Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА И НЕКОТОРЫЕ ФУНКЦИИ МЕМБРАН БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА И НЕКОТОРЫЕ ФУНКЦИИ МЕМБРАН БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ"

На правах рукописи АКАДЕМИЯ НАУК СССР Ордена Ленина Институт биохимии им. А, Н. Баха

ОСТРОВСКИЙ Дмитрий Николаевич

СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА И НЕКОТОРЫЕ ФУНКЦИИ МЕМБРАН БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ

(специальность 03,00.04—виологическая химия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 1973

i

л

У

ЖЩЫИЯ НЛУК СССР Ордена Дениаа Институт баохиыдц шд, А. Н.Баха

На правах рукописи

ОСТРОВСКИЙ Дмитрий Николаевич

Строение , свойства я некоторые фуккшзи мембран бактериальной клетки .

(специальность СО,00.И - биологическая хашя)

Автореферат диссертации па соискание ученой степени доктора биологических наук

* Л- • И;' ' - ' 1 к.и.-'КА«

Москва 1973

Работа выполнена в лаборатории эволюционной биохимии и субклеточных структур Ордена Ленина Института биохашн им, А.Н.Баха АН СССР

Научные консультанты : доктор биологических наук ШС.Гельмян академик • А.И.Опарин

Официальные оппоненты :

доктор, биологических наук,профессор Котелышкова Л.В

доктор биологических наук,профессор Коаев С.Б.

доктор биологических наук МолоткоаскиЙ Ю.Г

Работа направлена на официальный отзыв в Институт биохимии а физиологии микроорганизмов All СССР

SanyfTa диссертации состоится "/3" декабря 1973г. на заседания Ученого Совета Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР

Отзывы на автореферат просьба направлять по адресу :Москва II7071,Ленинский проспект 33, Ученому секретарю совета Института бнохиши им. А.Н.Еаха кандидату биологических паук Н.Н.Дъячкову С диссертацией мошю ознакомиться в библиотеке Отделения биологических наук АН СССР .

Автореферат разослан " 3/ " октября 1973г.

ВБЕШИЕ.

КРАТКАЯ X Л РЛ КТЙ РИСТИ К А БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕМБРАН. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

Проаедсее десятилетие в биологии ознаменовалось лавинообразный развитием интереса к биологический иеаОравам.

Некбрани как объект исследования несоинешо иссэт иного общего с другаии субклеточными надиодекулярьиид структурам - рибосоцаии, воиплексани белков с ДНК, гликопротеидаки , однако одно обстоятельство делает ыеибракы особенно привлекательными для биолога - это получившее широкое распространение представление о тон, что геибрана является структурный регулятором иаогих ваянейших биохииических процессов в клетке Такие представления были развит в области биофизика С.В.Ео-новыи, в области физиологии — Шансе и в области микробиологии - Нзнурой и их коллегами.

Бактериальные чейбравы привлекли к себе внимание ливь недавно, хотя ииеино иеибраны бактерий представляют большой интерес, ток как при относительной иорфолотческой простоте они выполняет инозество функции» распределенных в клетках высших организмов ыелду специализированкшш органеллаии.

Бактериальные иенбраны - эхо систеиа иеибран, сосхокаая из цктоплазиатической, охвахиваэдей вса клетку, и внутриклеточных иенбрэи, которые явлгеотся ьыростааа цатоплазиатаче-сной. Внеинай вид внутриклеточных сеыбран в зависимости от вида бактерий и особенностей их культи бн ров ан ия иогет варьировать от небольшого петлеобразного впячивания до слозного ла^еллярвого или ячеистого скопления, получившего название ыеаоэош.

- 4 -

Грамотрицательные бактерии имеют еще одно, особое, образование, часто именуемое внешней мембраной и представляющее собой гликолипопротеиднуа часть клеточной стенки.

Значительный вклад в анализ морфологических особенностей мембранного аппарата у представителей различных систематических групп бактерий внесли советские исследователи А.А.Ава-ина, В.ЬиЬирззова, Л.Н.Кац, В.Ы.Куышарева и другие.

Менбраны составляют от 10 до ЗС$ сухого веса бактериальной клетки.

Основными компонентами бактериальных неморан являются белки и лияпдк, относительное содержание которых колеблется в широких пределах, но в средней белки составляют около 60?Е сухого веса мембраны, липиды - около 30^ и 10/. приходятся на другие компоненты - углеводы, нуклеиновые кислоты, неорганические ионы.

Существенные нарушения структуры мембран наблюдаются при понкаении влажности препарата пике 20-30?», т.е. можно думать, что эти 20-3составляют необходимый минимум связанной в мембране воды, без которой нормальное функционирование мембран невозможно.

Функции мембранного аппарата бактериальной клетки чрезвычайно многообразны. Показано, что на мембране бактерий происходит начало удвоения ДНК, а также точка роста ДНК.

Бактериальные мембраны удерживают на себе значительное число рибосом, что связывают с особенностями функционирования этих рибосом, полагает, что в мембране располонены ферменты синтеза рибосомной РНК. Ротшильд и Роиео и другие авторы выделили из мембран и реконструировали ферментную

систеиу синтеза полисахаридов; в кеибрапах многих бактерий найдена липолитические ферменты и некоторие фсрцеьти участ-вузцие в синтезе липндов

Мембраниий аппарат Аи, v±aelü2.dii значительно увеличивается при переходе клеток на рески фиксации азота, и «одно думать, что мембранные ферменты пряно участвует в этой процессе*

Особый интерес представляют, конечно, сисхеш ферцентов, осуществляющих перенос электронов к кислороду и другил акцептораи, окислительное фосфорпларованме и трансмсибрап-ний перепое ионов и метаболитов. По всей этии вопросам имеется обиирная литература как в отношении бактерий, тай'и в отношении дрозеей, высших растений u eiiboteux (работ A.B. Котельпиковой, И.С.Кулаева, В.П.Скулачева, ü.Г.^о.иоткоеского, А.А.Шахова, H.H.Никольского, В.О.Пантенш, И.А.Владимирова, Ю.А.Овчцшшкова, В ,11 .Лузи^ова и других исследователей). Точная локализация в мембране перечисленных фериентних белков и комплексов пока не известна.

Скуднис сведения о расположении и характере взаимодействия компонентов мембраны и настоятельная потребность в такой информации для поникания механизма рабохи мембранных ферментнах систеи побудили нас предпринять настоящее исследование. Понимание молекулярной организации любой *биоструктуры включает как минтаи три момента: знание относительного расположения компонентов, состоянкл компонентов li характера их взеиколоЯс?гчя при функционировании структуры. ОтсутстЕзе иадекных данных о белках меибранц делает представления о ее молекулярной организации фрагиептарншш,

а усредигаэалЯ характер многих физических иетодоз исследова-вая позволяет говорить ллсь о сухарной состоянии Ее которых классов бсцэстз.

В этой связи задача, которую ш поставила перед с обе Я сводилась к следушпа вопросац.

I.-Что представляет собой белка байтериал v;ux изубран? (количество белков, ах иолзкулярше размеры, химические особенности, пространственная организация,ориентация)

2., Каков характер БзаипсотиоизниЙ компонентов иенбраны? ■ (фрагментации и хшаче екая модификация мембрана, выделение и изучение неубранных фериентнах комплексов, структурные перестройки в неибране, относительное расположение компонентов) .

3. Как образуется мембрана d бактериальной клетке а каким путеу она иогла образоваться на заре становления лизни?

Цельа этих исследований было создание более количественных представлений о строении н свойствах 1:еибраны бактерий, ыоторие иоглд ба в далъиейшеа послулить основой для понимания ыеханизма функциональных явлений в мембране и для понимания регуляторной роли кеыбраны в клетке.

МАТЕРИАЛЫ ii МВТОЛЯ

Основные объектом наших исследований была культура iilcrococcus iysoaoiltticu3 штаии £665 Флеишшга; в спе-

циальных опытах использовали I'arcze Bacillus stearotbexmo-philus 214 (из Института иикроЗиологии АН СССР),

Mycobacterium гubrum (из иосковского Государственного

Университета)»Escherichia оoil р-678 (яэ Института

эпидеизологси и кикробиологнц ии.Гакалея); E.coli Р-678 F А"

E. coli ya-2-I, Е. coll ff -3110 я его вариант 49-1, полученные от японских коллег.

Иегбраиы диделдли в основной пу?еи центрифугирования вдеточшх лизатов, полученные в результате растворения клеточной стенка лсэоцинои в гипотонической среде, с последующей обработкой ДНКазой и РНКазой для удаления пресса нуклеиновых кисло®. Изолирование внутренних и внесших меибран E.coli проводили по кегодиюа Ццдзуишга и Яиеда.

Зкстракцт яипидов из кеибран осуществляли сыесыэ хло-рофориа с иетаиолои (по Солчу). ¿елок определяли по иетоду Лоури и др.

Активность леги^погеназ определяли как скорость восстав новления искусственного акцептора электронов 2,6 дсглорфе-нолиндофенола (ДФИ). Падение оптической плотности при 600 ей на 0,001 за I una при 30°С (регистрируется на спектрофотометре СФ-4А с записывающей приставной) прикипали за показатель I единицы активности (ЕА). Реакционная спесь в конечной объече 5 ш содержала 2 нкиоля палата или 0,5 шшоля НАД-Н; 0,16 кзиоля ДОИ, О,OIL! фосфатный буфер pH 7,4 с О,ООП! *'gS<\ и исследуеиый препарат. Реакции начиналась с добавления субстраха.

Определение скорости поглощения кислорода проводили в терпютетируепой анпероиетрпческой ячейке с зациценныии тверди tin электродами конструкции К. О. кольца и Д.Н.Островского. Реакционная спесь в конечное объеие 2 ил содержала 2-10 икколя субстрата; 0,0Ш фосфатный буфер pH 7,4 с 0,00Ш tigso^ * Исследуеиий иатернал вносили в объеие 0,01-0,1 ил. Обычная температура измерения 30°С.

Пришгппенпое к з не ненке' химического состава иеибран Е. coli для изучения регулятopuofl роли ueuöpag проводили путей 2 часовой инкубации клеток итаит Р-678 Р А- на среде, не содержащей ненасыщенных кирпых кислот, или лухец 2 -асо-воЯ инкубации штаииа vj -3110 в присутствии хлорацфеншкода (0,05 иг/цл). Скорость биосинтеза липидов в ¿-них опытах определяли по вклэченз^э С^- ацетат а; биосинтеза РНК - по вклоче-

q т h

пил H -урзцила; биосинтеза белка - по включения СА-феншт-

ланина (Сокава и др.). Эта работа выполнена нами в Лаборатории проф.Я.Кадкиро в Токийской Университете.

Вклпчвича дройной гзт;-:« для изучения действия антибиотиков спектиноипцина и хлоращЁенмкола на биосинтез неубранных белков проводили путец последовательной добавки к растущей бактериальной культуре С^-лейцина, затеи антибиотика и затеи Н^-лейцппа с последующие ваделениен иеноран, разделение!! белков электрофорезом в полпакрилацидион геле и из^ейенцеи радиоактивности отдельных белков в сцинтилляционноа счетчике.Эта часть работы проведена в Лаборатории проф.С.Ццдзушииа в Нагойскои Университете.

Электрофорез кембраяныу белков в лолиакрилаыиднон геле в аналитической ц препаративном вариантах проводила в системе, содерзадей уксусиуа кислоту и кочевииу (Такалиа и др.) и в систеие, содерассей додецплсульфат натрия и иеркаптита-нол (Иапиро и др.). Белковые полосы на геле проявлялись аыи-дочерзш красителей или кушсси. Гелевые столбики денсито-нетрнровали ка иакрофотоиетра ЦФ-4. В специальных опытах столбики разрезали на дольки и подвергала гидролизу в соляной кислоте с последующий определением аминокислотного

состава гидролизатов в анализаторе Ilitachl КLA -зв или se подвергали гидролизу в пзрзкпси водорода для последующего оппелелештя рплкоакткипоотя Еклаченыых ^ vivo и H3- ашшокислот (счетчик Тг1са1Ъ ). Гэщачиониая инактивация кслбрЕнинх ^сряснтоп. Ист о ч никои излучения служил лкнсйпый ускоритель У-12 с энергией электровоз 3,5 1»эв. Специальный отатив с 15 ячейкам для образцов помещали в сухой дед и устанавливала на расстоянии 35 си от лучевой трубки. Препарат меабран наливали по I ил в стекляниие стаканчики, которое разведали в ячейках шта -тива, Нробы отбирали через каддые 25-30 секунд облучения и измеряли в них активность малатдегидрогеназы и НЛДН2 -дегидрогенази. Для измерения дозы радиации в таких се стаканчиках облучали раствор соли L'ûpa в cepitcíi кислото.Расчет дозы производили по формуле; Д = л Б.23,3 , где Д - доза в килорадзд, Û.E - разность мезду оптическими плотностями облученного u необлученного раствора соли t!opa прп 304 кик.

Ипйракпаснап спектроскопия препаратов бактеряальтпе кембоан. Густую суспензию мембран в воде (около ¿0 иг белка в мл) наносили па пластины из германия (2x30 ни) ели фаворита ми) из расчета 0,1-0,15 иг белка на I си2 площади. Пленки хису^швала на воздухе при коииатиой температуре и хранили в вакууме. Регистрации спектроз проводили на приборе TOI -10 (1ДР) И G -3 (ЯШНШя).

Доперирование производили в герметичной кувсте толщиной I6+I ик односокениша запелнзниеи кавети тяаедой водой.

Запись спектров при изучении скорости дейтерирования проводили в интервале IW0-IS00 сьГ1 против контрольной

- 10 -

кювегы с в (целевая програ^иа скоростз запаси 50 са~*/кин). Использовала т тсе л о ьод о род нуп коду 99чистоты, нейтрализованную по буиазноыу индикатору добавкой докаленного н

Обсчет спектров для определения степени дейтерообиена проводили по нетод шее Блоута и др. но уменьшению поглощения при 1550 сы-1, принииая за 100$ дейтернрование препарата в присутствии додецилсульфата натрия (1^) в случае целых иеи-бран, или лослс часового прогрева пра 60°С в случае работы с. мембранные белкаыа.

Спектры ядерного магнитного резонанса в препаратах иеибраз предварительно лнофплизированных и затеи озвученных в тязелой воде (99,в регистрировали на спектрометре УаПад НА-100 о (рабочая частота спектрометра 100 мггц). Для повысения отношения екгнал/цуц использовался накопитель спектров С-1024. Все спектры Я^Р снижались при температуре образцов ЗА0. Стабилизация резонансных условий осуществлялась по сигналу ¡¡¿О)присутствующе3 в небольшом количестве в тяг.елой Еоде. Для калибровка амплитудных иптеысивностей пиков в спектрах ЯЦР различных образцоз использовался один и тот се впеаний эталонный образец раствора гексаиетилдиси-локсана (ГЩС) в четыреххлористоы углероде в отношении 1:50. Химические сдвиги в спектрах йи? изверглись о? линии Н^О и пересчсхывалпсь на ГЦДС.(Рабсга выполнена совместно с г>отруд-ннкаии Института бсохипаи и физиологии иикроорганизмов и Института химии природных соединений АН СССР),

Кэцссзняя оптической точности суспензии мембран проводила на СФ4 при длине волны 600 ни, в которой вклад, поглоще-

- II -

нов самих мембран минимален. Измерительная кварцевая кювета (шириной I cu) теркостатировалась; температура измерялась непосредсгвеuno в пакете с по^оцьа термопары. Перед измерз-ниец оптической плотности образец виде рди вал с я при данной температуре около 3 шдн,

Включена парамагнитных зог^ов (нитронеильных свободных радикалов) в мембраны бактерий проводили путей длительного (30-W) мин) смешивания суспензии иеибран с эиульсией зоцда в водной буфере (нолученкцй озвучиванием твердого или еидкого зонда в дезинтеграторе us E-2QKC при коынатной тейпе ратуре 10-15 мин). Затем teiiópcau осаждались центрифуги-рованиеи и промывались в 0,0И фосфатной буфере с 0,00Ш Mgso^ для удаления невключенного или слабосвязанного зонда. Регистрация сигнала ЭПР проводилась на радиоспектрометре РЭ-1301 ила Variean Е-3 при помещении образца в виде густой суспензии (20-40 иг белка/мл) в тонкие аипули (объеиои около 10 но). Все спектры представляют собой первую производную интенсивности сигнала. Времена корреляции врадательвой диффузии молекул радикалов рассчитывали по формуле

= 6,65 . Д f.j - 1)ЛО~10сек (Вассериан)

-I

а для случая > Ю-9 се к использовали ссецкальнуо кали-

бровочную кривую. (Работа проведена совместно с сотрудниками Лабораторий Э.г.Розанцева ц Л.Д.Блимен$ельда Института химической физики АН СССР).

Элсктропноштроскопичоское изучение материала проводили в микроскопе jei после обработки препарата фосфор-но-вольфраиовой кислотой (ФВК). Капля препарата с концентра-

цией бзлка Г-10 uv/ал наносилась на парлодиевуга пленку, ' " подсушивалась на фильтровальной бумаге, логруяалась в раствор Ii ФВК (pH 7,0), затеи в дистиллированную воду и снова подсушивалась перед введением в микроскоп.

Определенна размеров частиц комплекса .осуществляли с покоцьв фильтрании через колонку геля сагарозы (Sag -4), любезней предоставленной фирмой Серавак (Англия). Высота колонка 51 сы, диаметр 1,5 см, скорость тока кидкостя через колонку 10 мл/час, элация проводилась фосфатный буфером pH 7,^ (0,01 Ü) на 0,5 U иаС1 .

В работе использованы лизоции, рибонуклеаза, дезокси-рцбонуклоаэа, гемоглобин, каталаза из печени рогатого скота и цитохром с фирмы Неааа1 , бычий сывороточный альбумин фирмы Light ; препарат 50s -рибосом из Е.coli получен от лаборатории хишШ и биохимии нуклеиновых кислот; вирус желтой ыозазкл турнепса получен от В.К.Вишниченко (ИГУ), а вирус табачной гозаикн - от О.0-Капица (Институт генетики).

Для ионообменной хроматографии ферментных комплексов использовали аналитические колонки анионообменников ДЗАЭ-, Зктеола-, и АЭ-целлалози/высота 10-12 см, диаметр I си /, промытых последовательно 0,5 Н наОН , водой, 0,5 Л НС1 и О,Olli фосфатным буферов pH 7,4.

Тонкослойная хроматография липидов на силикагеле (\7а-cog el ) проводилась в системе: тетрагидрофуран-метиладь-нетаяол- ZU ян4 ОН (10:5:5:1 по объему) в течение I часа при температуре 20-25°. Хроматограимы проявлялись выдерживанием в парах пода, регистрация радиоактивности на пластинах проводилась с помодьэ с санирующего газопроточного

- 13 -

счетчика Л10®^ , а количественные изыеренся радиоактивности в "пятнах" проводила после экстракции лапидов холуоль-ныи сцинтилляторои.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСТКНКНИВ

I. Ш1КИ ВАКТВГЙАЛЬШХ ПТГ35РАН

Отсуастви8надеиных методов разделения гидрофобных «выбранных белков заставило нас в целях определения молекулярных размеров белков прибегнуть к нетоду радиационной инактивации, разработанному в лаборатории радиационной бкохкиии А.Г.Пасынскии, Е.В.ьудницкой, U.C.Волковой и их сотрудниками. При выполнении такой работы итатив со инопествои'проба- -рок с образцами посещается на пути быстрых электронов, вылетал щах из ускорителя. Попадание I электрона з иолекулу фер-иента вызывает его инактивации, а так как в большую urine нь ' попасть проще, то инактивация крупных ферментов происходит быстрее.

Результаты серии экспериментов по определений иолевуляр-" ного веса иалатдегидрогеназы приведены на рис.1, где степень инактивации ( in ^ ) представлена как функция дозы радиа-

цци. Из этой кривой рассчитывается величина Д3?, необходимая для вычислении иолекулярного веса по фориуле Хатчиисона и Полларда U.B. = 0,72 . Ю12. Д37-1» где Д3? - доза,'пра которой остается лиыь 37jî активности фермента. Таким спосо-бои было показано, что иолекуляриый вес иалатдегцдрогеназц 73 ООО, а НДДН^ дегидрогеназы - 68 ООО, что соответствует имеющимся данный о растворимых фериеитах.

О / о /

t о Q / О / о / О ° У*

о Осу/ о/ Q / /о) О О о о о о о

о/

ХЯэ ° / о

* $ П rS 13 Доза, Jipad

Рис. ^ Графический расчет величины Л17 при облучен ли деглдрс-енаэы яблочной кислоты ьо фрагментах мембраны Л1. lysodmku-

c»j быстрыми электронами А к Ав— активность -.ггилр-.: на ..ы ,-.о н пссле об." /ч* Ü

Суш-зстсенно ответить, что сап принцип метода позволяет утверждать, что уничтожение любого соседа д?гидрoreнаэы в мембране не имеет фатальных последствий для фермента. Это уае проливает свет ка характер взаимоотношений компонентов и пригодится нам далее при обсуждении природы липопротеидных комплексов.

В середине 60-х годов Такаяиа, а затеи Шапиро с сотрудниками ■разработали методы электрофоретического разделения труднорастворпшзс белкоз в системах, содержащих уксусную кислоту и мочевину ми додецилсульфат натрия и керкаптэта-нол. 1'ы воспользовались этими подходами, чтобы углубиться

в бактериальную ыеибрану дальне. Электрофоре?ическону разделении б полиакрцлашщжш геле были подвергнут меибраниые белки из бактерий трех основных типов: il.lysodeikticus , E.coli , В.stearothermophllus . Во всех трех случаях мембранный белок разделялся при электрофорезе на 20-25 компонентов.

В качестве иллюстрации ш приводил фото и девентограмму мембранных белков 11* lysodeikticus , окраиенных аыи-дочерным красителей*

• Рис. 2 Фото- а девситограша цембранппх белков М. lysodeikticus после электрофорети— ческого разделения в полиeicpyда^зднои геле в системе Такаяиа к др.

- 16 -

Таким образои модно думать, что мембранные белки ком- ч гшектуатся из полипептадных цепей минимум 25 типов. Хотя по интенсивности окраски полос на геле моыно судить об относительной содержании каздого белка, однако это довольно неточный метод и в специальна! опытах щ пометили мембранные белки прижизненно С» и в количественно померлв содеряание каздого белкового компонента по включенной радиоактивности. Эти данные приведены в таблице I, из которой видно, что отдельные белки составляют дшь 4-10;; от всего мембранного белка и таким обраэоа распространенные представления о ыеи-бране как о матрице из однотипного структурного белка, на которой монтируются ферменты, следует считать непригодными по крайней ыере к исследуемым объектам, в которых количественно преобладающего белкового компонента нет. (Следует отме тать, что проба №-I соответствует группе полос'Г-Г3 на рис.2 проба 2-6 ;7-а; проба 4 - также группа полос).

Таблица I

Распределение радиоактивности во фракциях Ослка мсгорай 1у$о<1е{касц5> при гель-электрофорезе

11[юСы ("4<хг, а.нп/мцн I■ 111 [ о ; 7 ь Сч£г с У'10 т о 4 ' т" (кисти. ИОьТЬ,

1 юзоо 0,35 28 С(К1 29,0

2 870 8 2110 8.К

2220 <1,30 5 170

4 0,37 1.4 ООО 13

5 2/115 0,33 7 300 7,4

<; 1 720 0.33 5 220 ■ '. '»

7 18&0 0.33 •г) 7(4) Г|,0

8 1730 0,33 5 320 ^ 5,4

0 14й0 0,34 4 270 4,1

11 510 0.30 1 700 4,3

Прочие 2СОО 0,2'. 11) ШО 9,9

Сумма — — 66 230 100

- 17 -

Электрофорез в поли акридамидной геле, кро«о качественного разнообразия и количественных соотковеннй позволяет определить молекулярные веса разделяемых компонентов путей сравнения подвианости полос в гелях различной пористости. На рис.3 представлены результаты некоторых экспериментов, где сравнивались подвижности неубранных белков II. -deikticus . Талии путей было установлено, что мембранные белки (полипептиды) составляют ряд с молекулярными весами от 10 ООО до 160 ООО.

I,íi¡

о т I. i

te tfS

SJ №

ПО №0

Рнс^ ОИ^ДСЛ^ИИС MawKjvMpiJoro ^сса мембранных белко» rto данным » иолиак-

риламидноя »еле VI»—отношение ялиц t^oítfr* л G н 9V«wx М, ш — молекулярный пес; ц — ццтоярс* <■ е. ЮЗник Г— ТрННСЯИ Ы. S3 60№|* вЛ—СЫЮ1>1>ТСЧ1ГиП <>елк* <М. ф, &7«Ю); ta — у-глсОуАин чглоэека —

VttGuQh е. 6t 6tt ó* * — м^эшчвмии л^ммжчч

ПОЛОС Я* «И-

Ухе из этих немногих цифр ясно, что мембрана очень гетерогекна и, по-видимому, "непрозрачна", как говорят, для наиболее информативного из физических методов исследо-

- 18 -

вания белка - рентгеноструктурного анализа. Особые надежды возлагалась э этой сьяза на инфракрасную спектроскопии и 4 комбинационное рассеивание света.

Из пасты iieüflpaa 3 типов бактерий ш изготовили сухие пленки и получили спектры в диапазоне волновых чисел от 700 до 4 ООО eiГ1.

На рис Л приведен спектр для мембран М.lysodeiktlcus где 2 основных пика в середине - это полосы поглощения Амид-I и Ашд-П, вызванные колебаниями главным образом С = О и Я _ н групп в пептидной связи. На рис.5 показаны ИК-спектры внешних и внутренних мембран E.coli .

Ьидно, что полоса Амид-1 - это симметричный пик с максимумом при 1660 си-1. В целом спектры для мембран изо всех трех видов бактерий близки и, обобщая, можно по форме спектра и положение максимума заключить, что преобладающим типом вторичной структуры мембранных белков бактерий является

«С -спираль и (или) неупорядоченный клубок. Исключение составляет только препарат внешних мембран E.coli для которых полоса Ашзд-1 сдвинута в сторону больших длин волн, а это мо&С/Т быть обусловлено либо наличием в составе внешних мембран азотистых полисахаридов, либо - значительным вкладом -Форш .

Одновременно с нами попытку исследовать состояние мембранного белка LI. Iysodeiktiou3 предприняли американские и канадские биохимики, которые пришли к аналогичным выводам. Грин и Солтон полагают, что "плечо" при 1630 пц-^ достаточно вырагево, чтобы считать присутствие некоторого количества Jb -форма доказанный, однако Груда и Кинг отмечают, что

г 19 -

} I

1400 1600 1800 см-1

Рис.4 ИК - спектр мембран М. 1узо<1е1кМсиа 1зи / сухая плёнка / .

Рис.5 ИК - спектры внешней /а/ и внутренней /б/ ыеыбран Е.со11 уа2-1 /сухая пленка/ .

- 20 -

такое "плечо" мозет быть обусловлено примесью иукояептида из клеточной стеная. Обнаруживая иногда признаки J3 -формы на ЙК-спектрах сухих пленок мембран, мы относили их за счет несколько бсдьссй денатурации препарата, однако ш не проверяли наличие иукопептида в препарате мембран.

Гидратация сухой пленки из мембран привода к восстановление работы цепи дыхательных ферментов, хотя отдельные ферменты восстанавливают активность неполностью, т.е. можно думать, что существенной денатурации мембран при высушивании, не происходит. Чтобы рассеять опасения на этот счет мы прибегли к iÜC-спектроскопии в тяжелой воде, прошв препарат мембран 3 раза D

Спектр суспензии меыбран в д 2° представлен на рис.6 (это были внутренние мембраны E.coli ) и из него видно,что общий вывод о лорнирующей роли с/, -спирали и клубка во вторичной структуре мембранных белков сохраняет силу. Совершенно очевидно, однако, что любой ИК-спектр меибран отражает сумму состояний мноаества белков, и индивидуальные особенности каждого белка остается за пределами возыозностей метода.

В принципе ценную информацию о вторичной сгруктурз белков uosho получить, исходя из знания последовательности ами-вокислог в них и дазе нэ знания просто аминокислотного состава. В этой связи мы прибегли к препаративному разделении ыембранншс белков электрофорезом в полиакриламидном геле с последующий прокраииваниеи, извлечением и гидролизом белков, Сиесь аминокислот проходила некоторую очистку, а затем разде-дялась на ионообменных колонках в аминокисл'ом анализаторе.

Pito, б "К - спектр бнутреня:ix /цнтопяагигатичоск;:^/ мембран К.coli уа-2-1 в тяяелой во,".с .

Результаты такого анализа, который охватывает около 60£ от всех белков меибрЕды приведены в таблцце 2. Расчеты показывают, что коэффициент полярности, т.е. отношение гидрофильных аминокислот к гидрофобный в классификации Хзтча и Бруса варьирует? в еироких пределах: от 0,8 до 2,7. Напомкии, что ¿ обсчет по этоцу методу многих обычных растворимых белков

дает цифру 2,1. Сравнение степени гидрофобности с молекулярными размерами белков по Фишеру показало, что болызинство

*

ыекбраишх белков укладывается в закономерность, выведенную для белков сферической формы. Такиа образом, довольно неожиданно оказалось, что в целом белки мембран U. iyaodeiktlous

Таблица 2,Аминокислотный состав отдельных белков цсмбраа М. ¿^^¡¡¡кЬсих

Белок Ашю-¡сислота , коляранй процент ♦ * I ; 4 * * 6 : а • о : • * Ю : 13 : 0 : 2 : 4 : » 7 : 12 Протео-лилид

Лизап 3,16 4,42 3,28 5,43 . 5,26 4,73 3,44 5,48 10,1 5,47 0,89

Гдети дин 1,70 1,55 2,17 2,05 1,16 2,44 0,С2 1,3 5,58 4,37 1,64

Аргинаи 6,04 3,89 5,00 3,91 2,79 7,12 4,68 И,1 6,91 7,10 2,43

АсаарагдноЕаа е. 8,44 9,0В 8,97 6,53 6,49 8,57 3,88 6,97 9,05 8,64 4,96

Треонин 3,36 4,71 5,26 3,20 4,39 5,52 6,44 5,51 4,95 5,15 6,77

Серян 5,51 4,50 7,77 6,42 5,34 6,28 5,48 6,23 11,6 6,24 6,33 I

Глютамановая к. 11,83 11,39 10,47 9,19 9,37 9,90 2,22 4,05 3,17 И,4 6,28 8

Пролсн 6,14 7,36 5,30 11,69 5,18 3,42 9,27 6,67 ■ _ 2,52 12,49 (

Глицин 13,00 11,70 10,47 12,73 14,39 10,90 10,30 15,60 16,90 12,00 8,85

Аланан 10,15 9,10 10,26 10,43 11,79 11,60 8,58 10,30 13,30 11,45 8,31

Цкстии 1/2 8,40 - - 7,16 10,29 - 10,30 10,30 - - -

Валив 6,32 7,57 5,43 5,18 5,22 8,23 13,60 10,95 7,18 7,03 7,И

Метионии 0,44 следы следи следи 1,81 - 0,43 0,61 - - - 6,15

Изолейдан 3,40 4,07 2,79 2,39 3,36 4,85 7,46 5,43 4,60 4,55 7,94

Лейцин 5,90 7,06 7,03 6,09 6,89 9,73 9,10 7,75 8,10 9,09 6,57

Тврозаи 2,59 2,78 2,03 1,02 2,96 0,74 0,86 1,03 - 0,82 6,27

Фенилалаиш 2,65 2,91 4,08 5,50 3,18 4,35 2,94 2,14 следы 2,70 6,63

Полярность /П/ 2,14 1.75 2,11 1,82 1,70 1,68 0,81 1,52 2,69 2,16 0,87

Ьуиерадия белков приедена по работе Софроновой и др.

- 23 -

предраспадокепи к тоиу, чтобы в условиях водного окружения принимать глобулярную конфигурации и только один из и юс имеет тенденции к вытягиванию молекулы и один явно долееп иметь больше гидрофобные участка на поверхности и в силу этого давать агрегаты. Однако известно, что все мембранные белки ведут себя как очень гидрофобные соединения,склонные к агрегации а к взаимодействия с липидама и несклонное к растворении в воде. Поэтому ми предполагаем, что на поверхности остальных мембранных белков такзе имеются кеполярные участки или один большой неполярный участок, которые возникают в силу особой упаковки цепи под влиянием липида в мембране либо в силу концентрации гидрофобных аминокислот в отдельных местах полииептцдкой цепи.

Такая точка зрения недавно получила добавочную базу в опытах Грина и Солтона, где наличие гидрофобных участков на поверхности мембранных белков Ы. 1узойе1]^1сиз было предположено на основании уыирения сигнала (уменьшения времени поперечной релаксации Т-,) от протонов водорастворимого ЯИР-зонда. Подобное уширен ие сигнала ЯЫР, как показали модельные опыты, происходит при попадании метальных групп зонда в неполярные области белков.

Содержание аминокислот препятствующих образованию -спирали, в мембранных белках Н. 1уеойе1Ь^1сиз таково, что степень спиральности белков в средней иохет составлять 40^5 (от 5 до 80 ) при условии, конечно, что закономерности, подмеченные Дэвисом для обичных белков прило-нииы к белкам мембранный.

- 24 -

г, нлч рлзитаны лкгшдмй и белковый компошнт в

ЫЕМБРАНВ ?

Еез всякого эксперимента ясно, что белковые компоненты * должны иметь контакт с водным окружением, так как иембря*и катализируют множество реакций с водорастворимыми субстратами, Вторым аргументом в пользу выхода кембра?;;:лх белков на поверхность является высокая скорость изотопного обмена Н на О в пептидной группе при помещении сухого препарата мембран в тяжелую воду. Расчеты Н-О обмена проводятся на основан! и ИК-спектров до убыли полосы Амид-п (рис.6).

На рис.7 показана кинетика Н~ О обмена для исходных и обезжиренных мембран, из которой видно, что Н-0 обмен для обеесирелних мембран идет быстрее и, следовательно, лиицд к«кис-то образом экранирует или стабилизирует мембранные белка. Добавочную информации о взаимном расположении белка и липида дает воздействие протео- и липолитических ферментсв, которые, будучи высокомолекулярными гидрофильными соединениями, надо думать, действуют только о поверхности мембрана. Оказалось, что протеолиз мембран идет очень медленно в сравнении с протеолизом казеина. За 10 мин протео-лиэа дыхательная цепь фериептов остается полностью работоспособной, хотя белковые факторы сопряжения окисления с фос-форилированием при этом погибают. Интересно отметить, что разрукение факторов фо сформирования происходит только в тех случаях, когда протеиназа действует ва внутренняя сторону мембраны.

Рип. 1 1\Н111'Т1!К;\ обмена II в препаратах питает

ПЫХ ((II II <>бгЯ(К1ф01ШЫХ МСмПрП!! М. 1ут»||'11;|1П1* (Л). / —11{)«Г[КЧ( При СГ/ ц ( ч,»м

Вскоре после этого И.А.Лукоянова в нашей лаборатории совместно с В.И.Биразовой полазала, что протеолиз вызывает разрушение грибовидных субъединиц на неибрзне и таким образом эта серия исследований лаборатории была в числе первых, показавших белковую природу субъединиц и причастность их к I механизму сопрявения (до этого в митохондриологи« господство-

вала схеиа Грина, согласно которой грибовидные выросты рассматривались как ансамбль лппопротеидных комплексов - переносчиков электронов в дыхательной цепи),

Л»политические ферменты липаза и фосфолнпаза А оказывают глубокое деструктурируащее действие на бактериальную мембрану, разрушая асе липэды, какие только могут, и вызывая

значательнуо инактивацш дыхательных ферментов. Таким образом липиды тоге доступны действия извне и, рисуя гипотетиче- '' скую схему строения мембрана (ркс.8), мы доланы учитывать одновременный выход и.белков и липидов в водное кружение и некоторую защищенность белков со стороны лвдмдов.

показывает, что изолированный липид дает полосу поглощения при 720 см-1, котору» хииаки приписывает маятниковые колебаниям протонов в дирнокислотной цепи при трансположении углеродных атомов (рис.8). В нормальных мембранах такой полосы нет, а в мембранах из клеток выращенных в присутствии лево-иицетин/^гдеМнз-з2ад2спропорционирования синтеза липида образуется несколько больше, эта полоса вновь появляется,

¿'о —

■/со

700 800 с*С*

Ряс.В ИК - спектры а схематическое изображение иешбрац аз нормальных: /I/ и инкубированных с хлорамрешкодом клеток М. о^-ооае -исъз сиз /3/ И препарата лихадов^су -хае плешш /.

Рассмотрение спектров ИКС в области 700-800 си"

- 27 -

т.е. пик поглощения при 720 cu-1 является показателей наличия чисто липвдыих зон, и шлио заключить, что в нормальних условиях таких зон почти кет, хотя они могут появляться, по крайней мерс, в патологических случаях.

3. ХАРАКТЕР ВЗЛИГОЛЕЙСТВИЯ КОМПОНЕНТОВ МЕМБРАНЫ.

СТРУКТУРНЫЙ ПЕРЕХОД.

тагердщ н КООРДИНАЦИЯ БИОСИНТЕЗОВ.

Белковые компоненты мембраны, выполняя свои каталитические функции, несомненно, претерпевают определенные превращения, отразсениеи которых является в некоторой степени изотопный H^D обмен. Несомненно такзе, что изменение одного компонента в такой конденсированной системе как мембраны должно в какой-то мере сказаться на структуре соседних компонентов. Как yz:e отмечалось, в начале 60-х годов C.B. Конев, а также Ноиура и Шапке с соавторами развили представление о той, что внутримембранные взаимодействия могут приводить к кооперативам« структурный переходаи, захватывающий значительные части, если не всю мэибрану. УспешшЙ синтез стабильных свободных радикалов, разнообразных по структуре молекул , позволил значительно расширить экспериментальные возможности обнарунешщ и изучения постулированных конфор-мационнга переходов.

К своей работе, проведенной совместно с сотрудниками Института химической физики АН СССР, мы такке прибегли к помощи свободных радикалов, комбинируя этот метод (спин-зондирование) с методами светорассеиЕания, йК-ссектроскопии и определениями ферментных активностей. Регистрация оптической плотности суспензии иембран в воде как функции от

ДО 40 PÛ t С

reo9 Äib-саи-эстъ с?T:XT-.?atj?I оггт-е:^:^ nwwcn IGH5?*H if.LYjrcpEiKTpCiJs tc7C7FR?,iiP;'BAi"£i; t 1-й ¿SJCBfSÜ9*¡í:0¿ HUR,

s - г o,oi к «cíátsiph ty^re ря с otooi * *

S

60 te

ratjO sa М^зиость от »птячэскол

ОгФТНССта JEME РА M а.$ТЕЮТтаВ№1РНМ5,

i - г хсю^эогАКноа aoíE , Б - в CtOl ir 0СС31ГНН1 pH

С OjOOi и líjSO^ -

- 29 -

температуры (рис.9 и Ю) показывает, что СЕвторассеивание суспензий уменьшается по мере нагревания до 20° в случае' мембран п.1узойе!к1;1сиз и до 40° в случае мембран В* stearotb.ermooiiil.us , затеи наступает период неиз-

менного или слегка возрастающего светорассеивания, а ври температурах выие АО0 для меабран м.1гсо<1е:и£М.сиз или выше 60-65° для мембран В. stearothermйphilus происходит резкое и прогрессирующее возрастание мутности суспензий. В этом случае, как ив случае изменения параметров сгши-зонда 2,2,б,6-тетраиетил-4~пальмет1ш>1шаиздопнперздск-1-опсила (рис.11) точки перегиба кривой светорассеивания для В. stea -г о 'ЬЬ егл орЫ1и з совпадая! с ник ним и верхним температурными пределам роста. Возможно, что точки 20° и 40° такие ограничивает температурный интервал роста мезофильного у-2узойе±кисиз , хотя специально это пред полезен ие мы

не проверяли.Г

во во то ео во «о зо "с

1/Т

I

' ие.ИэАнааость врмек« керриица

; вр,шташ1зд дагнзл /&/ зощц,

»мгчииого я елггиио

! ШК5Р1Я В.ЕЛМОРНМ'М 5

¿гт Т^МИХРАТТ^ *

- 30 -

Каковы кэ причины столь своеобразного изменения свето-* рассеивания мембранных суспензий ? Что происходит в мембране? Для удобства рассупдавай щ рассмотрнц только препарат из В. зйеагй^егторЬИиБ , полагая, что аналогичные явления происходят такяе и в препарате мембран и.1узойе!^1сиз Ыозно думать, что при 15°С препарат мембран состоит из отдельных неубранных пузырьков и их агрегатов.

По мере нагревания начинается дезагрегация сгустков мембранных частиц, так как силы сцепления мехду отдельными частицаия оказывается недостаточными, чтобы противостоять их более интенсивному тепловому двинению. Нри 40°С процесс дезагрегации прекращается, по-видимому, вследствие специфического, индуцированного липидоа, структурного перехода в мембране, изменяющего поверхностные свойства мембран.Цожно предложить следующее объяснение зтоау явлении. Согласно работе Загельмана при температурах, выше температуры плавления липида, плоцадь, занимаемая одной молекулой линада, возрастает. В мембране это полег сопровождаться усилением липид-белковых взаимодействий вследствие взаимопроникновения компонентов мембраны. Кроме того, возрастание интенсивности движения молекул липида может привести к увеличении суммарной гидрофобной плоцади зпешкеИ поверхности мембранных частиц, чю вызовет усиление гидрофобных взаимодействий меяду ними. С этого момента силы сцепления мецду нейбраваии начинают преобладать над силами, стремяцимиса дезагрегировать сгустки мембран в результате теплового броуновского двнленмя. Этот процесс находит свое отражение на участке слабого возрастания иутности суспензии мембран.

- 31 -

Дальнейшее нагревание (выше 65°С), ло-виднноиу,вызывает денатурацию белкового компонента мембран, которая оопро-Еовдается интенсивной агрегацией ^змОранных частиц и возрасга-ниец иутнссти сусиеизии, ■

Присутствие в суспензии слабого нейтрального буфера существенно меняет характер кривой мутности. Светорасссивавао уменьшается вплоть до температуры 65°. Означает ли это, что характер влутрсмсмбранних превращений такие существенно изменился ? полагаем, что состояние и взаиморасположение компонентов мембраны претерпевают одинаковое изменения в буферных и деионизованных суспензиях мембран, однако в присутствия буфера над силами взаимодействия начинает доминировать отталкивание ионизованных электроотрицательных групп, и это маскирует внутримеыбранпые превращения. Если мембраны Ц. iysode-ikticus нагревать на 10 шн до какой-то температуры, а затеи возвращать к комнатной температуре, то активность ферментов изменяется такай образом, чю окисление яблочной кислоты остается почти на предаем уровне, а окисление НАДП^ резко падает прл предварительной прогреве до 45°(рис.12). ilosno било подозревать избирательную инактивацию де гид pareil азы однако инактивация фермента не происходит, а просто дегидрогапаза выбрасывается в раствор в составо довольно кр/пних липопротеидных фрагментов. Положение перегиба ца этой кривой зависит от концентрации ионов магния, от качества ДНКаэы, однако ясно одно, что могут бить условия при которых мембрану •• in vitro покидают отдельные функциональные участка.

Теперь обратимся к результатам спин-зондирования мембраны. Из рис.13, где о представлен как функция I/T,

- 32 -

5ИДЙ0, что локализованный в липидах мембран зонд улаьлпвгет несколько структурам* превргщений в мембране, часть котэрмх воспроизводится на эмульсии изолированного лигшда, а часть проявляется только при сохранении натив-вости неубранного белка. Активность отдельных «выбранных фериеитов, например, иал ат де гадроге в аз и, изменяется с температурой таки» образон, что на область переходов попадает область максимального возрастания активности фермента.

йтш;, бактериальные мембраны склонны испытывать значительные структурные перестройки, возникающие, очевидно в Давидах, зависящие от состояния белка и могущие приводить к измененпо активности некоторых ферментных систем,Насколько сущеотвенни структурные изменения в мембране длн низнедея-тельиости бактериальной клетки в целой ? Вполне вероятно, что в ЗД.ВОЫ организме подобные переходы индуцируются не столько температурой, сколько воздействиями биохимических медиаторов, и зависят, очевидно, от редокс-потенциала среды* ионной скдц цитоплазмы ц т.п. Реальность таких механизмов хорого илластрируется наблюдениями Хаузера и др. влияния пептидного антибиотика аламетицина на подвижность метильных групп фосфолияидов в мицеллах при соотношении молекул антибиотика и липида 1:100 - 1:600, что свидетельствует о передаче эффекта ториоленид на значительные расстояния.Зовенберг показал значительные изменения в структуре мембранных белков при действии ничтодных количеств инсулина.

Еще в 30-х годах А.И.Опарин и А.Л.Курсанг.-- с сотрудниками развили представление об обратимой сорбции-десорбции ферпеатов на поверхностях клеточных структур как механизме

. 12

гшсакость т^нл к^ор^и. п?Я згач'шда назоХЕса ХЕНОШ / А / ш шд-а / ■ / *-Xa?iuja M.iYSoCïitmtuS ст твзгипт* и^сдштгЕ/^хйго ПРО-

ГГШ. UITQÏ «?■ ИДВШИ*

юзвд ж жаилва р'«« ХРОМ -

BP» .

ÎSic.13 Изменение пара -метров сгшн-зоида в эглульсии лдпвдоз /а/, i иатИБивд: мембранаа/б/ ? И денатурированных 1 теплом мембранах М* lys od elkti сиз /в/. ■ как функции от температуры .

а.„- констдата

л и

изотропной сверхтон- i кой структуры .

; Л

ТЮК

Т 1D*K

Т 10 к

- 34 -

регуляции обмена веществ клетки. Наши опыты, проведенные с чистили мембранами, яеляются добавочной иллюстрацией к возможности работа какого механизма, однако ш думаем,что in vivo структурная перестройка мембраны может не приютить к столь серьезным последствиям как выброс фрагментов,а лишь вызывает специфическое изменение сил связи MeivV компонентами, изменение подвижности отдельных белков или появление чисто лапидных участков, осуществляющих обратимую сорбции компонентов цитоплазш. К большей осторокности при трактов- ' ка значимости структурных переходов нас склоняют и наблюдения над менбранама клеток, выращенных в присутствии левоыи-

/: : л о ран о сн и кол а / ^ цетина, где "ои прение1' мембраны не нарушает paoоты дыхательной ценя i"1 vivo и приводит к выбросу ферментных блокои дегидрогеназ лиеь при попытке выделить чистые мембраны. .

Пр.1 лабой оценке полученных данных, однако," остается несомненным, что мембрана бактерий испытывает структурные перестройки) оказывающие воздействие на работу мембранных систем. В принципа структурные перестройки мембраны,улавливаемые парамагнитным зондои или оптическими методами,могут не вызывать больших энергетических затрат и могут не совпадать в некоторых точках с фазовыми переходами, регистрируемыми калориметрически, однако в случае мембран бактерий наблюдается довольно хорошее соответствие данных от разных методов. Так анализ термограммы препарата мембран М. íyso -dsücticu3 (Ara и ДР*) показывает, что и при 18-20° и в диапазоне теызератур от 35 до 70° происходят заметные эндотермические перестройки, что согласуется с нашими данными. Ш полагаем, что переходы при крайних значениях температур

- 35 -

могут означать не столько факт прекращения анзнедептель-ности, сколько переключение на новый реаам обмена веществ, призванный вывести организм из чрезвычайно опасной ситуации. В этой связи дальнейшее развитие приведенных исследований мы представляем как изучение триггерноЗ функции обнаруженных переходов.

Совместно с Шакуловиа и Соковой ш предприняли попытку выяснить, насколько существенно состояние мембранного липида для.проявления жесткой связи между скоростями биосинтезов белка, РНК и лишдоы, которая проявляется в том, что биосинтез РНК и липидов нарушается если синтез белка остановлен из-за нехватки аминокислот. Нормальная мембрана В. coli модифицировалась in vivo проведением опита па холоду (20° ) или предварительной инкубацией с хлорамфениколом, когда накапливается избыток липида, или инкубацией мутанткого штамма в отсутствие ненасыщенной кирной кислоти, когда в липидах образуются только насыщенные кирныа кислоты. Схема опыта приведена на рис.14. За синтезом РНК следили по включения lí^-урацила, липида - по включению С ^-ацетата, белка -по включению фенилаланина.

Предпосылкой для таких экспериментов послужило предположение о том, что связь биосинтетических механизмов может осуществляться через мембрану, поскольку многие рибосомы адсорбированы на мембране, а аппараты биосинтезов липидов и РНК тоне находятся на или в мембране.

Опыты показали, что аесткая зависимость синтеза РНК ох биосинтеза белка сохраняется в клетках всех грех типовСрис. 13,16), т.е. если регулирующий сигнал действительно пере-

ОДМСРЛЦ? шОи^О

ИпОн 1О «шшООаО

Е:1с.14 Схогла приязненной модификации кецбргц В.соН ну;? ем вырадиваиля на среде несодоряащей ненаселенной слрпой кислоты /НЭГ/.на среде с хло-рамфешпсолоп /Хло+/ или инкубацией б стандартной среде прл20° .Овальные фигуры - белок,пря-ык<» а цэвитые ЛЕШЩ - липлд.

пяд5 е'лкее нэ-ура!л-.а а кдгпк е.с01х

?-бтз посте роста на наглей / к /

И Н^.Г СРЕДЕ / ОН / ,

+ ЛК - пнкубадця клеток б полноценной среде, - АК - шшубацня клеток на среде.липенной отдельч-х аминокислот,+ ХЛ - среда яикубавдш содержит хлор -аыфенакол .

- 37 -

дается через мембрану, то он идет по линии белок-бел е:о во го взаимодействия. То не самое относится к связи синтеза липнда и синтеза белка, однако с тем отличаем, что в этом случае чувствительной к состояние мембранного линида оказывается система релаксации, т.е. разрыва сесткой связи, которая происходит при введении хлорасфенкяола (рис.16).

Такай образом, проведенные эксперименты прямо укаэшшот на то, что состояние липидеых компонентов мембраны существенно для регуляции биосинтеза липидов и косвенно указывает на Боэмогнуя зависимость иеханнзна координации синтеза биополимеров от белок-белковых вэаиыодейатвий в мембране.

При изучении контроля над биосинтезом липидов со- стороны аппарата биосинтеза белка при разных температурах было показано, что при 40° дефицит аминокислот в среде инкубации приводит к специфическому угнетению биосинтеза фосфатидкл- -этаноламина (ФЭ) в то время как синтез фосфатидилглицерина (ФГ) и кардиолипина (КЛ) угнетается далеко не тан сильно. Сокава, обнаруживший аналогичЕгсе явление ранее, полагает,что в нем проявляется существо контроля со стороны аппарата биосинтеза белка над другими биосинтезами - избирательно угнетается образование структурообразующего компонента (рибосо-ыальная РНК.ФЭ) при сохранении синтеза метаболически актив-нош компонента (и РНК, КЛ и ФГ). Интересно отметить, что абсолютный уровень биосинтеза липидов в -ак - среде при 20° не только не ниде, но выше такового для температуры У>°, причем при 20° преимущественное влияние на биосинтез отдельных липидов уже почти отсутствует.

Такиц образом, можно заключить, что активность мембранных ферментов в клетке является функцией состояния нескольких

- 38 -

контролирующих механизмов, регуляторные воздействия от которых иногда аддитивны, но иногда взаимно исключает друг друга. Наиболее легко уклоняется от контроля со стороны регулирующих механизмов, по-видимому, система биосинтеза липи-дов, что согласуется с данными Троппа и др. о чувствительности процесса регуляции к концентрации кислорода в культу-ральной жидкости.

В этой связи уместно обратиться к природе внутри мембранных сил связи. Работами Н.С.Гельман и других сотрудников лаборатории показано, что при действии хелаторов типа ЭДТУ, некоторых детергентов и ультразвука бактериальная мембрана фрагаентнруется, причем самые мелкие фрагменты по соотношения белка и липида остаются почти идентичными исходной мембране. По аналогии с работами Грина, показавшего что дыха- , тельная цепь ферментов в митохондриях представлена ансамблями из А комплексов фиксированного состава, модно было думать, что фрагменты бактериальных мембран тоже представляют собой естественные стабильные комплексы. Цы предприняли попытку выделить эти комплексы, охарактеризовать их и через их строение понять как устроена сама мембрана. В качестве приз-нака^по которому велась очистка, использовали активность ыалат- и И АД Н2-де гвдроханаз.

Применив, вначале, в качестве экстрагирующего агента ЭДТУ и включив в систему очистки фильтрации через гель,центрифугирование в градиенте 'сахарозы, мы получили препарат, которой был однороден по данным электрофореза с подвижной границей (сводка свойств), почта однороден по данным аналитического центрифугирования, довольно гетерогенен по данным гельфильтрации и очень неоднороден по данным электрофореза

ВС. 16

/

/ / +■

/ /

/

/

/

1 , /

1 , - ак /

i г?"1;""

+ Xjl - ЕЖ

/У/

/ А/

10 30 10 30 мяк склепам; Нэ-УРШЛЛ /У/ И С14-

JKÏÏTjHA /У в КЕПКИ 8.00II - ' ЗХЮ £0 /ХШХ1 ЧАСТЬ ТЧЮТКЛ / Й ПОГЖ ПТ'дЦгЯПСУЕЛЦЗ^ С ir.CPÎÎfcEH!?-

KOBOïI /ПРЯШ ТЛГЕЬ ГИСЛКУ .

. 10 30 50 jxj расстояние от

старта

Рио.17 Действие спектиноиищша па биосинтез белков оболочек сфепопластов E.coII.Отношение радиоактивности II3 к С14 в белках,разделенных электрофорезом в иолиакрилаиидном геле в контрольной /К/ и опитной варианте /Оп/,С^% - уровень активности в контроле.

в доде цк л с уль фат е, обнарузившесочти столько не полос, что и в исходной мембране. Так^и образом препарат, по-видимому, предстаьтяет спесь мелких разнокачественных фрагментов мембрану, сбладавщих близкими физико-химическими свойствами.

Обработка иеубран М. 1узоае3.1:11сиз Твиног^-80 с последующей аналогичной очисткой позволяет выделять частицы о

с - = 80 Л и со значительно больший содержакиеи маркер-

ных ферментов (в 12-15 раз по отношения к исходной мембране). В специальном опыте, где исследовалась адсорбция радиоактивного субстрата на мембране, мы определили что I единица активности соответствует 0,34.Ю-^ ^л моль фериента. Исполь -зуя это отношение и принимая за средний молекулярный вес 70 ООО, мы рассчитали, что сферическая частица комплекса долги а содержать всего около 14 молекул, из которых 4-фе-:~ ментные и 10 - посторонние. Однако эти цифры рассчитаны на

средние значения размеров частиц в то время кач истинные

„ о

размеры колеблются в пределах 15-1сод, причем маркерные ферменты обнаруживаются как в оаиых мелких так и в самых крупных часшцах. Гетерогенность препаратов заставляет нас думать, чю окружение каждого данного белка в мембране тоае гетерогенно, точнее непостоянно во времени и что дыхательные ферменть образуют з мембране-фигуру наподобие звезды, в центра которой располагается цитохромы, а по периферии дегк-дрогенаэы, склонные давать комплексы как друг с другом (поэтому-то в одной частице 4 молекулы фермента) так и с различными другими кошюяентаин и склонные более легко покидать мембрану.

4. КДКИН ОБРАЗОМ СОБИРАЕТСЯ МЕМБРАНА ?

МЕМБРАНЫ И ЭВОЛЮЦИЯ.

Известно, что биосинтез липидов в основной протекает в самой se бактериальной мембране и такии образон проблема биосборки сводится к вопросу о той, как встраивается в мембрану белковый компонент. Высказывалось предположение, что мембранвце белки такяе синтезируются на мембранах (в прикрепленных к мембране рибосомах) и было показано, по активности некоторых ферментов, что антибиотики хлорамфеникол и спекти-ноаицин угнетают синтез цитоплазмагических белков и не так сильно влияют на синтез мембранных. tii прибегли к двойной радиоактивной метке мембран u.iysodeiktlcus ц е.coll *

для того, чтобы выяснить, в чем здесь дело. Двойная метка это поочередное включение сначала С^-лейцина в белки, а . затеи (после введения антибиотика) включение H - лейцина. Соотношения радиоактивиостей опытного и контрольного образца является самым чувствительным индикатором нарушений биосинтеза (рис.1?). В случае £]. lysodeikticus действовали хлорамфениколou и использовали фракции мембранных и цито -плазматических белков валово, а в случае Е.соц_ мег-бранные белки подвергались электрофорезу в поли ait риламид мои геле, гзлевые столбики розали на 100 долей и каидуо дольку просчитывала в отдельности. Таким способом было показано, что степень подавления биосинтеза мембранных и цитоплазматических белков этими антибиотиками во взятых концентрациях одинакова, синтез мембранных белков, следовательно, осуаест-вляется также,-как и синтез других белков.

Ка;с ге встраивается белки в ыеыбрану ? С помоцьэ ИКС

4 ч

и ЯЫ?-спект роскоши било показано, что после длительно!! инкубации клеток с з^юрапфениколоц в изолированных наибранах обнарузиваотся участки липидов не связанных с белками (ли-пидные окна). Участок инфракрасного спектра таких мембран изобразеи на рис.8, а спектра Я11Р приведены на рис. 1В Л'озно видеть,; что сегментарная подвижность диппдных иодекул возрастает в целой и в особенности возрастает подвианость протоков при матиленовых группах в углеводородной цепи. (Сигнал от протонов с химическим сдвигом 1,2 и.д.). Известно, что После удаления хлораыфенакола бактериальные клетки вос-станавлаваат нормальный химический состав, т.е. надо думать, что вновь синтезированный белок находит пипидные окна и.внедряется в структуру мембраны. Конечно, валыо знать имеется ли множество келких. окон в таких мембранах или одно большое — зона роста. Если окно одно, то при механической фрагментации мдибран (звуком) легко моано отделить нормальные участки от "озирев^их", однако такого разделения при центрифугировании в градиенте сахарозы не происходит и поэтоиу мы приходим к заключению, что чисто липидные участки рассеяны по всей плсщадн ыеибрану и представляют области включения вновь син-тезироханного белка, который, перзиецаясь по ыеибране, постепенно находит другие коцпсненты, также участвующие в выполнении какой-то общей функции.

Всегда ли биологическая мембрана была такой, какой представляется нам сейчас мембрана бактериальной кг.етки ? Все исследователи признают ключевую роль биоиеибраиы в организации и зволоции клетки и многие считаат, что появление мем-

Г

(Май (61, М-9, ——Яд

РксТЛСдаягры ЯЛ1Р кесггральпой {¡) ц л^шоиннетнно-

Ьой культ>ры (2) М. ГМДС — щгкшИк 1нир*Г(Н( «трлн ет «тн* ИрО *

И* ГМДС ■ отнято И У'мт*;

ни »ти»ск1Н №«<Н ЯННВ* « МУКИ ЛЙЦН*

м." яд ««адп — и ЬчГмЫ* «шп^

МОЫ1, | — Асла» <*-# мНяЛ, »МиЯ »м м*;мл-,

¿да 5Ш

с~>и и

НПО

-пни

Рас.19 Гипотетический путь развития биологической мембраны от простого бимолекулярного сдоя липидоа /1/ к едоязой яипопротеаддой системе.

браки вокруг уке структурированной протоплазмы означало

•ц

как-бы конец химической эволюции и начало биологической (клеточной) эволюции (Кальвин). ¡1ы полагаеи, однако, что простейсая мембрана была одним из первых этапов самой химической эполюции и что жизнь появилась на поверхности мирового океана. Ыоано думать, что первичной мембраной была ли-пидная, бимолекулярная пленка (Деборин, Гольдэкр» Серебров-ская).

Путь эволюции от таких бимолекулярных липидных пленок до структурно гетерогенных биологических мембран представляется нам как путь все большего внедрения молекул белка в структуру липидного слоя (рис.19) с конечным превращением мембраны в непрерывную систему липидных участков, вплетенных в также непрерывную) (и вместе с тем подвижную) сеть белковых молекул. -

Признание кардинальной роли развития мембран в эволюции -Ецзни позволяет, как нам канется, объяснить один из трудных моментов - деление предбиологических систем при достижении достаточно большие размеров. Образование мембраны в прогоклет-ках могло идти быстрее накопления массы протоплазмы,например, за счет синтеза большого количества плохорастворимых гидрофобных продуктов, которые имели тенденция встраиваться в мембрану. В таком случае увеличение площади поверхности частицы должно приводить к вытягиванию ее и, в конце концов, к разделения на две сферические частицы, в которых отношение поверхности к объему сохраняется таким gee ка* з "родительской" частице. Цокет быть и по сно пору в клетках, где господствует жесткая последовательность событий, диктуемая

- 45 -

генетический материалом, деление клетки стимулируется иаме-ненией площади я мембраны ?

В кезой мере эволюция биомеибраны повторяется в индивидуальной судьбе мембран вине смвуцих бактериальных клеток ?

Цы полагаем, что бимолекулярный лишдный слой в чистой виде существует в небольшой количестве в разных участках клетки, и его доля возрастает при усилении синтеза мембранных компонентов, так как он является местом встраивания белка в мембрану и местом взаимного узнавания функционально связанных компонентов.

Таким образом, можно думать, что этапы эволюции мембраны не столько повторяется в онтогенезе, сколько сосуществуют в одной и той же биомембране, сохраняясь в той или иной степени в зависимости от ее функций.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ - -

Насколько полно и категорично мы моаем ответить на вопросы, поставленные при формулировке задачи ?

Потеря активности мембранными ферментами при попытке освободить их от общества лишдов и друг друга вносит;существенную неопределенность в проблему изучения количества и свойств индивидуальных мембранных белков. Электрофорез в "деотких" системах растворителей позволил нам оценить число, молекулярные размеры и аминокислотный состав подавляющего большинства полипептидоз, из которых строятся мембранные белки, однако размеры функционирующих белков удалось определить лишь в двух случаях (дегидрогеназы яблочной кислоты и НАДН2) благодаря методу радиационной инактивации, ферментативные ие свойства мембран ш исследовали только на надмолекулярном

уровне, так как cams цел кие из выделенных нами частиц-ком- „

о

плексов ииелл радиус ( Rs ) порядка 80 А и по прьблизгнныи подсчетам содержали до 4 молекул маркерных ферментов и до 10 других белков (с условно-средним молекулярным весом 70 000).

Оштц с двойной меткой белков в присутствии хлорамфени-саоктил

кола и с^зомлцаана безусловно показывают, что синтез меи -бранных белков столь se чувствителен к этим антибиотикам, как г синтез других клеточных белков. Гипотеза о синтезе мекбрав;шх белков на мембрано-связанных рибосомах, ноторуо развиваат некоторые исследователи, от этого не страдает,но приведенные данные призывают к осторожному толкованию случаев избирательного ингибирования синтеза разных белков.так как для проявления такой избирательности, очевидно,треС^ются особые условия.

В значительной мере неясным остается, в паком месте и как белки встраиваются в мембрану. Особенности поведения фрагментов мембраны при ионообменной хроматографии, низкие величины времен корреляции вращательной диффузии спин-зондов С около КГ^сек), данные ИКС и яиР-спектросдопии, а танке результаты микрокалорииетрии (Ame и др.) указывает на то, что липадний компонент иембраны бактерий довольно поднимем - мембранный лнпид "гадкий". В то не время отсутствие в

_т

ИК-спектре интактной мембраны полосы поглощения при 720 cu , все «где низкая разреоенкость ЯИР-сцентров и многочисленные литературные данные по 'распределение молекул зондов в мембране и по зависимости активности мембранных ферментов от температуры свидетельствуют о наличии сильного липид-белко-

- 47 -

вого взаимодействия и об отсутствии значительных количеств чисоо липидных участков в мембране.

Фрагментация и фракционирование мембран из клеток,выращенных в присутствии хлорамфениксла (лев01шцегииа), когда липид накапливается в избитке, такие не выявила больавх час-то-липидных зон. В связи с излогенши мы полагаем, что внедрение новых молекул бейка в мембрану осуществляется через посадку на небольше участки ли пи до в, рассеянные по площади мембраны, с последующим перемещением вдоль мембраны м поиском партнеров по функции. Ыояно ли исключить другие варианты, например, посадку новых белков на родственные белки в мембране ? Исключить этого нельзя, однако следует отметить,' что нарушение липвд-лапвдяых сил сцепления путем нагрева, удаления ионов ме ++ или лаполиэа приводит к выбросу целого ряда белков (в виде комплексов) и таким образом можно думать,что ' местами или периодически связь медду белкамя осуществляется через липид. Кроме того, мембранные белка гидрофобна (около 20^ белков обладают особенно высоким содержанием иеноляркых аминокислот), и это также способствует взаимодействию их с областями чистого липида в мембране.

Существуют ли в мембране ферментные комплексы ? В некотором смысле вся мембрана - это один комплекс, но вопрос стоит о существовании функциональных блокоз с постоянным набором компонентов, таких как комплексы 1-1У из дыхательной цепа митохондрий, распределение маркерных ферментов во фрагментах, получающихся при самых различных воздействиях на мембрану и динамичность самих белковых молекул (но данный Н = Ю обмена и кинетики гибели спин-метка, присоединенной к белку)привел»

нас ic шел» об эфемерности комплексов, т.е. наы представляется, что компонент комплексов объединяется лить на некоторое время.Если это так, го в "оянревиих" мембранах ("лево-иицетиновых") следует озедать уменьшения активности дыхательной цепи при сохранении абсолютного количества ферментов. Тааое явление наблюдается, однако причина его t'j в эфемерности комплексов, а з выпадешь отдельных компонентов цепи при разрыве мембраны, В то же время дыхательная активность , целых "ловоцицетнновах" клеток сохраняется на уровне норналь^ вых клеток (в пересчете на обвдй белок), что свидетельствует в' пользу существования стабильных комплексов. Неопределенность-относительно "узкого" места дыхательной цепи пока не позволяет сделать однозначные выводы из этих экспериментоз.

Что касается относительного расположения компонентов мембраны, то доступность липадов действию липолитических ферментов, легкое распределение в иембране гидрофобных соединений (еппн-зоидов) и ограниченная доступность протеолизу кажутся наа надеиными показателями того, что и липид и белок ыембраны имеют выход на ее поверхность.

Вторичную структуру мембранных белков пока можно оценить - ориентировочно. Несомненно (по. данным Щ-спектросколии сухих пленок а препаратов в D20), что преобладающим тидоц вторичной структуры мембранных белков в целой является JL -спираль и (или) неупорядоченный клубок, однако в отношении индиви -дуальных белков (точнее жштептндов) ш ucsen опираться только на содержание антиспиральных ашшокислот и полагать (согдасио закономерности, подмеченной Д&висои), что степень заспирализованности колеблется от 5 до 80$. В этом направлении предстоит ецз очень большая работа.

_ 49 -

При изменении температуры от 10 до 90°С в суспензии мембран обнаруживается целый ркд сииптоцов, указывающих на глобальные структурные перестройки иеибралы (изиепение оптической плотности суспензии, активности ферментных систен, параметров липофильних спиновых зондов)„ Основой этих перестроек является пипид, так как по крайней перо две из них воспроизводятся на эмульсии лишада. Структурные перестройки липида при низких температурах { ^ 20°) вызывают значительную активация мембрашшх ферментов, участвующих в биосинтезе сашх липидов, что обнаруаивается по скорости включения с^-ацетата в гшпади Е.С°1А , вместе с тем состояние мембранных белков играет определяющую роль в возиоккости осуществления липидных перестроек в диапазоне 35-50° (ЫДуаоскяк-ысиз ),

Экспериментальная прижизненная модификация жирных кислот липидов Е. сои изменяет чувствительность к хлорамфенп-колу регуляторного аппарата клетки, координирующего биосинтез белка и дипида, однако совершенно ке сказывается ыа координации биосинтеза белка и нуклеиновых кислот.

Таким ооразом, моино думать, что липидные и белковые компоненты мембраны находятся в тесной контакте и существенно влияют друг на друга. Бактерколыше меибраны склонны испытывать глобальные структурные перестройки, шэеящме адоптивное и регуляторное значение, однако полнота вовлечения компонентов мембраны в эти перестройки и способ передачи воздействия от одного компонента к другоиу все еще остаются непеныки.

Структурная и функциональная гетерогенность мембран заставили нас прибегнуть ко множеству подходов, что несомненно привело к несколько поверхностной интерпретации резуль-

- 50 - '

salов некоторых слогньас методов. Однако, совокупность выво- ч * доз работы позволяет,на нао взгляд, составить белее определенное представление о временной и пространственной организации бактериальных мембран, чей это иохно было сделать рань-се.

Бактериальная мембрана представляется как динамичная система,"в которой белковые глобулы, ориентированные благодаря специфическому расположение гидрофобных участков,обла-* . 1 дав? некоторой подвиккостыо как в плоскости мембраны, так и

в направлении, перпендикулярном плоскости мембраны, и образует функционирующие комплексы переменного состава.

ВЫВОДЯ

I) С помощью различных биологических, химических и физических методов на мембранах из бактерий нескольких систематических групп были определены размеры некоторых ферментов in situ t качественный состав" полипептидов, рассчитаны их молекулярные веса, относительное количественное содержание каждого белка и особенности их биосинтеза в присутствии антибиотиков. Проведен аминокислотный анализ иеыбранпцх белков, исследована их вторичная структура и конфорыационная лабильность, изучены состояние и структурные превращения липидов и их роль з координации биосинтеза ряда веществ. Исследовано взаимное расподобениз компонентов и дана характеристика некоторых функциональных фрагментов мембраны - компонентов дыхательной цепи.

- 51 -

На основании этих эксг.ерииетаов формулируемся представление о бактериальной мембране как о динамичной структуре, основой строения и функционирования которой является взаимодействие липкдного и белкового компонентов.

2) Мембранные белки II. lysodeiktlcuo построены из более чей 25 полипептидних компонентов, причем каждый компонент составляет кеиее 10$ от общего их количества, а «олеку-лкрние веса варьируат от 10 ООО до 160 ООО.

Молекулярный вес ферментов малатдегидрогеиазы и НАДН^ -дегидрогеназы in situ определен как равный приблизительно 70 ООО.

3)преобладающими формами пространственной структуры мембранных белков является ' <А -спираль и хаотический клубок.

Полярность мембранных белков И. lysodeikticue варьирует в широких пределах (от 0,8 до 2,7) и состав аминокислот разнообразен, что указывает на разнообразие сил сеязи между компонентами мембраны.

Белки испытывают конформацнонние преЕрацения, глубина которых увеличивается при удалении липида.

В качестве особенности мембранных белков предполагайтел наличие на их поверхности гидрофобных участков.

4) Молекулы мембранного белка, имея выход на поверхность мембраны, в то не время з значительной мере защищены от контакта с водой липидои. Белковые компоненты, участвующие в окислительном фосфорилироваиии расположены на внутренней стороне мембраны.

Молекулы липцдов ориентированы поперек мембраны так, что большая часть их полярных группировок контактируй? с

внешней средой. Липнды находятся в состоянии быстрого двике- ■■ кия, обусловлаваощего небольшие величины времен корреляция вращательной диффузии парамагнитных зондов порядка 10~9сек).

Подвижность липлдов зависит от взаимодействия их полярных группировок и в условиях клетки, возможно, определяется наличием ионов двувалентных металлов и органических поликатионов.

Концевые еполярние группировки липидов обладают относительно булькеЙ сегментарной подвикноетьо, но-кислотного скелета, прилеаацие к глицерину, что можно объяснить, веерообразным расположением молекул липида в пространстве меаду молекулами белка.

Лиг.иды взаимодействуют с белками мембраны через углеводородное группировки и это взаимодействие ослабляется при образовании избытка липида в мембране, вызванного избирательный подавлениеи биосинтеза белков антибиотиком хлорамфенико-лои.

5) Из мембран и. 1у8±ае1к«сиз выделены липопротеид-

ные комплексы со средним значением радиуса частиц (к ) о

около 80 А. До игеа частиц (по белку) составляет дегидро-гйназа яблочной кислоты и содержится такге НДДН^-дегидрогеказа. Аргументируется предполокзнпе о том, что комплексы являются времениьи'и ассоциатами латералыю под винных компонентов и что компонента дыхательной цепи образуют радиалькэ симметричные фигуры с расположением цитохромоксидазы в центре, а деги-дрогеназ - по периферии ассоциата.

- 53 -

6) Лияидный компонент мембраны претерпевает несколько структурных перестроек при изменении температуры от 10 до 90°С. Характер перестроек в значительной мерз зависит от состояния мембранного белка. Предполагается регулсториал роль обнаруженных переходов через изменение взаимодействия мембранных ферментных комплексов. Экспериментальная модификация хишческого состава и физического состояния липидов приводит к изменению чувствительности аппарата координации биосинтеза белка и липидов к действию хлорамфеникола,однако зависимость синтеза нуклеиновых кислот от наличия полного набора аминокислот при этоу пе меняется.

7) Формирование мембран происходит путем встраивания отдельных белков в рассеянные по всей плоцади мембраны "вакансии" - мелкие участки липидного бислоя.

Показано, что антибиотики спектипокицин при действии на клетки Е. со11 и хлорамфеникод при действии на и. йе1к<;1сиз вызывают неспецифическое подавление синтеза как цитоплазмам плесках, тля и неубранных белков. Увеличение активности некоторых мембранных ферментов при действии этих антибиотиков вызвано активацией ферментов, очевидно,вследствие накопления в мембране избыточного количества лиледов.

8) Развиваются представления о кардинальной роли мембраны в возникновении и эволюции живых организмов.

Основные результаты работи излолепы в следуаких статьям:

I. Островский Д.Н., Ьратьян Е.Ф., Гельман Н.С. Действие панкреатической липазы на протопласты У. 1узо (1е1к1:1сиз в связи с вопросом о локализации

дыхательных фермезтоз у бактерий, Ьнохишш,1964, 29, 154

2* Жукова И.ГТ1 Островский Д.Н., Гельман Н.С., Опарин А.И. Очистка ферментного комплекса дегидрогеназ HAflHg и яблочной кислоты из мембран бактерий U.lysodeilctlcus Биохимия, 1966, 31, 1209

3. Островский Д.Н., Жукова И.Г., Выделение и очистка ферментного комплекса из мссбран бактерий M.lysodeilctlcus 196?. Материалы симпозиума "Эволюция мембранных структур и ядерного аппарата у микроорганизмов", стр.37,

Островский Д.К., Жукова И.Г., Гельман И.О. Изучение комплекса дегидрогеназ яблочной кислоты и в мембранах IS. lysodeiktlcud с помощью экстракции детергентами и солями желчных кислот, биохимия, 1960,33, 612

5. Гельман Н.С., Лукоянова U.A., Островский Д.Н." "Дыхательный

аппарат бактерий" 1966 "Наука", Москва.

6. Островский Д.Н., Цфасман И.У. Некоторые свойства липопро-

теидных комплексов дегидрогеназ из мембран М. lyso-deiktlcus ф i960. Материалы симпозиума "Супра-

молекуляряая организация вирусов, бактерий и простейших", стр.95

7. Островский Д.Н., Переверэев H.A., Жукова И.Г., Трутко C.W.

Гельман Н.С. Некоторые физико-химические свойства комплекса дегидрогеназ НАДН2 и палата из мембран М. sodciktious . Ьиохишя, 1968, 33, 3X9

8. Островский Д.Н., Цфасман H.Ii.» Гельман Н.С. Определение

молекулярних весов некоторых ферментных к неферментных белков бактериальных мембран методами радиационной инактивации и дискзлектрофореза, Биохимия 1969,34, 993

9. Гольдфельд Ü-Г.» Островский ДЛ1., Розанцев Э.Г. О структурных переходах в мембранах ü. iysodeikticus

Докл. АН СССР 1970, 191, 702

10. Банюкоэ В.И., £укова Ii.Г., Островский Д.Н. Оценка вторич-

ной структуры белков бактериальных мембран по данный инфракрасной спектроскопии. Докл. АН СССР 19VI, 198. VS7

11. Винюков В.И., Борунова С.Ф., Гольдфельд U.F.,Жукова И.Г.,

Кудлай Д.Г., Кузвецов А.Н., Шапиро А.Б.,Островский Д.Н. Исследование структурах переходов в биомембранах методов сиин-зонда. Температурные изменения в кембранах бактерий. Биохимия, 197I, 36, 1149

12. Бинюков В.И., Короиелли Т.В., Красильнвков H.A.»Иванов В, .Островский Д.Н. Исследование механизма взаимодействия клеток углеводород - окисляющих микобактерий с субстратом методом парамагнитного зонда, докл. АН СССР 1972, 203, 467

13. Софронова M.D., Островский Д.Н., Гельман Н.С. Состав

белков мембран Ii. lysodelktlcus . Биохимия 1971,

36, 977

14. Гельман Н.С., Лукояиовз U.A., Островский Д.Н. "Мембраны

бактерий я дыхательная цепь". "Наука", 1972

15. Цфасман U.U., Островский Д.Н., Гельман Н.С. Характеристи-

ка фрагмента меибраа U. l^aoiieiktious , содержащего . малат- и НАДН дегидрогеназы. Биохишя 1972,37, S89

16. Цфасман ld.il., Островский Д.Н., Гельман Н.С. Распределе-

ние малат- и НДДН^-дегндрогеназ и других белков при фрагментации ксмбран LI. lysodeikticus Биохимия 1972

37, 92

17. Иолчанов и.И,, Кукова И.Г.,Софронова й.й.,Сенченков Е.П. Островский Д.Н. Аминокислотный состав некоторых бовкоз бактериальных мембран. Докл. АН СССР, 1972, 206. 4S0

13. Канюков В.И., Капрельяиц ¿.С*, Кузнецов А.Н., Островский Д.Н. Исследование методом парамагнитного зонда температурных структурных переходов в бактериальных мембранах. Материалы k Меядународного Биоф.Конгресса 1972, 3, 16 .

19. Островский Д.Н., Софронова И.О. Некоторые данные о

молекулярной организации бактериальных мембран.Материалы 4 Меядународного Биоф,Конгресса 1972

20. Островский Д.Н., Кукова И.Г., Цфасман И.У. Физико-хиии-

чесние свойства ферментного лппопротеидного комплекса из мембран Оактерий ü. iysodelkticus . 2-й

Всесоюзный Биох. Съезд, Жезисы докладов ка сиипозиу-

*

це, Ташкент 1969.

..........„ кор.форегжц

2J. Островский Д.Н. LerSpanu и эволюция. Материалы. Проблемы происхозденил и супшости жизни. " Наука", 1973

22. Софронова W.ü., Островский Д.Н. Характеристика белков

мембран и. lysodcikticus . Всесоюзная конференция по регуляции биохимических процессов у микроорганизмов. Тезисы докладов. 1972, стр.159

23. Островский Д.Н., £!акулов P.C., Сонава Ю., Сокава Е.,

Кадкиро Е. Рол^ мембран з корреляции биосинтеза белка, нуклеиновых кислот и липидов у бактерий. Материалы Всесоюзной конференции по регуляции биохимических процессов у микроорганизмов. 1973 (в печати)

24. Цфасман H.ii., Островский Д.Я. О характере крепления

мембранных белков. Всесоюзная конференция по регуляции биохимических процессов у микроорганизмов. Тезисы докладов. 1972, стр.174

25. Буяло О.Д., Головачева P.C., Логинова Л.Г., Харатьян

Е.Ф., Островский Д.Н., Некоторые свойства мембран термофильных бактерий. Микробиология 1973.42, 280

26.tОстровский Д.Н., Ъыстров В.Ф., Жукова И.Г., Черьин И.И., Яковлев Г.И. Состояние компонентов мембран -sodeikticus по данным HhtP- и ИК-спектроскопии. биохимия 1973, 38, 161

2?. Красильников H.A., Норонелли Т.В., Островский Д.Н.,

Ьисько H.A. О локализации ферментов воекообразования в клетках Mycobacterium ceroformaas Микробиология, 1973, Шч 5

28. Софрокова У.О., Шапошников Г.Л., Гельман H.U., Островский Д.Н. Аминокислотный состав некоторых белков мембран М. lysoaeikticus . Биохимия 1973

(в печати)

29.Бинюков В.!А., Головачева P.C., Логинова Л.Г.,Капрельянц A.C., Кяйваряйнен Е.И., Сускина В.И.,Островский Д.Н. Исследование структурных изменений мембран термофильных бактерий в зависимости от температуры с помощь» методов спинового зонда и светорассеивания. Микробиология 197Э (в печати)

- 53 -

Капрельннц А.С., Ъшзякоз В.И., Григорян ГЛ., Островский Д.Н. Подвижность белков в бактериальных мембранах. Ыикробиология 1973 (в печати)

Бинаков В.И.,Дулова И.Г.,Каярельянц А.С.,Кузнецов А.Н., Розанцев Э.Г, .Осгровсклй Д.Н, Исследована? природы температурных структурных переходов в мембранах бактерий кетодом парааагцатпых зондов . Биохимия 1973 (в печати)

Gelraan U.S.,Lukoyanova М,А.,Ostrovsky В.И. Respiration and phosphorylation of bacteria. 1967 .Plenum Press New York *

Gelman U.S.,Ostrovsky D.N.»Lukoyanova M.A.»Slmakova I.M. Binding of respiratory enzymes in the membrane of I.Ucricoccua iysodeikticus .Abs.Comras.6th,Meeting of FEB3 .1969. MI166 .

Ostrovsky D.if. A possible pathway of biological mem — brane evolution . Third International conference on the Origin of Life.Pont a liusson,1971.

ft.

Kapreliana A.S.,Blniukov V.I.jttrigooian G.L.,Ostrovsky D.1I. Mobility of proteins in the membrane of Micrococcus lysodeikticus .FEBS letters .1975 , (in press) .

- 59 -

Материалы работы были дололеки: на Всесоюзной конференции по регуляции биохимических процессов у микроорганизмов (Пущино на Оке, 1972 г.), на П Всесоюзной биохимическом съезде (Ташкент, 1969 г.), на 6-й конференции Федерации Европейских биохимических обществ (Ыадрид, 1969), на на 3-й Международной конференции по происхождению жизни (Франция,1971), на 4-м Международном биофизическом конгрессе (Иосква,1972), на заседаниях Всесоюзного биохимического общества (Москва).

______________Зак^_г1§2__

Типография 2030 Госплана СССР