Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизмов вирусингибирующего действия соединения 1 - бораадамантана (БГ-12) на модели вируса гриппа

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов вирусингибирующего действия соединения 1 - бораадамантана (БГ-12) на модели вируса гриппа"

На правах рукописи

\

ПОГАРСКАЯ Ирина Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ВИРУСИНГИБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ СОЕДИНЕНИЯ 1 - БОРААДАМАНТАНА (БГ-12) НА МОДЕЛИ ВИРУСА ГРИППА

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

005553806

2 3 ОКТ 2014

МОСКВА - 2014

005553806

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

КОНТАРОВ Николай Александрович

доктор биологических наук профессор кафедры фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета РУДЫ

ГРЕБЕННИКОВА Татьяна Владимировна

доктор медицинских наук заведующий лабораторией детских вирусных инфекций ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»

ЛАВРЕНТЬЕВА Ирина Николаевна

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Официальные оппоненты:

Защита диссертации состоится «20» ноября 2014 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, по адресу: г. Москва, Малый Казенный переулок, д. 5А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук. Адрес сайта: www.instmech.ru

Автореферат разослан « » октября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И.В.Яковлева

Актуальность проблемы

Острые респираторные вирусные инфекции, в том числе и грипп, образуют наиболее распространенную группу патологии, которая в структуре инфекционной заболеваемости занимает 95 - 97%. (WHO, 2013).

Ежегодно в России эти инфекции поражают от 10 до 40 % всего населения. Материальный ущерб от гриппа превышает затраты на все остальные инфекционные заболевания вместе взятые. (WHO, 2013,2014).

Гриппозная инфекция у человека определяется сложными взаимодействиями нескольких факторов, включая вирулентность и генетическую специфичность вируса, иммунитет хозяина и, возможно, как генетические факторы, так и факторы внешней среды, которые влияют на передачу вируса в человеческой популяции. Для гриппа характерна определенная сезонность с наивысшей активностью зимой и ранней весной. Факторы окружающей среды в этот период могут иметь значение для передачи вируса гриппа. Такие часто возникающие клинические осложнения, как пневмония, вторичные бактериальные инфекции или обострения имеющейся патологии, опасны для лиц пожилого возраста и пациентов с хроническими заболеваниями (Юминова Н.В. и др., 2012).

На сегодняшний день трудно назвать в мире страну, в которой не были отмечены случаи заболевания гриппом, вызванные пандемическим вирусом H1N1 - 2009 (Львов Д.А. и др., 2011). В связи с быстрым распространением вирусных инфекций и формированием резистентности ко многим лекарственным средствам, химиотерапия в текущей практике лечения инфекционных заболеваний начинает играть все возрастающую роль (Чучалин А.Г., 2009, Деева Е.Г., 2008).

Вакцинопрофилактика единственный на сегодняшний день метод управления гриппозной инфекцией. Она наиболее эффективна. Однако, в связи с высокой способностью вируса к точечным мутациям, особенно поверхностных белков, вирус очень быстро уходит от вакцинного пресса (Зверев В.В., Юминова Н.В., 2012).

На сегодняшний день медицина имеет в своем распоряжении относительно небольшой перечень высокоспецифических противовирусных средств (химиопрепаратов), которые получили международное признание (Киселев О.И., 2013). Одной из основных задач клинической фармакокинетики, является поддержание оптимальной концентрации лекарства в месте действия - оптимизации фармакотерапии. Противовирусное лекарственное средство, которое используется в медицинской практике, обязательно должно отвечать двум требованиям. Во-первых, оно должно действовать не только на определенный этап репродукции вируса, хотя в идеале этот эффект должен носить строго избирательный характер без общего воздействия на организм, и иметь «свой терапевтический коридор». Во-вторых, сочетание с такими уникальными свойствами должно иметь оптимальную биодоступность при

его применении, и минимум побочных эффектов. Концентрация противовирусного препарата должна постоянно поддерживаться в организме пациента в процессе всего курса применения и его действие должно быть направлено на конкретный, узкий этап (стадию) репликационного цикла вируса. Этиотропные противогриппозные лекарственные средства (химиопрепараты) представлены следующими группами: блокаторы М2 каналов вируса гриппа А («Амантадин», «Ремантадин»); ингибиторы нейраминидазы вируса гриппа А и В («Озельтамивир», «Занамивир»); препараты с расширенным спектром действия («Рибавирин» и «Арбидол»); неспецифические препараты («Циклоферон» и «Афлубин»); «Ингавирин®». К препаратам с узким, направленным механизмом действия относят «Амантадин», «Ремантадин» и их аналоги (Киселев О.И., 2013, Дроздов И.Г., 2009).

Радикальных средств для лечения гриппа на сегодняшний день не существует. Основными факторами отсутствия таких химических веществ является природная изменчивость вирусной популяции, высокая вариабельность генома и генетическая предрасположенность к многочисленным точечным мутациям.

В связи с этим, важно осуществлять поиск химиопрепаратов, воздействующих на вирусную мембрану.

Каркасные фрагменты (би- или полициклы, кольца которых содержат более 2 общих атомов) используются для создания физиологически активных веществ. За счёт этого в органоборанах происходит ограничение конформационной подвижности молекулы, направленное увеличение липофильности соединения с целью улучшения его фармакологических характеристик (Маркушин С.Г., Бубнов Ю.Н, 2010, Морозов И.С., 2001).

Одним из таких препаратов является борное производное адамантана - соединение 1-бораадамантан (БГ-12). Атом бора -электрофильный центр молекулы. БГ-12 - это уникальная структура с тетраэдрическим (пирамидальным) атомом бора. В отличие от всех имеющихся на сегодняшний день химиопрепаратов, данное соединение изменяет физико-химические свойства постоянной в эволюционном отношении вирусной мембраны, а также вызывает инактивацию РНК - зависимой РНК - полимеразы, основного вирусного фермента. Вирулицидные свойства БГ-12 превосходят свойства «Ремантадина» в 10 раз (Маркушин С.Г, Лотте В.Д., 2009). Важным аспектом является также выбор способа доставки данного соединения непосредственно в дыхательный тракт. Одним из способов доставки может быть аэрозольный. Поражения дыхательного эпителия при гриппе требуют внедрения в практику аэрозольных препаратов с высокой локальной эффективностью и низким резорбтивным действием. Причём с использованием именно мицеллярных аэрозолей, которые могут оказывать

сами по себе вирусингибирующее действие по аналогии с липосомами (Контаров Н.А., 2010).

Цель исследования

Исследование механизмов вирусингибирующего действия 1-бораадамантана (БГ-12) на модели вируса гриппа, и разработка способа доставки БГ-12 в дыхательный тракт с помощью мицеллярных аэрозолей.

Задачи исследования

1. Определение количественных характеристик противовирусной активности БГ-12 в отношении вируса гриппа А.

2. Изучение кинетики изменения активности РНК - зависимой РНК - полимеразы вируса гриппа после взаимодействия с различными концентрациями БГ-12.

3. Изучение влияния БГ-12 на вирусную мембрану с помощью фосфолипидных монослоев.

4. Разработка флуоресцентного метода для изучения изменения структурно - функционального состояния вирусных белков после взаимодействия с различными химиопрепаратами на примере гемагглютинина вируса гриппа.

5. Получение экспериментального мицеллярного аэрозоля в комплексе с БГ-12.

6. Оценка эффективности экспериментального мицеллярного аэрозоля в комплексе с БГ-12 с помощью частиц латекса в респираторных органах мышей, инфицированных А/ВЧП/Вейбридж (Н7Ы7), А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (Н5Ы2), А/ШВЯС-14 (Н5Ш).

Научная новизна

Впервые проведена оценка вирусингибирующего действия БГ-12 в диапазоне концентраций 1-12 мкг/мл.

Изучена кинетика изменения активности РНК - зависимой РНК - полимеразы вируса гриппа после взаимодействия с различными концентрациями БГ-12.

Впервые проведено изучение влияния БГ-12 на вирусную мембрану с помощью фосфолипидных монослоёв.

Впервые разработан флуоресцентный метод для изучения структурно - функционального состояния вирусных белков на примере гемагглютинина вируса гриппа.

Создан экспериментальный мицеллярный аэрозоль в комплексе с БГ-12 из мицеллярных фосфолипидных эмульсий.

Определены физико-химические характеристики аэрозоля.

Впервые проведена оценка эффективности экспериментального мицеллярного аэрозоля в комплексе с БГ-12 с помощью частиц латекса на модели респираторных органов лабораторных животных (мышей), инфицированных А/ВЧП/Вейбридж (Н7Ш), А/Маллард

Пенсильвания/102/18/84 (ГОШ), А/№В1Ш-14 (Н5 N1).

Теоретическая и практическая значимость

Работа имеет прикладное значение. Возможное применение химиопрепарата 1-бораадамантана (БГ-12) для лечения и профилактики гриппа может вызвать снижение заболеваемости в случае эпидемии и пандемии, а также сведет на нет необходимость прогнозирования появления нового штамма вируса за счёт мутаций, так как вектор вирусингибирующего действия, используемых в работе химиопрепаратов, направлен на фосфолипидную мембрану, а не на антигенные белки, как многие имеющиеся на сегодняшний день лекарственные препараты. Разработанный в работе флуоресцентный метод позволит определять изменения структурно - функционального состояния вирусных белков при взаимодействии с различными химиопрепаратами.

Личный вклад автора

Автором был выполнен основной объём работ по всем разделам диссертации, проведён анализ использованной литературы и полученных данных, подготовлены материалы по основным публикациям, сформулированы выводы диссертации.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены на:

научных сессиях ФГУ "НИИ пульмонологии" ФМБА России (г. Москва, 2011 и 2012 гг.);

конференции молодых учёных и специалистов ФГБУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (г. Москва, 2012, 2013гг.);

научной сессии "Пироговские чтения" ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (г. Рязань, 2012 г.);

IV Съезде Биофизиков России (г. Нижний Новгород, 2012 г.);

научно-практической конференции "Простуда и Грипп" (г. Москва, 2012 г.);

22-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (г. Москва, октябрь, 2012 г.);

17-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология- наука XXI века" (г. Пущино, 2013 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований), заключения, выводов, списка публикаций по теме диссертационной работы, библиографического указателя (143 источника, из них 67 отечественных и 76 иностранных), раздела с благодарностями. Работа изложена на 105 страницах машинописного текста включая 19 рисунков, 9 таблиц и 5 электронно- микроскопических фотографий.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Химиопрепараты

В работе использовали производное 1-бораадамантана - соединение БГ-12 (ФГУН Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН). В данном соединении фрагмент адамантана соединён координационной связью с атомом бора, радикалы представлены органическими группами - Я и Я' (рис. 1).

Рисунок 1.1-Бораадамантан

Лабораторные животные

В работе было использовано 680 мышей линии Ва1Ь/с массой 8 - 10 г. (ИБК РАН, МО, РФ, г. Пущино). Всего было взято 8 групп мышей, по 85 мышей в каждой группе. Группы: 1-я группа - контроль (без инфицирования и введения аэрозолей); 2-я группа - мыши, инфицированные вирусом А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (Н5Ш); 3-я группа - мыши, которым вводили мицеллярные аэрозоли (без инфицирования); 4-я группа - мыши, инфицированные вирусом А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (Н5К2) + введение мицеллярных аэрозолей в комплексе с БГ-12 в концентрации 2 мкг/мл; 5-я группа - инфицированные мыши вирусом А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (Н5Ш) + введение аэрозолей в комплексе с БГ-12 в концентрации 4 мкг/мл; 6-я группа -инфицированные мыши вирусом А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (Н5И2) + введение аэрозолей в комплексе с БГ-12 в концентрации 6 мкг/мл; 7-я группа - инфицированные мыши вирусом А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (Н5Ш) + введение аэрозолей в комплексе с БГ-12 в концентрации 8 мкг/мл; 8-я группа - инфицированные мыши вирусом А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (Н5Ш) + введение аэрозолей в комплексе с БГ-12 в концентрации 10 мкг/мл.

Вирусы

В работе использовались очищенные в градиенте сахарозы штаммы вируса гриппа: А/ВЧП/Вейбридж (Н7Ы7), А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (Н5К2), А/1Ч1ВЯС-14 (Н5Ы1) со средним исходным инфекционным титром 4,5^ ± 0,2 ТЦЦ5о/мл. Вирусы были получены на 10-ти дневных куриных эмбрионах.

В работе были использованы вирусы авирулентные для человека.

Титрование вирусов

С целью определения ЦПД вирусы гриппа титровали в перевиваемой культуре клеток линии МБСК (состав поддерживающей среды: питательная среда ЯРМ1-1640 (ФГУП «НПО «Микроген» РФ), ТРСК-трипсин (три-тозил-1-фенилаланилхлорэтилкетон) в конечной концентрации 2 мкг/мл, пенициллин - стрептомицин (С1Ьсо, США), 10% фетальная бычья сыворотка (С1Ьсо, США), концентрация клеток составляла (2,0 ± 0,3) х 105 кл/мл и определялась с помощью камеры Горяева. Инфекционный титр по ЦПД рассчитывался по методу Рида-Менча. Контроль вируса (инфекционный титр) в МОСК составил 4,7 ± 0,3 ТЦД50/МЛ. Исследования за кинетикой снижения инфекционного титра проводилось в течение 7 суток. Множественность заражения для всех вирусов составляла 0,01 ТЦЦ 50/кл.

Электронная микроскопия

Для исследования нативного препарата вируса гриппа в электронном микроскопе проводили адсорбцию материала на формваровой пленке, стабилизированной углеродом. После трехкратной промывке ФБР №2 (рН = 7,2), материал контрастировали фосфорновольфрамовой кислотой (рН = 7,0-7,2). Для исследования вирулицидного действия БГ -12 в концентрации 10 мкг/мл в отношении вируса гриппа сначала на плёнке адсорбировали вирусные частицы, затем сеточку с пленкой помещали на каплю с раствором, содержащим БГ-12 и в течение 5 мин инкубировали при 37° С.

Определение противовирусной активности

Противовирусную активность препаратов оценивали по следующим показателям:

1) инфекционному титру по ЦПД;

2) уровню подавления цитотоксической активности вируса под воздействием БГ-12. Уменьшение уровня накопления вируса под влиянием препарата ( А 1§ТЦЦ50/мл) определяли по формуле:

Д=Ак-Ао (1).

где: Ак - уровень накопления вируса при культивировании без внесения в питательную среду изучаемого препарата ТЦД50/мл); А0 - уровень накопления вируса при культивировании с внесением в питательную среду изучаемого препарата ТЦЦ 50/мл);

3) коэффициенту ингибирования

Коэффициент ингибирования (Ки, %) рассчитывали по формуле:

Ки = ((АК01пр - Аоп) /Аконтр) х100% (2),

где: А контр - уровень накопления вируса при культивировании без внесения в питательную среду изучаемого препарата (lg ТЦД50/мл); Аоп - уровень накопления вируса при культивировании с внесением в питательную среду изучаемого препарата (lg ТЦД5о/мл), (Небольсин В.Е., 2009);

4) коэффициенту подавления ЦПД (Небольсин В.Б., 2009)

Определение активности вирионной РНК - зависимой РНК - полимеразы вируса гриппа (А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (H5N2))

Активность РНК-зависимой РНК - полимеразы вируса гриппа можно обнаружить, добавляя к вирионам буфер, рибонуклеозидтрифосфаты, двухвалентные катионы и детергент для пермеабилизации оболочки вириона (Мейхи Б, 1988).

Фосфолипидные монослои

Для получения монослоев из фосфатидилхолина (Sigma, США) с конечной концентрацией фосфатидилхолина (рис. 2) 1 мг/мл была использована оригинальная установка, состоящая из тефлоновой ванны Ленгмюра с размером 200x200x1 мм, весов Ленгмюра, неподвижного и снимающего барьера.

Рисунок 2. Фосфатидилхолин

При движении снимающего барьера монослой оказывает определённое давление на тефлоновую пластинку весов, которая передаётся через торсионную нить на ИК- датчик (РФ).

Напряжение с ИК - датчика и электропривода (координатора барьера) вводится в компьютер. Установка обеспечивает точность измерения поверхностного давления F = 0,05 мН/м.

Готовили растворы БГ-12 на бидистиллированной воде в нетоксических концентрациях 10~7- 10"6 М, с целью добавления на поверхность монослоя.

Получение мицеллярных фосфолипидных эмульсий

Получение мицеллярных фосфолипидных эмульсий осуществляли по методу (патент Арчаков А.И., Гусева М.К., Учайкин В.Ф. и др., ГУ НИИ БМХ РАМН). Для получения первичной эмульсии суспензировали 20 г фосфатидилхолина («Sigma», США) в водном растворе мальтозы («Sigma», США) объемом 400 мл. БГ-12 добавляли к мицеллярным эмульсиям в конечных концентрациях 5 и 10 мкг/мл.

Основные характеристики мицеллярных фосфолипидных эмульсий

Светопропускание фосфолипидных эмульсий

Определение светопропускания фосфолипидной эмульсии проводили с помощью спектрофотометра Zenith 200st (РФ) при длине волны 660 нм.

Определение размеров мицелл в фосфолипидной эмульсии

Размеры мицелл в фосфолипидных эмульсиях определяли по методу (Контаров H.A., 2009) с помощью спектрофотометра Zenith 200st (РФ).

Стабильность мицеллярных фосфолипидных эмульсий

Стабильность мицеллярных фосфолипидных эмульсий оценивали по изменению размеров частиц в зависимости от срока хранения (при температуре t = 4°С, 140 суток).

Определение дзета - потенциала мицелл фосфолипидных эмульсин

Определение дзета - потенциала мицелл фосфолипидных эмульсий проводили с помощью определения электрофоретической подвижности мицелл. Электрофоретическая подвижность определялась методом микроэлектрофореза с помощью прибора Zetasizer-2 (Англия).

Дзета - потенциал определяли исходя из значений электрофоретической подвижности мицелл (Контаров Н.А., 2010).

Получение экспериментальных мицеллярных аэрозолей из фосфолипидных эмульсий

Экспериментальные мицеллярные аэрозоли получали путём распыления шлиф - порошка, состоящего из окиси алюминия (корунда), мицелл, БГ-12 и водной суспензии латексных частиц (ИБК РАН, г. Пущино, МО).

Концентрацию латексных частиц измеряли с помощью импинджера. Экспериментальные мицеллярные аэрозоли вводили с помощью установки, описанной в работе (Жуков В.А., 2010).

Первичная культура клеток легких мышей

Получение первичных культур клеток легких мышей осуществляли по методу (Жуков В.А., 2010). Концентрация клеток легких мышей составила (2,1 ± 0,1) х 106кл/мл.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов осуществляли с применением методов параметрической статистики и однофакторного дисперсионного анализа, используя пакет программ 81а115Йса 6.0.

Соответствие распределения выборки нормальному определяли по критерию Колмогорова - Смирнова.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Определение количественных характеристик противовирусной активности БГ-12 в отношении вируса гриппа.

Первым этапом исследований явилось изучение количественных характеристик противовирусной активности БГ-12 в отношении вируса гриппа (на примере штамма А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (Н5Ш)).

Таблица 1. Определение коэффициента подавления цитотоксической активности вируса для различных концентраций

препарата БГ-12

Препарат Концентрация препарата, мкг/мл Культура клеток Коэффициент подавления ЦПД, %

БГ-12 10 МБСК 75,6 ± 3,1

БГ-12 5 МБСК 56,4 ± 1,0

Наиболее выраженное ингибирующее действие наблюдалось при концентрации препарата БГ-12 в значении 10 мкг/мл.

Таблица 2. Определение коэффициента ингибирования для различных концентраций препарата БГ-12

Препарат Концентрация препарата, мкг/мл Культура клеток Коэффициент ингибирования, (Ки)%

БГ-12 10 МБСК 75,6 ± 3,1

БГ-12 5 МБСК 56,4 ± 1,0

Из данных таблицы 2 видно, что наибольшее значение Ки соответствует концентрации БГ-12 - 10 мкг/мл.

При изучении влияния препарата на уровень подавления ЦПД вируса в культуре клеток МБСК было установлено, что наиболее выраженный уровень подавления накопления вируса наблюдался при концентрации препарата 10 мкг/мл (табл.3).

Таблица 3. Определение уровня подавления ЦПД вируса для различных концентраций препаратов БГ-12

Препарат Концентрация препарата, мкг/мл Культура клеток Уровень подавления накопления вируса, А1§ ТЦД50/МЛ

БГ-12 10 МЭСК 4,5 ±0,2

БГ-12 5 МБСК 3,2 + 0,1

Изучение кинетики изменения активности РНК - зависимой РНК - полимеразы при взаимодействии с БГ-12

Были получены графические зависимости кинетики изменения, активности фермента при взаимодействии с БГ-12 в концентрациях 5 и 10 мкг/мл (рис 3.).

2,5

5 5

1,5 ■

0,5

0,5

I } i

1 1,5

Время,ч

I }

2,5

Кривая 1 - контроль фермента.

Кривая 2 - добавление БГ-12 в конечной концентрации 5 мкг/мл.

Кривая 3 - добавление БГ-12 в конечной концентрации 10 мкг/мл.

Рисунок 3. Определение активности вирионной РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса гриппа (использование затравки Арв 0,5 мМ)

Из полученных результатов можно сделать вывод, что препарат обладает ингибирующей активностью в отношении РНК-зависимой РНК - полимеразы. Следует отметить, что, химиопрепарат БГ-12 в концентрации 10 мкг/мл оказывает наиболее выраженное ингибирующее действие в отношении фермента РНК - зависимой РНК - полимеразы.

Электронная микроскопия вируса гриппа после взаимодействия с БГ-12.

Было проведено электронно - микроскопическое исследование нативного вирусного вируса гриппа (А/ВЧП/Вейбридж (Н7Ш), А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (Н5ГО), А/ШВЯС-М (Н5Ш)) и после добавления к вышеперечисленным вирусным препаратам соединения БГ-12 в концентрации 10 мкг/мл с целью выявления наличия его вирулицидного действия.

На рисунке 4 представлена электронная микрофотография контрольного образца нативного вируса гриппа А/ВЧП/Вейбридж (Н7Ы7).

На данной микрофотографии видны морфологически целостные вирионы вируса гриппа с неизменёнными гемагглютининами.

Рисунок. 4. Вирус гриппа (А/ВЧП/Вейбридж (Н7Ш)). Контроль.

Увеличение 170000х.

После добавления к контролю БГ-12 в концентрации 10 мкг/мл было выявлено выраженное вирулицидное действие данного соединения (рис. 5), заключающееся в разрушении гемагглютинина и поверхностных мембран вирионов, деформации вирусных частиц вплоть до их полного разрушения.

Рисунок. 5. Определение вирулицидного действия БГ-12 (10 мкг/мл) в системе in situ, время обработки 1,5 часа, температура обработки 37° С (штамм А/ВЧП/Вейбридж (H7N7)). Увеличение 220000х.

Изучение влияния БГ-12 на вирусную мембрану с применением фосфолипидных монослоев

По экспериментально определённым значениям поверхностного давления (Г) и площади приходящейся на одну молекулу фосфолипида (А) построены Р-А диаграммы (рис. 6.).

А, (ангстрем)А2

Рисунок 6. Зависимость поверхностного давления мономолекулярной пленки из фосфатидилхолина от площади на молекулу

Добавление БГ-12 в концентрациях 10"6- 10"7 М достоверно изменяло поверхностное давление монослоя фосфолипидной плёнки: кривая 1 - контроль; кривая 2 - получена при добавлении БГ-12 в концентрации 10'7 М; кривая 3 получена при добавлении БГ-12 в концентрации 10" М. Полученные результаты указывают на увеличение площади, приходящейся на одну молекулу фосфатидилхолина. Увеличение площади, приходящейся на одну молекулу, может приводить к изменению частоты латеральной диффузии фосфолипидов в клеточной мембране. Исходя из зависимости (3):

V = 2 л/3~ (3),

А

где: у - частота латеральной диффузии, О - коэффициент диффузии, А - площадь, приходящаяся на одну молекулу фосфолипида.

Можно сделать вывод об уменьшении частоты латеральной диффузии при увеличении площади, приходящейся на одну молекулу фосфатидилхолина.

Уменьшение частоты латеральной диффузии молекул фосфолипида к поверхностности монослоя приводят к конформационным изменениям молекул фосфатидилхолина в монослое, итогом которых может являться невозможность слияния мембраны вирусной частицы и клетки, необходимого для дальнейшего размножения вируса.

Разработка флуоресцентного метода для изучения структурно - функционального состояния вирусных белков на примере гемагглютинина вируса гриппа

С помощью метода тушения собственной флуоресценции белка исследовано влияние фосфолипидов на конформационное состояние гемагглютинина (НА). Показано, что взаимодействие НА с модельными фосфолипидными мембранами сопровождается изменением структурно - динамической организации белка. Изучение механизмов образования белок - липидных комплексов имеет большое прикладное значение, а именно, при разработке противовирусных препаратов с мембранотропным действием (Контаров H.A. и др., 2011). В качестве липидных комплексов были выбраны липосомы разного фосфолипидного состава. Липосомы по своей структуре схожи с мицеллами, в которые встраивается БГ-12, при получении экспериментальных мицеллярных аэрозолей. Однако, о механизмах взаимодействия гемагглютинина (НА) вируса гриппа с липосомами и мицеллами на данный момент ничего не известно. В связи с чем, проведено изучение влияния нейтрально и отрицательно заряженных фосфолипидов липосом на структурно - динамические свойства молекулы НА с помощью метода тушения собственной флуоресценции белка. Используемые в работе нейтральный и анионные фосфолипиды в составе липосом выбраны с целью выявления общих механизмов их воздействия, не зависящих от заряда, на структурно-динамическую организацию гемагглютинина.

Был использован НА из вируса серотипа H3N2 («Sigma», Германия). Липосомы из фосфатидилхолина (ФХ) и его смесей (2:1) с кардиолипином (КЛ) или фосфатидилсерином (ФС) («Sigma», Германия) получали озвучиванием липидных суспензий в течение 3 минут при 5°С на частоте 22 кГц с помощью диспергатора УЗДН - 1 (РФ). Для исследования влияния фосфолипидов на конформацию НА использовали катионный тушитель Cs+ (CsCl) и нейтральный тушитель акриламид («Merk», Германия).

Диаметр везикул, определялся по методу (Контаров и др., 2012) и составлял 90 ±1,5 нм. Молярное соотношение белок: липид в 0,01 М трис -HCl, pH = 7,4 составляло 1:90 при концентрации белка 2 мкМ. Перед измерением белковой флуоресценции липосомы отделяли с помощью фильтрации (фильтры Millipore, dnOp=80 нм). Измерения проводили на спектрофлуориметре Zenyth-200St (РФ) при длине волны возбуждения 290 нм. Интенсивность флуоресценции регистрировали при 325 нм. Данные по тушению флуоресценции НА внешними тушителями анализировали с помощью уравнения Штерна - Фольмера (4), так как оно позволяет регистрировать динамическое тушение флуорофора, связанное со структурно-динамическими свойствами белковых молекул:

F/F0=1+KSV[Q], (4),

где: F0. F - интенсивности флуоресценции в отсутствие и в присутствии тушителя; Ksv - константа Штерна - Фольмера; [Q] - концентрация тушителя.

На рисунках 7а и 76 приведены графики Штерна - Фольмера для тушения собственной флуоресценции НА в буфере и в комплексе с липосомами.

Q,M

1 - НА + смесь ФХсФС (2:1);

2 - НА + смесь ФХ с КЛ (2:1);

3 - НА + ФХ;

4 - НА (контроль).

Рисунок 7а. Графики Штерна-Фольмера для тушения флуоресценции гемагглютинина акриламидом

а,м

1 - НА (контроль);

2 - НА + липосомы.

Рисунок 76. Графики Штерна-Фольмера для тушения флуоресценции гемагглютинина ионами цезия

Из графиков (рис. 7а и 76) можно видеть, что взаимодействие с фосфолипидными везикулами сопровождается заметным возрастанием эффективности тушения флуоресценции остатков триптофана акриламидом, в то время как катионный тушитель практически не тушит флуоресценцию. Низкая эффективность тушения флуоресценции НА ионами Сб+ обусловлена доступностью тушителю слабо флуоресцирующих остатков. При связывании белка с липосомами участки полипептидных цепей, содержащие эти остатки, по-видимому, погружаются в гидрофобную зону и становятся малодоступными для ионов Предполагается,

что основной вклад в собственную флуоресценцию белка вносят по нашим данным в основном остатки триптофана (Лакович Дж, 1986). Нейтральный тушитель - акриламид - способен тушить флуоресценцию хромофоров как поверхностную, так и внутреннюю. Диффузия акриламида во внутреннюю белковую матрицу определяется двумя факторами: конформационными флуктуациями белка в наносекундном диапазоне и локальным развёртыванием белковой молекулы. Наблюдаемое повышение доступности остатков триптофана акриламиду при образовании комплекса НА с липосомами является следствием изменения динамического состояния белковой глобулы. В таблице приведены значения константы

Штерна -Фольмера рассчитанные по данным рисунков 7а и 76 как тангенсы угла наклона соответствующих зависимостей с помощью метода наименьших квадратов для тушения флуоресценции НА с акриламидом.

Таблица 4. Значения констант Штерна - Фольмера для тушения флуоресценции НА акриламидом (р<0,05)

Система НА НА+ФХ НА+ФХ + К Л НА+ ФХ + Ф С

к8У,м4 1,48 ±0,031 2,14 ±0,022 2,3 ±0,025 2,95 ± 0,028

Из приведенных данных следует, что с нейтральными ФХ - везикулами НА обладает большей структурной жёсткостью, чем в комплексе с заряженными липосомами.

С помощью метода тушения собственной флуоресценции белка впервые выявлены структурно-функциональные изменения НА вируса гриппа при взаимодействии с липосомами, связанные с нарушением третичной структуры белка, обусловленным межмолекулярным взаимодействием фосфолипидов и НА. Таким образом, полученные результаты могут быть применены при изучении структурно-функциональных изменений вирусных белков после взаимодействия с химиопрепаратами различной природы.

Основные характеристики экспериментальных мицеллярных фосфолипидных эмульсий

Светопропускание мицеллярной фосфолипидной эмульсии для мицелл размером 40 нм при длине волны 660 нм составило 72 %, что соответствует требованиям Государственной фармакопеи РФ, издание XI.

Размер мицелл, определённый по спектру мутности мицеллярных эмульсий составил в среднем 41 ± 2 нм.

Дзета - потенциал фосфолипидных мицелл.

Известно, что устойчивость коллоидных растворов наблюдается при значениях дзета - потенциала большем 30 мВ по абсолютному значению.

В таблице 5 представлены значения дзета-потенциала для свободных мицелл и в комплексе с 1-бораадамантаном в конечных концентрациях 5 и 10 мкг/мл.

Таблица 5. Значения дзета - потенциала фосфатидилхолиновых мицелл

(р<0,05)

Препарат Дзета-потенциал, мВ

Свободные мицеллы(ФХ) - 42 ± 3

1-бораадамантан (5 мкг/мл) + мицеллы ФХ -48 ±2

1-борадамантан (10 мкг/мл) + мицеллы ФХ - 52 ±2

Стабильность фосфолипидных мицеллярных эмульсий

Стабильность мицеллярных фосфолипидных эмульсий оценивали по изменению размеров частиц в зависимости от срока хранения (при температуре = 4°С, 140 суток).

60

С

§

*

о -е-

а

ф §

50

40

§ 30 =г

I 20

10

50 100

Время хранения, сут.

150

Рисунок 8. Зависимость стабильности мицеллярных фосфолипидных эмульсий от срока хранения

Из графика видно, что размеры фосфолипидных мицелл при указанных условиях практически не менялся вплоть до 90 суток. В дальнейшем произошло незначительное увеличение размеров мицелл, однако, это изменение не является критическим. В целом фосфолипидные мицеллярные эмульсии оказались стабильными в указанном интервале времени срока хранения.

Определение коэффициента осаждения мицеллярного аэрозоля с БГ-12 в респираторном тракте мышей с помощью частиц латекса

Всего было взято 8 групп мышей, по 85 мышей в каждой группе (п = 680). Животным одновременно вводили мицеллярный аэрозоль, содержащий БГ-12 в конечных концентрациях 2 - 10 мкг/мл. После введения аэрозоля животных умерщвляли и извлекали лёгкие, далее проводили гомогенизацию тканей. Из 100 мкл гомогената готовили мазки на покровных стёклах для подсчёта частиц латекса под люминесцентным микроскопом. Абсолютное число латексных частиц в легких мышей составило 442 ± 2,5. Доза мицеллярного аэрозоля при интраназальном введении составила 50-70 мкл на мышь. Размер аэрозольных частиц 3 ± 0,02 мкм. Следующим этапом исследования было титрование вируса из гомогената ткани лёгких мышей в культуре клеток МОСК., с определением инфекционного титра вируса (табл.6) и определение константы оседания мицеллярных аэрозолей в респираторных органах мышей (табл.7). Из полученных результатов видна кинетика снижения инфекционного титра вируса при увеличении в мицеллярных аэрозолях в комплексе с БГ-12 в концентрациях от 2 мкг/мл до 10 мкг/мл.

Таблица 6. Концентрационная зависимость инфекционного титра для экспериментальных мицеллярных аэрозолей в комплексе с БГ-12 на примере вируса гриппа (А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (Н5Ш)) в лёгочной ткани мышей (р <0,05)

Концентрация БГ-12, мкг/мл ТЦД50/мл

2 5,2 ± 0,7

4 5,0 ± 0,6

6 4,6 ± 0,5

8 4,0 ± 0,5

10 3,5 ± 0,2

Таблица 7. Зависимость констант оседания Ка для экспериментальных мицеллярных аэрозолей в комплексе с БГ-12 на примере вируса гриппа (А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (Н5Ш)) в лёгочной ткани мышей

(р <0,05)

Концентрация БГ-12, мкг/мл Константа оседания, Ка

5 2,8 ± 0,3

10 2,6 ± 0,2

Расчёт коэффициента осаждения Ка в лёгких проводили по формуле:

Ка = И/ (\У IР), (5),

где: Р - средняя концентрация латексных частиц в аэрозоле (4,0 ± 0,1) х 102 частиц/л, I - время экспозиции (25 мин), XV - минутный объём дыхания мышей (23,0 ± 0,40 см 3/мин), N - количество латексных частиц в легких (442 ± 2,5).

Полученные данные Ка (табл. 7) отражают достаточно высокую эффективность оседания латексных частиц с мицеллярным аэрозолем в комплексе с БГ-12 в легких мышей (Жуков В.А, 2010), что указывает на возможность использования данного мицеллярного аэрозоля, содержащего БГ-12 с целью лечения гриппозной инфекции при непосредственном введении в дыхательный тракт.

ВЫВОД ы

1. Проведена количественная оценка вирусингибирующего действия БГ-12 для различных концентраций. Показано, что наиболее выраженное вирусингибирующее действие БГ-12 наблюдалось при концентрации 10 мкг/мл.

2. Выявлено ингибирование активности РНК - зависимой РНК - полимеразы под воздействием БГ-12 в концентрациях 5 и 10 мкг/мл, причём большее снижение активности наблюдалось при концентрации 10 мкг/мл.

3. Впервые с помощью фосфолипидных монослоев показаны структурно-функциональные изменения монослоя для различных концентраций БГ-12. Результатом этого может являться невозможность слияния мембраны вирусной частицы и клетки-хозяина, необходимого для дальнейшего размножения вируса.

4. Впервые разработан флуоресцентный метод для изучения структурно - функционального состояния вирусных белков на примере гемагглютинина вируса гриппа.

5. Впервые рассчитаны значения констант оседания мицеллярных аэрозольных частиц в комплексе с БГ-12 в дыхательном тракте мышей, указывающие на достаточно эффективное попадание аэрозольных частиц в ткани лёгких.

6. Показано достоверное снижение инфекционного титра вируса гриппа в легких мышей при введении мицеллярного аэрозоля в комплексе с БГ-12.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Погарская И.В., Контаров H.A., Бадаев Н.В., ЮминоваН.В. Исследование изменения структуры гемагглютинина вируса гриппа (НА) при взаимодействии с липосомами флуоресцентным методом. // «Биомедицинская химия». -2012. - Т.58 ,вып. № 2, с. 237-240.

2. Контаров H.A., Погарская И.В., Балаев Н.В., ЮминоваН.В. Изучение взаимодействия противовирусного препарата 1- бораадамантана с фосфолипидными монослоями как моделями мембраны вируса гриппа. // «Биомедицинская химия». - 2013. - Т.59, вып. № 5, с. 519-522.

3. N.A. Kontarov, I. V. Pogarskaya, Е.О. Kontarova, N.V. Balayev, N.V. Yuminova, V.V. Zverev, G.V. Arkharova, D.A. Efremov, M.E. Gurskiy, Yu.N. Bubnov. Investigation of the inhibition action of antiviral preparation 1-Boraadamantane concerning the flu virus. // «International Journal of Biomedicine» -v.3 (1) March 2013, p.44-46.

4. Погарская И.В., Контаров H.A., Контарова Е.О., Балаев H.B., Юминова H.B. Изучение вирусингибирующего действия Ингавирин® в комплексе с 1 - бораадамантаном в отношении вируса гриппа. // Материалы 1-й Научно-практической конференции «Простуда и Грипп» Москва-2012, сборник статей и тезисов, с. 13.

5. Контаров H.A., Погарская КВ., Балаев Н.В., Юминова Н.В. Изучение взаимодействия противовирусного препарата 1- борадамантана с фосфолипидными монослоями как моделями мембраны вируса гриппа. // Материалы IV Съезд Биофизиков России, Симпозиум I «Физико-химические основы функционирования биополимеров и клеток» -г. Нижний Новгород. - 2012 г., с. 148.

6. Погарская И.В., Контаров H.A., БалаевН.В., ЮминоваН.В. Исследование взаимодействия гемагглютинина вируса гриппа (НА) с липосомами флуоресцентным методом. // Материалы IV Съезд Биофизиков России, Симпозиум I «Физико-химические основы функционирования биополимеров и клеток» - г. Нижний Новгород. -2012 г., с. 237.

7. Контаров H.A., Погарская И.В., Юминова Н.В., Зверев В.В. Изучение поверхностно-активных свойств противовирусного препарата 1-бораадамантана с помощью фосфолипидных монослоёв. // Материалы 17-й Международной Пущинской школы - конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» - г. Пущино. - 2013 г., сборник статей и тезисов, с. 141.

8. Зверев В.В., Юминова Н.В., Контаров H.A., С.К. Александер, Е.О. Контарова, И.В. Погарская, Г.В. Архарова, Д.Е. Ефремов. Вакцинопрофилактика кори, эпидемического паротита и краснухи в России: проблемы и реалии. // «Инфекция и иммунитет». - Материалы Международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций».-2013.-Т.3,№ 2, с. 131.

9. Контарова Е.О., Юминова Н.В., Данилова В.В., Борисова Т.К., Никонова A.A., Контаров H.A., Александер С.К., Погарская И.В., Ковалёва Л.Г., Зверев В.В. Верификация вспышки эпидемического паротита на территории Удмуртской республики в 2008г. // «Инфекция и иммунитет». - Материалы Международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций». — 2013.-T.3, № 2, с. 141-142.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю и глубокую признательность директору ФГБУ НИИ ВС им. И.И. Мечникова РАМН, академику РАМН Звереву Виталию Васильевичу и заместителю директора по научной работе ФГБУ НИИ ВС им. И.И. Мечникова РАМН, доктору биологических наук Надежде Васильевне Юминовой за предоставленную возможность саморазвития и вклада в научную деятельность. Также автор благодарит своего научного руководителя кандидата биологических наук Николая Александровича Контарова за практическую и теоретическую помощь на всех этапах работы.

Также автор выражает признательность всему коллективу лаборатории детских вирусных инфекций ФГБУ НИИ ВС им. И.И. Мечникова РАМН и отдельно заведующему лабораторией клеточных гибридом, доктору медицинских наук Нагиевой Фирае Галиевне и заведующему лабораторией генетики РНК-содержащих вирусов, доктору медицинских наук Станиславу Георгиевичу Маркушину за сотрудничество.

Теплые слова благодарности хочется выразить заведующему лабораторией электронно-микроскопических исследований, к.б.н. Лотте Вере Даниловне за помощь в подборе материалов и подробный анализ всей работы с высказанными ценными замечаниями и советами.

Особую благодарность хочется выразить сотрудникам Института Биофизики Клетки РАН (г. Пущино, МО, РФ) лаборатории механизмов рецепции: зав. лаб., член-корр. РАН профессору, д.б.н. Фесенко Евгению Евгеньевичу и к.б.н. Катаеву Анатолию Ахсарбековичу за плодотворное сотрудничество и предоставленные возможности для проведения практической части работы и высокий профессионализм.

Заведующему лабораторией биологии лентивирусов, к.б.н. Носик Марине Николаевне и к.б.н., ведущему сотруднику лаборатории диагностики вирусных инфекций Эбралидзе Лине Константиновне, за рецензирование диссертации и подробный анализ материалов автореферата.

Моим оппонентам Гребенниковой Татьяне Владимировне и Лаврентьевой Ирине Николаевне за подробный анализ всей работы.

Выражаю глубокую признательность и благодарность М. Алёшиной за профессиональное мастерство, индивидуальный подход и помощь в разрешении проблем, а также за оказанную практическую и теоретическую помощь на всех этапах работы.

Также я благодарна всем соавторам моих работ за помощь в проведении исследований.

И отдельная особая благодарность всей моей семье и моим самым близким друзьям за поддержку и предоставленные возможности в реализации проектов, связанных с научной деятельностью.

Подписано в печать 06.10.2014 г. Заказ № 1362 Тираж 85 шт. Отпечатано в типографии «АллА-принт» г. Москва, Лубянский пр-д., д.21, стр.5 www.allaprint.ru