Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТОЯНИЯ И ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ КОМПОНЕНТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕМБРАН МЕТОДАМИ ИНФРАКРАСНОЙ И РАДИОСПЕКТРОСКОПИИ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТОЯНИЯ И ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ КОМПОНЕНТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕМБРАН МЕТОДАМИ ИНФРАКРАСНОЙ И РАДИОСПЕКТРОСКОПИИ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА

На прав вх ^ркялиг*

ШШВ ВЛАДИМИР ишош

ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТОЯНИЯ К ЯРОСТРАНСТЙЕННОЙ СТРУКТУРЫ КОМПОНЕНТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕМБРАв МЕТОДАМИ ИНФРАКРАСНОЙ И РАДИОСПЕКТРОСКОПИИ

(специальность 03.00.04 - биологическая химия)

автореферат

диссертации, представленной на соясканис ученой степени кандидата бмологмческих наук

академия наук ссср ордена ленина институт биохимии им. А.н. баха

На правах рухоииен

БИНШВ ВЛАДИМИР ИВАНОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТОЯНИЯ И ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ КОМПОНЕНТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕМБРАН МЕТОДАМИ ИНФРАКРАСНОЙ И РАДИОСПЕКТРОСКОПИИ

(специальность 03.00,04 - биологическая химия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации, представлен вой на соискание ученой степеня кандидат« биологических наук

я

Рабом яыполйена s лаборатории эволюционной бао-шй» * субклеточны* струк*УР ордена Ленина Института б&охшва ви.А*Н.Баха АВ СССР.

Научные руководите я* : кандкдат бЕодогичесттх наук

Д.П.ОстрогсквЙ

кандидат фязеко-иа*еи'ат$чвских веук Д„Н,Нузнецов

Официальные оппоненты: доягор бйохогячесясх наук.

Профессор Ю.І,Вл8ДЕїЗр0В кандидат баологкчесних вау* 1»Э.Еазшаяоон

fia офацЕальнвЯ отавв робота направлена в Институт фэтосюггвзв 1S СССР (Пувано-нз-Оке).

Автореферат расослан »/У* 1974 г,

Ssœaa двссертацна состоится * * jj^^JB74 г* на авоедбшш Ученого совета ордепа 2вввва Еисти*у*а Стоящая вн. à.H.Баха £8 СССР* Ëoratra B-7I, Іеяаншва проспэк*»83.

С дсссврїецюей согво овсэжоввхъея * б»<йшоте*е Инстя-ïjrt*

Увивай секретарь__.

шдвдп ошюягосш паук

/Н.И.ДЫПГО»/

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время понимание структура и функции биологических мембран составляет одну из центральных проблей молекулярной биологии (акад. Ю.А. Овчинников» В.П. Скула-чев, Ю.А. Владимиров и др.).

Повышенный интерес к биологически« мембранам явился следствием тех многочисленных и иногообразных функций био-ыеыбран, которые они выполняют в хизни клетки. Биологические иеибраны непосредственно участвуют в транспорте ионов и метаболитов. В них происходит трансформация энергии в цепях переноса электронов при окислительном и фотосинтетической фосфо рел ировании. Пространственное разделение ферментативных ансамблей и создание границ раздела также выполняет мембранный аппарат клетки.

Наибольший интерес в мембранной биохимии несомненно представляет их регуляторная роль в процессах жизнедеятельности клетки. Существует ряд идеи, определяющих развитие этой области иембранологии. Это гипотеза акад. ¿.И. Опарина и акад. А.Л. Курсанова об обратимой сорбции разнообразных ферментов на клеточных структурах» ведущей к изменению активности этих ферментов* и гипотеза о наличии кооперативных переходов в мембранных белках, липидах либо липопротеидных комплексах, которые носят глобальный характер и изменяют метаболизм всей клетки. Эту точку зрения развивают С.В, Конев, Лузатти, Номура, Шанжё,

В настоящей работе мы предприняли попытку подойти к выяснению возможного механизма участия мембран в регулировании метаболизма клетки, используя мембраны бактерий как наименее дифференцированные и в то хе время наиболее полифункдиональные из известных.мембранных систем (Н.С. Гельман» В.И* Бирюзова).

Непосредственной задачей работы было:

X. Определение состояния двух основных компонентов бяомембран-белков и лилндов.

2, Выявление и определение природы структурных переходов под влиянием важного в жизни клетки и постоянно-действующего фактора - температуры,

3. Оценка функционального значения сдвигов в структуре мембран при действии температуры, если таковые имеются.

Для решения поставленной задачи мы использовали методы инфракрасной спектроскопии и спин-зондирования, которые в настоящий момент являются одними из наиболее информативных методов исследования пространственной организации белков и липидов (Ю.Н. Чиргадзе» Л. А. Абатуров, Э.Г. Розанцев, А.8. Кагааясон и др.). Сочетание этих методов в измерением активности отдельных ферментов и ферментных систем и с измерением оптических свойств Мембранных препаратов позволило нам несколько расширить представления о характере и значении структурных переходов в биомембранах*

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В большей части экспериментов использовали 6-ти часовую культуру бактерий Micrococcus lysodoictius штамм 2665. Культура получена из Института вакцин и сывороток ни. Тарасевита. В ряде опытов использовали бактерии Bacillus stеarotheimophi1lus 2I4 из Лаборатории

физиологии термофильных организмов (Институт микробиологии АЙ СССР), liycobacterium paraffinlcun с кафедры биологии почв (Московский Государственный Университет), Escherichia coli Р-678 из Лаборатории- бактериоцинов (Институт эпидемиологии и микробиологии им. Гамалея). Культура м. lyaodoikticus была выращена на кадкой мясопептонной среде с* 0,555 Мл it при 30°С на качалках. После б-тн часов роста (конец логарифмической фазы) бактерии отделяли центрифугированием и промывали. Клетки В. stearotbermophilluB 214 были выращены на жидкой

питательной среде при температуре 55°С. Клетки м. рага-ffinioum бь&и выращены на среде с гексодеканом либо с глюкозой. Клетки в. сои колициногенаого штамма Р 6*?8 получены из -часовой культуры, выращенной при 37°С.

ИембраНЫ бактерий М. lysodeikticus и В. stearothe-rmophiius получали путем лизиса бактерий лиэоданом в гипотонической среде.

йеыбрааный препарат из клеток В,coli получади после 3-х минутного озвучивания суспензии клеток в дезинтеграторе «MSB - 20 КС" 5СО ВТ при Гоыогенат центрифугировали 15 ыин при 600 х J для осаждения неразрушенных клеток и фрагментов оболочек. Насадочпую жидкость центрифугировали 90 мин. При НО ООО х f и полученный осадок переосаядали при 35 ООО xj- 20 шш.

Все процедуры проводили ВКтПа фосфатном буфере

(0,01 и; pti ; ю"5 м möso4).

Липиды из мембран получали экстракцией смесью хлороформ-метанол (2:1) по Фолчу.

Дисперсию липидсл в буфере готовили путем озвучивания в дезинтеграторе "ИЗЕ-20 вс". Концентрация липида в исследуемых дисперсиях составляла около 10 мг/мл.

Активность дегидрогеназ определяли по скорости восстановления искусственного акцептора электронов 2,6-ди-хлорфенолиндофенола <2,6 ДФИ).

Дыхательную активность определяли по поглощению кислорода полярографкчески в ячейке Шольца <1965) при температуре 30°С.

Белок в мембранных препаратах определяли по методу Лоури.

Инфракрасная спектроскопия препаратов бактериальных мембран проводилась следующим образом. Густую суспензию мембран в воде (около "20 мг, белка в I мл) наносили на пластины из герцания (ф 30 мм,толщиной Z им) или флюорита (ф 40 1ш,толщинойЛ мк). Из расчета 0,1-0,15 мг. белка на I сгр площади. Плёнки высушивали на воздухе при комнатной талера тура. Регистрацию спектров прово-

- б-

дили на приборе тш- Ю (ГДР).

ДеЫерировайие проводили в герметичной колете тол -щивой 16 * х^н одномоментных заполнением «света тяжелой водой.

Запись спектров при изучении скорости дейтарирования Проводили в интервале Й00 - 1800 см"1 против контрольной кюветы с п2о . Использовали тякеловодородную воду 99,7% адстоты, нейтрализованную по бумажному индикатору добавкой прокаленного На^ро^. Обсчет спектров для опредоленда степени дейтерообмена проводили по методике Блоута по уменьшению поглощения при 1550 си"1, принимая эа 1001» дейтерироваиие ■ препарата в присутствии додещ!лсульфата натрия (1%) в случае целшс мембран или после часового прогрева при 60°С в случае работы с мембранными белками.

Препарат обезжиренных мембран получали погружением пластинок о сухой пленкой мембран в смесь хлороформа и метаноца(2:1 по объему) па 0*5 - I час при комнатной температуре..

Исследования светорассеивания суспензии мембран проводили на'спектрофотометре СФ-4А при длине волны 600 ни., з которой вклад в поглощение самих мембрав минимален. Перед измерением оптической плотности образец выдерживался при данной температуре около 3 мин.

В качестве спиновыг зондов использовали стабильные яминоксшшше радикалы: 1,1,3,3,7-пентаметвл ?,8-<5анэ-1,2,3,4* теграгадрош!рроло-|з,4-^.вндол-2-оксиз1 (I); 2,2,6,6-тетраметил-4-каприлоилоксшг-пипвридин-1-оксид (П); 2,2,4 ,9-певтаметил-1,2,3,^-тетрагидро-/-карболян-3-ок-сил (Ш); 2,2,6»6-тетраметштальм1(тшгоил-амндотгаеридия-1--оксил (1У); 2,2,6,6-тетраиегил-4-ЛлальнитивоидохсиэтиЛ--пиперадаш-1 оксил (У). Радикалы синтезированы в лаборатории Э.Г. Розанцева. Зонды вводились в мембраны на их водные ультразвуковых дисперсий. Невгаючивмийся зонд отмыва-лн буфером и мембраны осаждали центрифугированием. Исследуемый препарат содержал 30-40 мг белка/мл и ГО*7 спи-« пов/вд. Во Фракцию липидов зонд вводили через хлороформ.

a x t E ■ ' ^ ~

лшсоМ^сн» смадсф^чСН»

Ф.

Образцы для исследования помещали в тонкостенные стеклянные ампулы диаметром 1,0-1,2 им.

Регистрация спектров производилась на радиоспектрометрах РЭ-130Г, ЭПР-2, 9ПР-5 ("Сибирь")К В-4 ( Varían). Температура образца поддерживалась с помощью жидкостной либо газовой системы термостатирования.

Рабочие параметры радиоспектрометра выбиралась такие, которые не искажают форму спектров ЭПР зондов.

Из полученных спектров 8ПР зондов мы расчитывали время корреляции вращения радикалов ( )* характеризующее ыккровяэкость окружения зонда и константу изотропной^ сверхтонкой структуры (ftw), зависящей от поляркости окружения зонда. При исследовании локализации збкдов в мембранах мы использовали метод парамагнитного "тушения" сигнала зонда * находящегося в водной фазе, предложенный Г.И. Лихтенштейном и развитый &.Н. Кузнецовым применительно к микрогетерогенным системам.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Опенка вторичной структуры белков бактериальных мембран и степени их доступности для волн

На первом этапе работы мы попытались оценить структурную организацию белков в мембранах Ш-crococcus iyaodei-jrticua и Beherichi» coii по данным ШС-спектроско-

пии сухих пленок« а также по скорости Я Д обмена во влаякьге препаратах интакгшвс и обезжиренных мембран. На рис. I представлены ЙК-спектры иеибраа и. , и Е.соИ и спектр о бе зааре нных белков из мембран м. 1уооаоЦге1сио » области 1500-1800 см"1« где располагаются две наиболее характерные а удобные для оценки вторичной структуры белка полосы поглощения - амид I (валентные колебания связи = 0 в пеп-

тидной группе)' и амид П (в основном? деформациовкые колебания связи >Л/.~ Н в пептидной группе). Полоса амид I в данном случае характеризуется выраженным максимумом

им- тм * тмшГ*

«'" .......' ...... 1 I1 1 -■•— |

при ~ 1660 что свидетельствует о пребывании но-липептидных целей мембранных белков в состоянии (С -спирали шш неупорядоченного клубка. В то же время отсутствие добавочных максимумов (или "плечей") при 1630 и 1695 см-1 указывает на малую вероятность существования в мембранах

а - формы белков.

Перечисленные особенности спектров а равной мере относятся к мембранам пленкам из м. lyßodeikticus в s. coli» однако они не лиоены некоторых индивидуальных черт. Так, в ИК-спектре мембран E.coii заметно смещэкие максимума полосы амид I к-1655 см"1, а также появление "плеча" при 1630*1640 см-1 и меньшая выраженность полосы 1740 см"1, что-обусловлено, вероятно, присутствием в препарате элементов клеточной стенки.

Интересно отметить, что форма спектра существенно не меняется после удаления лшвдов (полоса 1740 см"1 обусловлена валентными колебаниями овяэи >С»0'і эфирной группе липидов и ее исчезновение является показателем полноты удаления липидов). Это обстоятельство трактовалось рядом авторов как показатели отсуствия сильных взаимодействий между липидами и белками мембраны. Таким образом, тезис о структуроопределающей роли липмда в мембранах казался опровергнутым; однако солее точным, пожалуй, будет утверждение, что при обезжиривании не происходит новообразования ß, - формы, а то время как значительные конформациояяве превращения типа перехода спирадь клубок могут быть ае замечены*

В этой связи дополнительную информацию о характере взаимоотношений между компонентами мембраны можно получить при анализе кинетики Н Д обмена в пептидной группе, что уже дало значительные результаты при научен» структуры белков и полипептждов (Кобяков 1969, Абатуров 1970).

Замещение водорода на дейтеряй в - Н-группе пептидной связи, приводит к значительному сдвигу полосы амид п в длинноволновую область (порядка 100 см""1), что позколяет использовать ИК-спектры дня количественной оценки дейтерообмена в белках.

На рис. 2 приведены ИН-едектры мембрая к мембранных белков из itaysoaejkteicue до момента содрнкосновевад с тяжелой водой в спустя 25 мин. Спектри даны в единицах оптической плотности, рассчитанной по точках на кривых пропускания через каждые 5 си"^, я приведены вслучао

мембран к одной и той же величине см-1«

• Положение максимума и симметрии полосы амид 2 не претерпевает существенных изменений при переносе сухой плёнки ыембран в Д20. Можно думать, по-видимому, что белковые молекулы в мембране не подвергаются денатурации (по крайней мере» типа перехода спираль (или клубок)

з—» форма) при.высушивании препарата меибран в процессе приготовления тонкой пленки.

Изучение кинетики дейтерообмена показало, что удаление липида делает доступными обмену подавляющее большинство ^Л/- Н-групп в пептидных- звеньях мембранных белков. Это явление мохно объяснить как экранирующим положением яипида, так и более активным влиянием липида на информацию мембранного белка, если допустить, что днпид поддерживает в состоянии «с- спирали значительную часть полипептидной цепи и что при удалении лшшда молекула белка превращается в неупорядоченный клубок» Последнее предположение получило некоторую поддержку в недавней работе Мазотти и др., показавшей изменение циркулярного дихроизма мембранного белка при удалении липида.

Для оценка возможных денатурирационных явлений прх изготовлении препарата мы определили в мембранах

- и -

и.іуеойвііЛісив активность малат-2 ,б-дюлорфеаоливдо-фенолоксидоредувтазы и скорость поглощения кислорода. Оказалось» что при высушивании сохраняется около окси-доредуктаэы а 100% активности дыхательной цепи.

Таким образом, на представленных данных следует, что белки бактериальных мембран находятся в состоянии

оС.- спирали и (или) неупорядоченного клубка и что большая часть пептидных групп защищена от контакта с водой липидвши компонентами мембраны.

П. Температурные структурные переходы в мембранах бактерий

Делая вывод о состоянии мембранного белка бактерий преимущественно в Л- спирали и неупорядоченного клубка, мы отдаем себе отчет в том, что состояние белка я мембраны в целом не есть что-то застывшее» что конфориация компонентов мембраны меняется при функционировании мембраны и изменении определяющих ее условий.

Для изучения возможных изменений в мембранах мы избрали температурные воздействия как наиболее легко дозируемые и имеющие большое значение в жизни микроорганизмов.

В настоящем разделе представлена серия работ, направленное на исследование температурных структурных переходов в бактериальных мембранах различного происхождения с помощью ряда физических и.биохимических методов*

В изолированные мембраны м. іуво аеНгЫсиа И Е.Соїі вводили в качестве возможных индикаторов структурных превращений свободные иминоксильные радикалы - зонды 1,1,5,3,7-пентаме*ял-7,8-бенэ-1,2,3,^-тетрагидропярро-до-(3,4 )-яндвл-2-оксял (I) и г,г,б,б-тетраметил-4-капралоилоксилпиперидин-1-окоил (Л). Для сравнения эти же радикалы были-введены в различные компоненты, выделенные из мембран К.1)гоой*1)гМсгш<

Спектры адр зондов в исследуемых системах имели хорово разрешенную сверхтонкую структуру, что соответствует

иолекулярно-дисперсному состоянию зондов ¿рис. 3),

лО

hc.^

РасЗ Сіиіііі ЭПР >1М1М > кнц пш а™

htim

________Д,'1іЧ»*Ипа n* irfT-1 ,11 rti > mi

AA МІМ I ____ ... .

«аютятях втри if. ІН****'

■Ipttt ^tl ІИІНИ*. » 1»>■!»■><

MWHMimiHX ' ' "

рміЧ іміріі it----

«г ц t*

Доказательством включения радикалов в мембрану служит, например, то« факт* что прошака ее привода« к удалению радикалов из мембран. Отоутстмв яакелеаяК в спектрах зондов при введении в препарат мембраа феррицианида калия (до ICT^U) указывает на объемную локализацию вводов. Внсокие коэффициенты распределения радикалов * £ ( > Х0б) и D ( « I02) в системе гептан-вода позволяют предположить, что аонды локализуются в гидрофобные зонах мембраны.

Наші были получены температураые зависимости зондов в рааличных^ бактериальных меибранах, в обезвоженном липнде, выделенном яз мембран ж водном препарате

мембранного бедка (рис. Ыожно видеть, что энергии активации вращательной диффузии гонда я абсолютные ана-чеяия *Ес для зонда П в суспвнвии мембран ж в безводном липиде близки, и, следовательно, мохно считать, что в ^ мембранах зонд Л локализован в лкмдных компонентах.

Температурные кривые для зондов I к II в липяде также имеет близкие энергии активации, разница в абсолютных значениях Ъ'с. связана с больюш эффективным объемом радикала I по сравнению с П. - В го же время характер кривых ¿9ТІ-Г- Т"1 для зонда I в мембранах я лкпвдах резко отличен. Наблюдается в качественное различна в изменении "Тс зондов I я П при переходе от лшіяда к мембране. По-видимому,. зонд I локализован преимущественно в белках мембран.

В пользу такой локализации зонда I свидетельствуют также следующие факты. Для подобного рода соединений обнаружено сродство к белкам. Характер температурных изменений для зонда I, включенного в водный раствор альбумина и в мембраны бактерий, сходен. Кроме того, формы спектров ЭПР для зонда I в мембранах я в растворе альбумина сходны (см. рис. 3).

Таким образом, мы предполагаем; что бонд і локализуется в'белковых областях бактериальных мембран, а П -в лшидных.

Из данных, представленных на рис. 4, следует также, что подвижность зоада П уменьшается в мембране по сравнению с лкпидом. Последнее, вероятно, является следствием структурированности липидов в мембране.

Для зондов, находящихся в различных структурах бактериальных мембран, было показано сравнительно резкое увеличение вращательной подвижности зондов в относительно узком интервале температур. Однако не ясно, в какой мере реакое уменьшение зондов обусловлено изменением окружения. Этот аффект може* быть обусловлен скачкообразным изменением подвижности зоада при непрерывном изменении структура его окружения.

- » -

В подму первого предположения свидетельствуют отсутствие подобных ИЗЦЄНЄШ1Й в зависимостях Хі. от Т в липаде и глицерине и одновременная регистрация структурного перехода различными зондами*

Температурный интервал структурного перехода, регистрируемого с помощью зонда I, характерен и для зонда О, что по-видимому, можно объяснить общность» процесса перо-стройки. ■

Интересно обсудить, является л* ©тот переход проявлением структурных превращений в дипядах, белках, либо этим свойством обладает лишь липопротеидяый комплекс в целом.

Нагревание обезвоженных лидидов (си* рис. 4), а также водной дисперсии липидов не обнаруживает особенностей, характерных для мембран во всем исследуемом интервале температур (30-60°С). С другой стороны, для рада белков известны структурные переходи в преддекату-рациониой области, которые регистрируются методами пик-рокалориыетрин к спектрополяриметрин.

Однако, обнаружить структурный переход на изолированных белкахM.lysodeikticue с помощью бонда I, не удается, так как процесс выделения ввязав с необратимой денатурацией обезжиренного белка (рис. Деватурационншв явлениям, возможно, объясняется и необратимость хода . кривой охлаждения tT«* Т зонда I в случав мембран В.coli.

Таким образом, структурный переход, наблвдаемый нами в мембранах v.iysodeürticua, по-видимому, не обуслов-деи фазовыми превращениями в лип идах, а связан со структурный» превращениями в белках. В этом случае понятна больдая глубина структурных превращений в Йелках по сравнение о липндом и температурный сдвиг начала структурных изменений в липиде мембран (рис.4). Хотя но исключено, что таким свойством может обладать лишь лшгопротеидтД комплекс в целом.

л , Исследованные нами с помощью зондов структурные переходы биомембран обратимы, причем они сопровождаются

резхшш nstteнениями активности некоторых дегидрогенаэ.

Необратимость ах появляется при достижении температур денатурации белка, что еще раз подтверждает белковую природу исследуемого перехода. При этом инактивация мембранных ферментов происходит в первую очередь. Такое несоответствие можно объяснить, например, тем, что метод спинового еонда регистрирует интегральные изменения, происходящие в локальном окружении статистически распределенных зондов* (Воля зондов, находящихся вблизи активных центров ферментов весьма мала).

Не исключено, что в исследуемых мембранах существуют и другие структурные переходы, связанные, например, с фазовыми переходами в мембранных лкладах. Поэтому, для реаеаия вопроса о ярцроде переходов представляет интерес исследовать структурные изменения биомембран в достаточно сироком интервале температур, который бы включал несколько структурных переходов.

Ранее был исследовав интервал температур 30-60°С, При снижения Температуры гаже комнатной форма спектра зоада П начинала усложняться. Мы предположили, что при понижении температуры радикал начинает перераспределяться в водное окружение. И действительно, введение в водную среду феррицваивда кадия (КГ1«) полностью уаирядо спектр радикала а водной среде.

Перераспределение зонда П создавало трудности для дальнейиего его использования в поставленной задаче.

Дня дальнейикх исследований нами был выбран зонд iy, при этом предполагалось, что в силу плохой растворимости его в воде я соответствия размеров его углеводородной ценя о жяряохисдотннмя остатками мембранных липидов он будет локализован s липвдяом компоненте мембрана.

OfiWKW» служили мембрвны бактерий tî.lyeocleilrticus И водная дисперсия липидов, выделенных из мембран. ^ Как показал эксперимент, зонд 1У включается в нссле-

ЗЖнйГ?*^ SïïKXiîS » ««вадрнс-дисперсном

' ч м свидетельствует хороао разрешенная струк-

тура спектров ЭПР зонда. Причем Ы— О* фрагмент зонда локализовав в объеме мембраны таким образом, что введение во внешнюю водку» среду парамагнитного комплекса (К3Ре(СЛ)б) В концентрации Ю"*1«, кбторое обычно уширяет сигнал 8ПР зонда в водной фазе, не приводит в жданном случае к.изменению формы спектра зонда. Значение параметра Од/ , которое пропорционально полярности окружения К - 0*фрагмента радикала, для зонда 1У в мембранах выше, чем для зонда П (16,55 гс., и 16,3 гс * 0,05, соответственно при Т°комн.)* Из этого следует, что Ы- СГ фрагмент зонда 1У располагается ближе ^поверхности мембраны, чем П. Возможно, что он находится в области полярных групп липидов мембран, либо в области двойного электрического слоя.

Форма спектров 8ПР, значения 2Г6 и о.ы для зонда 1У в мембранах и озвученных липидах близка, что подтверждает предположение о том, что используемый зонд локализован в липидных компонентах мембраны и, следовательно, должен преимущественно отражать изменения, происходящие в них»

При рассмотрении температурных зависимостей я<Ъг, представленных на рис. 5, видно, что в исследуемых системах существует несколько структурных состояний, которые соответствуют различным энергиям активаций вращения зонда. Так, в области низких температур в'нативных мембранах при 22°С наблюдается излом на кривых зависимости *£* и а„ от температуры, что говорит о наличии структурной перестройки в мембране. В дисперсии липида также регистрируется структурный переход в близкой области температур. Можно предположить, что эти переходы имеют общую природу. Это подтверждается и данными Стейма по микрокалориметрии.

Некоторое несоответствие температур переходов в липидно-водной части мембран н модельных мембранах, а также качественное различие'в изменении энергии активации вращения зонда при этих переходах возмаяро связано о возмущающим действием белка. Это косвенно подтверждается и тем, что после тепловой денатурации в области темпера-

- г? -

тур ниже 22°С резко усложняется форма спектра зонда (форма спектра приближается к таковой для зовда в без-•водаом лилиде), что« по-видииоиу, связано с наруяекиеи лшшд-белковшс взаимодействий при денатурации белков и частичный выделением лнпида в отдепьнуп фазу.

йк. S Зшсвмогь ішрамщиі Ті эош iv er те»* мротрм а сіотвім ходмі исперс«* дмпада х орммргдеьяо Ж«мтю*ромаиіа иокЗрйнАх >0), я яатавтнх мвмбраіах и. ijr»oJtthtic«* (в); tfcucinoo» n;:pa>mpö Ом зонда iv от температури х арммримліио деивтураровашш* иеиоршах (г), • ЯМІМШС Ивмбраяат M.t?iedalktl*ii4]|),

В диапазоне температур 38-45°С обнаруживается отклонение от Аррениусовской зависимости к резко нэке-

няется си/ для аативяьк мембран. эти отклонения отсутствуют для препарата денатурированных мембран и дисперсии липида, что указывает на значительную роль мембранного белка в осуществлении этого перехода. Такой вывод согла-с^тст и с данными, полученными нами ранее с помощью зояда, чувствительного к информационным изменения» белков.

%% 100 -

so

10 20

Г с

30 АО $0 60

Рас. б Омсдеме яблочной кяслотн (a) t HWIHj tel up* 20°С шмгшш хлеток М. i>to4*m tcut предвари -тельца прогретый* при задпявой тсийервтурв у тме-. ш часа.

. Интересно отметать, что в указанной области температур не ко торца ферментные системы мембран ii.lysoaeikti.cus

претерпевают существенные изменения. Так при температуре выше 35°С в лизате этих бактерий активность оксидазы НАДНз начинает резко падать (рис. 66). В то время как активность оксидазы яблочной кислоты сохраняется (рис.6а). Ыокно было бы думать, что происходит обычная тепловая

' инактивация более териолабильвой КШ2 дегйдрогеназы. Однако, на саком деле этот фермент ае инактивируется. При исследовании осадка и васадочной фракции лизата после центрифугирования при 40000*$ 20. мин. вами было обнаружено, что НАДНг дегвдрогеяаза почти полностью выходит из мембран и ее активность регистрируется в растворе. Можно полагать, что "выброс" фермента в условиях опыта обусловлен изменением взаимодействия мембранных компонентов в результате структурного перехода»

Как видно из рис. 5 последний перелом на кривой.

-^Т"1 в случае нативных мембран приходится на область ~750С»

Очевидно, что при таких температурах должна начинаться необратимая денатурация белков мембраны. Действительно, по данным, полученным нами с помощью ИК-спектро-скопии, прогревание нативных мембран в течение 2 часов при 60°С не приводит к заметным изменениям ИК-спехтров мембранных белков и в их структуре преобладают спираль и неупорядоченный клубок, а после кратковременного выдерживания в кипящей водяной бане существенно и необратимо возрастает доля Р- формы в конформации бедка (полоса поглощения 1630-1640 см~*.

Таким образом, переход при 75°С в нативных мембранах можно было бы объяснить изменением структуры липидов при необратимой денатурации мембранного белка*

Однако, в противоположность переходу при 38-45°С, который исчезал при денатурации этот переход сохраняется и в денатурированных мембранах (рис. 5 б). Это •позволяет нам предполагать, что структурный переход при 75°С в нативных мембранах обусловлен изменением ее липидно-водного компонента. Действительно, и в дисперсии липи: дов в близкой области температур наблюдается структурный переход (рис. 5а). Некоторое различие в температурах переходов и в изменении энергии активации вращения зонда при нис таете как и в случае первого перехода, можно приписать возмущающему влиянию белкового компонента.

При рассмотрении зависимостей CU/-T*"1 (рис. 5г,д) в этом интервале температур видно» что в денатурированных мембранах в области первого перехода отсутствует резкое изменение в Ol*, наблюдаемое в пативных мембранах. Такой результат не противоречит сделанному выводу, что резкие изменения в А* -отсутствуют и в водной дисперсии липида, и может быть следствием нарушения дипид-белковьк взаимодействий при необратимой денатурации мембранного белка.

В-связи с.наличием нескольких структурных переходов в биомембранах встает вопрос об их связи с экстремальными температурами роста. К сожалению, точных температурных границ роста бактерий M.iysodoik-eicus мы не знаем. Ложно предполагать, что ими могут быть 20 и 45 °С.

В этом плане представляет интерес изучение мембран термофильных бактерий» для которых температуры порядка 40-б0°С являются нормальными, что позволяет отклонить опасения регистрации денатурационных процессов при воздействии высоких температур.

В следующих экспериментах мы вэвли в качестве объекта исследования мембраны облигатиого термофила Bacillus stearothennophlluß И мезофила M.lysoaeikticus с тем, чтобы используя методы спинового зонда и светорассеива-ния, определить характер индуцируемых температурой структурных перестроек..

На рис. 7 представлена зависимость- *Сс от температуры для ЗОйдь, BJCCSIЭННОГО В мембраны в.stearotbemophilus.

Видно, что существует три участка с различными £«. вращательной диффузии зонда. Точки изменения £а приходятся на температуры около 40°С и 80°С. Из этого можно заключить, что в исследуемой области температур существует по крайней мере три различных структурных состояния бномембраны.

Изменение состояния отдельных компонентов мембраны, приводящие к существенным превращениям в структуре мем-

бравы а целен» обычно приводят к изменению многих свойств мембранного препарата, в ток числе меняется ракхер взаимодействия частиц суспензии и субъединиц мембраны, приводящие к изменению оптичеокях свойств препарата.

*> »_ Ж 30 t^

г 4с

I,«

.-«.О

2,1 3,9 3,1 3.» 3.&

1 iiitHnttitHMt-

В этой связи 1Ш провели измерения оптичеокой плотности взвеси мембран в обычном фосфатном буфере (0,01 U буфер рН 7,4 с 0,001 Н а также в деионизированвой воде. Светорассеиванне суспензий в деноииаованной воде умвнвнается по мере нагревания до 20° в случаа мембран ii.i^rsodelMleua и до 40° в случае мембран B.eteuoth»-rmoBhilAia , затем наступает период неизменного иди слегка возрастающего светорассеиванип, а при температурах ВЫЛО 40° ДЛЯ мембран М. lysodeiktlcus или вше 60-65° ДЛЯ мембран B.etearotberoopbllus происходит резкое и прогрессирующее возрастания мутности суспензий. В зтом случае, как и в случае изменения параметров-спин-зонда точки перегиба кривой светорассеивания для и.1уво-¿•iktleoa совпадают с nWnw и верхним температурными пределами роста. Возможно, что точки 20 и 40°

также ограничивают температурный интервал роста мезо-фильного м.ХузойеНгЫси^ хотя специально это предположение мы не проверили.

Каковы же причины столь своеобразного изменения светорассеивания мембранных суспензий? Что происходит в мембране? Для удобства рассуждений мы рассмотрим только препарат из в.а^еагоШегторЬ11«з полагая, что аналогичные явления происходят также и в препарате мембран ll.lysodeikti.cus . Можно думать., что при 15°0 препарат мембран состоит частично из отдельных мембранных пузурь-ков и их агрегатов. Агрегаты образовались, по-видимому, в результате ионных и гидрофобных взаимодействий менду частицами. По мере нагревания начинается дезагрегация сгустков мембранных частиц, так как силы сцеяления между отдельными частицами оказываются недостаточными, чтобы противостоять их более интенсивному тепловому движению. При 40° процесс дезагрегации прекращается, по-видимому, вследствие специфического индуцированного ливидом, структурного перехода.в мембране, изменяющего поверхностные свойства мембран. Можно предложить следующее объяснение этому явлению, рогласно работе Знгельмана, при температурах, выше температуры плавления липида, площадь, завиваемая одной молекулой липида, возрастает. В мембране это может сопровождаться усилением липид-белковых взаимодействий вследствие взаимопроникновения компонентов мембраны. Кроме того, возрастание интенсивности движения молекул липида может привести к увеличению суммарной гидрофобной площади внешней поверхности мембранных частиц, что вызовет усиление гидрофобных вззгиодействий между ними. С этого момевта силы сцепления между мембранами начинают преобладать над силами, стремящимися дезагрегировать сгустки мембран в результате теплового броуновского движения. Этот процесс находит свое отражение на участке слабого возрастания муаности суспензии мембран.

Дальнейшее нагревание (вше 65°С), по-видимому вызывает денатурацию белкового компонента мембран, которая сопровождается интенсивной агрегацией мембран-

• щи частиц * вйараотаниеи мутности суспензии.

Присутствие в суспензии слабого нейтрального буфера существенно меняет характер кривой мутности.^Све-торассеивание уменьшается вплоть до температура 65 . Означает ли ато, что характер внуярлшембранных превращений также существенно изменился? Мы полагаем, что состояние и взаиморасположение компонентов мембрана претерпевает одинаковые изменения в буферных и деионизованнык суспензиях мембран, однако в присутствии буфера над силами взаимодействия начинав* доминировать отталкивание 1 ионизованных электроотрицательных групп, и это маскирует внутримембраннце превращения.

Таким образом, резюмируя изложенное, мы можем отметить, что два независимых метода (спин-зондирование и светорассеивание) позволят обнаружить конформацяонные переходы в изолированной бактериальной мембране при температурах, ограничивающих температурный интервал роста втих бактерий. Нежно думать, что нижняя точка роста определяется температуров плавления дипидов, тогда хак верхняя точка роста определяется скорее свойствами белков. Однако, несомненно большую роль как в термостабильности, так и в холодоустойчивости бактерий играет взаимодействие обоих главных компонентов мембраны, В мембранах психрофильных бактерий липиды плавятся при низкой температуро, однако эта легкоплавкость, возможно, становится фатальной при повышений температур. Так клетки неидентифицированных морских бактерий лиаирувтся при повышении температуры выше 2.0°С ( D*¿ouetet«i ). у -облнгатвых термофилов типа B.st««xotbexnophiIua бедОК—лилидн1і9 взаимодействия уже осуществляются так, что при высоких температурах избыточная подвижность ли-падов не может дезорганизовать мембрану, однако жизнь тажах организмов при 30-40° становится невозможной из-м затвердевания липадоэ и нарушения функций мембраны. Вопрос о соотношении тепло- и холодоустойчхвооти на уровне организмов и молежул обсуждался pasee (Алежсанд-ров 1$69> ж мм склонны разделять мхенио проф. ілександ-

- 2k -

роза, полагающего, что для надлежащего выполнения функций макромолекули (а по нашему мнению и мембраны в целом) долины обладать строго определенной степенью лабильности.

В этой связи мы хотим обратить внимание на значения энергий активации (Еа) вращательной диффузии зондов в исследуемых системах.

Ряд экспериментальных данных, полученных при исследовании температурной зависимости вращательной подвижности зондов в простых жидкостях и длинноцепочечных полимерах указывает, что величина Еа для этих систем не зависит от структуры радикала, а полностью определяется структурой и сегментарной подвижностью полимеров и может служить характеристикой исследуемой системы. Так, например, показано, что энергии активации зондов в жестко сшитых полимерах имеют минимальные значения (1-2 ккал/моль), в то время, как в жидких растворителях - характеризуют-, ся большими значениями (10-15 ккал/моль). Этот вывод нельзя без .тщательного анализа и проверки переносить на более сложные системы и тем более аа биологические* Однако, полученные нами результаты позволяют заключить следующее: -

Во-первых, действительно Еа не зависит от размеров и формы радикала для липида, выделенного из мембран u.iy-scdeiirticus (зонд I и П в безводном лшшде).

Во-вторых, судя по аы для зондов ІУ и Пбмембра-нах ы.lyso fieikticusa онд П (точнее его имивоксильный фрагмент) расположен более поверхностно, в то же время известно, что как в модельных системах, так и в биомембранах, по мере удаления от поверхности сегментарная подвижность липидов растет, а упорядоченность уменьшается. И действительно, значение Еа для зонда ІУ меньше чем для зонда II в этих мембранах.

Таким образом, эта аналогии позволяют надеяться, что для случая "лштднф" зондов Еа, так же как и для случая простых жидкостей и полимеров, вероятно, отражает структуру и сегментарную подвижность липидов.

Б этом плаве поразительный факт близости Ва зондов для мембран термофильных и яеэофильншс бактерий в интервале их физиологических температур (40-70°С и 22-52 С) позволяет считать, что структурное состояние липндов в этих сдучаяк одинаковы. В то же время значение Ба зонда ІУ для дисперсии лшгадов дольше, чем для мёкбрак, т.е. липида в биомембранах более структурированы, чем в модельной системе. Это отражается и на величинах в этих системах ( *СЧ мембран > диспор. липида).

Рассматривая верхнюю и нижнюю точку роста бактерий как конформациояный переход в мембране, мы полагаем, что этот переход может означать не столько факт прекращения жизнедеятельности, сколько переключение на новый режим обмена веществ, призванный вывести организм са чрезвычайно опасной ситуации. В этой связи дальнейшее развитие приведенных исследований мы представляем как изучение триггерной функции обнаруженных переходов, что находит все большее экспериментальное подтверждение (Троицкий и др. 1972, Вохарицкая и др. 1972, Конев и др. 1972, Єїеіт 1972).

Специальный раздел диссертации посвящен исследованию механизма взаимодействия клеток углеводород-окасля~ юодах'микобактернй с субстратом.

Усвоение различными микроорганизмами углеводородов алифатического ряда представляет больной практический интерео, и, вместе с тем, изучение этого явления может дать многое для понимания молекулярной организации бактериальной мембраны и всей оболочки клетки, так как субстратом бактерий является исключительно мембранофиль-ное вещество.

Нас заинтересовал этот объект в связи с гипотезой« согласно которой углеводород растворяется в лкпофкдь-вой оболочке и диффундирует к внутренней ее поверхности, где трансформируется при участии специфических ферментов (Г.К. Скрябин и др.).

Цн попытались с помощью парамагнитного зонда ІУ, молекула которого похожа на молекулу субстрата-гекса-

декана получить информацию о характере взаимодействия алифатических углеводородов с оболочкой бактерий. Основанием для такой постановки вопроса послукила следующие рассуждения: ¿ели субстрат поглощается клеткой в виде микрокапель, то сигнал ЭПР от зонда, находящегося в таких каплях, будет неизменным как до, так и после поглощения субстрата; если же субстрат растворяется в оболочке клетки и затем диффундирует внутрь*ее, то параметры сигнала будут меняться ло мере продвижения углеводорода (и зонда) через стенку и мембрану клетки.

При добавлении зонда в смеси с субстратом к живым клеткам ( МусоЪас^вйот рага££іпісйа ) сигнал от зонда быстро исчезает вследствие его восстановления ферментными системами клетки, поэтому часть опытов была проведена с клетками, в которых ферменты инактивированны соляной кислотой или прогревом. Полученные значения Сі и <Хы зонда в исследуемых системах позволяют заключить, что зонд (и вместе с ним субстрат) при контакте с оболочкой бактерий диффундирует в липофильные участки двух типов. Такие участки представлены не чистым липидом, а, по-видимому, структурой, где липид находится в соединении с более полярными компонентами.

ВЫВОДЫ.

I* Белки бактериальных мембран находятся преимущественно в состоянии «С-спирали,и (или) неупорядоченного клубка.

2. Мембранные белки имеют контакт с водой, причем удаление липида увеличивает-.. количество пептидных групп, взаимодействующих с водой.

3. Плотность упаковки липидов в мембранах выше чем в водной дисперсии изолированных липидов.

4. Мембраны бактерий в вироком интервале температур претерпевают ряд структурных переходов. Одна из них индуцируются дипкдным компонентом меибрая, другие иогут зависеть от нативкостн мембранного белка ^возможно, индуцируются белкой либо лююпротокдным комплексом.

5. Структурные переходы вызывают изменение взаимодействия мекду компонентами иенбрави И сопровождаются скачкообразный изменением активности мембранных ферментов.

6. Нормальное функционирование мембран связано с определенный структурным состоянием мембранные лкпидов, и поддерживание его, по-видямому, является ОДНИМ И8 механизмов адаптации к новым температурным условиях.

7. При росте углеводород окисляющих бактерий

на среде с гексадеканом последний пропитывает оболочку ' солюбилизируясь в.хкоофикышх ее участках.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

I, Пишоков В.йь, Говдфельд Ы.Г., Борунова С.Ф., Жукова И.Г., Еудаай Д.Г., Кузнецов А.Н., Шапиро А.Б., Островский Д.Н. 1971, Исследование структурных переходов в биологических мембранах методом спинового зонда; температурные двменения мембран бактерий, та^^нкщ. 36, 1149.

2» Еинвков ВЛи» Хткола И.Г., Островскхй Д.Н. 1971 * Одеаиа вторичной структуры белков баюериахшке иомбрав по данным ШС-спектроскопин. ДАН СССР. 198.' 1457.

3. Бднюков В.Я., Коронеллх Т.В., Ерасальников Н.А., Иванов В.П., Островский Д.В. 1972. Иешедоваим методом

парамагнитного 'зонда иеханизиа взаимодействия с субстрат-том клеток углезодородокисяяидос микобактерий. ДАН СССР. 203, Л67.

4. Бинпвов В.И., Кузнецов А.Н., Капрельянц A.C., Островский Д.Н. 1572* Исследование методом парамагнитного зонда температурных структурных переходов в бактериальных мембранах» Материалы 4-го Ыежд. Еиоф. Конг.

т. 5.

5. Еинюков В.И., Головачева P.C., Логинова Л.Г., Капрельянц A.C., Кайваряйнен Е.И., Сускина В.И., Островский Д.Н, 1974» Исследование структурных изменений мембран термофильных бактерий в зависимости от температуры с помощью методов спинового зонда и светорас-сеивания. Микробиология (в печати).

6. Бинюков В.И., Жукова И.Г., Капрельянц A.C., Кузнецов А.Н., Розанцев Э.Г., Островский Д.Н. 1974. Исследование природы температурных структурных переходов в мембранах бактерий методом парамагнитных зондов. Биохимия (в печати).

Результаты исследований были доложены на Конференции по жидким кристаллам (г. Иваново1, I97I); на 4-ом Международном биофизическом Конгрессе (г. Москва, 1972); на Конференции молодых ученых Инотитута биохимии (1973) и на Школе по молекулярной организации биомембран (Черноголовка 1973).

Отпечатано на "Ротаторе* Тираж 200 эхз. 3. 6488