО лейкоциты стимулировать опсонизированным зимозаном, то выявлялис (рис. 1, 2; кривые 1) различные варианты изменения хемилюминесцентного ответ (ХЛ-ответа) ПМЛ. То что эффект ЛИ проявлялся только при последующей стимуляц1 клеток позволяет рассматривать действие ЛО лейкоцитов в рамках явления, которс получило название - прайминг [Van Epps et al., 1980; Guthrie L.A. et al., 1984]. Cy этого явления состоит в том, что взаимодействие лейкоцитов с каким-либо стимулом

>чень малой концентрации, не приводящее к непосредственной активации клеток, тем 1И менее завершается увеличением функционального потенциала лейкоцитов, :оторое проявляется в том, что ответ клеток после этого взаимодействия на ювторную стимуляцию с нормальной концентрацией второго стимула, увеличивается I несколько раз. Таким образом в наших экспериментах мы наблюдали, что излучение "НЛ, выступая в роли "первого стимула", вызывало прайминг лейкоцитов. Эффект ЛИ ia функциональную активность ПМЛ, полученных из разных образцов крови, был 1азным. Так, в первом случае, при использовании лейкомассы, выделенной из крови юльных острой пневмонией (рис. 1А, кривая 1) максимальное увеличение амплитуды 1ХЛ лейкоцитов по сравнению с необлученными клетками (контроль) наблюдалось ¡ри дозе ЛО 0,05 Дж/см2 и составляло 75 ± 10%. Дальнейшее увеличение дозы |блучения сопровождалось ингибированием ХЛ-ответа. В другом случае, когда ^пользовались лейкоциты, выделенные из крови больных с хронической пневмонией рис. 1Б, кривая 1) интенсивность ЛХЛ облученных клеток была выше, чем в контроле олько на 25 ± 4% и это увеличение наблюдалось при более высокой дозе - 0,10 (ж/см2. Последующее увеличение экспозиции ЛО как и в первом случае опровождалось ингибированием свечения клеток. Необходимо отметить, что при высоких дозах ЛО, когда наблюдалось снижение ХЛ-ответа, процент погибших клеток ¡ыл небольшим (3 - 5%) и определялся по тесту стрипановым синим.

ЛО лейкоцитов, выделенных из крови больных с хроническим бронхитом (рис. 2, ривая1)не приводило к значительному изменению амплитуды ХЛ-ответа клеток.

Итак, эффективность действия ЛИ была разной и зависела от свойств клеток, ыделенных из крови разных пациентов с различными типами бронхо-легочных аболеваний. Одним из объяснений этого явления может быть различие в онцентрациях эндогенного акцептора энергии ЛИ, который мы будем называть -эотосенсибилизатор (ФС). В роли подобных хромофоров могут выступать эндогенные орфирины, содержание которых изменяется при различных патологических остояниях [Кубатиев A.A., 1973; Кузнецова Н.П. и др., 1981; Кахн Х.А. и др., 1989; рубина Л. А., 1991]. Фотосенсибилизированная порфиринами перекисная юдификация липидов мембран может приводить к праймингу лейкоцитов [Kovalchuk .V. et al., 1991]. В связи с вышеизложенным представляло интерес выяснить, сколько ндогенных порфиринов могут содержать эти клетки. Для обнаружения и определения

I/lo, % 200 -i

100 -

0

1

'I г 0.00 0.08 0.16 Доза облучения, Дж/см.кв. l/lo, % 200 -i

100

I ' i ' I

0.00 0.15 0.30

Доза облучения, Дж/см.кв.

Рис. 1. Влияние лазерного облучения на

интенсивность хемилюминесценции

лейкоцитов крови пациентов с острой (А)

и хронической (Б) пневмонией без (1) и в

присутствии (2) Фотосенса.

Концентрация Фотосенса - 8,65 нМ.

По оси ординат - здесь и для рис. 2 - 7:

l/lo - отношение интенсивности ЛХЛ

ПМЛ после лазерного облучения к

интенсивности ЛХЛ ПМЛ необлученной

пробы.

количества порфиринов в суспензии ПМ1 использовали мета;

спектрофлуориметрии. Было установлено что содержание эндогенных порфиринов : лейкоцитах, а именно, в пробе используемой для измерения ЛХЛ (20С тыс. ПМЛ в 2 мл раствора Хенкса составляло в среднем в зависимости о" источника крови от 0,15 * 10"12 до 1,30 ■ 10'12 моль.

Если предполагать, что причиноь различной предстимулирующеь

активности ЛИ является разна; концентрация эндогенных ФС пр1 исследуемых патологиях, то прь добавлении экзогенного ФС, мы може<1 получить предстимулирующий эффект вызванный вкладом экзогенного ФС.

Для доказательства высказанной предположения в последующи; экспериментах мы использовал! экзогенный ФС - Фотосен< (сульфированный фталоциани*

алюминия). Производные фталоцианина хорошо известные ФС

сенсибилизирующие липиднук

пероксидацию в модельных мембранах I эритроцитах в.!. е! а1., 1993

РокКэкауа Т.!. е1 а1., 1993; Веп Ниг Е. е1 а1. 1993]. В отдельных экспериментах был« выбрана концентрация Фотосенса, равна) 8,65 х 10"9 М. При данной концентраци!

сам фталоцианин существенно не изменял функциональную активность клеток. Было эбнаружено, что (рис. 1А, кривая 2) ЛО клеток лейкомассы, выделенной из крови 5ольных острой пневмонией, в присутствии Фотосенса приводило к /меньшению их ХЛ-ответа на последующую стимуляцию опсонизированным зимозаном по сравнению с теми же клетками без ФС. При этом максимум ХЛ-ответа фагоцитов в присутствии Фотосенса наблюдался при меньшей дозе ЛО (0,025 Дж/см2) по :равнению с клетками, не содержащими фталоцианин (0,05 Дж/см2). Если же $отосенс вводили к клеткам, исходно :лабо отвечающим на ЛО, то выраженность <Л-ответа фагоцитов увеличивалась до 70 ± 5 % (рис. 1Б, кривая 2). Важно подчеркнуть, что в тех случаях, когда ЛО пейкоцитов без Фотосенса не вызывало сколько-нибудь заметной активации клеток 'рис. 2) по сравнению с контролем, введение экзогенного ФС сопровождалось эеанимацией ХЛ-ответа фагоцитов на световое воздействие.

Итак, в результате проведенных экспериментов обнаружили, что излучение ГНЛ зызывало прайминг лейкоцитов. При этом максимальный стимулирующий эффект ЛО наблюдался при различных дозах (0,05 - 0,10 Дж/см2) и зависел от используемого 1репарата лейкоцитов. В присутствии экзогенного фотосенсибилизатора (Фотосенса) наибольшая стимуляция тех же клеток была обнаружена при меньших дозах ЛИ.

2.2. Изучение влияния лазерного облучения в присутствии плазмы крови на люминол-зависимую хемилюминесценцию лейкоцитов крови человека.

В предыдущих экспериментах предполагалось, что фотосенсибилизаторы, гызывающие лазер-индуцированный прайминг лейкоцитов, присутствуют непосредственно в клетках. Однако известно, что эндогенные порфирины находятся и

1/1 о,%

0.0 0.1 0. Доза облучения, Дж/см.кв.

Рис. 2. Влияние лазерного облучения на интенсивность хемилюминесценции лейкоцитов крови пациентов с хроническим бронхитом в стадии стихающего обострения. 1 - без Фотосенса; 2-е Фотосенсом, концентрация Фотосенса - 8,65 нМ.

в плазме крови, где они связаны в основном с липопрогеинами и белками плазмы [Jon G., 1984; Аскаров К.А., 1987]. И в этой связи вполне возможно, что свой вклад в изменение функционального потенциала лейкоцитов может вносить и плазменный пул фотосенсибилизаторов. Для обнаружения и определения количества эндогенных порфиринов в плазме крови был использован метод спектрофлуориметрии. Было установлено, что в 10 мкл плазмы содержание эндогенных порфиринов составляло в среднем от 0,20 * 10~12 до 5,9 * 10"12 моль. Представляло интерес выяснить роль порфиринов, находящихся в плазме крови, в индукции прайминга лейкоцитов при

действии ЛИ.

1/1о, % 160-1

120

80-

40-I

0.0

0.8

1.6

I

2.4

Изучали влияние ЛО лейкоцитов в присутствии плазмы крови на функциональную активность ПМЛ. В данном исследовании использовались лейкоциты, исходно (без плазмы) не отвечающие на ЛО. Плазма крови содержала определенное количество эндогенных (порфирины) и/или внутривенно введенного экзогенного (Фотосенс) фотосенсибилизаторов. В первой серии экспериментов мы использовали ПМЛ и плазму крови пациентов с онкологическими патологиями, прошедших процедуру лазерного облучения по методу ФДТ опухолей с внутривенно введенным Фотосенсом. В отдельных экспериментах было установлено, чтс в при добавлении 10 мкл аутологичной плазмы крови к лейкоцитам (200 тыс. е 2 мл раствора Хенкса) сама плазма существенно не изменяла функциональную активность клеток. Поэтому облучение ПМЛ проводили в присутствии 10 мкл плазмь ПМЛ крови. Обнаружили (рис.3), чго при введении в пробу Ю мкл плазмы крови,

Доза облучения, Дж/см.кв.

Рис. 3. Изменение интенсивности хемилюминесценции лейкоцитов после лазерного облучения клеток в присутствии аутологичной плазмы крови (10 мкл) с внутривенно введенным Фотосенсом.

1-е плазмой, количество Фотосенса в добавляемой плазме крови - 0,52 пмоль; 2 - без плазмы.

Количество Фотосенса, пмоль Количество Фотосенса, пмоль.

'ис. 4. Зависимость интенсивности хемилюминесценции лейкоцитов от количества >отосенса в добавляемой плазме крови для одного пациента (А) и для разных ациентов (Б). Клетки облучали в присутствии аутолотчной плазмы крови (10 мкп) ветом гелий-неонового лазера. Доза облучения - 0,06 Дж/см2.

1 - с облучением; 2 - без облучения (1-е плазмой, 1о - без плазмы)- Уменьшения опичества Фотосенса в добавляемой плазме крови добивались путем разбавления лазмы раствором Хенкса.

содержащей 0,52 пмоль Фотосенса, по мере увеличения дозы ЛО от 0,02 Дж/см2 до 0,06 Дж/см2 происходит увеличение ХЛ-ответа фагоцитов на последующую стимуляцию опсонизированным зимозаном. Максимальная активация ЛХЛ ПМЛ наблюдалась при дозе 0,06 Дж/см2 и составила 52 ± 3%. При дозе облучения 0,08 Дж/см2 и более происходило дозозависимое ингибирование ЛХЛ ПМЛ. При этом было показано с помощью теста с трипановым синим, что ингибирование активности ПМЛ не связано с потерей жизнеспособности клеток. Облучение клеток лейкомассы в растворе Хенкса без добавленной плазмы в пределах использованных доз ЛО приводило к незначительному изменению величины ХЛ-ответа. Само по себе ЛО не изменяло уровень спонтанной ЛХЛ ПМЛ, а проявлялось только лишь при последующей стимуляции. Иными словами, ЛО лейкоцитов в присутствии плазмы, содержащей определенное количество ФС, вызывало прайминг, качественно

совпадающий с ситуацией, когда к лейкоцитам вводили экзогенный Фотосенс (рис. 1; 2). Обнаружили (рис. 4А), что интенсивность ЛХЛ ПМЛ при лазерном облучении зависела от количества Фотосенса в плазме крови. При дозе ЛО, равной 0,06 Дж/см2,

максимальная активация ХЛ-ответа клеток наблюдалась при количестве

1/1о, % 300 —I

200 -

100-

0 —-1

о

3

6

Доза облучения, Дж/см.кв.

Рис. 5. Изменение интенсивности хемилюминесценции лейкоцитов после лазерного облучения клеток в присутствии аугологичной плазмы крови (10 мкл).

1,3: кровь получена от пациента с пневмонией, 1-е плазмой, количество порфирина в добавляемой плазме крови -0,41 пмоль; 3 - без плазмы. 2,4: кровь получена от пациента с бронхиальной астмой, 2-е плазмой, количество порфирина в добавляемой плазме крови - 0,59 пмоль; 4 - без плазмы.

Фотосенса в добавляемой плазме крови, равном 0,48 пмоль, и составила 42% ± 3%. Уменьшение количества Фотосенса в плазме крови сопровождалось снижением интенсивности ХЛ-ответа клеток от 42% ± 3% до 7% ± 3%, чте достоверно по отношению к контролю. На рис. 4Б представлены результаты влияния одинакового объема (10 мкл) плазмы крови разных больных с онкологическими заболеваниями на предстимуляцик: ПМЛ. Видно, что по мере увеличения количества Фотосенса в добавляемой плазме от 0,05 * 10"1' моль до 1,50 * 10"12 моль при ¡1С (0,06 Дж/см2) интенсивность ЛХЛ ПМЛ на последующую стимуляции: возрастала от 7 ± 1% до 77 ± 2% пс отношению к контролю. Итак, е результате проведения данны> экспериментов удалось

в присутствии плазмы крови с

установить, что интенсивность ЛХЛ ПМЛ внутривенно введенным Фотосенсом зависит, как от количества ФС, так и от дозы ЛО, В следующей серии экспериментов были использованы лейкоциты и плазмг крови пациентов с бронхо-легочными заболеваниями. Содержание эндогенногс

юрфирина в плазме определяли флуориметрически. Было обнаружено (рис. 5), что интенсивность ЛХЛ ПМЛ после лазерного облучения в присутствии плазмы крови, содержащей эндогенный порфирин,

зависит от дозы ЛО. На графике представлены две зависимости изменения стимулированного ХЛ-ответа фагоцитов от дозы ЛО в присутствии плазмы крови для двух разных пациентов: в одном случае с пневмонией (кривые 1, 3), в другом - с эронхиальной астмой (кривые 2, 4). При дальнейшем исследовании было эбнаружено (рис. 5, 6), что значение интенсивности стимулированной ОЗ 1ХЛ клеток после ЛО зависит от соличества эндогенного порфирина в добавляемой плазме крови. ■Необходимо заметить, что в данных жспериментах были использованы слетки для которых в отсутствии плазмы срови значимых изменений ЛХЛ в швисимости от дозы ЛИ не наблюдается (рис. 5, кривые 3, 4; рис. 6, сривая 2). Т.е. эффекты ЛО таких клеток з присутствии плазмы крови

300

200-

100-

l/lo, %

~г

-г

0.0

Т

0.4

"I 0.8

Количество порфирина, пмоль

Рис. 6. Зависимость интенсивности хемилюминесценции лейкоцитов от количества эндогенных порфиринов в добавляемой плазме крови для разных пациентов. Клетки облучали в присутствии аутологичной плазмы крови (10 мкл) светом гелий-неонового лазера. Доза облучения -1,05 Дж/см2.

1-е облучением", 2 - без облучения (1-е плазмой, 1о - без плазмы).

эпределяются в основном наличием в

плазме ФС, которым может быть эндогенный порфирин.

Итак, показано, что после лазерного облучения лейкоцитов крови человека в присутствии плазмы с эндогенными порфиринами и/или внутривенно введенным 1>отосенсом - ХЛ-ответ фагоцитов зависел как от дозы облучения, так и от сонцентрации ФС. В случае использования плазмы с эндогенными порфиринами максимальная стимуляция хемилюминесценции наблюдалась при больших дозах

i

облучения (0,30 - 1,05 Дж/см2), чем в случае использования плазмы с эндогенными порфиринами и внутривенно введенным Фотосенсом (0,06 Дж/см2).

2.3. Влияние лазерного облучения в присутствии фотосенсибилизаторов на концентрацию кальция в цитоплазме полиморфноядерных лейкоцитов.

Итак, в результате проведенных экспериментов было установлено, чтс ПО лейкоцитов в присутствии ФС приводит к праймингу ПМЛ. Учитывая важную роль ионов кальция в развитии предстимуляции фагоцитов, представляло интерес изучить

изменение концентрации ионов кальция

Доза облучения, Дж/см.кв.

0.0 100 -Л

0.5 L

1.0

J

5 х

+

tM (3

О

50 -

Г

О

I

60

п 120

в цитоплазме лейкоцитов после ЛО. Эксперименты проводили следующим образом: после добавления Фотосенса или плазмы крови суспензию ПМЛ подвергали облучению светом ГНЛ. Контрольную пробу инкубировали е темноте в течение времени, соответствующего времени облучени? (темновая инкубация). После темновой инкубации наблюдали незначительный подъем концентрации кальция составляющий около 3 ± 2 нМ. Однакс после облучения ПМЛ в присутствие Фотосенса или плазмы крови наблюдал!' достоверное возрастание концентрациу внутриклеточного кальция. Для ПМЛ полученных из крови разных пациентов максимальное увеличение базальногс уровня кальция составляло в среднем от 50 ± 5 до 95 ± 5 нМ. Увеличение концентрации кальция в цитоплазме ПМЛ наблюдали при облучена лейкоцитов светом ГНЛ в дозах от 0,25 до 0,85 Дж/см2 в присутствии Фотосенса (рис 7) или аутологичной плазмы крови (10 мкп), содержащей эндогенные порфирины (рис

Концентрация Фотосенса, н

Рис. 7. Изменение концентрации кальция в цитоплазме лейкоцитов крови человека при облучении светом гелий-неонового лазера в присутствии Фотосенса.

1: зависимость от дозы облучения; концентрация Фотосенса -10 нМ. 2: зависимость от концентрации Фотосенса; доза облучения - 0,25 Дж/см2. Фотосенс вводили in vitro.

д[Са^ ]•, нМ 100-.'

2+

д[Са2+].,нМ

А

Б

50 -

О-1

0.0 0.5 1.0 0.0 0.5 1.0

Доза облучения, Дж/см.кв. Количество порфирина, пмоль

Рис. 8. Изменение концентрации кальция в цитоплазме лейкоцитов крови человека при облучении светом гелий-неонового лазера в присутствии аутологичной плазмы крови (10 мкл).

А - зависимость от дозы облучения; количество эндогенных порфиринов в добавляемой плазме крови: 1 - 0,32 пмоль; 2 - 0,20 пмоль. Б - зависимость от количества эндогенных порфиринов в добавляемой плазме крови; доза облучения - 0,45 Дж/см2.

)). Необходимо отметить, что зависимости изменения концентрации внутриклеточного :альция в ПМЛ от дозы облучения оказались аналогичны по своему характеру 1ависимостям изменения интенсивности ЛХЛ от дозы облучения. При этом с гвеличением дозы облучения происходило увеличение соответствующего параметра, > после достижения максимума при дальнейшем возрастании экспозиции Понаблюдали снижение интенсивности ЛХЛ ПМЛ и концентрации кальция в цитоплазме юйкоцитов. Т. е. вероятно данные процессы взаимосвязаны и вовлечены в динамику >азвития прайминга лейкоцитов. Представляло интерес выяснить источник юступления кальция в цитоплазму клеток - внутриклеточные ли это депо или вход :альция происходит из внешней среды. Для этого изучали изменение концентрации :альция в ПМЛ после ЛО (0,25 Дж/см2) с 10 мкл плазмы крови без и в присутствии юмплексона ионов кальция - ЭГТА и блокатора кальциевых каналов плазматической лембраны - верапамила. В первом случае после облучения лейкоцитов без ЭГТА

наблюдали увеличение базального уровня кальция на 60,0 + 4,5 нМ. Тогда как облучение клеток светом ГНЛ в присутствии 2 мМ ЭГТА не приводило к изменению концентрации кальция в цитоплазме ПМЛ. Аналогичные результаты были получены и при использовании специфического блокатора кальциевых каналов -верапамила. При облучении ПМЛ без блокатора наблюдали увеличение базального уровня кальция на 50 + 5 нМ. После облучения лейкоцитов светом лазера в присутствии 0,1 мМ верапамила - изменения концентрации кальция в цитоплазме клеток не наблюдали. Следовательно можно предположить, что вход ионов кальция в клетку при ЛО происходит из внешней среды. Этот результат подтверждает наше предположение о том, что при облучении клеток в присутствии ФС происходит свободнорадикальное окисление липидов цитоплазматической мембраны, в

результате увеличивается

проницаемость мембраны для разных ионов и, в частности, для ионов кальция. А возрастание концентрации кальция в цитоплазме ПМЛ приводит к праймингу клеток.

2.4. Фотосенсибилизированное свободнорадикальное окисление липидов. В этом разделе изучалу фотосенсибилизированное свободнорадикальное окисление

липидов и фотосенсибилизированныР гемолиз эритроцитов. Для такогс исследования были использовань липосомы, апо-В ЛП сыворотки кров1< человека, а так же эритроциты кровк кролика. Было обнаружено (рис. 9), чтс при ЛО суспензии липосом (ЛС) < Фотогемом происходит накопление ТБКАП СРО мембран ЛС, зависящее

Концентрация Фотогема, мкг/мл О 125 250

0 5 10 15

Доза облучения, Дж/см.кв.

Рис. 9. Фотосенсибилизированное Фотогемом окисленио липосом при облучении гелий-неоновым лазером.

1: зависимость от концентрации Фотогема; доза облучения -10,5 Дж/см2. 2: зависимость от дозы облучения; концентрация Фотогема - 32,5 мкг/мл. ТБКАП - ТБК-акгивные продукты. ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота.

Доза облучения, Дж/см.кв.

О

3-1 |_

20

40

а х С т Ю и

Л 2

л с о 5 х

С 1 <

Ш

ь <

о-1

100

~I 200

как от концентрации ФС, так и от дозы облучения. Аналогичные результаты были получены и при использовании Фотосенса. Жирорастворимые

соединения (ионол, а-токоферол), в отличии от водорастворимых (СОД и азида натрия), были

высокоэффективны в торможении СРО ЛС. Представляло интерес выяснить, сколько ФС связано с мембранами липосом. Для решения этой задачи были использованы три независимых метода отделения ЛС от невстроенного ФС:

ультрацентрифугирование, ультрафильтрация на микропористых фильтрах и гель-фильтрация. Оказалось, что исследуемые ФС встраиваются в мембраны ЛС. При этом на 10 тысяч молекул фосфолипида приходилось 16 молекул Фотогема или 3 молекулы Фотосенса.

Учитывая то, что в плазме крови фотосенсибилизаторы могут быть связаны с липопротеинами, - необходимо было исследовать фотосенсибилизированное окисление апо-В ЛП при действии ЛИ. Было обнаружено [рис. 10), что при ЛО апо-В ЛП сыворотки крови человека с Фотогемом происходит накопление ТБКАП СРО липопротеинов, зависящее как от концентрации ФС, так и от цозы облучения. Очевидно (рис. 10, кривая 2), что ЛО апо-В ЛП без Фотогема так же 1риводило к накоплению продуктов окисления липидов (ЛТБКАП составляло 0,258 шоль/мг белка), вероятно в данном случае наблюдается СРО апо-В ЛП, фотосенсибилизированное эндогенными ФС (возможно порфиринами).

Концентрация Фотогема, мкг/мл

Рис. 10. Накопление ТБК-активных продуктов фотосенсибилизированного Фотогемом окисления апо-В липопротеинов сыворотки крови человека при облучении светом гелий-неонового лазера. 1: зависимость от дозы облучения; концентрация Фотогема -130 мкг/мл. 2: зависимость от концентрации Фотогема; доза облучения - 20 Дж/см.кв.

Поскольку гемолиз эритроцитов (ЭЦ) развивается вследствие увеличения ионной проницаемости плазматической мембраны, то представляло интерес исследовать влияния ЛИ на фотосенсибилизированный гемолиз ЭЦ. Было обнаружено, что ЛО суспензии ЭЦ крови кролика в присутствии Фотогема или Фотосенса в дозах от 1 до 3 Дж/см2 или от 2,5 до 28 Дж/см2 соответственно сопровождается инициацией фотосенсибилизированного гемолиза ЭЦ. Уровень гемолиза повышался с увеличением как концентрации ФС (Фотогема или Фотосенса), так и дозы лазерного облучения. Сопоставление зависимостей величины фотогемолиза от концентрации ФС и от дозы облучения в экспериментах без отмывки и с отмывкой ЭЦ от невстроенных в мембраны клеток ФС позволяет предположить, что фотосенсибилизированный гемолиз ЭЦ вызывается за счет вклада хромофоров как связанных, так и несвязанных с мембранами клеток.

Итак, в результате проведенных экспериментов было установлено, что ЛО лейкоцитов в присутствии ФС вызывает прайминг ПМЛ. При этом в цитоплазме клеток увеличивается концентрация ионов кальция. К увеличению проницаемости мембран для ионов кальция вероятно приводит фотосенсибилизированное эндогенными порфиринами клетки и плазмы крови СРО липидов мембран. Основываясь на экспериментальных данных настоящей работы, гипотетическую схему событий фотосенсибилизированного изменения активности лейкоцитов в процессе ЛТ можно представить следующим образом:

1. Эндогенные порфирины, содержание которых может увеличиваться при различных патологиях в клеточных мембранах и в плазме крови, поглощая световую энергию ЛИ, индуцируют свободнорадикальные реакции, приводящие к увеличению ионной проницаемости и в том числе для ионов Са2+ через мембраны лейкоцитов.

2. Увеличение содержания ионов Са2* в цитозоле лейкоцитов запускает Са2+-зависимые процессы, приводящие к предстимуляции (праймингу) клеток, что выражается в повышении уровня функциональной активности клетки, а затем, при наличии стимулирующего влияния, к повышенной продукции различных биологически активных соединений (оксид азота, супероксид-анионрадикал, простагландины, лейкотриены, гистамин, лизосомальные ферменты и др.). Некоторые из них обладают бактерицидным эффектом, а также способны влиять на микроциркуляцию крови. Например, оксид азота (N0") является предшественником так

называемого Endothelium Derived Relaxing Factor (EDRF) - фактора, расслабляющего сосуды, который приводит к вазодилятации последних и улучшению микроциркуляции, что является основой для большинства благотворных клинических эффектов ЛТ.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что облучение лейкоцитов светом гелий-неонового лазера вызывало увеличение функциональной активности клеток, что проявлялось при последующей стимуляции опсонизированным зимозаном и выражалось в увеличении интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ-ответ). Установили, что с возрастанием дозы лазерного облучения происходит увеличение ХЛ-ответа, которое при дальнейшем возрастании дозы сменяется ингибированием. При этом максимальный стимулирующий эффект лазерного излучения наблюдался в диапазоне доз от 0,05 до 0,15 Дж/см2 и зависел от используемого препарата лейкоцитов. В присутствии экзогенного фотосенсибилизатора - Фотосенса (8,65 нМ) наибольшая стимуляция тех же клеток была обнаружена при меньших дозах лазерного излучения.

2. Показано, что после лазерного облучения лейкоцитов крови человека в присутствии аугологичной плазмы крови, содержащей эндогенные порфирины и/или внутривенно введенный Фотосенс - ХЛ-ответ фагоцитов зависел как от дозы лазерного облучения, гак и от концентрации фотосенсибилизаторов. При этом использовались клетки, не отвечающие на лазерное облучение без плазмы. В случае использования плазмы с эндогенными порфиринами максимальная стимуляция хемилюминесценции наблюдалась при больших дозах облучения (0,30 - 1,05 Дж/см2), чем в случае использования плазмы с эндогенными порфиринами и внутривенно введенным Фотосенсом (0,06 Дж/см2).

3. Показано, что после лазерного облучения лейкоцитов крови человека в присутствии Фотосенса или аутологичной плазмы крови с эндогенными порфиринами -происходило увеличение концентрации кальция в цитоплазме клеток в среднем от 50 ± 5 до 95 ± 5 нМ. Лазер-индуцированное изменение базального уровня кальция зависело как от дозы облучения, так и от концентрации фотосенсибилизаторов. Максимальное увеличение концентрации кальция в цитоплазме лейкоцитов наблюдалось в диапазоне доз лазерного излучения от 0,25 до 0,65 Дж/см2.

4. Показано, что в зависимости как от дозы облучения, так и от концентрации фотосенсибилизаторов при лазерном облучении: а) суспензии липосом с Фотогемом

или с Фотосенсом в дозах от 2 до 20 Дж/см2, а так же липопротеинов сыворотки крови человека с и без Фотогема в дозах от 2,5 до 30 Дж/см2 происходит накопление ТБК-активных продуктов перекисного окисления липидов; б) суспензии эритроцитов крови кролика с Фотогемом или с Фотосенсом в дозах от 1 до 3 Дж/см2 или от 2,5 до 28 Дж/см2 соответственно инициируется гемолиз эритроцитов.

5. На основании полученных данных сформулирована гипотеза свободнорадикального механизма действия низкоинтенсивного лазерного излучения. Гипотеза основана на участии эндогенных фотосенсибилизаторов в индукции свободнорадикальных реакций, приводящих к увеличению концентрации кальция в цитоплазме клеток и предстимуляции (праймингу) лейкоцитов. Лазер-индуцированное увеличение функциональной активности лейкоцитов может являться основой для улучшения микроциркуляции и бактерицидного эффекта, наблюдаемых при проведении лазерной терапии. Практические рекомендации.

1. Результаты работы могут быть использованы для разработки методов выбора доз облучения и способов проведения лазерной терапии с целью повышения эффективности лечения и предотвращения развития побочных эффектов. Кроме того полученные данные могут быть использованы при фотодинамической терапии для разработки методов выбора безопасного для неопухолевых тканей содержания внутривенно вводимого экзогенного фотосенсибилизатора.

2. Результаты работы могут быть использованы в курсе лекций по теме: "Биофизические основы фотомедицины" для студентов 6-го курса на медико-биологическом факультете РГМУ.

3. Результаты работы могут быть использованы в лекциях на "Высших международных университетских курсах по фундаментальным аспектам лазерной медицины и биомедицинской оптики" при МГУ им. М.В.Ломоносоеа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Interaction of photosensitizers with membranes of liposomes and of erythrocytes. G.I.KIebanov, E.F.Stranadko, Yu.O.Teselkin, I.V.Babenkova, T.V.Chichuk. // SPIE Proceedings, Photochemotherapy: PDT and other modalities П. - 1996. - V. 2924. - P. 205 • 211.

2. Aggregation and hemolysis of human erythrocytes at photodynamic therapy A.V.Priezzhev, N.N.Firsov, E.F.Stranadko, O.M.Ryaboshapka, T.V.Chichuk, O.V.Sushiskaya

I SPIE Proceedings, Photochemotherapy: PDT and other modalities II. - 1996. - V. 2924. ->. 212-218.

!. Изменение параметров свободнорадикального статуса у пациентов при [эотодинамической терапии. Т.В.Чичук, Г.И.Клебанов, Е.Ф.Странадко, Г.Н.Любченко. // |>отодинамическая терапия злокачественных новообразований, М-лы Второго ¡сероссийского симпозиума с межд. участием, Россия, Москва, 15-16 апреля, 1997 г. -Л., 1997.-С. 89-94.

k Effect of laser irradiation on the photosensitized lipid peroxidation of liposomes and ihotosensitized hemolysis of human erythrocytes. G.I.KIebanov, Yu.O.Teselkin, V.Babenkova, E.F.Stranadko, T.V.Chichuk. // "Laser Therapy". - 1996. - V.8, N.1. - P. 83. i. Investigation of aggregation and hemolysis of human erythrocytes at photodynamic herapy. A.V.Priezzhev, N.N.Firsov, E.F.Stranadko, O.V.Sushiskaya, T.V.Chichuk. // "Laser "herapy". - 1996. - V.8, N.1. - P. 84.

i. Влияние лазерного облучения на клетки крови в присутствии фотосенсибилизатора. ".И.Клебанов, Е.Ф.Странадко, Ю.О.Теселкин, И.В.Бабенкова, Т.В.Чичук. II Тез. I !сероссийской конф. фотобиологов, Россия, Пущино 28-30 мая, 1996 г. - Пущино, 996. - С. 106 -107.

Агрегация и гемолиз эритроцитов при фотодинамической терапии А.В.Приезжев, 1,Н.Фирсов, Е.Ф.Странадко, О.М.Рябошапка, Т.В.Чичук, О.В.Сущинская. // Тез. I ¡сероссийской конф. фотобиологов, Россия, Пущино 28-30 мая, 1996 г. - Пущино, 996. С. 111.

I. Побочные эффекты фотодинамической терапии: возможные механизмы и |рофилактика. Т.В.Чичук, Г.И.Клебанов, Е.Ф.Странадко, Ю.О.Теселкин, И.В.Бабенкова. i Новые направления лазерной медицины, М-лы Межд. конф., Россия, Москва, 26-27 юября, 1996. - М„ 1996. - С. 271 - 272.

I. Гипотеза свободнорадикального механизма терапевтического действия шкоинтенсивного лазерного излучения. Г.И.Клебанов, Т.В.Чичук, И.А.Страшкевич, :.Ф.Странадко. // Новые направления лазерной медицины, М-лы Межд. конф., Россия, Лосква, 26-27 ноября, 1996. - М., 1996. - С. 313 - 314.

0.Interaction of photosensitizers with membranes of liposomes and of human blood cells. i.l.Klebanov, E.F.Stranadko, Yu.O.Teselkin, I.V.Babenkova, T.V.Chichuk, I.A.Strashkevych. ' 12th International congress of photobiology, Abs., Vienna, Austria, 1-6 September, 1996. -'ienna, 1996. - P. 293.

11.Низкоинтенсивное лазерное излучение вызывает фотосенсибилизированную активацию лейкоцитов. Г.И.Клебанов, Т.В.Чичук, И.А.Страшкевич. // Применение лазеров в биологии и медицине. Сб. тез. и научн. докладов Межд. конф., Украина, Киев 15-17 апреля, 1997 г. - Киев, 1997. - С. 62.