Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антибактериальное действие липосом и возможность их применения для профилактики раневой инфекции

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антибактериальное действие липосом и возможность их применения для профилактики раневой инфекции"

' А. ¡1 Г< ' ')

-ГОЗУД'.ктЕлИШ КОМИТЕТ РСМСР САНИТАРКО-ЭГСШЕ^ЮЮГИЧЕСКОГО

НАЛЗОРЛ

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСЮШ ИНСТИТУТ ЭПШ»ЮОЛОГЮ1 И МИКРОБИОЛОГИИ им. Г. Н. ГАЕР1Г1ЕЕСКСГО

На правах рукописи

ШШЛШ ЛАРИСА ПЕТРОВНА

АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ ШПОСОЧ И ВОЗИОХНОСТЬ ИХ ПРИЧЕНЕННЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ РАНЕВОЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание.ученой степени кандидата биологических наук

Москва. 1992

Работа выполнена в Экспериментальной лаборатории медико-биодо-гических проблем при Кемеровском государственном медицинском институте.

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РМСР, доктор медицинских каук, профессор ЕК Мэльникова

" Заслуженный деятель науки РСФСР, доктор медицинских наук, профессор Т. КЩ?аер

Официальные оппоненты:

/

доктор медицинских наук, профессор Г. Е. Афиногенов

кандидат биологических ггаук Е. А. Шмелева

Ведущая организация: Есесоганий научно-исследовательский институт антибиотиков

зашгга состоится JuClpmCL 1QS2 г. в Ю часов на заседании специализированного coserá К.084; 18.01 при кэековском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г. Е Габричевского по адресу: ул. Адмирала Цжарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричзвского. :

• Автореферат разослан 'PV^ÜQP&JdCk ПЪ>-У2®2. г.

Ученый секретарь специализированного совета, канд5щат медицинских наук

3. Н. Ермоленко

■nr vztt I - 3 -

' I

i i. i, I

4 ¡ ОБЯАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

tcc'jo'

~ 'Актуальность работы. Современная медицина использует пшрскиЛ бср химиотералевтических средств для лечения инфекционных заболе-ниЯ. Наиболее распространенной группой антибактериальных препара-в являются антибиотики, широкое использование которых привело к сту антибиотикорезнстентности микроорганизмов, которая для ног.о-'рых ранее высокоэффективных препаратов составляет 00-901 (С. II Comeo и, К. М. Мирзаев,1987). В основном применяемые в практике анти-ютериальные средства используются для подавления размножения пошита в организм болезнетворных бактерий. В то те время недостающее внимание уделяется препаратам, действие которых направлено i профилактику инфекционного процесса в самом начале его развития 3. Г. Петровская, 1980).

В связи с этим по-прежнему остается актуальной проблема поиска разработки новых антибактериальных препаратов, обладающих высокой йективностыо, низкой токсичностью и иммуногенностыо (Д. Ланчини.Ф. *ренти,1985). Ш нашему мнению, таким средством могут оказаться гассомы, для которых показана возможность направленного транспорта тканям гнойней и огнестрельной ран (Т. ЯШраер с соавт. ,1938). Это зжет играть существенную роль для воздействия как lía поврежденные кани, так и микрофлору ран.

Наиболее распространенным направлением использования липосом в иологии и медицине является создание липосомлльных Форм лекарс-венных препаратов С А. Е Стефанов, 1980; М. А. Владимирский с соавт.,

Ю77). Так, введение в состав .силосом антибиотиков (Г. Л. Полов'","'П. ] Гончаров,1980, К. А. Ротов с соавт,1989; И. В. Белинская . с ,с< авт. ,1901; Л. Е Березовская, 1991) позволяет получить Сактернцидн] з^фзкт при использовании субингибиторных концентраций препарата (, В. Губенко с соавт. . 1991; М. С. КасиссуЮ еЪ а1. ,1988). Автора обш няш усиление активности антибиотиков увеличением проницаемое вн'ешней мембраны клеточной стенки грамотрицателышх бактер вследствие воздействия на них липосом. Однако, усиление зффек могло быть свяаано и с непосредственным антибактериальным действи лилосом, хотя авторы этого не исследовали.

В литературе широко описаны возможные механизмы взаимодейств липосом с клетками (сорбция на поверхности клеточной мембраны, ел яние с клеточной мембраной, эндоцитоз, обмен липиднымп молекулам;: др.) (Л. Е Марголис,' Л. Д. Бергельсон, 1386). Описанные механизм ш точно-липосомальных взаимоотношений изучены на примере их взат действия с эукариотическими клетками. Основываясь на свойстве лиг сом модифицировать клеточные мембраны, можно предположить, что с могут взаимодействовать также с поверхностными структурами 0акте; альных клеток.

Для эффективного воздействия липосом на жизнедеятельность б; териадьной клетки, необходимо выбрать их параметры для достиже: максимальной активности липосомального препарата Так, дшшые ли' ратуры свидетельствуют о зависимости физико-химических свойств , посомальной суспензии от величины рН (А. Л. Клибанов с соавт. ,19' Э. ТошПпбоп е1 а1. ,1989) и выраженности процесса неферментативн окисления липидных компонентов липосом (& А. Владимиров, 10 0. СапЬоШ е1 а1. ,1989; ША-БаМ вг а1. ,1989; М. А. Кеэтеуапоуа, М Вогйапоу,1989). Поэтому для решения вопроса о возможности исполь вания липосом в качестве антибактериального средства актуальной

дачей является изучение данных показателей в липосомальной суспензии и стандартизация получаемых липосом по величине. рН и уровню л.ч-пидной пероксидации.

Цель и задачи ¡геелвдовапня. Определить в опытах in vitro возможность влияния липоссм на лизнеспоссбность микроорганизмов, наиболее часто встречающихся при раневой инфекции, и изучить некоторые механизмы их антибактериальной активности. Оценить динамику качественных и количественных изменений раневой микрофлоры in vivo, происходящих под действием липссом, и определить возможность их использования для профилактики раневой инфекции.

Для достижения указанной цели были поставлены следугаие задачи:

1. Изучить влияние липосом из фосфатидилхолина (ФХ) и холестерина (X) в молярном соотношении 7:5 на жизнедеятельность представителей условно патогенных и патогенных микроорганизмов in vitro при различных сроках инкубации в физиологическом растворе и растворе плазма

2. Исследовать следующие возможные механизмы антибшетериально-го действия липосом:

а) изучить влияние структуры препарата на их антибаютриальную активность при совместной инкубации с бактериальными клетками;

б) изучить влияние рН липосомальнсй суспензия на- антибактериальную активность липосом при их совместной инкубации с бактериальными клетками;

в) изучить влияние уровня переписного окисления липидов на антибактериальную активность липосом при их совместной инкубации с бактериальными клетками;

г) изучить изменение степени адгезии бактерий к эукариотичэс-ким клеткам под действием липссом.

3. Оценить эффективность однократного подкожного введения

суспензии липосом экспериментальным животным на мшроОисиогичеаку: характеристику и клиническое течение огнестрельных ран.

Пиучпая но низ на. В доступной нам научной и патентной литерат ре имеется лишь единичные сообщения, касащиеся вопроса взаимодейс твия липосом с бактериальными клетками СL. J. Barsukov et al. 1986; S Tomlinson et al. ,1989). Также мы на встретили сообщений о влияни лйпосом на жизнедеятельность микроорганизмов и возможность их при менения при лечении раневой инфекции. Впервые выявленный нами анти бактериальный эффект липосом как в экспериментах m vitro, так и животных с раневой инфекцией, а также исследование механизмов, бла годаря которым может осуществляться их бактерицидное действие, яв ляется новым в микробиологии, фармакологии и практической медицине В связи с этим, многие поднимаемые в работе вопросы изучены нам впервые.

Осношие положения, ituiiocciiauc да аациту

1. Суспензия фосфатидилхолин-холестериновых липосом обладав прямым бактерицидным действием по отношению к условно патогенным патогенным микроорганизмам.

2. бактерицидная активность препарата определяется не тольн химическим составом, но и наличием везикулярной структуры использ$ емых липидов.

3. Одними из основных параметров липосом, определяющими t бактерицидную активности, являются рН липосомальной суспензии и сс держание в вей продуктов перекисного окисления липидов.

4. Помимо прямого бактерицидного действия препарата, его ант! бактериальная активность in vivo может быть реализована путем пс давления первой Фазы инфекционного процесса за счет антиадгеэивнс активности липосом, проявляющейся в субингибиторных концентрациях.

5. фи однократном подкожном введении животным с огнестрелык

аиой суспензия липосом сохраняет свое антибактериальное действие, но проявляется в снижении уровня обсемененности раны и степени ин-;азии бактерий вглубь тканей раневого канала.

Практическое а паче пне работы. Обоснована возможность применч [ия липосом для подавления размножения условно патогенной микрофло->ы и целесообразность их использования для профилактики раневой инфекции. Определены некоторые параметры, влиякшэ на штибактериальную активность липосомальной суспензга!. Провеяевкыэ исспериментальные исследования легли в основу при разработке вркн-дапиально нового фармакологического препарата для лечения микребно загрязненных ран, получившего название "Липоран". Токсикологические . испытания "Липорана" показали его безвредность для организма. Полугенные в работе данные об антибактериальной активности "Липорана" в комплексе с другими исследованиями препарата представлены в Фармакологический кошггот Министерства здравоохранения СССР (протокол N I от 1.02.90). Получено разрешение на проведение 1 фазы клинических испытаний. В настоящее Еремя проводится разработка лабораторной и промышленной технологии получения "Липорана", в которой учтены выбранные в работе физико-химические параметры липосом, обеспечивающие наиболее выраженный антибактериальный эффект.

Структура и объеи работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 150 страницах машинописи, иллюстрирована 17 рисунками, 3 фотографиями и 30 таблицами. Библиографический указатель содержит 97 отечественных и 62 зарубежных источника. Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и сбсужцены: - на Всесоюзной школе-семинаре "Химиотерапия раневой инфекции

Ь травматологии и ортопедии" (г. Москва, 28 - 30 сентября 1990 г.)

- на международном симпозиуме "Липосомы в биологии и медицине" (г.Ташкент, 12-16 ноября 1990 г.)

- на Всесоюзной научной конференции "Огнестрельная рана и раневая инфекция" (г.Ленинград, 19-21 февраля 1991 г.)

- на заседании Кемеровского областного общества хирургоз (г/Кемерово, 19 марта 1991 г.)

- на ХХП пленуме правления Всесоюзного научного общества травматологов -ортопедов (г.Иркутск, 27-29 июня 1991 г.)

- на совместной конференции кафедр микробиологии, хирургии ] патологической Физиологии Кемеровского Государственного медицинского института (г.Кемерово, 21 ноября 1991 г.).

СОДЕРЮит РАБОТ и

Экспорииоитамъпы(1 материях В качестве объекта исследовани бактерицидных свойств липосом в работе использованы музейные штамм S. aureus 209-Р, Ps. aeruginosa 2134, Е. coll М17, Pr. mirabiUs 8 клинический штамм S. enteriditis 1735.

Для изучения антиадгезивных свойств липосом использовали кли нические высоковирулонтные штаммы S. aureus 2/8, Ps. aeruginosa 51 зукариотические клетки линий НЕр-2, HeLa и иммортализованные астро циты спинного ганглия крысы.

Для моделирования патологического процесса использовали поло возрелых кроликов обоего пола породы "Шиншилла" весом 2.5-3. 5 кг.

У с годы исследования. Липосомы из фосфатидилхолина и холесте рина в молярном соотношении 7: 5 готовили по методу Baneham et al (1965) с последующей ультразвуковой обработкой суспензии при 22 к1 и 4 С. Содержание протонов водорода в липосомальной суспензии опре деля ли методом рН-метрии. Содержание продуктов ГОЛ в липосомальт

липосомально-бактериальных суспензиях определяли в тесте с тгп арбитуровой кислотой по содерлашпо в суспензии малонсвого апьлогн-а (МПА) (Л. "А. Андреева с соавт. ,1933). Для получения липсссм разной гепени окисленности использоваян ФХ, предварительно подвергнутый кислению в системе Ге-аскорбат. При получения суспензии липидов в элипосомальной форме к высушенной смеси липидов добавляли раЕкое эсовое количество холеата натрия и после тщательного перемешивания »суспендировали в 0.15 М растворе N201. Для определения мшшмаль-эй подавляющей концентрации (МПК) лгаюсом применяли м°тод серийных заведений лшосомальной суспензии в жидкой питательной среде (Г. Н. эршин,1971). В- качестве инкубационных сред использовали 0.15 М аствор хлорида натрия и 207, растзор плаз!.<ы здорового донора в филологическом растворе. Определение динамики гибели бактериальных деток при совместной инкуб,'или их с липосэмальными суспензия),г»! оп-эделялк методом предельны:? разведений (Н. С. Егоров,1983). Степень цгегии бактериальных клеток к эукариотическим оценивали путем эдсчета бактериальных клеток, сорбированных на поверхности эукари-гических клеток, методом прямой световой микроскопш!. Изучение :обенностей течения инфекционного процесса под действием липосом роводили на кроликах с моделью сквозной огнестрельной раны мягких <аней бедра. Суспензию липосом вводили под- кожу гойени в течение 1 аса после нанесения транш в дозе 35 иг/мл/кг. МшсроЗиологические ^следования тканей раневдго капалз проводили через 1, 3, б и 3 су-ж после травмы. Забор тканей осуществляли на расстоянии О. 5; 1.0; 5 и с сч от края раневого капал?, к перкарин. Уровень микробного Зсемгненип тглнг:1 оценивали по количеству бактерий на 1 г/ткани. ¡енгкФикаши бактерий, выделенных их тканей раневого капая?., осу-гетвллли по обдаприпятич методам (П. О. Бг.ргер, 1973; Мс?од'г;есккр са?ан;:;м?85). Для обрлбсткн шг&ровыг результатов ;!сс.-пг.опяип

:(,)шеняди методы описательной статистики. Достоверность различи двумя или кееколыотмп выборками оценивали по критерию Сгь юдонга. Достоверными считали различия при Р<=0. 05. Математически операции, их графическое отображение и редакцию текстового матери; ла проводили на персональном компьютере IBM FS по стандартным при* ладным программам (LEXICON 6.66, STADIA, SUPERCALCK-4, GRAPHEF DOKTOR HALLO).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Ъянтшз липосои да рост бактсриахышх культур. Если при в севе из контрольных суспензий рост исследуемых культур наблюдал на протяжение всего периода наблюдения (3 суток), то совместная и: кубация бактериальных клеток с лштоеомальной суспензией псказзл что через 24 часа илкубации ШК лпносомальной суспензии в физмол гическом растьоре составила: для Рз. aeruginosa и E. coli - 6 мг/мл, для S. aureus и Pr. mirabilis -3.1 мг/мл и для S. enteritid -1.5 мг/мл. К концу периода наблюдения (48 -72 часа) для всех ис ледуеыых штаммов ешстерий подавляющей рост микроорганизмов окаэ лась минимальная использованная концентрация липосом (1.5-Е мг/мл).

При использовании в качестве среды инкубации 201 раствс плазмы антибактериальный э-We кт/липосом оказался менее выраженш Так, через 24 часа взаимодействия бактерицидной для зтих куль: оказалась только концентрация препарата 25.0 мг/мл. При продле! сроков инкубации до 48 часов уменьшение подавляющей концентрации 12.5 мг/мл было зарегистрировано толы со для культуры S. aureus, для остальных культур этот показатель остался прежним. В конце : риода наблюдения эти концентрации такжа не изменились.

Проведенные исследования показали, что попользованные н

липосош обладают прямым антибактериальным действием по отношении к основным вилам условно патогенных и патогенных микроорганизмов, которое можно расценивать как бактерицидное (Г. Н. Першин, 1971). В доступной литературе мы не встретили сообпений о возможности подавления роста бактерий под действием фосфолипидных везикул. Снижение бактерицидного эффекта липосом после добавления в среду инкубации плазмы крови может быть следствием сорбционной активности липосом по отношению к белковым компонентам плазмы и продуктам их деградации (Q. Welsmann et al. ,1977; D. Hoekstra, G. Scherphof.1979), что мо-жэт вызвать увеличение проницаемости липосом и их разрушение (Т. М. Allen,1981). Кроме того, добавление в среду инкубации питательных веществ, содержащихся в плазме, также можвт способствовать размножению бактерий.

Некоторые иехаянаии бактерицидной активности липосом. Одной из причин, подавляющих рост бактериальных клеток, может явиться упорядоченная структура бислойных везикул, позволяющая им активно взаимодействовать с бактериальной клеткой.

Исследования показали, что в отличие от липосом, суспензия не-липосомальной формы липидов в физиологическом растворе проявляла антибактериальное действие на клетки S. aureus в концентрации >-6.2мг/мл только через 48 часов инкубации.' На клетки используемых грамотрицательных палочек липиды в нелипосомальной форме на протяжении всего периода наблюдения антибактериального действия не оказывали. Таким образом, в механизмах зарегистрированного бактерицидного эффекта липосом существенное значение имеет наличие упорядоченной бислойной структуры везикул.

Влияпис pH л тот оиалт> но Я сусповзия ва ее автнОактерналъвую ахтивпость. Попытка стандартизовать подученный препарат по ого антибактериальному действию показала, что достигаемый эффект липосо-

иальной суспензии находится в зависимости от ее кислотности. Изучение динамики роста культур Ps. aeruginosa и S. aureus в физиологической растворе при значениях рН от 3 до 9 показало, что летальной для бактериальных клеток оказалась только рН 3 (Рис. 1А). При остальных исследуемых значениях рН уменьшения количества жизнеспособных клеток не наблюдалось, несмотря на отсутствие в инкубационной среде питательных вещэств.

В то время при воздействии на культуру S. aureus липосомаль-ной суспензии с теми же значениями рН (Рис. 1Б) уже через 6 часов отмечена полная гибель бактерий при рН 3, 4 и 5, через 12 часов -при рН 6 и к окончанию срока инкубации (24 часа) - при остальных значениях рН. Воздействие препарата на культуру синегнойной палочки носило несколько иной характер: гибель бактерий вызывал препарат со значениями pIK =5. Слабокислые, нейтральные и сэлочьые суспензии существенного влияния на рост этой культуры не оказывали.

Различия в активности липосомальной суспензии по отношению к представителям грамположительной и грамотрицателыюй флоры, вероятно, связаны с различиями в строении их клеточной стенки. Как показано в работе S. Tomlinson et al., (1989), слияние лилосом с внесшей мембраной грамотрицательных бактерий происходит наиболее активно при нейтральных значениях рЕ Вероятно, встраиваясь в мембрану и привнося в нее несвойственный бактериям холестерин, липосоУШ стабилизируют внешнюю мембрану и делают клетку более устойчивой к воздействию повреждающих факторов. Поэтому при значениях рН, близких к нейтральным, липосомы ,бактерицидного действия на культуру Ps. aeruginosa не сказывают, в отличие от культуры S. aureus, у которой внешняя мембрана отсутствует.

Таким образом, бактерицидная активность липосомальной суспензии имеет прямую зависимость от ее рЕ Активность суспензии по от-

Рис. 1. Динамика роста культуры S. aureus в Физиологическом растворе (А) и липосомальной суспензии (Б) с различными значениями рН. Цифрами обозначены значения pit

эиению к исследуемым культурам наиболее выражена при вначениих К =5. Возможно, именно этим можно объяснить отсутствие литературах данных об антибактериальной актишюсти липосом. Подтверждением эму могут служить работы L. J. Barsukov et al. (1986), S. Tomlinson t al. (1989), в которых авторы использовали липосомы с нейтрал»hu-íi значениями рН При этом воздействие липосом на бактериальную летку было кратковременным.

Влняпкс у ром я порскиспого окисления липосоиальящг мкаы)

на ;у!71г0а:стср.чгиьчую тггитссть лнггосои. Одним из факторов, ока зыг.чииих шпотоксический з^ст на клет ки макроорганизма, являете 1!С(1лрмектатизное окисление липидов клеточных мембран (0. КВоскре сенскау., Л. 11 Левицкий, .1970; Ю. А. Владимиров, 1989). Мы предположили что на ж;зксс:тосо?кост> бактериальных клеток также может оказыват рлся;:^ ;;а-:оплэние в итерационной ср°др продуктов перекисног окислсг.кл липидов (ГОЛ). Поэтому параллельно с определением коли Ч1.-стг,а жизнеспособных клето1с ш определяли содержание продуктов ПО в липосомальной и липосомально-Оактериальных суспензиях с разным значениями рН.

Исследования показали, что т. первые 12 часов инкубации во все исс.'.сдуо.'&ас суспензиях уровень вторичных продуктов ПОЛ достоверн не изменялся, а к концу периода наблюдения содержание продуктов ПО увеличивалось оОратнопропориионально значениям рЕ При атом наибо .-<¡0 значительнее повышение уровня МДА определялось в липосоиальны суспензиях с клетками золотистого стафилококка В суспензиях, со лержшшх клетки синегнойной палочки, увеличение уровня перекисног окисления липидов такке наблюдалось, но в значительно меньшей сте ген;:, чем ь суспензиях, не содержала бактериальных клеток. Следо вательно, в процессе инкубации липосом с бактериальными клеткам происходит гибель бактерий и накопление в суспензии продуктов ПОЛ Однако осталось неясным, влияет ли увеличение продуктов ПОЛ в сред инкубации на антибактериальную активность липосом, или эти два про цесса между собой не связаны. Поэтому была проведена дополнительна серия экспериментов для определения роли продуктов перекисног окисления липосомалького ФХ в зарегистрированном антибактериально эффекте липосом на мультиламеллярных липосомах из ФХ, лредЕаритель но подвергнутого различной степени окисленности.

Исследования показали, что антибактериальное действие окислен-к липосом проявляется уже через 1 час инкубации значительным ени-шисм количества жизнеспособных клеток в суспензии. Через 3 часа гмечено полное отсутствий роста для обеих исследуемых культур, ¿енывекие содержания продуктов ПОЛ в суспензии липосом значительно зменяло динамику роста бактериальных культур. Так, в' суспензиях зокисленных и среднеокиеленных липосом только через 6 часов шжу-ащш достоверно снизилось количество жизнеспособных клеток. Прод-ение инкубации до 24 часов достоверно не изменило количество кде-ок Ps. aeruginosa, в то же время для культуры S. aureus отмечено :олное отсутствие роста.

Таким образом, пг,обеденные исследования показали, что в меха-гизмэ бактерицидного действия штосом супественная роль принадлежит ;ействию продуктов перпкисного озелени" лилзссмальных ичшдов, с ювьшзчием уровня которого бактерицидная активность липосомальной :успензии увеличивается.

Дниаиика гяболи исследуемых бактерналышх культур под действием ллдосом различной кппцептрации. После того, как были определены некоторые параметры для стан дартизации суспензии липосом, было проведено^ изучение динамики гибели культур Ps. aeruginosa и S. aureus под действием лгагасомальных суспензий различной концентрации (25.0; 12.5; 6.2; 3.1; 1.5; 0.8; 0.4; 0.2 И 0.0 мг /мл). На основании полученных данных были выбраны следующие парамэтры липосомальной суспензии: рН 4. 8+-0.12, МЛА 51.7 - 75.7 нмоль/мл.

Показано, что скорость гибели бактериальных клеток зависит от концентрации липосомальной суспензии. При этом культура S. aureus проявилз большую чувствительность к действию липосомальной суспензии, так как для нее бактерицидной оказалась суспензия липосом в концентрации 0.8 мг/мл, тогда как для культуры Ps. aeruginosa -1.6

мг/мл. В то же время, в целом картина гибели исследуемых культур; отнлсяпзжсл к двум различным группам бактерий, при выбранных параметрах лппосом имеет сходный характер, что позволяет сделать предположение об эффективности использования липосомальной суспензи г,ля воздействия на различные условно патогенные виды возбудителе! раневой итк'кшш.

11:>учу чио влияния лшюсои па яцгсанн б.чптерш? к эукарноп чоскьц кдогггаи. Одним из осноеных Факторов. определяющих течение микрооко загрязненных ран, является выраженность первой Сазы инфекционного процесса, т. е. адгезии и колонизации бактерий в тканях раны. Поэтому воздействие на этот начальный этап инфекционного процесса может явиться существенным Фактором для профилактики развития раневой инфекции. Исследования показали, что независимо, от вида используемых бактерий и клеточных линий эукариот наибольсее количество баетериальных клеток адсорбировалось из контрольных суспензий. Адгезия из лгаоесмальнс-Оагаериальнь.'х суспензий осуществлялась не столь интенсивно и пр.: этом носила ярко выраженный дозозависишЯ характер (Табл.1). В среднем для используемых видов бшстсриальных и эукаристических ыетск степень адгезии бактерий по сравнению с контрольной группой составила: при концентрации липосом 25.0 мг/ш - 322, при минимальной используемой концентрации 0. 025 мг/мл - 632 (Р<0.001). 'Азжно предположить, что сорбированные на клетках липосо-мы созлага барьер между адгеэинами бактериальной и рецепторами эу-кариоткческой клэток, что значительно умонмпаэт процесс адгезии.

этот э'м.якг нырялу с щ'яжы счктерицнлниъ! дрйстепйм липосом мойгт

оказать суЕ5ств;ин:е влияние па рагвити« раневсй микрофлоры в условиях целостного оргагшгич.

Тачим обр-ток. г.гог.2зе!:нни исегс-лснакч.ч что суспен-

зия /.клоссм I; янгиРиториья и су^;:ш-к'5;:тоГ'ЛЬ1Х концентрациях обладает

TaQjL 1.

- 17 -

Урогеиь адгезии клеток Staphylococcus aureus к эукариотичаским клеткам линии НЕр-2

жцектрацкя n М ш ПК2 ЫН % к конт- PI F2 иг/ил (ИА) ролю

0.0 (К) 160 15.4

0.025 129 б. 73

0.25 115 б. 66

2.5 150 4.59

25 165 4.03

0.734 89 1370. б

0.427 70 471.1

0.483 66 386.8

0.361 58 266.2

0.323 64 261.1

43.7 <0.001

38. 3 <0. 001 >0. 05

30. О <0. 001 <0. 05

26.7 <0.001 >0.05

1 - достоверность различий по сравнению с контрольной серией

2 - достоверность различий по сравнению с кредыдлией кснцгатрацизй

нтиадтезивным действием. При этом аффективными ока&адись концент-ации липоссмальной суспензии в 125-250 раз ни.те ба1стерпц;'.дкых, что овпадает с литературными данными по изучению антиадгезивного ействия субингибиторных концентраций других антибактериальных пре-аратов, в частности,.антибиотиков (J.-F.Desnoffes,1989; D.M.Schiff erll, Е. Н. Beachay,1988). Кром? того, показано, что зарегистриро-анный эффект не косит специфический характер ни по отношению к актериальным культурам, ни по отношению к зукариотическим клепсзм.

Иаучепмз аяткОшгтс риала во го дейстшш липисситльпоа cyciwu~ гии у килотпих с сгисстрслыюй юной ияг:апс тканой. Возможность фактического использования липосом как антибакте ризльного проплата предполагает подтверждение зарегистрированного in vitro бакте-,;:цидного и антиадгезивного эффектов суспензии липосом при введении !в в организм. Ранее а исследованиях, проведенных в нашей лзбсрчто-

рии, был реезн вопрос о способе введения препарата для его напра ленного транспорта к очагу травматического повреждения. Показа] Г. И tip hp р с соаят. ,1938), что такой транспорт оптимально осушес ьлн^тся при подкойлсм продении липосом дистальнее раны. При эк нзриод полувиведения препарата составляет 4-6 суток.

Эксперименты, проведенные in vivo, подтвердили данные стенд вш: опытов. Если у животных с огнестрельной травмой С контроль н; группа) на протяжении всего периода наблюдения колебания числе: иости микроорганизмов, контаминирутспих рану, находились в предел; от 4. 55f-0.30 log кл/г до 7. Б1+-0. 31 log кл/г, то у животных пос, однократного введения липосом (опытная группа) колебания составля, 1.04+-0, 73 - 5. 48+-0.71 leg кл/г (Рис. 1). При этом на протяжен: всего периода наблюдения во всех исследуемых образцах тканей знач' кия численности микроорганизмов в тканях у животных опытной груп: Оыли достоверно л;-:«;, чем у язгаотних контрольной группа Причем отлхчи-э от опытных животных у последних этот показатель практичес: всегда презыгал (фити^ский уровень, что явилось следствием про: pocciipi.xrLvro размножения бактериальных клеток в тканях с актив протекает»»! процессами тглпоеого распада (Ы. И. Кузин, Б. И. Костюч HOK.lSül). Б то же срока у тазотных, которым были введены липосом микрсСнзл c5cev.e.'.:i:iüiocTb достигала критического уровня однократно только в тиглях, нэпесрегстЕекко прилегавших к раневому каналу.

S обеих группах тавотных ¡¿аксиматну<? значения численное бактерий на всей исследуемой глубину тканей нпСл«дались .ча 3 сут после ранения, т.е. в период максимальных клинических проявлений Сшы раневого процесса. Но если у опытных жгвотных в дальнэйш происходило подавление локального воспалительного процесса, сопр вождающаеся значительным уменьшением микробной обсемеиеняости, то животных контрольной группы максимальные клинические проявлен

ст\

-г^ 111М1Т 1ЧПТ I 1 М »4

ВРЕМЯ (сутеи)

--4

Г----::

6 3 4 1

ВРЕМЯ (сутки)

Рис. 2. Динамика микробной обсемененности тканей огнестрельной раны на различном удалении от раневого канала у животных контрольной (А) и опытной (Б) групп (1 - 0.0-0.5 см, 2-0.5-1.0 см, 3 - 1.0-1.5 см, 4 - 1.5-2.0 см, 5 - критический уровень).

эйного воспаления наблюдались в период с 6 по 9 сутки после ране-I, когда отмечалось сохранение высокой численности высеваемых <роорганиамов и их значительная распространенность в ткани к пе-¡>ерии от раневого канала. Последнее было показано при изучении [юграфичеекой распространенности бактерий в тканях огнестрельной ны. Показано, что у животных обеих групп по мере удаления ог ра-вого канала происходит прогрессивное снижение численности бакте-й- Но если у контрольных животных наблюдалось постепенное сниже-

2

- '¿и -

низ обсемененности тканей, то у животных после введения липе изменения в степени обсемененности различных слоев тканей были лее резкими. Так, если через 1 сутки после нанесения травмы у вотных контрольной группы наблюдалось незначительное снижение щ бактерий, и на расстоянии 2. О см этот показатель только на ЗС бил ниже, чем на поверхности раневого канала, то у животных опьп группы уже на расстоянии 1.0 см от раневого канала отмечено сш ние уровня обсемененности на 43. 4Z, а на расстоянии 2.0 см -74. 9Z. В динамике характер распространенности бактерий по nanpaj нии к здоровым тканям остался прежним, и к концу периода наблюд« разница в количестве бактерий в тканях, удаленных от раневого кг ла на расстояние 2.0 см, в сравнении с поверхностными тканями у вотных опытной группы составила 44.02, в то время как у контрол! животных - 23.37..

Принимая во внимание идентичность травмы у обеих групп rai ных и значительное накопление липосом в патологически измене! тканях уже через 1 час после их введения, выявленные качественш количественные отличия, зарегистрированные при микробиологичес исследованиях раневой микрофлоры у животных контрольной и опьп групп, а также менее выраженный процесс гнойного воспаления в oi ной группе можно связать только с действием вводимого препар; Существенное значение в полученном эффекте могут иметь показанш экспериментах in vitro бактерицидное и антиадгезивное действия посом.

Таким образом, проведенное исследование на животных с огн< рельной раной подтвердило результаты модельных эксперимент Использованный препарат липосом после однократного подкожного i дения оказывает выраженный антибактериальный эффект, что выража< не только снижением численности бактерий, контаминирующих ткани

ы, но и уменьшением распространенности микроорганизмов it периферии г раневого канала.

выводи

1. Суспензия фос гэтидилхолин-холестериновых лшосом облздает грямым бактерицидным действием по отношению ко всем исследованным 'словно патогенным и патогенным микроорганизмам в дозах 1.5-3.2 мг/ а и выше. Чувствительность к действию препарата убывает в ряду: ïalmonella entlridltis, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, 'SGudcmonos aeruginosa и Escherichia coll.

2. Бактерицидная активность препарата определяется не только эго молекулярным составом, но и обусловлена наличием везикулярной зтруктурц используемых липицов, при отсутствии которой эффективность препарата снижается в 4 - 16 раз.

3. Бактерицидная активность лшосомзльной суспензии зависит от ее рН и содержания продуктов ПОЛ. Оптимальными параметра),« липосомальной суспензии являются р'й 4. 8+-0.12, уровень МДА G1.70+-2. 34 нмоль /мл - 75.7Е5+-7.03 нмоль/мл. При этих условиях ЫПК препарата составляет для Staphylococcus aureus - 0.8 мг/мл, для Psaudononos aeruginosa - 1,6 иг/щ

4. Суспензия липосом в концентрациях в а 2-32.0 раз ниже инги-биторных обладает антиадгезивным действием по отношению к эукарио-тическим клеткам.

5. Введение суспензии фосфатидилхолин-холестериновых липосом с заданными параметрами подкожно животным дистальнео огнестрельной раны в дозе 25 мг/мл/кг приводит к снижению уровня обсемененнооти раны и инвазивности бактерий вглубь тканей раневого канала.

- 22 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕ№ ДИССЕРТАЦИИ

1. Противовоспалительные эффекты липосом/ Е II Крейнее, Е М. льникова, Я. М. Марголин и др. // Вести. Акад. мед. наук СССР. - 199 М 6.- С. 44-47.

2. Мельянцева Л. И , Крейнее К , Лагунова Н. Т. Эксперик тальное обоснование и эффективность антибактериальной терапии нестрельных ран с помощью препарата "липоран"/ Всесоюзная юбилей научная конференция, посвященная 180-летию со дня рождения ЕИ. рогова и 150-летию начала его научной и педагогической деятельно в Медика-хирургической академии России, 19-21 февраля 1991: 1 докл. - Л. , 1990, С. 34-36.

3. Крейнее Е М., Ыарголин Я. М., Мельянцева Л. П. Примене "липорана" при отсроченной первичной хирургической обработке нестрельных ран / Всесоюзная юбилейная научная конференция, пос щенная 180-летию со дня рождения К И. Пирогова и 150-летию на' его научной и педагогической деятельности в Медико-хирургичес академии России, 19-21 февраля 1991: Тез. докл. - Л. , 1990, С. 894. Использование липосом с ингибиторами фосфолипаз для леч<

огнестрельных ран/ Ю. Г. Шапошников, Я. М. Марголин, Е М. Крейнее и // ХХП пленум правления Всесоюзного научного общества травматож -ортопедов, 27-29 июня 1991: Тез. докл.: Иркутск, 1991, с. 112-:

5. Мельянцева Л. П., Крэйнес Е М. Антибактериальная актива липосом // Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфек Всесоюзн. конф., 22-24 октября 1991: Тез. докл. ,М.-1991.-Ч. 4. - С -433.

6. Мельянцева Л П. Влияние липосомальной суспензии на мик нуг обсеменэнность травматически поврежденных мягких тканей. // филактика и лечение ранеЕой ;га&;кции у травматолого-ортопедиче больных.- М.: Изд-во Щ'Л'О. 1991.- С. 33-36.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Мельянцева, Лариса Петровна

- 107-ВЫВОДЫ

1. Суспензия фосфатидилхолин-холестериновых липосом обладает прямым бактерицидным действием по отношению ко всем исследованным условно патогенным и патогенным микроорганизмам в дозах 1.5-3.2 мг/ мл и выше. Чувствительность к действию препарата убывает в ряду: Salmonella entiriditis, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonos aeruginosa и Escherichia coli.

2. Бактерицидная активность препарата определяется не только его молекулярным составом, но и обусловлена наличием везикулярной структуры используемых липидов, при отсутствии которой эффективность препарата снижается в 4 - 16 раз.

3. Бактерицидная активность липосомальной суспензии зависит от ее рН и содержания продуктов ПОЛ. Оптимальными параметрами липосомальной суспензии являются рН 4.8+-0.12, уровень Щк 51.70+-2.34 нмоль /мл - 75. 75+-7. 03 нмоль/мл. При этих условиях МПК препарата составляет для Staphylococcus aureus -0.8 мг/мл, для Pseudomonos aeruginosa - 1.6 мг/мл.

4. Суспензия липосом в концентрациях в 125 - 250 раз ниже ин-гибиторных обладает антиадгезивным действием по отношению к эукари-отическим клеткам.

5. Введение суспензии фосфатидилхолин-холестериновых липосом с заданными параметрами подкожно животным дистальнее огнестрельной раны в дозе 25 мг/мл/кг приводит к снижению уровня обсемененности раны и инвазивноети бактерий вглубь тканей раневого канала.

Автор благодарит научных руководителей работы Заслуженного деятеля науки РСФСР, профессора Е М. Мельникову и Заслуженного деятеля науки РСФСР, профессора Т. И. Щраера, выражает искреннюю благодарность за творческую помощь д. м. н. В. М. Крейнееу, а также Н. Т. Лагунову, Я М. Марголина, И. М. Устьянцеву, R Г. Булгакова и Е. М. Еропкину за большую техническую помощь при подготовке материалов диссертации.

- 96 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из перспективных направлений в современной медицине является использование липосомальной формы лекарственных препаратов и самих липосом для лечения целого ряда заболеваний (А. В. Стефанов с соавт. ,1980, 1984; М. А. Владимирский с соавт. ,1981; В. IL Торчилин с соавт. , 1982; G. Gregoriadis, 1973 и др.). Выявленный авторами терапевтический эффект липосом основан на их способности встраиваться в цитоплазматическуго мембрану эукариотических клеток или обмениваться с ними лйпиднымй компонентами. Можно предположить, что подобный эффект может проявляться и при взаимодействии липосом с бактериальными клетками. Однако наличие на поверхности бактерий клеточной стенки является препятствием для непосредственного контакта между липосомальной и цитоплавматической мембранами. Поэтому вопрос о том. оказывают ли липосомы на бактериальную клетку столь же положительный эффект вследствие модификации клеточной мембраны оставался нерешенным, Тем не менее отсутствие непосредственного контакта между липосомальной и бактериальной цитоплавматической мембранами не исключает возможности воздействия липосом на другие поверхностные структуры бактерий. Кроме того, влияние на функциональную активность бактериальной клетки могут оказывать продукты биодеградации липосомальных липидов. В связи с этим изучение возможности влияния липосомальной суспензии на жизнеспособность бактериальной клетки может иметь как научный интерес, так и значимость для практического здравоохранения. Решение этих вопросов к явилось предметом нашего исследования.

Проведенные исследования впервые позволили установить, что пустые липосомы из фосфатидилхолина и холестерина в молярном соотношении 7: 5 обладают прямым бактерицидным действием на культуры условно патогенных и патогенных микроорганизмов. При этом степень чувствительности бактерий к действию препарата зависит от их видо nn> „

О I вой принадлежат Б результате проведенных исследований была определена минимальная подавляющая концентрация липосом для изучаемых штаммов бактерий, которая черев 24 часа инкубации составила для Pseudoronos aeruginosa и Escherichia ooli - 6.2 мг/мл, для Staphylococcus aureus и Proteus mirabilis - 3.1 мг/мл и для SaliTionella enter! tidis - 1. 5 мг/мл. Продление сроков инкубации до 48 и 72 часов позволило еще более снизить ингибирувдие концентрации препарата. Таким образом, выраженность зарегистрированного бактерицидного эффекта липосом находится в прямой зависимости от дозы использованного препарата и времени его воздействия на микроорганизмы. Присутствие: в среде инкубации компонентов биологических жидкостей снижает активность суспензии липосом, которая сохраняется для S. aureus при увеличении концентрации до 6.2 мг/мл, для гра-мотрицательных палочек - до 25.0 мг/мл и времени инкубации до двух суток. Снижение бактерицидной активности липосом может явиться и-ледст] дуктах их деградации (G. Weismann et all. ,1977; D. Hoekstra, G. Scherphof,1979), что приводит к увеличению проницаемости липосом, и, вследствие этого, их разрушению (Т. М. Allen,1981). i с&п. гиЬгП. «иЛиииитЕ» ии^ДЬ ± aojaisj± uuuwja wtdwtfariwe i-, ± у у гьж g ynUs* Uwpc& зование, выявленная способность липосом подавлять рост бактерий может быть обусловлена как свойствами их структурных компонентов, так и упорядоченной структурой липидных молекул в составе липосомальной мембраны. Поэтому для решения вопроса о механизме антибактериального действия липосом важным этапом явилось определение влияния на этот процесс структурной организации микровезикул. Для этого изучали влияние на жизнеспособность бактериальной клетки исходных ингредиентов липосом в нелипосомальной форме. В результате проведенной работы выявлено, что в генезе бактерицидного действия отготт-твием сорбции везикул на белковых компонентах плазмы и про no su липосом существенное значение принадлежит упорядоченной бислойной структуре липосомальных везикул, так как использование липидов того ш состава в мицеллярной форме бактерицидного эффекта на исследуемые культуры практически не оказывает. Таким образом, проведенные исследования показали, что суспензия липосом может быть использована для подавления роста микроорганизмов.

Известно, что активность, многих веществ, в том числе и лекарственных, в большой степени зависит от физико-химических характеристик как самого препарата, так и условий внешней среды. В связи с этим для эффективного воздействия липосом на жизнедеятельность бактериальной клетки важным вопросом явилось изучение параметров, влияющих на бактерицидную активность липосом, и определение их оптимальных значений. Данные литературы свидетельствуют о зависимости физико-химических свойств липосомальной суспензии от величины рН (A. JL Клибанов с соавт. ,1990; S. Tftoml inson et al. ,1989) и содержания в ней продуктов ПОЛ (КХ А. Владимиров, 1989; 0. Cantoni et al. ,1989; Th. A. Dahl et al. Д989; M. A. Nesmeyanova, XL V. Bogdanov, 1989). Поэтому для решения вопроса о возможности использования липосом в качестве антибактериального средства важной задачей явилось изучение и оптимизация этих показателей в липосомальной суспензии, а также стандартизация получаемых липосом по величине рН и уровню липидной пероксидации.

В результате проведенных исследований установлено, что антибактериальная активность суспензии липосом имеет обратную зависимость от ее рЕ При этом чувствительность культуры Ps. aeruginosa к действию препарата уменьшается с увеличением рН, и при значениях рН < 6 антибактериальный эффект липосом не проявляется. Для культуры S. aureus эффект отмечен при всех исследуемых значениях рН, хотя в кислой среде бактерицидная активность липосом проявляется на более раннних сроках. Такие различия в активности липосомальной суспензии по отношению к представителям грамположительной и грамот рицательной флоры могут быть связаны с характером строения их клеточной стенки. В случае грамположительных бактерий непосредственный контакт липосомальной и цитоплазматической мембраны невозможен из-за наличия клеточной стенки, и воздействие липосом на клетку может носить лишь опосредованный характер, осуществляясь либо за счет сорбции липосом на поверхностных структурах бактериальной клетки (В. И. Карамушка с соавт., 1987), либо за счет обмена отдельными липидными компонентами (L. I.Barsukov et al. ,1976), либо пп пттагп n ^TmtjTjrrr тАтя"пт»тттттпг гтплтгггт^тлг» Лгттглт?п*эт?пттг*г* wrmnnAim ттх. гттгчг ОС% ЬЧС1 JоЛжШПМШ А иXIЧп£3iA rbXSJG SJlfLUMtbl родеЩШгх ^шии^ишсушдЫА липидов СЮ. А. Владимиров, А. И. Арчаков,1972).

При взаимодействии липосом с грамотрицательными бактериями по мимо перечисленных механизмов может происходить непосредственное слияние липосом с внешней мембраной бактериальной клетки (S. Thomlinson et al.,1989). В этом случае липосомы, за счет модификации липидного бислоя мембран, могут выполнять свою защитную функцию, и на некоторое время предохранять бактериальную клетку от разрушения, с чем, вероятно, и связаны более длительные сроки гибели Ps. aeruginosa под действием липосомальной суспензии с кислыми значениями рН. Так как процесс слияния липосомальной и клеточной мембран наиболее активно осуществляется при нейтральных значениях рН (S. Thomlinson et al. ,1989), этим можно объяснить тот факт, что при рН > 6 липосомы бактерицидного влияния на клетки грамотрица-тельных бактерий не оказывают. Кроме того, при рН >= 8 происходит увеличение количества бактерий в суспензии, что может быть связано с расищплением липосомальных липидов бактериальными ферментами (фосфолипаза С, щелочная фосфатаеа и др.} (А. Ф. Мороз, 1988) с последующим использованием продуктов их деградации в качестве : источ

- 100 кика питании.

Как известно, в присутствии кислорода фосфолипидные компоненты искусственных и биологических мембран подвержены процессу перекис ного окисления (Ю. А. Владимиров, А, И. Арчаков, 1972}, в результате чего происходит деформация мембранного лнпопротеинового комплекса, il4J.D ЕИШСЮ -L ИриАмЦоЬшии JL JJ WIOIWUpOJl ЦМЛ WpVjiUnUXS вида», иУДСкЙЛЯС: iUJl активность мембраносвязакных ферментов, нарушается целостность мембранного бислоя, что в итоге приводит к цитолизу и гибели клетки. В связи с этим, функциональная активность бактериальных клеток во многом определяется содержанием в их мембране и во внешней среде первичных и вторичных продуктов ИОД (Г, Готтшалк,1982; 0. Cantoni et al. ,1989; Th. A. Dahl, 1989). Поэтому воздействие на бактериальную клетку продуктов пероксидации липосомальных липидов может оказать значительное влияние на жизнеспособность бактериальной клетки.

В результате проведенных исследований показано, что в процессе инкубации как липосомальной, так и липосомально-бактериальных суспензий происходит накопление в них продуктов перекиеного окисления липидов. При этом содержание ЩА в них к концу периода наблюдения увеличивается прямопрспорционально значению рН липосомальной суспензии. Таким образом, б результате совместной инкубации wetn,±opjujri >ШгшиЬимсышпи1а и^ип^линш na,n.uiuicnjric; хз srmrvj бационной среде продуктов ПОЛ и гибель бактериальных клеток. Доказательством тому, что накопление продуктов липидной пероксидации играет существенную роль в механизмах 'гибели бактерий, явились результаты эксперимента, в котором для инкубации с бактериями использовали липосомы различной степени окисленности. В работе впервые показано, что содержание продуктов ПОЛ в липосомальной суспензии оказывает существенное влияние на выраженность бактерицидного действия липосом. В то же время, этот эффект не косит прянепропорциональной зависимости. Так, повышение уровня ЩА липосо-мальных суспензий с 31.53+-3.12 нмоль/мл до 42.17 +-3. 86 нмоль/мл не вносит достоверных изменений в характер роста бактериальных культур, и лишь высокая степень окисленности суспензии (67.75 +-5.18 нмоль/мл и более) вызывает выраженное увеличение антибактериальной активности липосом.

Как и при воздействии кислых продуктов среды, влияние продуктов ПОЛ на жизнеспособность бактериальной клетки оказалось более выраженным по отношению к грамотрицательным бактериям. Вероятно, большая устойчивость культуры Ps. aeruginosa к используемым липосо-мам по сравнению с S. aureus связана с различной активностью у этих культур ферментативных систем, как принимающих участие в метаболизме перекисей липидов {цитохромы, каталаза, глутатионпероксидач, m тг1 тх тхгтптх&7хг\*пг\тчггггг «чтгмтг ттгкптталл i шг-,-л:-Ь/~ч т-iг\ тт г-lтл.^.тг-Т'П'г~,;Т*Cf •— oaf , хan, mi пах пипууаяЩгих oiui имУЦсии i. xurbi-'yfcMWJi, aA-mjyUiuriUoem лйъ лота, глутатион, НАДФ) {Г. Готтшалк, 1982; С. Н. Голиков с соавт., 1986). Поскольку у клеток Ps. aeruginosa система антиоксидантной защиты, противодействующая развитию свободнорадикаяьного окисления, развита в большей степени, это позволяет ей более активно противодействовать токсическому воздействию продуктов ПОЛ.

Выявленные различия антибактериальной активности липосом по отношению к различным группам бактерий в зависимости от величины рН и уровня продуктов ПОЛ могут позволить конструировать липосомы с заранее заданными свойствами. Благодаря изменению в суспензии липосом этих параметров появляется возможность моноспецифического антибактериального воздействия на определенные группы микроорганизмов.

Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что гибель бактериальных клеток наступает вследствие токсического воздействия на них продуктов липидной пероксидации.

Наиболее активно этот процесс происходит в кислой среде. Установлены оптимальные параметры липосомальной суспензии, при которых ее воздействие на различные типы бактериальных клеток наиболее выражено: рН 4. 8+-0.12, ЦДЛ 51. 7G+-75. 75 нмоль/мл.

Помимо воздействия на бактерии продуктов деградации липосо-мальных^липидов, липосомально-бактериальные взаимодействия могут осуществляться вследствие сорбции везикул на поверхностных структурах бактериальной клетки (ВЛ1 Карамушка с соавт,,1987; L. I. Barsukov et al. , 1976). Такое взаимодействие может привести к изменению свойств бактериальной клетки, обусловленных активностью этих структур, в том числе оказать влияние на механизм адгезии бактерий к клеткам макроорганизма, активность которого определяется многими специфическими функциями клеточной поверхности {Д. Г. Звягинцев, а С, Гузев ,1971; А. Ф. Перцовская, 1971}. Изучение изменений адгезивной способности бактериальных клеток под действием липосом проводилось нами in vitro на примере адгезии S. aureus и Ps. aeruginosa к монослоям эукариотических клеток линий НЕр-2, HeLa и иммортализованным аетроцитам спинного ганглия. Проведенные исследования впервые показали, что суспензия липосом в ингибитор-ных и субингибиторных концентрациях обладает антиадгезивным действием, что проявляется в снижении уровня сорбции бактерий на поверхности эукариотических клеток на 28.2 - 79.8Z по сравнению с контрольными суспензиями. Полученные данные показали, что антиадгезивное действие липосом носит неспецифический характер как по отношению к бактериальным культурам, так и к различным линиям эукариотических клеток. Вероятно, снижение сорбционной активности бактериальных клеток происходит благодаря создаваемому липосомами механическому барьеру между адгезинами бактериальной и рецепторами эукариотической клеток, так как липосомы могут сорбироваться на

- 103 поверхностных образованиях как про-, так и эукариот (JL Б. Марголис, Л. Д. Бергельсон, 1986; А. С. Allison, P. David, 1975).

Проведенные in vitro исследования позволили предположить, что л*ттглтгптт Ann^nrnwirrj-TrwA mm-vn т^птлттлтз? w ттлпАи л «пттттт тггт/г Аиптж» u^Uiicncj&n. фиицга & лОлс w I fepyinuiDoui. ^шниииж и о саДсах1П£ЭШ1*1 ко -химическими параметрами может быть использована в качестве лекарственного препарата для лечения инфекционных заболеваний, вызванных условно патогенной флорой. Возможность практического использования липосом в качестве антибактериального средства предполагает подтвеждение зарегистрированных in vitro бактерицидного и антиадгезивного аффектов препарата при введении его в организм, поскольку взаимодействие липосом с биологически активными компонентами крови и тканей может значительно изменить их свойства (G. Weismann et all., 1977; Т. М. Allen, 1981) и нивелировать эффект, зарегистрированный в опытах in vitro.

Исследования in vivo были проведены на кроликах с моделью огнестрельной раны мягких тканей бедра. Помимо оценки общей микробной обсемененности тканей раневого канала и выявления качественного состава раневой микрофлоры была проведена топографическая оценка распространенности микроорганизмов в мягких тканях к периферии от раневого канала. Эксперименты на животных подтвердили высокую антибактериальную активность исследуемого препарата. На протяжении всего периода наблюдения (первая и вторая фазы раневого процесса) обсемененность всех исследуемых тканей к периферии от раневого канала у животных, которым в течение 1 часа после нанесения травмы была введена.суспензия липосом, была достоверно ниже, чем у животных контрольной группы. При этом если у животных контрольной группы обсемененность всех исследованных тканей Ьгнест-рельной раны превысила критический уровень уже через 1 сутки после травмы, то у животных опытной группы микробная обсемененность дос

- 104 тигала критического уровня только на 3 сутки после травмы (в период максимального развития воспалительного процесса) и только в тканях, непосредственно прилежащих к раневому каналу. Антибактериальное действие суспензии липосом проявлялось не только в уменьшении уровня обсемененности тканей огнестрельной раны, но и в снижении уровня инвазивности бактерий вглубь тканей. По сравнению с контрольной группой животных, количество бактерий в тканях, расположенных на различном расстоянии от раневого канала, у животных опытной группы было на 48.3-79.3% ниже. Хотя препарат животным вводили однократно, эффективность его действия сохранялась на протяжении всего периода наблюдения. Некоторое увеличение численности бактерий на 9 сутки у животных опытной группы, вероятно, связано с тем, что к этому сроку содержание препарата в тканях значительно снижается, так как период полувыведения липосом из тканевого депо составляет 4 - 6 суток (Т. И. Щраер с соавт., 1988).

Существенные отличия между животными обеих групп отмечены при анализе качественного состава раневой микрофлоры. Исследования показали, что состав микрофлоры ран у животных контрольной группы был более разнообразным, чем у животных опытной. Из ран животных контрольной группы преимущественно высевались ассоциации из 2-3 видов бактерий, в то время как в опытной группе в 30% высевались монокультуры. Кроме того, если общее число выделенных штаммов у контрольных животных достигало 8-8, то у животных опытной группы оно не превышало 2-5. При этом если из ран контрольных животных преимущественно высевались условно патогенные бактерии СS. aureus и представители кишечной группы.), то у опытных животных помимо S. aureus доминировали Micrococcus sp. и грамотрицательные нефер-ментирующие палочки. В процессе наблюдения отмечались изменения состава раневой микрофлоры. Если в начальный период из ран живот

- 105 ных обеих групп преимущественно высевались кожи, то начиная с 6 суток в ранах животных контрольной группы начала превалировать палочковая группа бактерий при доминирующей роли представителей кишечной флоры, Это согласуется с данными, полученными при изучении посттравматической инфекции у людей (А. М, Королюк с соавт. , 1989). У животных опытной группы изменение микробного пейзажа произошло на 3 суток позже (9 сутки) и было менее выражено. Вероятно, это связано с тем, что у этой группы животных процесс очищения раны от раневой микрофлоры осуществлялся более активно, чем у контрольных животных. Вследствие этого более интенсивно происходило заселение ран микрофлорой вивария.

Эксперименты на животных с моделью огнестрельной травмы мягких тканей подтвердили наличие выявленного в экспериментах in vitro антибактериального действия пустых фосфатидилхолин-холестериновых липосом. Использованный препарат после однократного подкожного введения оказывал выраженный антибактериальный эффект, который проявлялся как в снижении численности бактерий, контаминируюшях ткани раны, так и в уменьшении их распространенности к периферии от раневого канала. Полученный эффект может быть обусловлен показанными in vitro бактерицидным и антиадгезивным действием липосом. Кроме того, существенное улучшение клинической картины инфекционного процесса у животных опытной группы могло быть обусловлено сорбцией на липосомальных мембранах целого ряда микробных токсинов (W. В. Van Heyningent1971), а также продуктов эндогенной интоксикации (А. В. Стефанов с соавт., 1984).

Таким образом, проведенные исследования показали, что однократное подкожное введение суспензии фосфатидилхолин-холестериновых липосом с заданными физико-химическими параметрами может быть использовано для профилактики раннего нагноения микробно загрязнен

- 106 яых ран. Для подтверждения эффективности препарата у больных с микробно загрязненными ранами необходимо дальнейшие его клинические изучение, что является задачей нашего дальнейшего исследования. С этой целью данные о специфическом действии препарата и его токсикологические характеристики представлены в Фармакологический комитет и получено разрешение на проведение первой фазы его клинических испытаний.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мельянцева, Лариса Петровна, Москва

1. Акатов А. К } Зуева В. С. Стафилококки. М.: Медицина, 1983. -256 С.

2. Александер Дж. , Гуд Р. А. Иммунологиядля хирургов. М.: Медицина, 1974.- 191 С.

3. Афиногенов Г. Е. , Блинов Е П. Антисептики в хирургии. Л.: Шдицина, 1987. - 144 С.

4. Бабаян 3. А. , Лепахин В. К. , Руденко Г. М. и др. Руководящие методические материалы по экспериментальному и клиническому изучению лекарственных средств; -М. ,1986. -С. 53-66.

5. Безбородов А. М. Биохимические основы микробиологического синтеза. М.: Легкая и пищевая пром-ть, 1984. - 304 С.

6. Безрукова А. Г. Спектроскопические методы исследования параметров липосом. // Направленный транспорт и иммобилизация биологически активных препаратов для клинической практики: Науч. конф:, Киев, 20-21 апреля 1984: Тез. докл. Киев, 1984. - С. 4.

7. Липосомальные лекарственные формы полиеновых антибиотиков / И. Б. Белявская, Б. С. Грязнова, Р. М. Петюшенко и др. // Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций: Всее. конф. , 22-24 октября, 1991: Тез. докл. М, 1981. - 4.1. - С. 59.

8. Беляков В. Д., Ряпис Л. А., Илюхин В. И. Псевдомонады и псев-домонадозы. М.: Шдицина, 1990. - 224 С, '

9. Березовская Л. Н. Проблемы создания липоеомальных лекарственных форм антибиотиков. // Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций: Есес. конф., 22-24 октября, 1991: Тез. докл. М, 1991. - 4.1. - С. 63-64.

10. Биргер М. О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М.: Шдицина, 1973. - 456 С»

11. Бородин Е. А., Арчаков А. й. Стабилизация и реактивация ци-тохрома Р-450 фосфатидилхолином при перекисном окислении липидов.//- 109;

12. Биол. мембраны. 1987. - т. 4. - N7. - С. 719-728.

13. Бертиев Ю. В. , Бродинова Н. С. , Мороз А. Ф. Экзотоксин А Pseudomonas aeruginosa и его роль в патогенезе сикегнойной инфекции //Ж. микробиол. 5 эпидемиол. и иммунобиол. 1981. - N 2.- С. 13-19.

14. Вицин Б. А. Раны и их лечение. // Раны и неспецифическая гнойная хирургйчбскй.я инфекция. ~ Новосибирск: Наука, 1S7S. С. 8-17.

15. Владимиров К). А. , Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М. , 1972. - 252 С.

16. Владимиров К). А. Роль нарушения липидного слоя мембран в развитии патологичееких процессов. // Пат. физиол. експер. терапия. -1989. N 4. - С. 7-18.

17. Воденников Н. А. Кислотно-щелочное равновесие чистых и гнойных ран при гнойных воспалительных процессах. // Вестн. хир. -1950. Т. 70. - N 4. - С. 28-32.

18. Войно-Ясенецкий М. В. Биология и патология инфекционных процессов/АМН СССР. Л.: Медицина, 1981. - 208 С.

19. Воскресенский 0. Е , Левицкий А. П. Перекиси липидов в живом организме.// Вопр. мед. химии. 1970. - Т. 16. - вып. 6. - С. 563-583.

20. Говалло А. И. , Рычков Ю. Г. Физиологическая генетика .человека в проблеме заживления ран. Рецензия.// Хирургия. 1987.- Н !.-С. 116.

21. Гамалея И. Г. , Стручков Ю. В., Хохлов А. Е Структура микрофлоры гнойных ран и частота вторичного их инфицирования. //Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике: Всес. кокф. , Tes, докл. М, 1983. - С. 39-40.- 110

22. Голиков 0. Е , Саноцкий И. В., . Тиунов Л. А. Общие механизмы токсического действия/АМН СССР. Л.: Медицина - 1986. - 280 С.

23. Гончар А. К } Коган А. С. , Салганик Р, И. Раневой процесс и иммобилизованные протеолитические ферменты.- Новосибирск: Наука, 1986. 120 С.

24. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. М.: Мир, 1982. - 310 С.

25. Грачева Е М., Щетинина И. Е Клиническая химиотерапия при инфекционных болезнях. JL: Медицина, 1980. - 248 С.

26. Грегориадие Г., Аллиеон А. Липосомы в биологических системах. М.: Медицина, 1983. - 384 С.

27. Трансмембранный транспорт липидов между лецитиновыми липо-еомами и клетками нейрабластами С 1300 RL8. / ЕМ. Гулая, Г. М.Волков, Е Е Говсива и др. // Укр. биохим. ж. 1987. - Т. 59. - N 4. - С. 64-69.

28. Давыдовский И. В. Процесс заживления ран. Актовая речь 23 ноября 1949 г. - & ,1950. - 12 С.

29. Далин М. В., Фиш Е Г. Адгезины микроорганизмов. Итоги науки и техники. ВИНИТИ, Микробиология. - М,1985. - 110 С,

30. Даценко Б. М., Белов С. Г. , Тамм Т. И. Гнойная рана. Киев: Здоров'я, 1985.- 136 С.

31. Джавец Э. , Мельник Дж. Л. , Эйдельберг Э. А. Руководство по медицинской микробиологии. М.: Медицина, 1982. - Т. 1. - 368 С.

32. Джавец 3., Мельник Дж. JL , Эйдельберг 3. А. Руководство по медицинской микробиологии. М.: Медицина, 1982. - Т. 2. - 384 О.

33. Егоров Е С. Руководство к практическим занятиям по микро- ill биологии. -M.: Ивд-бо Московского университетаj 1983. 222 С.

34. Езепчук Ю. Б. Биомолекулярные основы патогенности. -М.: Наука, 1977. 215 С.

35. Езепчук Ю. В. Патогенность как функция биомолекул. -Е: Медицина, 1985.- 238 С.

36. Евепчук Ю. В. Функциональные критерии патогенности //Ж. микробиол. , эпидемиол. и иммунобиол. 1988. - N 5. - С. 113-116.

37. Блинов Н. Е Химическая микробиология. Е : Высшая школа,1989. 448 С.

38. Звягинцев Д. Г,, Гузев В. С. Концентрирование и разделение бактерий на анионите Дауэкс. //Ж. Микробиология. 1971. - Т. 40. - N 1. -С. 139-143.

39. Исполатовская ML В. , Шапошникова Г. М. Клеточные стенки бактерий// Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1973. - N 8. - С. 103 -108.

40. Кагава Я Биомембраны. М.: Высшая школа, 1975. - 303 С.- 42. Каплан А. В., Махеон Е Е., Мельникова В. М. Гнойная травматология костей и суставов. М.: Медицина, 1985. - 384 С.

41. Взаимодействие гликопротеида клеточной оболочки Bacillus ' pumilis с липоеомами/ Карамушка В, И. , Грузина Т. Г. , Подольская В. И.и др.// Укр. биохим. журн. 1987.- Т. 59. - N 1.- С. 70-75.

42. Биотинмлированные рН-чувствительные липосомы контейнер для направленной доставки биологически активных веществ к клеткам/ А. Л. Кливынов, А. А. Богданов, А, Е Лукьянов и др. //Вестн. АМН СССР.1990. N 8. - С. 50-53.

43. Колкер И.Й. Микрофлора гнойных ран, видовой состав и количественная характеристика. // Актуальные вопросы клинической микробиологии. Новосибирск: Наука, 1986. С. 11-17.

44. Костюкова R Н, Начальный этап инфекционного процесса колонизация и пути ее предотвращения. // Ж. микробиол. , эпидемиол. и иммунобиол. - 1989. - N 9.- С. 103-110.

45. Котик А. , Яначек К. мембранный транспорт. М.: Шр, 1980. -320 С.

46. Краткий определитель бактерий Берги /Под ред. Дж. Хоулта,1. , 1 t---- л £Г\г; лm. : wmp} j. sou, 4эи v.

47. Противовоспалительные эффекты липосом/В. М. Крайнее, В. Ы. Мельникова, Я, М. Шрголин и др. // Веотк, Акад. мед. наук СССР. 1S90.isт <77 п л л лгч1. П — У-', *±*±— *±Г .

48. Коррекция процессов переписного окисления липидов с помощью липосом. / В. М, Крейнес, Ю. Г, Шапошников, й. М. Устьянцева и др. // Экспериментальная травматология и ортопедия. М. , 1990.- С. 7- 10.

49. Кузин М. й., .Шимкевич JL JL Патогенез раневого процесса. // Рана и раневая инфекция. М.: Медицина, .1931.- СЛ 14-160.

50. Кузин М. И. , Костюченок Б. Е Раны и раневая инфекция. -М.: Медицина, 1981. 688 С.54, Кульберг А. Я. Рецепторы клеточных мембран. М.: Высшая школа, 1987. - 103 С.

51. Ланчини Д. , Паренти Ф. Антибиотики . -М.: Мир, 1985. 272 С.

52. Лебедь О. PL , Стефанов А. Б, , Примак ?. Г. Влияние условий ультразвуковой обработки на характеристики формирующихся липосом// Укр. биохим. журнал. 1989,- Т. 61. - N 3, С, 96-101.

53. Лишко В. К Современные подходы к моделированию биологических мембран. //Направленный 'транспорт и иммобилизация биологически активных препаратов для клинической практики. Киев, -1984. -С. 16-17,

54. Лыткин М. И. , Коеачев й. Д. , Пуни Ц. А. Некоторые вопросы гнойной инфекции огнестрельных рак, // Вестн. хир. 1S70. - Т. 105. - N1. А А л tf™\ А /~ч11 . ~ О- 1U.

55. Марголис Л. Б. } Бергельсон Л. Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М. - 1986. - 240 С.

56. Мельникова Б. М. Химиотерапия раневой инфекции в травматологии и ортопедии. М.: Медицина, 1975, - 224 С.

57. Мельникова Б. М. , Богомолова R С. , ймшенецкая В. Ф. Этиологическая структура гнойно-воспалительных процессов в хирургических клиниках. / Лаб. дело. 1984. - N 7. - С. 438-442.

58. Моров А. Ф., Анциферова Н. Г. , Баскакова R В, и др. Синег-нойная инфекция. -М.: Медицина, 1988. 256 С.

59. Мусил Я. Основы биохимии патологических процессов: пер. с чеш. М.: Медицина, 1S85. - 365 С.

60. Николаев В. Г. , Стрелко В. В. Гемосорбция на активированных углях. Киев.: Каукова думка, 1S79.- .288 С.

61. Перцовекая .4. Ф. Адсорбция (адгезия) микроорганизмов (влияние характера взаимодействующих поверхностей и определение силы адгезии) . Автореф. канд. дйес. М. - 1971.г

62. Першин Г. R Методы экспериментальной химиотерапии. М.: Медицина, 1971,- 539 С.

63. Петровская В. Г. Перспективы получения усовершенствованных- 114 средств профилактики инфекционных заболеваний// Ж. микробиол. , эпи-демиол. и иммунобиол. 1380. - N 5. - С. 51-69,

64. Полинг Г. , Полинг П. Химия. М. г Мир, 1978. - 582 С.

65. Ионов Г. А. , Гончаров II И. Включение рубомицина в многоелой ные липосомы. // Антибиотики. 1980. - N Б. - С. 367-340.

66. Попов А. М, » Лоенко КЗ. К. , Анмсимов М. М. Р'зменение чувствительности опухолевых клеток к действию тритерпеновых глюкозидов ли-шеомами. // Антибиотики. 1981.- N 3.- С. 127-129.

67. Попов И. К Роль цАЩ включенного в липосомы, в стабилизации мембран кардиомиоцитов при патологии сердечной мышцы. / /Дисс. канд. мед. наук. JL - 1S85. - 166 С.

68. Пращенков К. й. , Сахаров П. П. , Гудков S. И. Значение клини-кобактериологических и клинике-иммунологических параллелей в учении0 раневой инфекции. // Журн. микробиол. , эпидемиол. и иммунобиол. -1945.- Т. 7-3.-С. 4.

69. Бяткин К Д., Кривошеин Ю. С. Микробиология. М.:. Медицина,1 г-О" ем пlbои. Difi

70. Речменский С. С. К характеристике флоры ран. // Журн. микробиол. , эпидемиол. и иммунобиол. 1944. - Т. 9. - С. 70.

71. Ротов К А., Васильев В. П. , Антонов КЗ. В. Получение и характеристика липосом, содержащих антибиотики// Микробиол. журнал.ibos, ~ rt О. 1. - oi. - о.

72. Самеонова Т. М. Экологические и .биологические параллели при изучении стафилококков. // Инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами стафилококками и еинегнойной палочкой. -!vL , 1982. -С. 23-32.

73. Соринеон С.Е, Мирзаев КМ. Комплексная фармакотерапия при инфекционных заболеваниях. Ташкент: Медицина, 1987. - 365 С.

74. Стейнмер Р. , 3дельберг 3. , Ингрэм Дж. Мир микробов. М.: Мир, 1979. Т. 1. - 320 С.л

75. Стейниер Р. , Здельберг 3. , Ингрем Дж, Мир микробов. М.:a m о r^r^ fi г*,mni-ij J.Tift), ~ I „ iG. ~ V/.

76. Стефанов А. В. Использование липосом в медицине. //Мол. биоя. 1980,- Вып. 27. - С. 32-34.

77. Об особенностях действия норадреналина, заключенного в липосомы, ка системное артериальное давление. / Стефанов, А. В. , Гуревич

78. И. , Дмитриева A. R и др.// Фйбиол. журн. 1S80. - Т. XXVI. - Ы 1.- С.1 г т,т,

79. Страйер Л. Биохимия. М.: Мир. 1984.- Т. 1.- 232 С.

80. Страйер Л, Биохимия. М.: Мир, 1S85. - Т. 2. - 312 С.

81. Стручков В. Н. s Григорян В. К. , ГостищвБ В. К. Гнойная рака.- 116

82. Si. Ча&оь E. й. , Смирной В. Н. Стенка сосудов б атеро- и тромбо-генезе, М. , 1983, - С, 195-204.

83. Шапошников Ю, Г, , Решетников 5. А.' Профилактика и лечение инфицированных ран на этапах медицинской эвакуации. // Воен. -мед. зкурн. 1976. - С. 33-37.

84. Шапошников КЗ. Г. , Решетников Е. А. , Кондратьева И, Е. Профилактика и лечение гнойной инфекции ран. //Воен. -мед. «урн. 1978, -N 1. - С. 19-24.

85. Шапошников Ю. Г., Рудаков Б, Я. Оценка течения репаративных процессов в ранах, //Хирургия. 1984,- N4.- С. 11-13.

86. Особенности патогенеза и лечения огнестрельных ран. / Ю. Г. Шапошников, Б. Я. Рудаков, Г, Н. Берченко и др. //Раны и раневая инфекция: 2 Веееоюз. конф. *, Тез. докл. ML , 1986, - С. 20-21,

87. Применение взвеси липосом при экспериментальном локальном гнойном процессе/ Т. И, ffipaep,- В, М. Крейнее, Н. А. Голубчикова и др. // Хирургия, 1988,- N 4,- С, 30-34.57, Шувалова Е, П. Инфекционные болезни: Учебник. М.: Медицина, 1SS0, - 560 С.

88. Allen 7. ivl A study о Г phospholipid interact ions between high density lipoproteins and small unilamellar vesicles. //Bioohim. et biophys. acta. 1981,- V, 640, - P. 385-397.

89. Allen Т. U., Cleland L. C. Serum-induced leakage of liposome oontens. //Biochim, et biophis. aota. 1S31. - V. 557,- P. 418 -425,

90. Allison A. C. , David P. Increaset biochemical and biological activites of mononuclear phagocites ezposed to variousstimul, with special reference to secretion of 1isosomal ensymes. /

91. Mononucl. Fhagocit. Immun. Infect, and Patol. Oxford, 1975.- P. 487504.

92. Barton P. G. , Gunstone P. D. Hydrocarbon chain packing and molecular motion in phospholipid bilayers formed from unsaturated lecithins. //J. Biol. Chetru 1975.- V. 250. - P. 4470-4476.

93. Batzri S., Korn E. D. Interaction of phoshpolipid vesicles with cells: Endooytosis and fusion, as alternate mechanism for the uptake of lipid-soluble and water-soluble molecules. //J. Cell Biol. 1975. - V. 66. - P. 621-634.

94. Bayer E. A. ,Rivnay В., Skuteisky E. In .the mode of liposornecell interaction: biotin-conjugated lipids as ultr-astructural 'probes. //Biochim. et Biophiys. Acta.-1979. V. 550. -P. 464-473.

95. Beachey E. //J. infect. Dis. -1981.-Vol. 143. -R 325 -345.

96. Behffl K. , Falk K., Skogh T. , Lewis D. The Effect, of Trauma to the leg on the first-pass uptace of bacteria by the lung- //J, r. 4 nnfl т Г or* *ТЛ с*. . v- г- 1 ТП ГУ* Г* СЛА n>i i Ucufra. isoo. V. <c,o. ~ rtx, — ouppi. - r. bif-bj.».

97. Berlin R. H. , Brandberg A. Tissue changes and bacteriological finding 1,6 and 12 hours after shot iniuries. //Revue International des seruices de sante des armies de Terre, de-. И9 108.- N. 1. P. 175-184.

98. De Gier J. , Mandersloot J. G. , Van Deenen L. L. Lipid composition and permeability of liposomes, //Biochem. Biophis. Acta. -1968. V. 150. - N 4. - P. 565-675. '

99. Demel R. A. , Kinsky'S. C. , Kinsky S. B., van Deenen L, L. Effect of temperature and cholesterol on the glucose permeability of liposomes prepared with natural and sinthetic lecithins. //Biochem, Biophys. Acta, 1968. - V. 150. - N 4. - P. 329-336.

100. Desnoffes J.-F. Antibiotiques et adhesion bacterienne. // Rev. fr. lab, 1983, - V. 13. - N 196. - C. 77-82.

101. Gregoriadis G. , Ryman В. E. Lysosomal localisation of b- f r uo tofuranos i da-ге containing Iipisomes injected into rat-implications in the treatment of genetic disorders. // Biochem. J.-1972. V. 129. - F. 123-133,

102. Gregoriadis G. Drug entrappment in liposomes.// FEBS Lett. -1973. -V. 36. -N. 3, -P. 292-296.

103. Hoekstra D. , Soherphof G. Effect of fetal calf serum and serum protein fractions on the uptake of liposomal phosphatidylcholine by rat hepatocytes.//Biochim. Biophys. Acta.-1979,- V. 551.- P. 109-121.

104. Hoekstra D., Yaron A, , Carmel A., Scherphof G. Fusion of phospholipid vesicles containing a trypsin-sensitive fluorogenio substrate and trypsin,// FEBS Lett. 1979.- V. 106. - P. 176-180.

105. Huang L. , Ozato K. , Pagano R. E, Interaction of phospholipid vesicles with murine lymphocytes. 1. Vesicles-cell adsorbtion and fusion as alternative pathway of uptake. // Membr. Biochem. 1978.- V.I.- P. 1-25.

106. Inbar E, Shinitzky M. Increase of cholesterol level in the surface nv&iribrart* of lymphoma cells and its inhibitory effect onascites tumor '-development.//Proc. Nat. Aoad. Soi. US. 1974.- V. 71.1. P. 2188-Si 30.

107. Krizek T. , Robson Evaluation of quantitative bacteriology in woundmariageirient.//Am J. Surg. 1975.- V. 130. - P. 579584.

108. The interaction of oationiо liposomes containing enterapped horse radish peroxidase with cells in culture. / V. E. Ivfegee, C. W. Goff, J. Sohokneoht et al. // J. Cell Biol. 1974. -Vol. 63. - P. 492-504.

109. O. Maki D. G. Nosocomial bacteremia.- Am. J. Med.-1981.-V. 70.-N 3.- P. 719 -732.

110. Martin F. J. , Mo Donald R. S, Phospholipid exchange between bilayer membrane vesicles.//Biochemistry.-1975. V. 15. - P. 321-327.

111. Mauricio T, et al. Comparision of water exposed ares of cholera toxin when free in solution and bound to 1 i posomes containing the ganglioside AM. //Bioohem. Biophys. Res. Commun. 1885. -V, 136. - N. 2. - P. 835-846.

112. Naouoohio M. C. , Gat to B. R J. , Sordelli D. 0. , D'Aguino M. Enhanced liposome-mediated antibacterial activity of piperacillin and gentamioin against, gram-negative bacilli in vitro //J. Microcapsul. -1988. -5, N4.- P. 303-309. /

113. Nesmejanova M. A. , Bogdanov ivL V. Participation of aoid phospholipids in protein translocation across the bacterial cytoplasmic membrane. //FEBS Lett. -1989. -257. N 2. - P. 203-207.

114. Modulation of phytohemagglutinin-mediated lymphocyte stimulation by egg lecithin. / M. H. Ng, W. S. Ng, W. К. К. Ho et al.// Exp. Cell. Res. 1978. - V. 116. - P. 387 -395.

115. Bacterial adhesens in patogenecity /S. Normark* S. Hultren, В. -1. Marklund// Perspeot. Antiinfec. Therapy: Bayer AG Oenten.

116. Symp. , Washington, D. C. , Aug. 31 Sept. 3, 1983.- Braunschweig, «iesbaden, 1989. - P. 89-34.

117. Pagano R. E., Huang L. , Weg S. Interaction of phospholipid vesicles with cultured mammal ian" cells. // Nature. 1374. -V. 252- P. 165-167.

118. Pagano R E. , Huang L. Interaction of phospholipid vesicles with oultured mammalian cells. II. Studies of mechanism. / / J. Cell. Biol. -1975. V. 67. - P. 49-GO.

119. Pagano R. E. , Takeichi M. Adhesion of phospholipid vesicles to Chinese hamster fibroblasts. The role of cell surface proteins. //J. Cell. Biol. -1977. -V. 74. -N. 2, P. 531-546.

120. Papahajopoulos D. , Vatrins J. C. Phospholipid model membranes. II. Permeability properties of hydrated liquid crystals. //Biochem. Biophys. Acta. 1967.-V. 135. - N 4. - P. 639-652.

121. Papahajopoulos D. , Post* G., Mayhew E. Cellular uptake of cyclic AMP captured within phospholipid vesicles and effect on cell growth behaviour. // Biochem. Biophys. Acta. 1974.- V. 353. - N 3.

122. РЛП /) л* о . *±\-P± li'J.

123. Quite Paul G. , Belan Kiran K. Coagulase-Negative Staphylococcal Adhesence and Persistence/The J. of Infections diseases, Vol. 156. N4.- October 1987.- P. 543-547.

124. Razin S. Reconstitute on of biological membranes. // Biochem. Biophys. Acta. 1972.- V. 265. - N2.- P. 241-2S6.

125. Sohi ffer 1 i D. IvL , Beaohey E. H. Васter i al adhes i on: Modulation by antibiotics which perturb protein synthesis. //Antimiorob. Agents arid Chemother. 1388.- V. 32. - N 11.- P. 1603-1608.

126. Stendahl 0., Magnusson К. -E. //J. Path. 1982. - Vol. 138.1. P. 62.

127. Szoka F. , jaoobson K., Derako. Z.,. Fapahadjopoulos D. Fluorescence studies on the mechanism of liposome-cell interaction in vitro.//Biochem. Biophys. Acta 1980.- V. 600. - P. 1T18.

128. Tian H. M , Huang M.L., Liu Y. Q. et al, Primary bacterial cont&mination of wound track. //Acta Chir. Scand. 1982.-Suppl. 503. - P.265-26S.

129. Quantitative bacteriological study of the wound track./

130. H. Tian, G. Deng, M Huang et al.// J. Trauma. 1SSS. - V. 28. - N.1. -Suppl. P. 215-219.

131. Tikka S. The contamination of missile wounds with special reference to early antimicrobial therapy.//Acta Chir. Scand.-1982. -Suppl. 508. P. 281-287.

132. Tomiinson S. j Taylor P. W. , Luzio J. P. Transfer of phospholipid and protein into the envelope of gramnegativ bacteria by liposome fusion. //Biochemistry. 1S3S. - 23. - N 21.- P. 8303-8311.

133. Van Heuningen : W. В. , Carpenter С. C. , Picree B. F. , Greenough W. B. Desacti vat ion of cholera toxin by ganglioside.//- 123

134. J. Infect. Dis. -1971. V. 184. - P. 415-419.

135. Watt P. L. , Ward M. E. Bacterial Adhesence/Ed E. H. Beachey. -New York, 1980. P, 253-288,

136. Liposomecell interaction: transfer and intracellular release of a trapped fluorescent marker. / J. N. Weinstein, P. Henkart, S. Yoshicami et al. // Science.- 1977,- V, 195. N 4277,- P. 489-492.

137. Weissmann G. , Cohen C. , Hoffstein S. Introduction of enzymes by means of liposomes into non-phagocytic human cell in v i tro. //B i ocem. В i ophys. Acta. -1977. V. 498. - P. 375-385,

138. Zheng Т., Driessen A, J, M. , Konings V.N. Effect of cholesterol on the 'branched -chain amino acid transport system of Streptococcas oremotis //J. Baoteriol.-1988.-170, N 7.-P. 3194-3198.