Механизмы ингибирующего действия борных производных адамантана и липосом в отношении вирусов гриппа

Контаров, Николай Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы ингибирующего действия борных производных адамантана и липосом в отношении вирусов гриппа
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы ингибирующего действия борных производных адамантана и липосом в отношении вирусов гриппа"

На правах рукописи

Контаров Николай Александрович

Механизмы ингибирующего действия борных производных адамантана и липосом в отношении вирусов

гриппа

03.02.02 - вирусология 03.01.02-биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

003493238

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук

Н.В. Юминова, доктор медицинских наук С.Г. Маркушин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук Ф.Г. Нагиева, кандидат биологических наук Г.В. Архарова

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи

Защита состоится <(Ю» 010 года в 12 часов на заседании

диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан

АъМЬЛ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Яковлева

Актуальность проблемы

Грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), несмотря на определенные успехи в вакцино- и химиопрофилактике, остаются одной из самых актуальных медицинских и социально-экономических проблем. В России на грипп и ОРВИ ежегодно приходится до 90% от всей регистрируемой инфекционной заболеваемости (до 30 млн. больных; из них 45-60% дети). Экономический ущерб, причиняемый гриппом и ОРВИ, составляет около 86% от экономических потерь, наносимых инфекционными болезнями. В течение 20052009 гг. выявлены изменения в эпидемиологии гриппа животных. Продолжают возникать случаи заболевания людей, вирус распространился географически на новые страны. Так, особую актуальность приобретает грипп птиц. Грипп птиц -высококонтагиозная вирусная инфекция, которая может поражать все виды пернатых. Для птиц грипп является энтеральной инфекцией, при которой поражаются паренхиматозные органы, особенно селезенка, и легкие. К настоящему времени известно, что носителями вируса гриппа птиц Н5Ы1 могут являться практически все известные дикие птицы водного и околоводного комплекса [Киселев О.И., 2008]. В значительно меньшей степени среди птиц на данный момент циркулирует серотип Н?^ (вирус «чумы птиц»), последняя эпизоотия была зарегистрирована в 2003 году в Голландии среди домашней птицы. Этим вирусом было заражено 88 человек, работавших на птицефермах, у которых диагностировали лишь коньюктивит. Домашние птицы, особенно куры и утки, высоко восприимчивы к штаммам вируса гриппа серотипа НзМ], летальность от которых доходит до 100%. За период с января 2004 года по август 2009 года в мире зарегистрировано 237 случаев птичьего гриппа у людей, вызванных вирусом АЛ^ТЧь из них 137 (58%) закончились летальным исходом [Со)с!тап Б, 2009]. Большинство описанных случаев заражения людей происходило при непосредственном контакте с больными птицами.

Эффективность современных вакцин ограничивается постоянно меняющимся антигенным разнообразием вируса гриппа, вектором их действия

являются антигенные белки. Поэтому при появлении нового штамма необходимо заниматься созданием новой вакцины, что экономически невыгодно. В связи с этим появление нового фосфолипидного препарата может решить данную проблему за счет воздействия его на липидную мембрану вирионов, липидный состав которой примерно одинаков для всех известных серотипов вируса гриппа.

Цель исследования

Разработка теоретических и научно-практических основ для создания, оценки и применения липосом, борных производных адамантана и их комплексов, направленных на лечение и профилактику гриппозной инфекции.

Задачи исследования

1. Оценить возможность использования липосом разного липидного состава для снижения токсичности борных производных адамантана.

2. Определить нетоксический диапазон концентраций и характеристики связывания бораадамантана с липосомами.

3. Выявить механизмы вирусоингибирующего действия борных производных адамантана, липосом и их комплексов в отношении вируса гриппа.

4. Протестировать вирулицидное действие бораадамантана, нативных липосом и комплексов бораадамантана с липосомами на лабораторных животных.

5. Разработать методику определения размера и концентрации липосом.

Научная новизна

Впервые применен нанотехнологический подход к подбору биодеградируемого носителя (липосомы) и нетоксического диапазона концентраций для новой группы противовирусных препаратов - борных производных адамантана (бораадамантана). Определен оптимальный липидный состав нативных липосом и липосом в комплексе с бораадамантаном для слияния с клетками и вирионами. Для контроля качества нанотехнологического процесса получения липосом был разработан и апробирован на практике новый

метод оценки размеров и концентрации липосом. Впервые выявлены физико-химические механизмы, обусловливающие выраженное вирусоингибирующее действие бораадамантана в нетоксическом диапазоне концентраций, связанные с изменением фазового состояния липидной мембраны вириона, а именно, повышение температуры фазового перехода липидов, входящих в состав мембран вирионов. Показано выраженное вирусоингибирующее действие нативных безхолестериновых липосом и липосом в комплексе с бораадамантаном и выявлен физико-химический механизм данного явления, заключающийся в экстракции холестерина и других липидов липосомами из мембран вирионов. Процесс экстракции был зафиксирован двумя методами: гель-фильтрацией с радиоактивно меченными липосомами и вирионами, и по изменению величины поляризации флуоресцентных зондов. При низкой микровязкости липидных мембран вирионов нормальный процесс слияния вирионов с клеткой невозможен. Вирусоингибирующее действие используемых в работе препаратов доказано достоверным снижением смертности лабораторных животных, зараженных различными дозами (2^ ЭИД5о/мл, 41с, ЭИДм/мл) вируса серотипа, ^N2 авирулентного для человека, при введении одинаковых доз бораадамантана, липосом и липосом в комплексе с бораадамантаном различными способами.

Практическая значимость работы

Работа имеет прикладное значение. Возможное применение используемых в работе химиопрепаратов для лечения гриппа вызовет снижение заболеваемости в случае эпидемии и пандемии, а также сведет практически на нет необходимость прогнозирования появления нового штамма вируса за счет мутаций, так как вектор вирусоингибирущего действия, используемых в работе химиопрепаратов, направлен на липидную мембрану вируса, а не на антигенные белки, как многие имеющиеся на сегодняшний день лекарственные препараты. Использование наночастиц - липосом в качестве биодеградируемого нетоксического носителя позволяет пролонгировать действие многих противовирусных препаратов.

Разработанная методика оценки качества дисперсии липосом позволяет определять размеры и концентрацию липосом и стандартизовать липосомальные дисперсии.

Апробация материалов диссертации и публикации

Материалы диссертации доложены на Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008), Всероссийской конференции «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов» (Пермь, 2008), Международной конференции «Органическая химия для медицины» (Черноголовка, 2008).

Апробация диссертации состоялась 19 октября 2009 г. на научной конференции отдела вирусологии ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

Основные положения диссертации изложены в 6 печатных работах, в том числе в 2 журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 95 страницах машинописного текста, иллюстрированы 8 таблицами, 12 рисунками.

Диссертация состоит из введения, восьми глав обзора литературы, семи глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Список цитируемой литературы включает 100 работ отечественных и зарубежных авторов.

Содержание работы Материалы и методы исследования

В работе было использовано борное производное адамантана (CioHi6)-соединение БГ-12 (Институт элементоорганических соединений им, A.A. Несмеянова РАН, Москва). В данном соединении фрагмент амантадина соединен координационной связью с атомом бора. Радикал представлен органической группой [Бубнов Ю.Н., 1981].

Объектом исследования служили штамм А/ВЧП/Вейбридж (H7N7), штамм вируса гриппа птиц А/Маллард Пенсильвания/10218/84 (H5N2), штамм A/NIBRG-14 вируса гриппа птиц (H5N1), авирулентные для человека. Вирусы выращивали на 10-дневных куриных эмбрионах. Опыты проводили в первичной культуре фибробластов куриного эмбриона (ФКЭ), а также в перевиваемой культуре клеток линии MDCK.

Липосомы получали по стандартному методу с незначительными модификациями [Pagano I. 1965]. Яичный лецитин и дипальмитоилфосфатидилхолин («Sigma», США) в концентрации 1-3 мг/мл в растворе 0,01 М KCl инкубировали при 70°С в течение 10 мин; фосфатидилэтаноламин и дипалмитоилфосфатидилхолин («Sigma», США) смешивали в мольном соотношении 1:1 и 2:1; липосомы из яичного фосфатидилхолина и яичного фосфатидилхолина в смеси с холестерином (3:1, моль:моль) и инкубировали при тех же условиях. Размеры липосом определяли по спектру мутности дисперсии и с помощью электронной микроскопии. Затем дисперсию липосом озвучивали воздействием ультразвуковой установки УЗДН-А (Украина) в течение 3 мин (мощность- 500 Вт).

Электрофоретическую подвижность липосом, ^, измеряли коммерческим прибором «Zetasizer-2» (Malvern Instr., USA) (Химический факультет МГУ). Величину поверхностного потенциала определяли из потенциала с учетом поправки на плоскость скольжения, составляющей 2 ангстрема, по формуле:

Для расчетов использовался пакет программ МаШСАЭ 12 .

Для получения монослоя использована оригинальная установка, состоящая из тефлоновой ванны Лэнгмюра с размером 200*200* 1(мм), весов Лэнгмюра, неподвижного и сжимающего барьера. Установка обеспечивает точность измерения поверхностного давления Б = 0,05 мН/м.

обратная дебаевская длина экранирования.

Точность определения площади А0, занимаемой одной молекулой, составляет 2-5%. Для получения монослоя на чистую поверхность водной фазы между сжимающим и неподвижным барьерами наносили раствор в хлороформе с исследуемой системой из микрошприца. Объем наносимого на поверхность раствора 30 мкл. В качестве субфазы использовали трижды перегнанную воду (электропроводность воды 70 кОм, рН 6,3, поверхностное натяжение 73,4 мН/м при 20°С).

Для определения изменения микровязкости липидной мембраны вирионов и липосом применялись флуоресцентные зонды двух типов: NBD -фосфатидилэтаноламин и NBD - фосфатидилхолин (Sigma, США), 8-АНС (РФ). Для определения величины поляризации использовали спектрофлюориметр Флюорат — 02 — Панорама (РФ).

С целью выявления экстракции холестерина липосомами применяли гель-фильтрацию и радиометрию меченных радионуклидами (3Н - инулин и 14С -фосфатидилхолин) липосом в колонке для гель-фильтрации с сефарозой 4В. Колонка для гель-фильтрации с сефарозой 4В (10x400 мм; объем геля 30 мл, объем наносимого образца 1 мл; элюция дистиллированной водой; скорость хроматографирования 0,5-0,6 мл/мин). Радиометрия образцов осуществлялась с помощью радиометра (БЛ-БДБ-2, РФ) (Научно-исследовательский институт ядерной физики им. Д.В. Скобельцина, МГУ).

Для измерения температуры фазового перехода при одновременной фиксации оптической плотности раствора использовали спектрофотометр Zenyth 200st (РФ).

Титр вирусов определяли в реакции гемагглютинации (микрометод) с 0,5% суспензией куриных эритроцитов, идентификации по бляшкам в 72 часовой культуре ФКЭ и в 10-дневных куриных эмбрионах при их заражении в аллантоисную полость. Инфекционный титр рассчитывали по методу Рида— Менча в модификации Томпсона [Thompson W.R., 1947].

Изучение вирусингибирующего действия препарата БГ-12 проводили на модели лабораторных мышей линии Balb/c, инфицированных интраназально

штаммом А/Маллард /Пенсильвания /10218/84 вируса гриппа птиц (НзЪЬ). Мыши линии Ва1Ь/с (массой 8-10 г) инфицировались интраназально дозами 21э ЭИД5о/мл и 41ё ЭИДзо/мл штамма А/Маллард / Пенсильвания/10218/ 84 вируса гриппа птиц (^N2), адаптированного к мышам этой линии. Предварительные исследования показали, что интраназальное введение мышам этой линии дозы в 4^ ЭИД50/МЛ вызывает гибель животных на 3-4 сутки, а интраназальное введение дозы в 2\£ ЭИД50/МЛ - на 5-6 сутки. Мышам под легким эфирным наркозом вводили вируссодержащую жидкость в объеме 20 мкл в каждую ноздрю. Спустя 6 часов инфицированным животным вводили препараты БГ-12, используя различные методы введения. Первой группе животных препарат вводили в виде раствора интраназально в дозе 0,4 мкг (по 0,2 мкг в каждую ноздрю). Мышам из 2-ой группы препарат вводили интраназально в виде суспензии липосом на базе дипальмитоилфосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина (в соотношении 1:2) в концентрации 1мг/мл, нагруженных молекулами препарата БГ-12 (1мкг/мл). Дисперсия липосом вводилась в объеме 20 мкл в каждую ноздрю животного. Общее количество препарата БГ-12, вводимого с дисперсией липосом в ноздри каждого животного не превышало 0,4 мкг. Животным первой и второй групп препарат вводили ежедневно один раз в день в течение 7 дней. В качестве контроля наблюдали группу животных, инфицированных вышеуказанными дозами вируса, а также группу неинфицированных животных. Парентеральное введение препарата БГ-12 проводили в мышцу бедра в течение 7 дней. Доза препарата равнялась 0,4 мкг.

Для исследования препарата липосом в электронном микроскопе проводили адсорбцию материала на формваровой пленке, стабилизированной углеродом. После 3-х кратной промывки ФБР №2 (рН 7,2), материал контрастировали фосфорновольфрамовой кислотой (рН 7,0-7,2). Для исследования процесса взаимодействия липосом с вирионами вируса гриппа птиц сначала на пленке адсорбировали вирусные частицы. Затем сеточку помещали на каплю липосомсодержащей смеси и в течение 5 мин инкубировали при комнатной

температуре. Вируссодержащую аллантоисную жидкость осветляли на низкоскоростной центрифуге при 3000 об/мин. Затем проводили осаждение вирионов вируса гриппа в угловом роторе центрифуги " Бекман" при 14000 об/мин в течение 3-х часов. Осадок вируса ресуспендировали, осветляли и наслаивали на 20% сахарозную подушку. Дальнейшее осаждение вируса через сахарозную подушку проводили в бакет-роторе SW-25 ультрацентрифуги "Бекман" при 25000 об/мин.

Осадок вируса ресуспендировали в фосфатном буфере (рН 7,4) и титровали в куриных эмбрионах.

Титр суспензии вирионов равнялся 61g ЭИД5о/мл. Вируссодержащую жидкость делили на три порции. К первой добавляли взвесь липосом, не содержащих препарат БГ-12, ко второй - взвесь липосом (3 мг/мл), нагруженных молекулами препарата БГ-12 (1 мкг/мл). Контрольный препарат представлял собой взвесь вирионов с титром 512-1024 ГАЕ/мл.

Все смеси инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С и еще 24 часа при комнатной температуре. По окончании инкубации производили титрование указанных материалов.

С целью определения размера и концентрации липосом использовались липосомы из дипальмитоилфосфатидилхолина, полученные одновременным нагреванием и встряхиванием в различных концентрациях NaCl и КС1. Анализ спектра мутности проводили с использованием спектрофотометра Zenyth 200st (РФ), показатели преломления суспензий липосом измеряли с помощью рефрактометров типа РПЛ-3 (РФ).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью параметрической статистики с использованием критерия Стьюдента и дисперсионного анализа, применяя пакет программ Microsoft Office Excel 2003. Выживаемость мышей оценивали по методу С. Гланца (С. Гланц, 2005).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

На первом этапе исследования определена токсичность препарата и нетоксический диапазон концентраций. При определении токсичности БГ-12 использовали различные исходные концентрации данного препарата в изотоническом буфере. В опытах концентрации БГ-12 в среде ЯРМ1-1640 варьировали от 3 мкг/мл до 100 мкг/мл. Максимальная нетоксическая доза для культуры ФКЭ составляла 25 мкг/мл, а для культуры МБСК - 12,5 мкг/мл. Поскольку вирусы гриппа птиц (№N1) и вирусы чумы птиц в последний

период стали представлять повышенную опасность для человека в связи с увеличением пандемического потенциала, основное внимание было сосредоточено на изучении ингибирующего действия борсодержащих соединений на эти вирусы. На модели штамма А/ВЧП/Вейбридж (Т^Ы?) была определена так называемая минимальная ингибирующая концентрация (МИК) препарата БГ-12, вызывающая снижение титра вируса в 2 раза. Для этого монослой ФКЭ инфицировали вирусом с множественностью 50 БОЕ на матрац (Ум=50 мл) и инкубировали под агаровым покрытием при 37°С в присутствии различных концентраций БГ-12. Как оказалось, МИК в данном случае составляла 0,1 мкг/мл. Одним из серьезных недостатков борсодержащих соединений является их плохая растворимость в водной среде, что значительно затрудняет проникновение в клетки данных соединений и снижает их терапевтический эффект. Учитывая это обстоятельство, с целью увеличения вирусингибирующего эффекта борсодержащих соединений было

целесообразным включить их молекулы в мембраны липосом, которые активно взаимодействуют с клетками и, следовательно, могут способствовать более эффективному транспорту молекул борсодержащих соединений в инфицированные клетки. Однако предварительно необходимо было изучить закономерности процесса включения БГ-12 в липосомы. Проведено изучение изменения электрохимических характеристик липосом, полученных на основе дипальмитоилфосфатидилхолина при их взаимодействии с препаратом БГ-12, с

целью определить допустимые терапевтические концентрации БГ-12 в липосомах. К дисперсии липосом с концентрацией липида 1 мг/мл в растворе 0,01 М КС1 были добавлены возрастающие концентрации препарата БГ-12. Результаты исследования отражены в таблице 1.

Таблица 1

Изменение электрохимических характеристик липосом на базе дипальмитоилфосфатидилхолина в зависимости от концентрации БГ-12 в суспензии (средние значения 20 измерений)

Концентрация бораадамантана в суспензии липосом, мкг/мл Дзета-потенциал <£>, мВ Плотность заряда <а>, Кл/м2 Поверхностный потенциал Ф, мВ

Контроль -5,8 + 0,03 1,8*10° ±0,01 -4,7

1 -3,3 ±0,02 1,1*10 4±0,01 -3,6

3 -2,8 + 0,02 0,8*10'4±0,01 -3,3

5 -2,5 + 0,01 0,9* 104± 0,01 -3,1

7 -5,6 ±0,03 1,4*10"3±0,01 -4,9

10 -3,3 + 0,01 1,2*10"4±0,01 -3,4

25 -6,3 ±0,01 2,4*10'3 ±0,01 -6,6

50 -7,2+0,02 З,0*10"3±0,01 -7,3

75 -7,4 ±0,02 З,2*10"3±0,01 -7,4

По экспериментальным данным была получена зависимость дзета-потенциала липосом от концентрации БГ-12 (Рис.1). Данная зависимость отображает процесс адсорбции БГ-12 на поверхности липосом:

Зависимость дзета-потенциала липосом от концентрации БГ-12

£0

-1

. -2 -

5 3

г -3 ■

=Г

X .

о -4

с -5 -I га

6 -6 -

20 30 40 50 60 70 80

Концентрация БГ-12, мкг/мл

С помощью полученной зависимости можно анализировать процесс адсорбции БГ-12 на поверхности липосом, но данная зависимость не отображает истинный скачок потенциала, так как плоскость адсорбции располагается на некоторой глубине в мембране липосом и для его точного измерения требуется измерение граничного потенциала с помощью метода компенсации внутримембранного поля (КВП) на плоских мембранах. В нашем же случае было зафиксировано изменение потенциала только в диффузном слое, т.е. непосредственно дзета-потенциал, не имея информации об изменение граничного потенциала. В связи с этим можно сделать предположение, что истинный скачок потенциала при адсорбции и встраивании БГ-12 может быть несколько больше исходя из данных полученных группой Е.Симоновой с сотрудниками при изучении включения ремантадина в бислойные мембраны [Симонова Е., 1984].

Интерпретация данных полученной зависимости позволяет судить о том, что оптимальными концентрациями БГ-12 для встраивания в липосомы являются нетоксические дозы, в частности от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл и наилучшим

диапазоном концентраций является диапазон от 1 мкг/мл до 7 мкг/мл, так как после 10 мкг/мл происходит разрушение липосом, либо невозможность дальнейшего встраивания БГ-12 в их липидную мембрану, что проявлялось падением дзета-потенциала с ростом концентрации БГ-12 и последующем выходом кривой на плато.

Для количественного описания адсорбции БГ-12 на липосомах использовалась модель, развитая в работе Е. Симоновой с сотрудниками. Основываясь на данной модели, необходимо определить поверхностную концентрацию адсорбированных частиц, а поскольку каждая из них несет единичный заряд, - величину адсорбированного заряда. Для этого полную величину заряда поверхности после адсорбции рассчитывали с использование уравнения Гуи-Чепмена:

О- = 7(8eeaRTct )sinh(F^/2Är) (2), Величину адсорбированного заряда находили вычитанием из найденной величины исходной плотности поверхностного заряда:

<т„=<г-<т',( 3)

Для теоретического описания полученных экспериментальных результатов применяли уравнение:

<тл - Кса exp(-^F/Ä7), (4) где К - константа адсорбции.

Для концентрации БГ-12, равной 10"6 М и 10"5 М в растворе 10"3 М KCl, по этой формуле были рассчитаны константы адсорбции, которые имели следующие значения (Кл-м2-М-1): 1 мкг/мл: К=3*107; Змкг/мл: К=8,5*106; 5 мкг/мл: К=6,5*105; 7 мкг/мл: К=4,5*104; 10 мкг/мл: К=3,2*104. Была построена кривая зависимости десятичного логарифма константы связывания от концентрации (Еис.2).

£ 1 Л х

? 6 -

о 5 -о

сл

3 2 1 -

Зависимость константы адсорбции БГ-12 от его концентрации

4 6 8

Концентрация БГ-12, С, мкг/мл

С помощью построенной графической зависимости десятичного логарифма константы адсорбции БГ-12 от концентрации БГ-12 можно сделать вывод о насыщении липосом препаратом БГ-12 при его концентрациях от 7 мкг/мл. Полученные данные по определению константы адсорбции БГ-12 на липосомах согласуются с результатами, полученными ранее и отражающими токсичность данного препарата для монослоя клеток линии МБСК. По-видимому, доза препарата выше 7-10 мкг/мл вызывает коллапс липидного бислоя поверхностной мембраны клеток и нарушает ее функции (в частности, адгезивную функцию).

В следующей части исследований проведен ряд экспериментов по изучению вирусингибирующего действия липосом из

дипальмитоилфосфатидилхолина и холестерина в соотношении 3:1, содержащих молекулы препарата БГ-12 на клетки МБСК, инфицированные вирусом «чумы птиц» (штамм А/ВЧП/Вейбридж (Н7Н7)). На начальной стадии данного изучения было исследовано размножение вируса «чумы птиц» в присутствии липосом, содержащих молекулы препарата БГ-12 в среде 11РМ1-1640 с ТРСК-трипсином (конечная концентрация 2 мкг/мл). С этой целью монослой клеток МБСК был инфицирован вирусом «чумы птиц» с

множественностью заражения 0,01 ЭИД5о/кл. Затем вирус отмывали и в матрацы вносили среду ЯРМ1-1640 , содержащую взвесь липосом (2 мг/мл), в липидные мембраны которых были включены молекулы препарата БГ-12. В качестве контроля использовали вирусинфицированные клетки, содержащие препарат БГ-12, а также среды 11РМ1-1640, содержащие нативные липосомы. Инфицированные клетки инкубировались 4 дня при температуре 37°С. Ежедневно проводилось изучение состояния клеток под микроскопом, и определялись инфекционный и гемагглютинирующий титры. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Влияние липосом, содержащих препарат БГ-12, на размножение штамма вируса «чумы птиц» А/ВЧП/Вейбридж в клетках 1УШСК (10 измерений)

Состав поддерживающей среды Титр вируса ГАЕ/мл (1§ЭИД5о/мл) после инфекции

2-ой день 3-ий день 4-ый день

1 Среда 11РМ1-1640 64 (4 + 0,02) 128 (4 + 0,02) 128 (4 ±0,02)

2 Среда ЯРМ1-1640 + липосомы (0,1 мг/мл) 64 (4 + 0,02) 0(0) 0(0)

3 Среда ЯРМ1-1640 +БГ-12 (1мкг/мл) 32 (4 + 0,02) 64 (0) 0(0)

4 Среда ИРМЫ 640+ липосомы (0,1 мг/мл) + БГ-12 (1 мкг/мл) 64 (4+0,02) 0(0) 0(0)

Как видно из таблицы 2, наличие липосом в поддерживающей среде привело к снижению инфекционного и гемагглютинирующего титров до нуля. Аналогичным образом действовало на размножение вируса и совместное присутствие препарата БГ-12 и липосом в поддерживающей среде. Добавление препарата БГ-12 в среду вызывало более медленное снижение размножения вируса «чумы птиц» в клетках МОСК. При увеличении множественности

заражения в 10 раз кинетика снижения гемагглютинирующего и инфекционного титров была аналогичной (данные не приводятся).

Предобработка клеточного монослоя свободными липосомами и липосомами, нагруженными БГ-12 не выявила статистически значимого снижения гемагглютинирующего и инфекционного титров.

В следующей серии экспериментов использовали липосомы на базе комбинации фосфатидилэтаноламина и дипальмитоилфосфатидилхолина в соотношении 1:1 и 2:1. Результаты влияния этих липосом, содержащих препарат БГ-12, на размножение вируса гриппа представлены в таблице 3. Как видно из данной таблицы, в клетках MDCK, инфицированных вирусом чумы птиц, наблюдалось значительное накопление гемагглютинирующих титров, что свидетельствовало об активном размножении вируса. На 3-й день инкубации вирусинфицированных клеток при 37°С гемагглютинирующий титр вируса в среде достигал 128 ГАЕ/мл. В клетках, инфицированных вирусом «чумы птиц», в присутствии в среде препарата БГ-12, наблюдалось подавление размножения вируса. Также полное подавление размножения вируса наблюдалось в клетках, инфицированных вирусом, в присутствии липосом, нагруженных молекулами препарата БГ-12. Однако, как видно из таблицы 3, нативные липосомы также обладали значительным вирусингибирующим действием, и степень ингибиции во многом зависела от липидного состава липосом. Дисперсия липосом на базе дипальмитоилфосфатидилхолина ингибировала размножение вируса в меньшей степени, чем липосомы, полученные на базе смеси фосфатидилэтаноламина и дипальмитоилфосфатидтилхолина в мольном соотношении 1:1 и 2:1, они ингибировали размножение вируса в значительно большей степени.

В следующей части нашего исследования была предпринята попытка выяснить физико-химические механизмы вирусингибирующего действия бораадамантана и липосом на вирусные мембраны. С этой целью были сформированы липидные мономолекулярные пленки из фосфатидилхолина, содержащегося в мембране вириона. Добавление бораадамантана в концентрациях 10"6-10"7М достоверно изменяло поверхностное давление

мономолекулярной липидной пленки: кривые 1,2 получены при концентрации БГ-12 10"7 М, кривая 3 - при 10 6 М. (Рис.3).

Таблица 3

Влияние липосом с разным составом фосфолипидов, содержащих

препарат БГ-12, на размножение штамма вируса чумы птиц А/ВЧП/Вейбридж (Н?1Ч7) (в клетках 1УГОСК, предварительно обработанных СаСЬ (10 измерений)

Состав системы Титр вируса, (ГАЕ/мл), ЭИД50/мл

48ч 72ч 120ч

1 Клетки МЭСК, инфицированные 64 128 256

вирусом чумы птиц (4 ±0,02) (4,5 ±0,02) (4,5 ±0,02)

Клетки МЭСК, инфицированные 0 (0) 0 (0) 0 (0)

2 вирусом чумы птиц + препарат БГ-12 (1 мкг/мл)

Клетки МВСК, инфицированные

вирусом чумы птиц + липосомы 4 0 0

(дипальмитоилфосфатидилхолин) (0,2 мг/мл)+ Са2+ (2мМ) (1,5 ±0,02) (0) (0)

Клетки МБСК, инфицированные

вирусом чумы птиц + липосомы 0 (0) 0 (0) 0 (0)

4 (дипальмитоилфосфатидилхолин+

ф о сф ати ди лэтано л ам ин)

(0,2мг/мл)+ Са2+(2мМ)

Клетки МБСК, инфицированные

вирусом чумы ПТИЦ+ липосомы 0 (0) 0 (0) 0 (0)

5 (дипальмитоилфосфатидилхолин+

фосфатидилэтаноламин)(0,2мг/мл)

+БГ-12-( 1 мкг/мл)+ Са2+ (2мМ)

Рис.3

Зависимость поверхностного давления мномолекулярной пленки из фосфатидилхолина от площади на молекулу

А, (ангстрем)А2

Полученные результаты указывают на увеличение площади, приходящейся на одну молекулу липида. Предположительно, что вирусоингибирующее действие борных производных адамантана связано с нарушением целостности мембран вирионов посредством изменения фазовых свойств липидов, входящих в состав мембран. Для подтверждения этого предположения была использована дифференциальная сканирующая калориметрия с одновременной регистрацией оптической плотности. После взаимодействие БГ-12 с вирионами наблюдалось увеличение температуры фазового перехода с 298 К до 308 К, т.е. «замораживание» липидной мембраны вириона (Рис.4).

При таком фазовом состоянии мембраны полноценное слияние вириона с клеткой невозможно, невзирая на взаимодействие гемагглютининов с рецепторами сиаловых кислот. Данный эффект характерен для всех используемых концентраций бораадамантана (106 - 10"7М) и серотипов вирусов H5N2, H7N7 авирулентных для человека с инфекционным и гемааглютинирующим титром 61g ЭИДзо/мл и 512 ГАЕ/мл соответственно. Увеличение температуры фазового перехода мембран вирионов сопровождается

увеличением площади, приходящейся на одну молекулу липида, что согласуется с полученными нами ранее данными (Рис.3).

Рис.4

Зависимость оптической плотности взвеси вирусных частиц от температуры фазового перехода их мембран

1.32 1,3 -1,28 -1,26 -

* 1,24 -

1,22 -1,2 -1,18 -1,16 -

295 300 305 310 315 320

т,к

В случае взаимодействия «жидких» безхолестериновых липосом с вирусами гриппа происходил обмен липидами: липосомы экстрагировали холестерин вирусной мембраны. Литературных данных по механизму взаимодействия вирусов гриппа с «жидкими» липосомами нет. По-нашему мнению, одним из возможных механизмов этого явления может быть процесс везикуляции вирионов. Чтобы проверить эту гипотезу, после инкубации с вирионами, мечеными 14С - фосфатидилхолинами, в течение 5 часов липосомальную дисперсию с мечеными 3Н - инулином, фракционировали по размерам гель-фильтрацией на сефарозе 4В. Отсутствие ассоциатов вирионов во фракциях контролировали реакцией гемагглютинации (микрометод). Обнаружено, что основная часть меченых липидов находится в составе частиц, совпадающих по своим размерам с исходными липосомами. Совпадали не только средние размеры, но и распределение по размерам. Небольшая фракция липосом в

результате взаимодействия с клеточной поверхностью превратилась в более крупные агрегаты. В их составе также присутствовали вирусные липиды.

Результаты гель-фильтрации показывают, что вирусные липиды вошли в состав липосом, а не образовывали свои собственные везикулы.

С целью подтверждения процессов обмена холестерина между вирионами и липосомами были проведены исследования с применением флуоресцентных зондов. Для этого вирионы инкубировали с липосомами из яичного фосфатидилхолина или яичного фосфатидилхолина в смеси с холестерином (3:1, моль:моль). В первом случае холестерин переходил из вирусной мембраны на липосомы, во втором липосомальный холестерин включался в вирионы. В зависимости от обработки молярное отношение холестерина менялось от 0,5 до 3,5. Значения микровязкости мембран вирионов, рассчитанные по формуле Перрена-Яблонского, исходя из значений поляризации Р:

В случае взаимодействия безхолестериновых липосом уменьшалась с 5*10'3 Па*с до 10"3Па*с; в случае же взаимодействия липосом, содержащих холестерин - увеличивалась до 24,8*10"3 Па*с.

Из полученных данных следует вывод о влиянии липосом на микровязкость вирусной мембраны, которая, в свою очередь, действует на процесс слияния вириона гриппа с клеткой, а также оказывает воздействие на работу ионных каналов (М2-белок) мембраны вириона. Микровязкость бислоев липосом и вирионов характеризуется наличием в них определенного количества холестерина. Изменение его количества приводит к уменьшению или к увеличению микровязкости бислойной фосфолипидной мембраны.

Предварительные исследования на лабораторных животных показали, что интраназальное введение мышам этой линии дозы в ЭИДзо/мл вызывает гибель животных на 3-4 сутки, а интраназальное введение дозы в ЭИД50/МЛ -на 5-6 сутки. Мышам под легким эфирным наркозом вводили вируссодержащую жидкость в объеме 20 мкл в каждую ноздрю. Результаты эксперимента

представлены на Рисунке 5. Кривая 1 - интраназальный способ введения БГ-12 в дозе 0,4 мкг; кривая 2 - интраназальное введение липосом, содержащих БГ-12 в дозе 0,4мкг; кривая 3 - парентеральное введение раствора БГ-12 в дозе 0,4 мкг; кривая 4 - интраназальное введение нативных липосом в концентрации 1мг/ мл. Доза заражения вирусом указана в lg ЭИД50/МЛ. Из полученных данных видно, что наибольший вирусоингибирующий эффект оказывается при интраназальном введении нативных липосом.

Рис.5

Кривые "доза-ответ" для различных способов введения используемых в работе химюпре паратов

120 100

X н

8 80 л

g 60 I

х £

I 40 х О

0 -,---,-,-,-,-1-,-,-,

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

Доза заражения вирусом, |д ЭЦД50/мп

Следует особо отметить, что при использовании как интраназального, так и парентерального методов введения, была использована крайне низкая лечебная доза (0,4 мкг) препарата БГ-12, учитывая, что препарат БГ-12 в опытах in vitro обладал намного большей эффективностью, чем ремантадин.

Анализ результатов электронной микроскопии позволяет сделать несколько предварительных предположений относительно механизма инактивации липосомами гемагглютинирующей способности вируса гриппа птиц.

На основе данных электронной микроскопии можно сделать вывод о том, что происходила экстракция холестерина, входящего в состав мембран вирионов в значительном количестве в фосфолипидный бислой липосом (Рис.6 а,в).

Рис.6

Пролонгированная стадия взаимодействия липосом с вирионами гриппа птиц. Масштабная линейка - 100 нм

В пользу этого свидетельствует сокращение содержания липидов в мембранах вирионов, контактирующих с липосомами. (Рис. 6 б,г).

Экстракция холестерина в липосомы приводила к уменьшению вязкости липидного бислоя вирионов, к появлению разницы в кривизнах наружного и внутреннего фосфолипидных мембран вирионов, что в свою очередь вызывало дезинтеграцию и дезориентацию гемагглютининов, а впоследствии и к разрушению самих вирионов. Выше отмечалось, что процесс разрушения вирионов активизировался в присутствии БГ-12 в составе липосом. Указанный

препарат БГ-12 является ингибитором вируса гриппа. Ранее было показано, что при внесении БГ-12 в виде раствора в вируссодержащую жидкость в конечной концентрации 20 мкг/мл, он вызывал деструкцию вирионов вируса гриппа.

При попытке объяснить механизм вирулицидного действия липосом на вирус гриппа птиц обращает внимание, имеющееся противоречие между малочисленностью вирионов с адсорбированными липосомами, по данным электронной микроскопии не более 20-30 %, и нулевым значением гемагглютинирующего и инфекционного титров вируса. Таким образом, 70-80% вирионов, имея морфологически интактные гемагглютинины, тем не менее, не обладали гемагглютинирующей активностью. Можно предположить, что это обстоятельство может указывать на наличие конформационных изменений в структуре молекул гемагглютининов, вызванных кратковременным контактом вирионов с липосомами. Однако эти изменения играют большую роль в процессе ингибирования вируса, чем морфологически выраженные деструктивные изменения вирионов, содержащихся в препаратах.

Разработанная методика определения концентрации и размеров липосом основывалась на спектральной зависимости мутности дисперсии липосом, выражающаяся степенной функцией:

г = АХ" (6)

Показатель преломления п является функцией относительного размера а = 2тцп / Я и относительного показателя преломления частиц, т-р/ц0> где г -радиус частиц, Я - длина волны света, /'ил- показатели преломления дисперсной фазы и дисперсионной среды. В работе п калибрована от а и ш в диапазоне а<25, 1,05<т< 1,30с шагом А/и = 0,05. Сравнение значений диаметра липосом, определенных по разработанной методике (1) и электронной микроскопии (2) приведены в таблице 4.

Из данных таблицы 4 можно заключить, что разработанный метод дает хорошее совпадение результатов по определению диаметра липосом с методом электронной микроскопии.

Табли1(а 4

Сравнение значений диаметра липосом, определенных по спектру мутности (1) и электронной микроскопии (2)

Раствор Количество измерений с1ср, нм (1) ¿ср., нм (2)

№С1 (0,9%) 30 85 70

ЫаС1 (0,85%) 30 82 73

КС1 (0,9%) 30 84 72

Выводы:

1. Впервые применен нанотехнологический подход к подбору биодеградируемого носителя (липосомы) и нетоксического диапазона концентраций для новой группы противовирусных препаратов — борных производных адамантана (бораадамантана).

2. Разработана и апробирована на практике новая методика оценки размеров и концентрации липосом.

3. Выявлены физико-химические механизмы, обусловливающие выраженное вирусоингибирующее действие бораадамантана, связанные с повышением температуры фазового перехода липидов, входящих в состав мембран вирионов.

4. Процесс экстракции холестерина липосомами из мембран вирионов был зафиксирован двумя методами: гель-фильтрацией с радиоактивно меченными липосомами и вирионами, и по изменению поляризации флуоресцентных зондов. Полученные данные свидетельствовало об уменьшении микровязкости липидных мембран вирионов.

5. По данным электронной микроскопии, наиболее выраженным вирусоингибирующим действием обладают липосомы средних размеров (80-100 нм), состоящие из смеси дипальмитоилфосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина в мольном соотношении 1:1 и 1:2 соответственно в комплексе с бораадамантаном.

6. На лабораторных животных, зараженных авирулентным для человека, серотипом HsN] с дозой заражения 21g и 41g ЭИД50/МЛ показано достоверное снижение смертности после введения одинаковых доз бораадамантана, нативных липосом и их комплексов с бораадамантаном различными способами.

7. Доказана возможность применения липосом, бораадамантана и комплексов липосом с бораадамантаном в качестве лекарственных препаратов для лечения гриппа.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Контаров H.A. Использование липосом разного липидного состава в комплексе с борными производными адамантана как ингибиторов специфической активности вирусов гриппа птиц. /Артюшенко C.B., Маркушин С.Г., Бубнов Ю.Н. //Материалы международной конференции «Органическая химия для медицины». - Черноголовка. - 2008.- с.78-79.

2. Контаров H.A. Изучение вирусингибирующего действия борных производных адамантана в отношении вирусов гриппа. //Материалы Всероссийской конференции «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов». - Пермь. - 2008. - с.117-118.

3. Контаров H.A. Изучение противовирусного действия борных производных адамантана по отношению к различным штаммам вируса гриппа птиц. /Артюшенко C.B., Юминова Н.В. //Материалы международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». - Санкт-Петербург. - 2008. - с.14.

4. Маркушин С.Г. 1-бораадамантаны - потенциальные средства лечения и профилактики гриппа человека и птиц. / Контаров H.A., Акопова И.И., Коптяева И.Б., Артюшенко C.B., Бубнов Ю.Н. //Сб. научных трудов (вып.9) «Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней». - Москва. - 2009. - с.98-103.

5. Контаров H.A. Новый метод определения размеров и концентрации липосом. /Лотте В.Д., Контарова Е.О., Бадаев Н.В., Юминова Н.В., Зверев В.В. // ЖМЭИ. - 2009. - №6. - с.95-98.

6. Контаров Н.А. Изучение взаимодействия бораадамантана с вирусом гриппа птиц. /Артюшенко C.B., Маркушин С.Г., Бубнов Ю.Н., Лотте В.Д. // Биофизика. - 2010. - том 55. - Принята в печать.

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, 2-ой Автозаводский пр-д, д. ЗА Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Контаров, Николай Александрович

Список используемых сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.:.

1. Вирус гриппа.'.

1.1. Структура.

1.2. Серологические реакции.

1.3. Белки.

1.4. Углеводы.

1.5. Липиды.

1.6. Нуклеиновая кислота.

1.7. Цикл размножения.

1.8. Начальные стадии инфекции.

1.9. Сборка и выход вируса из клетки.

1.10. Неполный вирус.

1.11. Классификация вирусов гриппа.

1.12. Патогенез.

1.13. Химиотерапия гриппа.

2. Структурные и физико-химические свойства липосом.

3. Механизмы взаимодействия липосом с клетками.

4. Поляризация флуоресценции.

5. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК).

6. Электронная микроскопия липосом.

7. Методы определения размеров и концентрации липосом.

8. Поверхностный потенциал. Модель Гуи-Чепмена-Штерна.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Химиопрепараты.

2.2. Вирус.

2.3. Культуры клеток.

2.4. Получение липосом.

2.5. Измерение электрофоретической подвижности липосом.

2.6. Определение поверхностного давления.

2.7. Применение флуоресцентных зондов.

2.8. Гель-фильтрация и радиометрия меченных радионуклидами липосом.

2.9. Дифференциальная сканирующая калориметрия с одновременным измерением оптической плотности.

2.10. Определение титра вируса.

2.11. Опыты с лабораторными животными.

2.12. Электронная микроскопия.

2.13. Определение размеров и концентрации липосом.

2.14. Методы статистической обработки результатов.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Изучение биологических характеристик препарата БГ - 12 и его взаимодействия с липосомами электрохимическим методом.

3.2. Изучение вирусингибирующего действия свободных липосом и липосом нагруженных БГ-12.

3.3. Предобработка клеточного монослоя свободными липосомами и липосомами нагруженными БГ-12.

3.4. Изучение физико-химических механизмов взаимодействия бораадамантана с вирионами.

3.5. Физико-химический механизм взаимодействия липосом с вирионами гриппа.

3.6. Модельные эксперименты с мышами.

3.7. Электронная микроскопия.

3.8. Определение размеров и концентрации липосом.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы ингибирующего действия борных производных адамантана и липосом в отношении вирусов гриппа"

Экономический ущерб, причиняемый гриппом и ОРВИ, составляет около 86% от экономических потерь, наносимых инфекционными болезнями. ВОЗ прогнозирует появление в ближайшие годы нового антигенного варианта вируса гриппа, что может привести к развитию пандемии с 4-5 кратным ростом заболеваемости. В течение 2005 года отмечаются изменения в эпидемиологии гриппа среди животных.

Продолжают возникать случаи заболевания людей, вирус распространился географически на новые страны. Так, особую актуальность приобретает грипп птиц. Грипп птиц высококонтагиозная вирусная инфекция, которая может поражать все виды пернатых. Для птиц грипп является энтеральной инфекцией; сильно поражаются паренхиматозные органы, особенно селезенка, также страдают легкие. К настоящему времени известно, что носителями вируса гриппа птиц H5N( могут являться практически все известные дикие птицы водного и околоводного комплекса [2]. В значительно меньшей степени среди птиц на данный момент циркулирует серотип H7N7 (вирус чумы птиц), последняя эпидемия была зарегистрирована в 2003 году в Голландии среди домашней птицы, также этим вирусом было заражено 88 человек, работавших на птицефермах, хотя вирус вызывал у них лишь коньюктивит [8].

Домашние птицы сильно восприимчивы к штаммам вируса гриппа б

H5Ni, летальность доходит до 100%. При этом самые чувствительные -куры, особенно цыплята. За период с января 2004 года по 23 августа 2009 года в мире зарегистрировано 237 случаев птичьего гриппа, вызванных вирусом А/ H5Nb из них 137 (58%) закончились летальным исходом; также 246 тыс. случаев в мире, зараженных вирусом A/H]Nb из них 3700 закончились летальным исходом [9]. Во Вьетнаме зарегистрировано 90 случаев, в Таиланде - 24, Камбодже - 6, Индонезии - 60 и в Китае - 20. Единичные случаи заражения человека данным штаммом были в США, Канаде, Турции. В замороженном инфицированном мясе птиц вирус сохраняется около года. Термическая обработка убивает вирус.

Целью данной работы являлось изучение физико-химических механизмов вирусингибирующего действия новых препаратов производных бораадамантана и липосом по отношению к нескольким штаммам вируса гриппа птиц, а также теоретическое и экспериментальное определение оптимальных концентраций данных препаратов.

Целью настоящей работы являлась разработка теоретических и научно-практических основ для создания, оценки и применения липосом, борных производных адамантана и их комплексов, направленных на лечение и профилактику гриппозной инфекции.

Задачи исследования:

2. Определить нетоксический диапазон концентраций и характеристики связывания бораадамантана с липосомами.

5. Разработать методику определения размера и концентрации липосом.

Научная новизна. Автором впервые применен нанотехнологический подход с целью подбора биодеградируемого носителя (липосомы) и нетоксического диапазона концентраций для новой группы противовирусных препаратов - борных производных адамантана (бораадамантана). Впервые определен наиболее оптимальный липидный состав нативных липосом и липосом в комплексе с бораадамантаном для слияния с клетками и вирионами. Для контроля качества нанотехнологического процесса получения липосом был разработан и апробирован на практике новый метод оценки размеров и концентрации липосом. Впервые выявлены физикохимические механизмы, обуславливающие выраженное вирусоингибирующее действие бораадамантана в нетоксическом диапазоне концентраций, связанные с изменением фазового состояния липидной мембраны вириона, а именно, повышение температуры фазового перехода липидов, входящих в состав мембран вирионов.

Автором показано выраженное вирусоингибирующее действие нативных безхолестериновых липосом и липосом в комплексе с бораадамантаном и выявлен физико-химический механизм данного явления, заключающийся в экстракции холестерина липосомами из мембран вирионов. Процесс экстракции был зафиксирован двумя 8 методами: гель-фильтрацией с радиоактивно меченными липосомами и вирионами и по изменению величины поляризации флуоресцентных зондов. Все это свидетельствовало об уменьшении микровязкости липидных мембран вирионов. При низкой микровязкости липидных мембран вирионов нормальный процесс слияния вирионов с клеткой невозможен. Вирусоингибирующее действие используемых в работе препаратов было показано также на зараженных авирулентным для человека серотипом H5N2 вируса гриппа лабораторных животных (линейные мыши) достоверным снижением смертности после введения различных доз бораадамантана, нативных липосом и в комплексе с бораадамантаном различными способами.

Практическая значимость работы. Работа имеет большое народно-хозяйственное значение. Возможное применение используемых в работе химиопрепаратов в качестве лечения гриппа вызовет снижение заболеваемости в случае эпидемии и пандемии. А также сведет практически на нет необходимость прогнозирования появления нового штамма вируса за счет мутаций, так как вектор вирусоингибирущего действия данных химиопрепаратов направлен на липидную мембрану вируса, а не на антигенные белки, как многие имеющиеся на сегодняшний день лекарственные препараты. Использование наночастиц - липосом в качестве биодеградируемого нетоксического носителя позволяет их примененять с целью пролонгирования действия многих противовирусных препаратов. Разработанный метод оценки качества получения дисперсии липосом, основанный на определении по спектру мутности взвеси определять размеры и концентрацию липосом, позволит стандартизовать липосомальные дисперсии по размерам.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Контаров, Николай Александрович

Выводы:

2. Разработана и апробирована на практике новая методика оценки размеров и концентрации липосом.

6. На лабораторных животных, зараженных авирулентным для человека, серотипом H5N] с дозой заражения 21g и 41g ЭИД50/мл показано достоверное снижение смертности после введения

83 одинаковых доз бораадамантана, нативных липосом и их комплексов с бораадамантаном различными способами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Контаров, Николай Александрович, Москва

1. Кингсбери Д.У. Орто- и парамиксовирусы и их репликация. В кн.: Вирусология. В 3-х томах/ под ред. Б.Филдс, Д.Найпа. М.: Мир, 1989. -Т.2. - С. 446-486.

2. Львов Д.К. Популяционные взаимодействия в биологической системе: вирус гриппа А дикие и домашние животные — человек: причины и последствия проникновения на территорию России высокопатогенного A/H5N,//:)KM3H. - 2006. - №3. - С. 96 - 100.

3. Львов Д.К. Грипп А: эпидемию можно предупредить // Животноводство России. 2005. - №9. - С. 6-8.

4. Кингсбери Д.У. В кн.: Вирусология. В 3-х томах/ под ред. Б.Филдс, Д.Найпа. -М.: Мир, 1989. Т. 1. - С. 128 - 145.

5. Ершов Ф.И., Киселев О.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). М.: ГЭОТАР - Иедиа, 2005. - 356 с.

6. Киселев О.И., Исаков В.А., Шаронов Б.П., Сухинин В.П. Патогенез тяжелых форм гриппа // Вестн. РАМН. 1994. - №9. -С.32-36

7. Колобухина Л.В. Новые стандарты лекарственной терапии гриппа //РМЖ. -2005. №21. - С. 1429-1431.

8. Слепушкин А.Н., Львов Д.К., Маринич И.Г. и др. Эпидемиологические особенности гриппа последних лет // Вопр. Вирусол. 1998. - №2. - С.59-62.

9. Федякина И.Т., Ямникова С.С., Галегов Г.А., Львов Д.К. Действия специальных противовирусных препаратов на репродукцию вирусов гриппа птиц А/Н5, изолированных в России // Вопр. Вирусол. 2005. - №4. - С.35-37.

10. Верещагин, А.Г. Биохимия триглицеридов / А.Г. Верещагин. -М.: Наука, 1972.-308 с.

11. Вилкова, С.А. Товароведение и экспертиза парфюмерно-косметических товаров. М.:Деловая литература. — 2000. — 47 с.

12. Владимиров, Ю.А. Мембранные липиды// Пат. физиол. 1989. -№4.-С. 7- 18.

13. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. М.: Наука, 1972.-252 с.

14. Влияние продуктов перекисного окисления липосомальных липидов наантибактериальную активность липосом /Л.П. Мельянцева, В.М. Крейнес, Т.И. Шраер идр. // Антибиотики и химиотерапия.-1999. -Т. 37, № 11 .-С.8-10.

15. Воронков, В.Н. Исследование механических свойств кожи человека в норме и припатологических состояниях: Автореф. дис. . канд. биол. наук / В.Н. Воронков. -Пущино: Б.и., 1993. 21 с.

16. Гевренова, Р. Современните фитохимични и фармакологични познания за сенниковите растения, использовани в народната медицина / Р. Гевренова, И. Асенов // Фармация. 1995.-Т.4.-С. 31 -37.

17. Гончарова, Т.П. Энциклопедия лекарственных растений: (лечение травами): В 2-х тт.Т.1.-М.: Изд. Дом МСП. 1998. - 560 с.

18. Горболенко, Е.А. Экономика и конкурентоспособность / Е.А. Горболенко, И.А Коровкин // Партнеры и конкуренты. 2000. - № 9. -С. 15-17.

19. Букринская А.Г. Вирусология. М., 1986.

20. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа.Вып.1 / МЗ СССР. 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987. -336 с.

21. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. Вып.2 / МЗ СССР. 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989. - 400 с.

22. Дудниченко, А.С., Краснопольский, Ю.М., Швец, В.И. Липосомальные лекарственные препараты в экспериментальной клинике. Харьков. Изд. Группа «РА - Каравелла»,2001.-144 с.

23. Ефременко, В.И. Липосомы (получение, свойства, аспекты применения в биологии и медицине) Ставрополь: Б.и., 1999. - 263 с.

24. Ефременко, В.И. Липосомы (получение, свойства, аспекты применения в биологии и медицине) / В.И. Ефременко. -Ставрополь: Б.и., 2001. 236 с.

25. Иванова, Н.Н., Петров, В.И., Каплун, А.П., и др. Физиологически активные липиды // Вестн. АМН СССР. 1990. - № 6 .-С. 38-40.

26. Интенсивный метод экстрагирования кумаринов из корней SeseliGrandivitatum / М.А. Балабуткин, Э.М. Агаев, А.З. Абышев и др. // Хим. фармац. журн. - 1993. - №3. - С. 47.

27. Использование в клинической медицине липосомальных форм лекарственных препаратов / В.Ф. Антонов, Ю.А. Князев, Ю. Машковский и др. // Сов. медицина. 1983. - №5. С. 59-63.

28. Исследование по улучшению состава и технологии производства лечебно-профилактических средств, предназначенных для ионофореза / Л.М. Кузякова, Э.Ф.

29. Степанова, А.В. Умнов, и др. // «Человек и лекарство», российский нац. конгр. (9; 2002; Москва). Материалы / IX Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». М., 2002. - С. 644-645.

30. Калантаевская, К.А. Морфология и физиология кожи человека. — К.: Здоровья, 1972. -267с.

31. Корсуи, В.Ф., Ситкевич, А.Е., Ефимов, В.В. Лечение кожных болезней препаратами растительного происхождения: Справочник. Минск: Беларусь. 1995.- 383с.

32. Крепе, Е.М. Липиды клеточных мембран. Ленинград: Наука, 1981.-339 с.

33. Крейтис, М. Техника липидологии / М. Крейтис. М.: Мир, 1975. - С. 258-286.

34. Краснопольский, Ю.М., Степанов, А.Е., Швец, В.И. Некоторые аспекты технологии получения липосомальных форм лекарственных препаратов./ Ю.М. Краснопольский, А.Е. Степанов, В.И. Швец. // Химико-фармацевтический журнал.- 1999. -С. 20-23.

35. Кузякова, Л.М. Липосомы в медикаментозном преодолении клеточных и анатомических барьеров / Л.М. Кузякова // Фармация на современном этапе проблемы и достижения: Сб.науч. трудов / НИИФ. 2000. - Т. 39. - С. 70-77.

36. Кузякова, Л.М. Методологические подходы и разработка технологии липосомальных лекарственных и лечебно-профилактических препаратов: Дис. . д-ра фарм. наук / Л.М. Кузякова. Пятигорск: Б.и., 2000. - 326 с.

37. Кучеренко, Н.Е. Липиды / Н.Е. Кучеренко, А.Н. Васильев. -Киев: Вища шк. Головное изд-во, 1985. 247 с.

38. Лившиц, И.М. Стандартизация, метрология и сертификация: Учебник / Лившиц И.М. М. : Юрайт., 2004. - 330 с.

39. Липосомы в биологических системах / Под ред. Г. Грегориадиса,

40. A. Аллисона, М.: Медицина, 1983. - 384 с.

41. Липосомы и перспективы их использования в прикладной иммунологии/ Г.С. Власов,

42. B.Ф. Салов, В.П. Торчилин и др. //ЖМЭИ.-1982.- N 8.- С. 12 19.

43. Локализация а-токоферола в гидрофобной зоне липидного бислоя / В.Е. Каган, В.И.

44. Скрыпин, Е.А. Сербинова и др. // Докл. АН СССР. 1986. - Т. 288, № 5.- С. 1242-1245.

45. Лопатин, П.В. Коростин, Б.И. Ультраэмульсия как лекарственная форма управляемой доставки лекарственных веществ. Биологически активные эмульсии в эксперименте иклинике. / П.В. Лопатин, Б.И. Коростин // Сб. науч. Трудов. М. -1983.-С. 179- 185.

46. Марголина, А.А., Эрнандес Е.И., Зайкина, О.Э. Новая косметология. Издат. Дом «Косметика и медицина». - М. - 2000. -204 с.

47. Марголина, А.А. Липидный барьер кожи и косметических средств / А.А. Марголина, Е.И. Эрнандес, О.Э. Зайкина // Косметика и медицина. М. - 2002. - 9 с.

48. Марголина, А.А., Эрнандес, Е.И. Возможности косметологии в лечении акне // Косметика и медицина. 2003. №1. - С. 38-45.

49. Марголис, Л.Б. Липосомы и их взаимодействие с клетками / Л.Б. Марголис, Л.Д. Бергельсон. М.: Наука, 1986. - 240 с.

50. Маркин, B.C. О первичном акте в процессе слияния мембран /

51. B.C. Маркин, М.М. Козлов // Биофизика. 1983. -Т. XXVIII, вып.1.1. C. 72-77.

52. Методические рекомендации по иммобилизации в липосомы веществ различной природы, стерилизации и стабилизации липосом: Утв. МЗ РФ 06.04.2000г. / В.И. Ефременко,

53. Т.В. Таран, JI.M. Кузякова и др. Ставрополь: Б.и., 2000. - 46 с.

54. Мичник, О.В. Исследование реологических свойств мазей, содержащих различные фитокомплексы / О.В. Мичник, Э.Ф. Степанова, В.В. Гладышев // Фармация. 1993. - Т. 1.-С. 21-24.

55. Молчанов, Г.И. Интенсивная обработка лекарственного сырья / Г.И. Молчанов. М.: Медицина, 1981. - 205 с.

56. Николаев, А.Я. Биологическая химия /А.Я. Николаев. М.: Медицинское информационное агентство, 2001.- 496 с.

57. Новый подход к клинической оценке парфюмерно-косметической продукции / А. А.

58. Кубанова, В.Н. Федорова, И.И. Богатырева и др. // «Биологически-активные вещества и новые продукты в косметике», междунар. конф. (1996; Москва).Тез. докл. междунар. конф. -М., 1996.-С. 62.

59. Орлова, Г.Л. Микробиология.- М.: Медицина, 1979. 315 с.

60. Парций Я.Е. Комментарий к правилам торговли. М. : Юрайт., -2003.-37 с.

61. Пат. 2053763 РФ, МПК 6 А61К7/48. Биологически-активная добавка для косметических изделий / Некрасова В.Б., Курыгина В.Г., Никитина Т.В. и др. (РФ). 7 с.

62. Петрухин, А.Т. «Флавоноидосодержащие растения, используемые в косметике» //

63. Косметика и медицина, 2003. №3,- С. 46-54.

64. Пугачев, С.В. Стандартизация : проблемы и перспективы развития // Стандарты и качество. 2003. - № 3. - С. 12-17.

65. Рахманов, M.JI. О создании национальной системы аккредитации в Российской Федерации // Сертификация. 2003. - № 2.-С. 6-7.

66. Рубцов А.В. и др. Как делают проекты специальных технических регламентов. М. : Регламент. 2003. - 37с.

67. Руководство по методам исследования, технологическому контролю и учету производства в масложировой промышленности: В 6т./ Под ред. В.П. Ржехина, А.С. Сергеева.

68. Л.:ВНИИЖ, 1967. Т. 1, кн. 1.-585 с.

69. Слетов, Н.В. Врачебная косметика / Н.В. Слетов.- М. Наука, 1928.-45 с.

70. Степанов, А.Е. Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Физиологически активные липиды. М.: - Наука. - 1991.- 136 с.

71. Тимко, В.Я., Панкина,Г.В. Проведение сертификации продукции посредством процедуры признания // Сертификация. 2000. -№ 1. -С. 32-34.

72. Трейер, В.В. Национальная система стандартизации : какой она должна быть // Стандарты и качество. 2003. - №8. — С.38-47.

73. Удянская, И.Л. Антиоксидантная защита / И.Л.Удянская // Сырье и упаковка. 2001. - № 1 (И).-С. 20-21.

74. Хертель, Б. Молекулярные и клеточные механизмы естественного старения и фото старения (стрессорные факторы, защитные механизмы) / Б. Хертель // Косметика имедицина. 2000. - № 4. - С. 5 - 17.

75. Ципоркина, И.В. Практическая косметология для всех. Лучшие методики / И.В. Ципоркина. СПб: Питер, 2002. - 224 с.

76. Швец, В.И., Степанов А.Е., Крылова В.Н. Мио-инозит и фосфоинозиты.- М.- Наука.- 1987.- 240 с.

77. Швец, В.И., Краснопольский, Ю.М., Каплун, Ю.М., Степанов А.Е. Биотехнологические направления в создании лекарственных и диагностических препаратов липидной природы.// Вопросы мед. химии, 1997.- С. 416-424.

78. Элькина, Б.И., Каплун, А.П., Швец, В.И. Липидные препараты//Хим.- фарм. журнал 1986. 1988.- № 2. - С.72-77.

79. Aekermann, H.-W., Dibow, M.S. Viriuses of procariotes // Y.l. General properties of bacteriofages. CRC Press Boca Raton Fl. 1987. -P.151-154

80. Allenby, A.C. / A.C. Allenby, N.H. Creasey, J.A.G. Edginton et al. // Brit. J. Derm. 1969. - 81, Suppl. 4. - P. 47.

81. Chen H., Deng G., Li Z. et al. The evolution of H5Ni influenza viruses in ducks in southern China // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. -Vol. 101. P. 10452-10457.

82. Arnold, J. A simple procedure for preparation of REV-liposomes /J.Arnold, A.I.Deev // Virology. 1985. - Vol. 40, № 11. - P. 808 - 809.

83. Clerk J., Fuller F., Bishop D. Tick-borne viruses structurally similar to orthomyxoviruses //Virology. 1983. Vol. 127. - P. 205-219.

84. Bangham, A.D. Negative Staining of Phospholipids and their Structured Modification by Surface Agents as Observed in the Electron Microscope / A.D. Bangham, R.W. Home //J. Mol.Biol. 1964. - Vol. 8. - P. 660-668.

85. De Jong M. D., Hein T.T. vian influenza A// J. Clin. Virol. 2006. -Vol. 35.-P. 2-13.

86. Guan Y., Poon L.L., Cheung C.Y. et al. H5N1 influenza: a protean pandemic threat // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - Vol. 101. - P. 8156-8161.

87. Guan Y., Shortridge K. F., Krauss S., Webster R. G. Molecular characterization of H9N2 influenza viruses: were they the donors of the «internal» genes of H5N1 viruses in Hong Kong // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P.9363-9367.

88. Kawaoka Y., Krauss S., Webster R.G. Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza 1 viruses in the 1957 and 1968 pandemics //J. Viriol. 1989. - Vol. 63. - P.4603-4608.

89. Stevens J., Corper A.L. Basler C.F., et al. Structure of the uncleaved human HI hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus //Science. 2003. - Vol.21. - P. 1744-1748.

90. Webster R.G., Bean W.J., Gorman O.T. et al. Evolution and ecology of influenza A viruses //Microbiol. Rev. 1992. - Vol. 56. - P. 152-179.

91. Koopmans M, Wilbrink В., Conyn M. et al. Transmission of H7N7 avian influenza A virus to human during a large outbreak in commercial poultry farms in the Netherlands //Lancet. 2004. - Vol. 393. - P. 587593.

92. Oxvord J.S., Hockley D.J. Ortomyxoviridse. In: Animal virus structure. London, 1987. - P. 213-232.

93. Semple A.B. Epidimiology of the influenza epidemic in Liverpool in 1950-1951 //Proc. R. Soc. Med. 1951.-Vol.44. - P. 794-796.

94. Walters J.H. Influenza 1918: the contemporary perspective // Bull. NY Acad. Med. 1978. Vol. 54. - P. 855-864.

95. Fountain,M.W.Glyceraldehyde-3-phosphat-dehydragenasepromote Ca2+dependent fusion of liposomes and secretion sinpermeabilyzed neutrophis / M.W. Fountain, S.J. Stoehr, D.I. Margolis //J. Cell.Biol. -1990.-Vol. Ill, №5. -P. 77.

96. Gains, N. Characterisation of small unilamellar vesicles produced in imsonicated phosphatidic acid and phosphatidylcho-lin-phosphatidic acid dispersions by pH adjustment / N. Gains, H. Hauser// Biochim. Et biophys. acta. 1983. - Vol. 731. - P. 31 -39.

97. Gregoriadis, G. Comparative effect and fate of non-entrapped and liposome-entrapped neuraminidase injected into rats / G. Gregoriadis, D.Putnamn, L. Louis // Biochem. J. 1974. - Vol. 140. - P. 323-330.

98. Crommelin, D., Schreier, H. Liposomes in Colloidal Drug Delivery Systems./ D. Crommelin,, H. Schreier // Kreuter J. (Ed.) Marcel Dekker, New York. 1994. P. 73 - 157.

99. Gibson J R Rationale for the development of new topical treatments for acne vulgaris // Biochim. Et biophys. acta. 1996. - Vol. 57. - R 9-13.

100. Hayashi, K. Fractionation of alfa and gamma linolenik acid enriched triacylglicerols from vegetable oils by column chromatografthy on silic acid / Hayashi K. //Yukagaku. 1993. - Vol. 42- P. 942.

101. Hexsel, D.M. SURGICAL ROUNDS: subcision: a treatment for cellulite / D.M. Hexsel, R. Mazzuco Int J. Dermatol. 2000. - 39(7). - P. 539-544.

102. Jizomoto, H. Encapsulation of drugs bylyiphilized, emptydipalmitoylphosphatidylcholineliposomes / H. Jizomoto, E. Kanaoka, K. Hirano // Chem. And Pharm. Bull. 1989. - Vol. 37, № 7. -P. 1895-1898.

103. Kantor, H.L. Fusion of phosphatidylcholine bilayer vesicles. Role of free fatty acids / H.L. Kantor, J.H. Prestegard // Biochemistry. 1978. -Vol. 17.-P.

Информация о работе

Контаров, Николай Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.02

Диссертация

Механизмы ингибирующего действия борных производных адамантана и липосом в отношении вирусов гриппа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы