Синтез и изучение противовирусных свойств соединений пептидной природы

Гараев, Тимур Мансурович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Синтез и изучение противовирусных свойств соединений пептидной природы
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Синтез и изучение противовирусных свойств соединений пептидной природы"

На правах рукописи

ГАРАЕВ Тимур Мансурович

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СВОЙСТВ СОЕДИНЕНИЙ ПЕПТИДНОЙ ПРИРОДЫ

03.0q.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 5 МЛ0Ш

Москва-2012

005014219

Работа выполнена в лаборатории антигенных детерминант вирусных белков и синтеза пептидов и в лаборатории онтогенеза вирусов Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития Российской Федерации

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Шибнев Владимир Александрович

доктор медицинских наук Бурцева Елена Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Галегов Георгий Артемьевич:

доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение |

науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук

Защита диссертации состоится «02» апреля 2012 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 00.020.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития Российской Федерации по адресу: 123098, г. Москва ул. Гамалеи,16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития Российской Федерации.

Автореферат разослан «I» оиа^х

2012г

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук,

Бурцева Е.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Важнейшей задачей современной науки является борьба с вирусными инфекциями, которая развивается в двух направлениях. Первое - поиск и создание химических препаратов, способных эффективно взаимодействовать непосредственно с вирусной частицей и тем самым ингибировать процесс ее репликации. Второе - поиск и создание нетоксичных веществ как природных, так и синтетических, способных активировать иммунную защиту организма, в частности за счет индукции интерферона.

Одной из актуальных проблем современной медицины является проблема гриппа. Ее сложность связана со способностью этих вирусов к легкой изменчивости структуры в результате мутаций, рекомбинаций и ассортации, приводящих к изменению биологических свойств.

Несмотря на всемирные усилия по созданию средств химиотерапии и вакцин пандемия 2009/2010 года, вызванная вирусом гриппа А(Н1К1)рс1ш2009, показала как их крайнюю ограниченность, так и недостаточную эффективность,. На сегодня имеется лишь два типа противогриппозных соединений - это производные сиаловой кислоты, являющиеся ингибиторами нейраминидазы (осельтамивир и занамивир), и производные адамантана (ремантадин и амантадин), которые ингибируют функцию протонпроводящего канала М2. У всех этих препаратов есть один существенный недостаток: в результате химического прессинга вирусные частицы, легко мутируя, приобретают устойчивость по отношению к ним. Так, к ранее достаточно эффективным препаратам адамантанового ряда у вирусов гриппа А в настоящее время выработалась практически 100%-ная резистентность.

Поэтому очень важна не только разработка новых антигрипозных препаратов, но и изучение путей «реанимации» активности соединений, утративших свои противовирусные свойства. Объектом такого исследования является синтез новых производных адамантанового карбоцикла на основе ремантадина, амантадина и адамантанкарбоновых кислот.

Вещества, способные стимулировать иммунную защиту организма, в частности индуцировать выработку интерферона, принадлежат к разным классам органических соединений, начиная от полифенола из масла хлопчатника (госсипол) и кончая пептидами из иммуноглобулинов (тафцин). Этих соединений довольно много, но лишь единицы из них рассматриваются как медикаментозные средства, что связано с их токсичностью.

Источниками нетоксичных иммуностимуляторов могут являться пептиды, содержащие аналоги природных аминокислот, такие как аминофосфиновые кислоты, а также пептидные фрагменты «шарнирной» области иммуноглобулинов класса в, которые легко выщепляются сериновыми протеазами. Такие синтетические пептиды будут представлять собой новый класс нетоксичных противовирусных соединений, подконтрольных иммунной системе организма.

Цели работы.

Исследование посвящено двум направлениям. Первое - преодоление резистентности вирусов гриппа А(Н11М1 )рс1т2009 и А(НЗЫ2) в отношении соединений ремантадина и амантадина модификацией их аминокислотными, пептидными и другими остатками. Второе - поиск и синтез соединений пептидной природы, способных индуцировать иммунный ответ в организме.

Задачи исследования

1. Синтезировать аминокислотные, пептидные и другие производные ремантадина, амантадина и адамантанкарбоновых кислот и исследовать их противовирусные свойства в отношении вирусов гриппа А(Н1Ш)р11т2009 и А(НЗЫ2).

2. Синтезировать новый тип потенциальных индукторов интерферона, включающих в свою структуру а-аминофосфиновые кислоты, и исследовать их активность в отношении вируса энцефаломиокардита мышей.

3. В качестве потенциального противовирусного соединения синтезировать гептапептидный фрагмент из «шарнирной» области человека, включающий остатки пролина и дисульфидную связь, и исследовать его противовирусные свойства в отношении вируса гриппа А.

Научная новизна работы.

1. Впервые осуществлен синтез производных адамантана (ремантадина, амантадина и адамантанкарбоновых кислот) с аминокислотными, пептидными и некоторыми другими остатками. Показано, что среди них есть ряд нетоксичных соединений, обладающих высокой противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А(Н1Ш)рс1т2009 и А(НЗЫ2), резистентных к действию амантадина и ремантадина.

2. Осуществлен синтез дипептидов, включающих нетоксичные а-аминофосфиновые кислоты. Впервые показано, что дипептиды, содержащие фосфоаланин, обладают способностью индуцировать интерферон.

3. По специально разработанной схеме синтеза был получен гептапептидный фрагмент из «шарнирной» области человека, включающий дисульфидную связь, который обладает противовирусной активностью в отношении вируса гриппа А(Н1Ш)р(1т2009.

4. На основе испытания синтезированных амидов трипептидов, включающих остатки иминокислот и глицина, показано, что противовирусный эффект амида Н-СНу-Рго-С1у-ОН в отношении ВИЧ-1 может реализоваться только в животной сыворотке, а не в сыворотке человека.

Практическая значимость работы.

1. Среди синтезированных производных адамантана обнаружены нетоксичные соединения с высоким уровнем противовирусной активности в отношении вирусов гриппа А(НШ1)рс1т2009 и А(НЗ№), что указывает на практическую перспективность использования этих соединений для расширения ассортимента медикаментозных противогриппозных средств. Показано, что введение дополнительных функциональных групп в молекулу препарата, утратившего противовирусные свойства, является одним из путей преодоления резистентности вирусной инфекции к этому препарату.

2. Синтезированые оригинальные пептиды, включающие остатки а-аминофосфиновых кислот, обладают иммуностимулирующими свойствами.

3. «Шарнирная» область иммуноглобулинов может быть источником иммуноактивных пептидов, которые представляют особую ценность в качестве нетоксичных противовирусных средств.

4. На примере Ы-ацилтрипептидов, включающих а-иминокислоты, исследованы и найдены оптимальные условия процесса амидирования пептидов при наличии в них лабильных пептидных связей.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Синтезированные новые производные адамантанового карбоцикла способны подавлять репликацию вирусов гриппа А(Н 1N1 )рёш2009 и А(НЗШ), резистентных к действию ремантадина. Противовирусный эффект достигается введением в

молекулы ремантадина, амантадина и адамантанкарбоновых кислот новых функциональных групп за счет аминокислотных, пептидных и других остатков.

2. Синтезированные фосфодипептиды, содержащие фосфиновый аналог аланина, способны индуцировать интерферон в высоком титре.

3. Разработанная оптимальная стратегия синтеза позволила получить гептапептид «шарнирной» области IgG человека, с хорошим выходом конечного продукта. Показано, что этот пептид обладает противовирусной активностью в отношении вируса гриппа A(HlNl)pdm2009.

4. Найдено, что оптимальным способом амидирования эфиров трипептидов, содержащих лабильные пептидные связи между остатками глицина и иминокислот, является их взаимодействие с сухим аммиаком в условиях реакции смешанных ангидридов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и опубликованы в материалах V Российского Симпозиума «Белки и пептиды» (г. Петрозаводск, 2011) и на Международной научно-практической конференции «Синтез, выделение и изучение комплексных свойств новых биологически активных соединений» (г.Душанбе, Таджикский национальный университет, 2011). Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 28 сентября 2009 года.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 6 сообщений, из них в ведущих лицензированных научных журналах и изданиях, определенных Высшей аттестационной комиссией - 4. Опубликованы тезисы докладов на одной российской и одной международной конференциях. Зарегистрирована патентная заявка в ФСИС № 2011115151 от 19.04.2011г.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения экспериментального материала, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 120 источников. Работа иллюстрирована 13 рисунками и содержит 29 схем и 40 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Синтез соединений. Соединения были получены методами классического пептидного синтеза с использованием реакций смешанных ангидридов и активированных эфиров. При синтезе пептидов и пептидных производных использовались L-аминокислоты фирмы Nova Biochem (США). Для синтеза адамантановых производных использовался рацемический ремантадин гидрохлорид фирмы Zhejiang Kangyu Pharmaceutical Со (Китай). Все полученные соединения были идентифицированы с помощью ТСХ на пластинах Silufol (Чехия) и Dc-Kieselgel 60 (Merck, Германия), а также посредством масс-спектрометрии на MALDI-TOF-времяпролетном масс-спектрометре Bruker UltraFlex II с программным обеспечением для сбора и обработки масс-спектров flexControl 1.1. и flexAnalys2.2. Удельное оптическое вращение полученных соединений определяли на автоматическом поляримерте А1-ЕПЛ (СССР) (1%-ный раствор в этиловом спирте, длина кюветы 0,5 дм). Температуру плавления полученных соединений измеряли на приборе «Boetius» VEB Analytik (ГДР). Данные ВЭЖХ для синтетических пептидных фрагментов IgG были получены на жидкостном хроматографе «Agilent 1100»(США) с масс-спектрометрическим детектором «Agilent 1100VL».

Клетки. В работе были использованы клеточные культуры MDCK, VERO и суспензионная культура клеток МТ-4.

Вирусы. Были использованы штаммы вируса гриппа А: пандемический A/IIV-Moscow/01/(HlNl)pdm2009, подобный эталонному варианту А/С alifomia/7/2009 (HlNl)swl, и А/Москва/26/2009 (H3N2), резистентные к ремантадину; вирус простого герпеса (ВПГ) типа 1, штамм J12; вирус ВИЧ-1 BRU и вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС), штамм Индиана.

Процент ингибирования вирусной репродукции синтезированными соединениями определяли in vitro методом ИФА по стандартной методике. Токсичность соединений определяли также in vitro на клеточной культуре колориметрическим методом, сравнивая оптическую плотность контрольной и исследуемой лунки.

1. Аминокислотные производные адамантанового ряда и их противовирусная активность в отношении вирусов гриппа A(HlNl)pdm2009 и A(H3N2). 1.1 Производные аминоадамантаное.

Изучение методом кристаллографии вирусного белка М2 гриппа А объяснило механизм противовирусного действия аминоадамантановых препаратов, которые за счет взаимодействия их аминогруппы с гидроксилом серина в положении 31 трансмембранной области белка М2 перекрывали канал, образованный этим белком, и тем нарушали нормальный ток протонов, необходимый для репродукции вируса. В результате мутации вируса остаток серина в положении 31 был заменен остатком аспарагина, из-за чего стало невозможным образование связи аминоадамантанов с этим участком белка М2.

Для преодоления резистентности вирусов гриппа к препаратам адамантанового ряда следовало снабдить молекулу дополнительными функциональными группами, которые могли бы взаимодействовать с другими аминокислотными остатками белка М2 , нарушая работу канала. Одним из источников таких групп являются нетоксичные аминокислотные, пептидные и другие остатки. Они являются естественными элементами для организма и способны образовывать любые межмолекулярные связи за исключением ковалентных, а также влиять на гидрофильно-гидрофобные взаимодействия молекул.

Для присоединения таких остатков использовали метод смешанных ангидридов, в условиях которого свободная аминогруппа аминоадамантана и карбоксильная группа аминокилоты образовывали амидную связь. Аминогруппу аминокислоты или пептида предварительно защищали трет-бутилоксикарбонильной (Вое-) или бензилоксикарбонильной (Z-) группами, которые впоследствии отщеплялись соответствующими методами (Схема 1 ).

сн. 1 Т

"СООН

ИБХФ

ыт

, г- с

R н3с-с-

н.с-

Н,С"

Схема I. Сннтез аминоадамантановых производных Вос-а ми но кислот методом смешанных ангидридов. МШ - М-метилморфолин, ИБХФ - изобутилхлорформиат, Я-боковая группа аминокислоты

Испытание противовирусных свойств производных адамантана проводили совместно с Лабораторией эпидемиологии и этнологии гриппа.

По схеме 1 был получен ряд аминокислотных производных (Табл.1), которые позволили выяснить влияние на противовирусную активность удаленности аминогруппы аминокислотного остатка от адамантанового карбоцикла, основности и гидрофобности вводимого аминокислотного остатка. Так, не проявили противовирусной активности производные с остатками алифатических аминокислот, таких как глицин, р-аланин, у-аминомасляная кислота (САВА) и даже саркозин (Баг), основность которого за счет аминометильной группы довольно высока (рКа 10,01). Однако в случае производных с у-аминомасляной кислотой (табл.1, соед.14) и саркозином (табл.1, соед.16), у которых аминогруппа защищена Вос-группой, противовирусная активность в отношении вирусов гриппа А(Н1М1)рс1т2009 и А(Н31М2) составляла 50 и 70% соответственно, что может указывать на особую роль увеличения гидрофобности молекулы.

н>с СН, О 0 С1

СН, ¿н, 0 сн>

Вос-САВА-Кеш (Н) Вос-гаг-Кет (16!

Таблица 1. Ингибирование репродукции вирусов гриппа А(Н1М)р<1т2009 и А(НЗ№) производными адамантана с остатками аминокислот и пептидов._ .

% ингибирования вирусной репродукции в

№ Соединение культуре клеток КШСК при

соед. концентрации соединений 5 мкг/мл

А(НШ1)рс1т2009 А(НЗЫ2)

1 Н-01у-Яеш 18 2

2 Вос-Иу-Яет 0 -

3 Н-А1а-Яет 0 -

4 Вос-А1а-Кеш 13 -

5 Н-р-А1а-Яет 20 -

6 Вос-р-А1а-Яет 0 -

7 Н-Уа1-Яет 28 -

8 Вос-Уа1-Яет 12 -

9 Н-Ьси-Кеш 31 0

10 Вос-Ьеи-Яет 27 -

11 Н-Ие-Яет 22 -

12 Вос-11е-Яет 29 -

13 Н-вАВА-Яет 0 -

14 Вос-ОАВА-Яет 48 52

15 Н-Заг-Яет 0 0

16 Вос-8аг-Яет 71 64

17 Н-01у2-Яеш 0 -

18 Вос-С1\2-Яет 0 -

19 Н-01уз-Яет 0 -

20 Н-Рго-Яет 11 13

21 Вос-Рго-Яет 7 -

22 Н-Ргог-Яеш 0 22

23 Вос-Ргог-Яет 9 -

24 Н-Ргоз-Яеш 9 12

25 Вос-Ргоз-Яет 0 -

26 Н-Авп-Яет 25 -

27 Вос-Азп-Яет 18 -

28 Н-01п-Яет 0 -

29 Н-Айр-Яет 4 -

30 Вос-Азр-Яет 37 -

31 Н-СЫ-Яет 0 -

32 В0С-О1и(ОВг1)-Яет 0 -

Дальнейшее отдаление аминогруппы от карбоцикла за счет пептидных остатков ди-и триглицина (табл.1, соед. 17-19) не привело к появлению противовирусной активности в отношении вирусов гриппа А. То же наблюдалось и в случае ди- и трипролиновых остатков, имеющих специфическую конформацию (табл.1, соед. 20-25)

Не обнаруживается активность и при использовании отдаленных амидных групп на примере аминокислотных остатков аспарагина и глютамина (табл.1, соед.26 и 27).

В случае присоединения к ремантадину остатков дикарбоновых кислот (аспарагиновой с рКа 3,86 и глютаминовой с рКа 4,25) восстановления противовирусной активности также не наблюдали ни при наличии свободных боковых карбоксильных групп (табл.1, соед. 29-31), ни в виде их бензиновых эфиров (соед.32). Лишь в случае соединения 30 активность составляла 37%.

Возможно, что отсутствие активности у производных ремантадина с алифатическими аминокислотными остатками могло быть следствием недостаточной основности молекулы. Поэтому были получены производные ремантадина с основными аминокислотами, содержащими дополнительную аминогруппу, такими как лизин, орнитин, цитруллин и аргинин. Но и соединения лизина с ремантадином (табл. 2, соед.1 и 2) как с открытыми аминогруппами, так и с блокированными оказались малоактивными (15-20%). Однако когда лизиновый остаток удален от карбоцикла на длину глицинового остатка, противовирусная активность возрастает до 34% (табл.2, соед.З).

мн,

нд

гг

Н-1_у5-С1у-Нет (3) снз Н^-С^-Кет (5)

п О

сн,

}Гг .. ,

NN. О ^Н

Н-1.уз-С1у3-Р?ет (7) СНз

Таблица 2. Ингибированне репродукции вирусов гриппа А производными ремантадина с остатками лизина.

№ соед. Соединение % ингибирования вирусной репродукции в культуре клеток МОСК. при концентрации соединений 5 мкг/мл

А(НШ1)рёт2009 А(НЗ№)

1 Н-Ьу5-Яеш 15 11

2 Вос-Ьу5(Вос)-Кет 23 -

3 Н-Ьу5-С1у-Яет 34 -

4 Вос-Ьу5(Вос)-01у-Яет 0 -

5 Н-Ьуз-Иуг-Яет 0 -

6 Вос-Ьу5(Вос)-01у2-Кеш 6 -

7 Н-Ьу5-а1у3-1*.ет 0 -

8 Вос-Ьуз(Вос)-01уз-Кет 0 -

9 Вос-Ьу5(Вос)-1.у5(2)-11ет 68 30

Дальнейшее отдаление аминогрупп лизина за счет аминокислотных остатков глицина (ди- и триглицина) не приводило к увеличению противовирусной активности соединении 5-8 (табл.2).

Синтезированное производное ремантадина, включающее дипептид лизил-лизин, в котором обе аминогруппы первого аминокислотного остатка закрыты Вос-группами, а е-аминогруппа второго остатка 2-группой (соед.9, табл.1), проявляет ингибирующую активность в отношении вируса гриппа А(Н1Ы1)рс1т2009 (68%), а для штамма А(НЗК2) активность лишь 30%. Размеры усредненного внутреннего диаметра поры канала М2 около 11 ангстрем, и объемное соединение 9, возможно, не способно проникнуть внутрь канала, но может взаимодействовать с его наружной частью.

Аналогом лизина может считаться аминокислота орнитин (От), в котором боковая группа короче на одно метиленовое звено. Этого оказалось достаточно, чтобы орнитин-адамантановое соединение с блокированными аминогруппами (табл.3, соед. 2) уже проявляло противовирусную активность на уровне 70%.

Вое-Огп{ВосН?«т (2) Вос-СЛ(Вос)-Квт (4)

Можно полагать, что в процессе ингибирования вирусов гриппа А(НЖ1)р(1ш2009 и А(НЗЫ2) существенную роль играет увеличение гидрофобности за счет Вос-группы.

Таблица 3. Ингибирование репродукции вирусов гриппа А производными адамантана с основными аминокислотами__

№ соед. Соединение % ингибирования вирусной репродукции в культуре клеток МОСК при концентрации соединений 5 мкг/мл

А(Н1Ш)р(1т2009 А(НЗ№)

1 Н-Ош-Яеш 0 6

2 Вос-Огп(Вос)-Кеш 71 66

3 Н-Сй-Яет 36 0

4 Вос-Сп(Вос)-11ет 53 25

В этом ряду рассматривается влияние на противовирусную активность и такого аминокислотного остатка, как цитруллин (Сй). Активность соединения 4 (табл.3) составляет 53%, что меньше активности Вос^аг-Лет (71%) и Вос-Огп(Вос)-Кет (71%).

Следующие аминокислотные остатки, которые могли повлиять на появление противовирусных свойств, - это аргинин и креатин (Сге), содержащие гуанидиновую группу (табл.4). Гуанидиновая группа благодаря делокализации заряда при протонировании проявляет сильноосновные свойства (рКа 12,48) и способна к образованию устойчивых водородных связей. Были синтезированы производные ремантадина с остатками аргинина и нитро-аргинина (табл.4, соед. 1-4). Однако гуанидиновая группа в соединении с карбоциклом оказалась неспособной влиять на транспорт протонов в канале белка М2 ни в свободном, ни в блокированном виде.

Таблица 4. Ингибирование репродукции вирусов гриппа Л производными адамантана, содержащими

% ингибирования вирусной репродукции в

№ Соединение культуре клеток МЭСК при

соед. концентрации соединений 5 мкг/мл

A(HlNl)pdm2009 A(H3N2)

1 H-Arg-Rem 25 -

2 Z-Arg(Z2)-Rem 0 -

3 Boc-Arg(N02)-Rem 0 -

4 Boc-Arg-Rem 0 -

5 H-Cre-Rem 35 43

6 Boc-Cre-Rem 38 47

И только в случае производного с остатком креатина противовирусная активность проявлялась в отношении обоих штаммов как для соединения со свободной аминогруппой (35 и 43%), так и с Вое- защищенной (38 и 47%) (табл. 2, соед.5-6).

к т v3^ TJ h3C^Vh

H-Arg-Rem (1) H-Cre-Rem (5) нэ° ° Boc-Cre-Rem (В)

Возможно, отсутствие активности в случае аргининового остатка и наличие ее у креатинового производного связано со структурной особенностью молекулы последнего. Она менее громоздка по сравнению с объемной молекулой производных аргинина, что позволяет ей взаимодействовать с белками канала М2 вируса гриппа А.

Особый интерес представляло присоединение к ремантадину остатка гистидина, имеющего имидазольную группу с подвижным атомом водорода (рКа 6). Она вносит в молекулу существенные изменения, в результате чего активность соединения H-His-Rem уже составила более 90% (табл.5, соед.1) в отношении обоих штаммов вируса гриппа А. В работе протонного насоса белка М2 вируса гриппа остатки гистидина в трансмембранной области белка М2 участвуют в регуляции потока протонов, поэтому присутствие дополнительного остатка гистидина в поре канала может нарушать нормальный ток протонов ввиду возникающей конкурентной реакции протонирования имидозольного кольца.

Таблица 5. Ингибирование репродукции вирусов гриппа А производными адамантана с остатками

гистидина и тирозина.

A(HlNl)pdm2009 A(H3N2)

1 H-His-Rem 91 94

2 Boc-His-Rem 33 37

3 H-His-AmAd' 23 26

4 Boc-His-AmAd 29 31

5 H-Tyr(Bzl)-Rem 90 95

6 Boc-Tyr(Bzl)-Rem 5 -

Возможно, что имидазольная группа является той структурой, которая позволяет соединению 1 (табл.5) осуществлять донорно-акцепторные взаимодействия с

Am Ad- остаток I-аминоаламантана

функциональными группами белка М2, Поэтому в случае блокировки а-аминогруппы остатка гистидина обнаруживается снижение активное™ соединения (менее 37%) в отношении обоих штаммов.

Н (-1 I

ЪУ

Н!С НС О

Н-Н1а-Яет (1) СН, Boc.His.Rein (2)

Гистидил-1-аминоадамантан (табл.5, соед.З и 4), у которого в сравнении с гистидил-ремантадином отсутствует метиленовое звено при адамангановом карбоцикле, был не способен в достаточной мере ингибировать репродукцию вируса гриппа (29-31%). Возможно, что снижение активности связано с утратой молекулярной подвижности между аминокислотным остатком и адамантановым карбоциклом.

И.

'IV

°=< нл-1 .

«■а

снз Вос-Н|'5-АтА* (4]

с остатками фенилаланина и тирозина Однако была отмечена значительная роль

N' H2N

H-His-AmAd (3)

В ряду производных ремантадина противовирусная активность не проявлялась, тирозинового остатка, в котором гидроксил был защищен бензильной группой (соед.6, табл.3). Это соединение не проявляло активности в отношении вируса гриппа A(HlNl)pdm2009. Напротив, соединение 5 (табл.5) со свободной a-аминогруппой было очень эффективным в отношении обоих штаммов (90-95% при 5 мкг/мл). Однако начиная уже с 20 мкг/мл, жизнеспособность клеток нарушалась.

В синтезе производных ремантадина также были использованы серосодержащие аминокислоты, такие как метионин, цистеин, таурин (Таи), а также липоевая кислота (тиоктовая, TOA) (табл.6). Соединения метионина с ремантадином (соед 1, 2, табл.6) не проявляли активности ни с открытой аминогруппой, ни с блокированной. То же самое наблюдается и для производного цистеина с открытой тиольной и a-аминогруппой (соед. 4). Однако когда тиольная группа цистеина была блокирована ацетамидометильной (Асш) группой, а a-аминогруппа была свободной (соед. 3), то такое соединение уже проявляло противовирусную активность в отношении обоих штаммов порядка 50%.

Таблица 6. Ингабирование репродукции вирусов гриппа А производными амнноадамантана с

A(HlNl)pdm2009 A(H3N2)

1 H-Met-Rem 8 15

2 Boc-Met-Rem 10 -

3 H-Cys(Acm)-Rem 45 51

4 H-Cys-Rem 0 -

5 TOA-Rem 78 88

6 H-Tau- Rem 76 71

7 Boc-Tau- Rem 30 41

ТОА-Регп (5) Н-Таи^ет (в)

В случае производного ремантадина с остатком липоевой кислоты (табл.6, соед.5), в молекуле которой имеется длинная углеводородная цепочка с циклической дисульфидной группой, способной при определенных условиях размыкаться с образованием дисульфидной связи, возникает значительный противовирусный эффект (78 и 88%) в отношении обоих штаммов вируса гриппа А.

Интересно проявление противовирусных свойств у производнного ремантадина с остатком таурина со свободной аминогруппой (табл.6, соед. 6), которое подавляло развитие вирусов обоих штаммов более чем на 70%, в то время как то же производное с Ы-защищенным таурином (табл.6, соед.7) было менее активно (30-41%).

1.2 Производные адамантанкарбоновых кислот.

В качестве перспективных противовирусных соединений представляли интерес адамантанкарбоновые кислоты, которые тоже могли использоваться для получения аминокислотных производных.

При получении производных адамантанкарбоновых кислот амидная связь образовывалась уже за счет взаимодействия карбоксильной группы адамантанкарбоновых кислот и аминогруппы аминокислот или диаминов в условиях метода смешанных ангидридов аналогично схеме 1. При этом карбоксильная функция аминокислоты защищалась сложноэфирной группой. В синтезе использовали 1-адамантанкарбоновую и 1,3-адамантандикарбоновую кислоты.

Полученные производные адамантанкарбоновых кислот включали остатки глицина, серина, лизина, пролина, глютаминовой кислоты, 1,2-диаминоэтана, 1,6-диаминогексана.

При этом в случае производных с остатками глицина, пролина и глютаминовой кислоты противовирусная активность не обнаруживалась.

Представляли интерес лизиновые производные 1-адамантанкарбоновой кислоты (А<1). При этом были получены производные как по а-, так и по Е-аминогруппам лизина (схема 2).

Соединения, полученные по схеме 2, содержали адамантановый карбоцикл на разном расстоянии от а-карбоксильной группы лизина. Это свойство принципиально отличало две пары соединений, представленных в таблице 7.

Таблица 7. Ингибирование репродукции вирусов гриппа Л адамантнл-лнзиновых производных

А(Н1Ш)рс1т2009 АОШ2)

1 АсИ^-ОСНз 6 -

2 Н-Ьу5(Ас1)-ОН 54 25

3 АсМ-ув-ОН 14 -

4 Н-Ьу5(А(1)-ОСНз 47 25

Схема 2. Синтез адамантил-производных лизина методой смешанных ангидридов.

Из данных таблицы 7 следует, что соединения I и 3, • в которых адамантанкарбоновая кислота связана с а-аминогруппой лизина, практически неактивны. В то же время отдаление адамантанового остова от а-карбоксильной группы лизина (табл.7, соед. 2 и 4) приводит к появлению активности порядка 50%. При этом активность в отношении вируса гриппа A(HlNl)pdm2009 заметно выше, чем в отношении A(H3N2).

Необычной модификацией функциональных групп производных адамантана была замена карбоксильной группы аминокислоты на фосфиновую группировку в составе аминокислоты. Методом активированных эфиров было получено соединение 1-адамантановой кислоты с фосфо-аланином (ЫН2-СН(СНз)-Р(0)(0Н)Н). Однако противовирусная активность соединения Ad-AlaPn была всего 27-39%.

Исходя из описанных выше результатов, можно предположить, что увеличение числа функциональных групп в адамантановой конструкции повышает возможности соединения для взаимодействия с белками вируса гриппа А. В таблице 8 представлены производные 1,3-адамантандикарбоновой кислоты (соед. 1 и 2) и 1,3-адаманатандиуксусной кислоты (соед.З) с остатком серина и метиловым эфиром серина.

Таблица 8. Ннгибирование репродукции вирусов гриппа А производными 1,3-адамаитанкарбоновых кислот с остатком серина.___

№ соед. Соединение % ингибпрования вирусной репродукции в культуре клеток МОСК при концентрации соединений 5 мкг/мл

A(HlNl)pdm2009 A(H3N2)

1 Ad-(Ser-OMe)2 3 30

2 Ad-(Ser-OHfe 0 -

3 Ad-(CH2-Ser-OMe)2 90 98

Соединение 3 отличается от соединения 1 наличием метиленового звена при карбоцикле. Из данных таблицы 8 видно, что соединение 3 оказалось одним из наиболее активных (90-98%) среди аминокислотных производных адамантановых кислот. При этом оно абсолютно нетоксично для клеточной культуры МОСК., даже при достижении

концентрации 80 мкг/мл клетки продолжали нормальное существование, а ингибирование успешно происходило уже при концентрации 5мкг/мл. Напротив, соединение 1 не проявляло противовирусной активности в отношении вирусов гриппа А. Возможно, карбоксильные группы ввиду малой подвижности связи с карбоциклом в отсутствии метиленового звена не способны удерживать молекулярную конструкцию вблизи канала М2. С другой стороны, дополнительные СН2-группы в положении 1 и 3 адамантанового остова не только увеличивают подвижность остатков серина, но и геометрически удлиняют молекулу. Вероятно, это позволяет «перекрыть» канал белка М2.

Если соединение 1 (табл. 8) в виде диметилового эфира проявляло противовирусную активность в отношении вируса гриппа А(НЗЫ2) порядка 30%, то полученное после омыления сложноэфирных групп соединение 2 (табл.8) полностью ее утратило.

Исследования противовирусной активности синтезированных аминокислотных и пептидных производных адамантанового ряда подтвердили, что в ряде полученных соединений введение функциональных групп приводит к значительному подавлению репликации вирусов гриппа А(НШ1)рёт2009 и А(НЗК2), резистентных к действию ремантадина.

В таблице 9 представлены соединения, способные с разной степенью эффективности ингибировать вирусы А(НШ1)р<1ш2009 и А(Н2№), и результаты цитопатического действия этих соединений на культуру клеток МОСК. Изучение противовирусной активности проводили при нагрузке препарата 5 мкг/мл. Представленный в таблице процент ингибирования соединений является средним арифметическим из опытов в аналогичных условиях.

Проведенные исследования зависимости противовирусной активности от структуры синтезированных соединений позволяют лишь в общих чертах дать этому оценку. Создается впечатление, что уровень противовирусной активности во многом зависит от гидрофобносги молекулы (табл.9). С другой стороны, наличие имидазольной группы увеличивает противовирусную активность почти до 100% (соед. XI, табл.9), но стоит заблокировать аминогруппу этого же соединения Вос-группой (соед.2, табл.5), как его противовирусная активность снижается до 33-37%. Подобное наблюдается в случае очень гидрофобного адамантантирозинового соединения со свободной аминогруппой (соед.ХУ, табл.9), когда противовирусная активность достигает 90-95%, а при закрытой аминогруппе (соед.6, табл.5) полностью исчезает. Такое поведение может указывать на разный механизм взаимодействия этих соединений с аминокислотными остатками белка М2 протонпроводящего канала.

Полученные результаты позволяют считать, что адамантановый цикл в качестве мембранотропного носителя способен транспортировать функционально активные группы к белку М2 вирусов гриппа А(Н1М)рс1т2009 и А(НЗЫ2). А такие соединения как (Вос)2-Огп-Яет (1), Вос-Баг-Яет (11), ТОА-Яет (VII), Н-Ь^-Яет (XI), АсЦСНг-Зег-ОМеЬ (XIII), Н-Таи-Яеш (XIV) могут представлять практический интерес в качестве перспективных противовирусных средств.

-СН,

но о

СН,

А^(ЗегОМе) (1)

А(!(СН25ег-ОМе)2 (3)

Таблица 9. Ингибирование вирусной репродукции производными адамантана (5 мкг/ил) и их токсическое действие на монослон клеток МРСК ___

№ соед. Соединение Активность, % МПК (мкг/мл) ХТИ

А(Н1!М1)рс]т2009 А(НЗШ)

I Вос-Огп(Вос)-Яет 71,06 66 40 8

II Вос-Заг-Яет 70,8 64 40 8

III Н-СИ-Яет 36 н/э 40 8

IV Вос-Сп-Яет 53 25 >80 >16

V Вос-Ьуз(Вос) -ЬуБ^)- Яет 69 30 >80 >16

VI Вос-вАВА-Яет 48 52 40 8

VII ТОА-Яет 78 89 80 16

VIII Н-Ьуз(А(1)-ОН 54 25 >80 >16

IX Н-Ьу$(Ас1)-ОМе 47 25 >80 >16

X Ас! -ЬЮА 74 63 >80 >16

XI Н-Шэ-Яет 91 94 40 8

XII Н-Су5(Аст)-Яет 45 51 60 12

XIII АсЦСНг-Бег-ОМе): 98 90 >80 >16

XIV Н-Таи- Яеш 76 72 >80 >16

XV Н-Туг(Вг1)-Яеш 90 95 20 4

ЯетаШаёте н/э н/э 40 8

НИЛ- остаток 1,6-тександнамина, МПК - максимальная переносимая концентрация, ХТИ -химико-терапевтический индекс

2. Спите! и исследование противовирусных и иммуностимулирующих свойств дипептидов, включающих а-аминофосфиновые кислоты.

В настоящее время известно большое количество природных и неприродных соединений, способных активировать иммунную систему. Среди них наибольший интерес представляют пептиды, способные индуцировать интерферон. Это особенно присуще тем пептидам, в струи^-ре которых присутствуют остатки неприродных аминокислот, к числу которых относятся а-аминофосфиновые кислоты. Особенность этих кислот состоит в том, что фосфиновая группа при определенных условиях способна превращаться в фосфоновую, которая отличается как геометрией молекулы, так и кислотностью. Однако до настоящего времени не было исследования их свойств в качестве элементов воздействия на иммунную систему ни в роли противовирусных средств, ни в качестве

идукторов интерферона Попадая в систему сложных биохимических процессов, пептиды, включающие эти фосфоаминокислоты, должны оказывать влияние на функционирование иммунной системы.

Синтез пептидов, включающих остаток фосфоаланина, осуществлялся методом активированных эфиров, исходя из Вос-аминокислот и фосфоаланина в водно-диоксановой среде с последующим отщеплением защитной Вос-группы HCl в этилацетате по схеме 3.

сн3

Boc2-Lys-0SU + ^он ^аНСОз > в^-уА ^

4 н HCl

Н3С jj1 Диоксан 2 ' Н )1 Н

в этилацетате

.ОН

2 HCl*H-Lys—N ХР

Н U—н

Схема 3. Синтез дипептидов, включающих остаток А1аРн - фосфинового аналога аланина на примере получения H-Lys-AlaPH.

По этой схеме были синтезированы фосфо-дипептиды H-Lys-AlaPH и Н-Рго-А1аРн. Реакция образования пептида проходила с выходом около 70-75%. Очистку проводили хроматографией на силикагеле в системе метанол-хлороформ( 13:60).

2.1 Интерферониндуцирующая активность фосфопептидов.

Полученные фосфодипептиды исследовались на способность индуцировать интерферон в милимолярных концентрациях. Изучение иммуномодулирующих свойств проводили совместно с Лабораторией онтогенеза вирусов. Исследование проводили m vitro через 5, 24 и 48 часов после индукции лимфоцитов периферической крови. Оба дипептида (H-Lys-AlaPH и Н-Рго-А1аРн) обладали способностью индуцировать интерферон.

Исследование индукции интерферона in vivo проводили на белых лабораторных мытах. Для этой цели мышам внутрибрюшинно вводили дипептад Н-Рго-А1аРн однократно в дозах 0,5; 1,0 мг/кг массы. Титр интерферона определяли в сыворотке крови через 5, 24 и 48 часов после введения дипептида. В качестве референс-индуктора применяли ридостин. Дипептид Н-Рго-А1аРн индуцировал синтез позднего интерферона при обеих примененных дозах (320 и 160 ед/мл) (табл. 10).

Таблица 10. Индукция интерферона у мышей дипептпдом Н-Рго-А1аРн

Концентрация дипептида, мг/кг Титр интерферона, ед/мл

5 ч. 24 ч. ^ 48 ч.

0,5 <10 < 10 320

1,0 <10 < 10 160

Ридостин, 5,0 320 640 320

Из таблицы 10 видно, что пептиды, включающие а-аминофосфиновые кислоты, были способны к индукции позднего интерферона на уровне референс-индуктора ридосшна.

2.2 Противовирусная активность фосфодипептидов

Изучение противовирусных свойств проводили т vivo при смертельной экспериментальной инфекции мышей, вызванной вирусом энцефаломиокардита мышей

(EMC), а также in vitro на штамме ВИЧ-l BRU, предоставленном профессором Л.Монтанье (Ин-т Пастера, Франция) на культуре клеток МТ4.

Для исследования in vivo были использованы пептиды, способные индуцировать выработку интерферона: H-Lys-AlaPH и Н-Рго-А1аРн.

Исследуемые соединения вводили мышам внутрибрюшинно однократно в дозах 0,5 ; 1 и 10 мкг/кг за 24 часа до заражения. Полученные данные представлены в таблице 11.

Таблица 11. Защитный эффект фосфопептидов при инфекции мышей, вызванной вирусом энцефаломиокардита мышей

Концентрация, мкг/кг Н-Рго-А1аРн H-Lys-AlaPH

Выжившие, % Защита, % Р Выжившие, % Защита, % Р

0,5 19,1 18,1 <0,5 10,0 5,0 >0,5

1,0 37,5 27,1 <0,05 40,0 35,0 <0,05

10,0 25,0 15,0 <0,05 20,0 15,0 <0,5

Ридостин, 5,0 54,1 44,1 <0,05 37,2 32,2 <0,05

Примечание: Вирус ЕМС вводили интеркраниально через 24 часа после введения дипептидов, р -погрешность измерений.

Н-Рго-А1аРн, введенный в дозах 0,5; 1 и 10 мг/кг, достоверно защищает мышей от экспериментального вирусного энцефалита (18,1%, 27,1% и 15,0 % соответственно). Защитный эффект H-Lys-AlaPn наблюдали при дозах от 1 мг/кг и выше ( 35% и 15%).

Совместно с Лабораторией вирусов иммунодефицита человека" проводили испытания in vitro на модели экспериментальной инфекции на перевиваемой лимфобластоидной линии клеток человека МТ4 вирусом иммунодефицита (штамм ВИЧ-1 BRU). В качестве препарата сравнения использовали азидотимидин (AZT).

Соединения не проявляли токсического эффекта до 750 гамм, при концентрации 1000-1500 гамм клетки испытывали цитотоксический эффект. Наиболее остро токсический эффект проявился для фосфодипептида H-Lys-AlaPH- Ингибирования вируса ВИЧ-1 в данном случае достичь не удалось. По прошествии 48 часов клетки погибли. Наблюдалось слияние клеточных мембран - синцитиев.

3. «Шарнирная» область иммуноглобулинов как потенциальный источник противовирусных пептидов.

В процессе иммунного ответа иммуноглобулины под воздействием сериновых протеиназ способны продуцировать пептиды, активирующие иммунный ответ организма. Их источником могут являться как Fab-, так и Fc - фрагменты антитела. В этом отношении мало изучена так называемая «шарнирная» область антитела, представляющая собою последовательность, включающую в зависимости от типа антитела от 15 до 64 аминокислотных остатков. Структурная особенность «шарнирной» области характеризуется как высоким содержанием остатков пролина, так и наличием остатков цистеина, которые образуют S-S связи, выполняющие задачу стяжки между двумя параллельными полипептидными цепями этого фрагмента антитела.

Ранее было показано, что гексапептнднын фрагмент «шарнирной» области IgG кролика H-Cys-Pro-Pro-Pro-Glu-Leu-OH способен индуцировать в высоком титре лейкоцитарный интерферон на уровне токсина золотистого стафилококка. В связи с этим было важно выяснить, способны ли подобные пептидные фрагменты, также содержащие в

своей структуре -Б-Б- фрагмент, проявлять противовирусные свойства в культурах клеток на примере ингибирования вирусов гриппа А, а также определить уровень токсичности подобных веществ в отношении ряда клеток. С этой целью была разработана оптимальная схема синтеза подобного соединения Н-Су5(81Ви)-Рго-А1а-Рго-01и-Ьеи- РЬе-ОН (схема 5). Как следует из схемы, синтез осуществляется конденсацией отдельных фрагментов ди- и трипептидов.

Суя

Рго

Вос-

Всс-

Вос-

НС1-Н-

Ми — ¿ОН

ДВи

СА

0,05н №ОН 51Ви

Ми

5гви

-ОМе

А1а

Рго

-ОН н-

-он нач-СА

0,05н N804

4н НС1

С1и Ьеи РЬе

Вое--ОН на-н-4-0Ег

-ОМе

■ОМе

ОШи ОН на-Н-

■ОН

С.А.

Н/РЛ

ОШи

Вое-

СА.

1н на

Р1 Ви Н;/Рс1

01Ви

Ми

АВи

Схема 5. Схема синтеза гептапеитияа НС1Н-Су5(51Ви)-Рго-А|а-Рго-С1и-Ьеи-РЬе-ОЕ1.

С.А. - метод смешанных ангидридов

При синтезе пептидов классическим методом необходимо защищать карбоксильную группу образованием сложного эфира или амида. Однако в финальной стадии синтеза, когда приходится с пептида удалять защитные группы, возникает определенная сложность. Сложноэфирная группа либо отщепляется щелочным гидролизом, либо превращается в амидную группу. Оба эти процесса в зависимости от длины пептида в разной степени сопровождаются протеканием побочных реакций. Вариант синтеза пептида, исходя из амида С-концевой аминокислоты во многом определяется свойствами этой аминокислоты, поскольку лимитирующим моментом становится растворимость соединения.

Первоначально рассматривался «амидный» вариант синтеза этого гептапептида, однако уже дипептид Н-Ьеи-РЬе-ЫНз был нерастворим в условиях реакции смешанных ангидридов.

Для исследования процесса амидирования эфиров более длинных М-ацилпептидов, включающих остатки иминокислот, которые образуют наиболее чувствительные к гидролизу и аммонолизу пептидные связи, были выбраны трипептиды, содержащие иминокислоты (пролин и оксипролин). Наличие иминокислот позволило с помощью ТСХ и изатинового реагента идентифицировать возможную деградацию пептидных связей.

Было исследовано три способа амидирования М-ацилпептидов и их эфиров.

1. Аммонолиз эфиров Ы-ацилтрипептидов в абсолютном спирте, насыщенном сухим аммиаком, в ампуле. Выход амида составлял около 50%.

2. Амидирование полученных каталитическим гидрированием эфиров трипептидов в ампуле в растворе хлороформа, насыщенного сухим аммиаком, при 20°С в течение двух суток. Процесс не доходил до конца и выход не превышал 35%.

3. Использование метода смешанных ангидридов в случае ацилтрипептидов со свободной карбоксильной группой. Активированная карбоксильная группа трипептида при температуре -25°С взаимодействовала с сухим аммиаком (двухкратный избыток) в хлороформе. Выход амида ацилтрипептида достигал 60-70%.

Последний способ амидирования был успешно использован для получения серии амидов аминокислот и пептидов (табл. 12):

Таблица 12. Синтезированные амиды пептидов и аминокислот

№ соед. Соединение № соед. Соединение

1 Н - Gly - Pro - Gly - NH2 7 H - Hyp - Pro - Gly - NH2

2 H - Gly - Hyp - Gly - NH2 8 H - Gly - Pro - ß-Ala - NH2

3 H - Pro - Pro - Gly - NH2 9 H - Pro - Gly - NH2

4 H - Pro - Hyp - Gly - NH2 10 H- Hyp-Gly-NH2

5 H - Lys - Pro - Gly - NH2 11 H-Gly-NH2

6 H - Lys - Hyp - Gly - NH2 12 H - ß-Ala-NH2

Этот же метод амидирования использовали для получения Z-Glu(OtBu)-Leu-Phe-NH2. Однако после снятия N-защитной группы растворимость H-Glu(OtBu)-Leu-Phe-NH2 была недостаточна для обеспечения необходимого выход пентапептида Z-Ala-Pro-Glu(OtBu)-Leu-Phe-NH2. Поэтому синтез проводили, исходя из эфира фенилаланина Н-Phe-OEt. В качестве N-защитных групп использовали Z- или Вос-группу, которые отщеплялись каталитическим гидрированием над палладием и 4н HCl в эгилацетате соответственно. Эфиры N-ацилди- и трипептиов в процессе синтеза омыляли 0,05н NaOH (ацетон-вода, 1:1).

На последней стадии N-концевую Вос-группу и трет-бутильную группу с у-СООН функции глютаминовой кислоты отщепляли 4н HCl в этилацетате, при этом сульфгидрильную группу цистеина оставляли защищенной, чтобы сохранить S-S связь, которая могла влиять на биологическую активность пептида.

На рисунке 1 показана структурная модель синтетического гептапептидного фрагмента «шарнирной» области IgG человека. Модель была обсчитана с помощью программного обеспечения HyperChem 8.0 Professional Edition. Структура, представленная на рисунке 1, была получена с применением полуэмпирического метода MNDO, который позволяет проводить качественные расчеты электронной и атомной структур органических молекул. Этот метод позволяет получать хорошие результаты для больших органических молекул при расчетах электронных характеристик системы и теплот образования.

4.2. Биологические свойства синтетического гептапеппшда.

Испытание токсичности проводили в условиях in vitro на трех клеточных культурах: VERO, MDCK и суспензионной культуре клеток МТ-4 (табл. 13).

Рис.1 Структурная модель синтетического гептапептида Н(1-Н-( \>;>!НпИ'п! ЛЬ* 1'го (.1и-1еи-РЬе-ОЕе

Таблица 13. Исследование цитотоксического воздействия гептапептида на клетки.

Клеточная культура Гибель клеток, %

10 мкг/мл 50 мкг/мл 100 мкг/мл 250 мкг/мл 500 мкг/мл 1000 мкг/мл

VERO 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 100,0

MDCK 0.0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

МТ-4 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 75%

Из таблицы 13 легко видеть, что пептид проявляет токсическое действие на клетки VERO при постоянном его присутствии в течение всего срока культивирования клеток (5 суток) в концентрациях 500 мкг/мл и выше. Клеточная линия MDCK оказалась устойчивой к присутствию пептида в течение всего срока культивирования клеток (3 I суток). При всех концентрациях пептида монослой клеток оставался целым и соответствовал клеточному контролю без препарата вплоть до 1000 мкг/мл.

Суспензионная культура МТ-4 не разрушалась вплоть до концентрации 500 мкг/мл, j однако при 1000 мкг/мл наблюдалась гибель клеток.

Была исследована способность полученного гептапептида защищать клетки от вирусов гриппа А и простого герпеса (ВПГ).

Противовирусную активность пептида в отношении эпидемического человеческого ' штамма гриппа A/MocKBa/(HlNl)pdm2009, резистентного к действию ремантадина и амантадина, определяли на монослое клеток MDCK методом ИФА по методике, описанной ранее. Полученные данные представлены в таблице 14. |

Таблица 14. Процент ингнбировання репродукции вируса гриппа А/Москва/А(НШ1)р<1т2009 в клетках культуры МОСК синтетическим гептапептидом.

Разведение Защита клеток, %

0 25 50 100 250 500

вируса мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл

ю-2 0 25,2 39.4 42 44 ...

10° 0 12,5 44 46 41 41

При анализе данных оказалось, что эфир гепталептида с S-трет-бутильной группой защищает клетки MDCK от воздействия вируса гриппа А на 40%. Причем из таблицы 14 видно, что увеличение концентрации от 50 до 500 мкг/мл не влияет на защиту клеток, из чего можно сделать вывод, что пептид скорее взаимодействует с клетками и защищает их, чем вмешивается в жизненный цикл вируса.

Исследования противовирусной активности пептида против ВПГ проводили совместно с лабораторией Онтогенеза вирусов. В эксперименте использовался ВПГ типа 1, штамм Л2 в титре 4,5 ^ТЦИДзо. Пептид вводили по двум схемам: одновременно с заражением и за 2 часа до заражения клеточной культуры VERO вирусом герпеса в дозе 100 ТЦИД50. Полученные результаты представлены в таблице 15.

Таблица 15. Влияние исследуемого гептапептнда на развитие цитопатического эффекта в клетках, инфицированных вирусом простого герпеса

Схема применения Вирусиндуцированный цитодеструктивный эффект, %

0 мкг/мл 10 мкг/мл 25 мкг/мл 50 мкг/мл 100 мкг/мл 200 мкг/мл

Введение пептида одновременно с заражением 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Введение пептида за 2 часа до заражения. ... ... ... 100,0 100,0

Как видно из данных таблицы 15, пептид в концентрации до 200 мкг/мл не защищает клетки VERO от цитодеструктивного действия вируса простого герпеса. Дальнейшее увеличение концентрации (более 500 мкг/мл) вызывает цитотоксический эффект.

4. Исследование цитотоксического действия амидов пептидов и их испытание на анти-ВИЧ акпшвность.

Синтезированные амиды трипептидов неожиданно оказались интересными, когда было опубликовано сообщение Е.Андерссона и соавт. (Su J., Andersson Е., Horal P. J. Human Virology, vol 4, № 1, (2001)) о том, что амид трипептида H-Gly-Pro-GIy-OH (табл.9, соед.1) способен в культуре клеток ингибировать репликацию ВИЧ-1. Создавалось впечатление, что этот трипептид, представляющий собой фрагмент петли V3 гликопротеина gpl20 этого вируса, на который направлены типоспецифические нейтрализующие антитела, отчасти способен выполнять ее функции.

Удивительная простота амида трипептида со свойствами противовирусной активности побудила исследовать зависимость этого феномена от аминокислотного состава трипептида, включающего остаток амида глицина.

Было исследовано токсическое действие синтезированных амидов пептидов на клетки линии МТ-4. Пептиды добавляли в регулярных концентрациях (100-1500 мкг/мл). Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере СО2 и 98% влажности в течение 3-5 дней. Учет результатов проводили окрашиванием клеток с помощью тетразолиевого красителя (метод МТТ) и световой микроскопии. Результаты представлены в таблице 16.

Таблица 16. Процент выживших клеток МТ-4 при различных концентрациях соединений в мкг/мл.

Концентрация мкг/мл H-Gly-NH2 H-Gly-Pro -Gly- NH2 H-Gly-Pro -P-Ala-NH, H-Pro-Pro -Gly-NH2 H-Hyp-Pro -Gly-NH2 H-Pro-Hyp -Gly-NH2

100 88,7 78,8 87,8 85,1 97,1 84,3

250 90,2 79,9 83,4 89,3 94,2 96,4

500 86,8 84,7 86,7 77,2 86,3 73,1

750 82,2 90,1 89,3 74,0 72,3 89,3

1000 77,9 74,8 93,5 66,5 72,9 70,0

1500 75,3 84,1 83,2 43,2 46,2 51,1

Для сравнения: AZT 77,49% (1 мкг/мл)

Как следует из приведенных данных, этими соединениями не удалось достигнуть значимого подавления роста клеток при концентрациях пептидов до 1000мкг/мл, что свидетельствует о крайне низкой токсичности синтезированных веществ.

Полученные соединения тестировались против ВИЧ-1 типа В на модели экспериментальной инфекции перевиваемой линии лимфобластоидных клеток человека МТ-4 штамма ВИЧ -1 BRU (субтип В). Использовался активный вирус ВИЧ-1 BRU. Данные биологических испытаний трипептидов приведены в таблице 17.

Таблица 17. Подавление ВНЧ-1 BRU синтезированными амидами трипептидов в процентах (метод

\Соедин. H-Gly- H-Gly-Pro- H-Gly-Pro- H-Pro-Pro- H-Hyp-Pro- H-Pro-Hyp-

NH; Gly-NH2 P-Ala-NH2 Gly-NH2 Gly-NH2 Gly-NH2

мкг/мл

100 1 0 0 0 0 0 0

250 14,9 0 0 0 0 0

500 10 0 0 0 0 0

750 13,3 3,5 0 0 0 0

1000 5,3 0 0 0 0 0

1500 11,4 0 0 0 0 0

Для сравнения: активность AZT составляла 58,77% (1 мкг/мл)

Из данных таблицы 17 следует, что эти соединения не подавляли репликацию вируса ВИЧ-1 BRU.

В дальнейшем стало понятно, почему в данном случае не наблюдалось противовирусного действия H-Gly-Pro-Gly-NHi. Позднее в работах Е.Андерссона и соавт. было показано, что амид трипептида Gly-Pro-Gly подвергался ферментативному гидролизу до образования амида глицина, затем специфической гидролазой, находящейся в животной сыворотке, он трансформировался в активное начало - амид а-гидроксиглицика, который и оказывал ингибирующее действие на ВИЧ-1.

Отсутствие анти-ВИЧ-активности у вышеописанного амида (табл.12, соед.1) и родственных ему соединений (табл.12, соед.2-12) связано с тем, что использованная тест-система содержала человеческую сыворотку, в то время как фермент гидроксилирующий соединение 11 (табл.12) по данным Е.Андерссона и соавт. содержится лишь в животной сыворотке. Кроме того применяемый в опытах вирус ВИЧ-1 BRU принадлежит субтипу В, а в экспериментах Е.Андерссона и соавт. был использован субтип А.

ВЫВОДЫ:

1. Сшггезированные новые производные адамантанового карбоцикла способны подавлять репликацию вирусов гриппа A(HlNl)pdm2009 и A(H3N2), резистентных к действию ремантадина. Противовирусный эффект достигается введением в молекулы ремантадина, амантадина и адамантанкарбоновых кислот новых функциональных групп за счет аминокислотных, пептидных и других остатков. Среди исследованных аминокислотных производных адамантанового карбоцикла соединения Boc-Orn(Boc)-Rem, Boc-Sar-Rem, H-His-Rem, TOA-Rem, H-Tau-Rem и Ad-(CH2-SerOMe)2, не проявляя токсичности, обладали высоким уровнем противовирусной активности, и могут рассматриваться в качестве потенциальных медикаментозных средств против вируса гриппа А.

2. Синтезированные фосфодипептиды, содержащие а-аминофосфиновые кислоты (фосфоаланин и фосфолейцин) обладают противовирусной активностью в отношении вируса энцефаломиокардита мышей, а также способны индуцировать интерферон в достаточно высоком титре (160-320 ед.).

3. Разработанная оптимальная стратегия синтеза позволила получить этиловый эфир гептапептидного фрагмента «шарнирной» области иммуноглобулина человека HC!-H-Cys(StBu)-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Phe-OH. Показано, что этот пептид обладает противовирусными свойствами in vitro в отношении вируса гриппа A(HlNl)pdm2009. Исследование цитотоксического действия этого пептида на культурах VERO, MDCK и МТ4 показало, что эфир гептапептида обладает крайне низкой токсичностью.

4. На примере трипептидов, включающих остатки иминокислот (пролина и оксипролина), был исследован процесс амидирования их карбоксильной группы в присутствии лабильных пептидных связей, чувствительных к аммонолизу. Установлено, что амид трипептида H-Gly-Pro-Gly-OH и родственные ему соединения, содержащие остатки глицина, пролина и оксипролина, не способны ингибировать репликацию вируса иммунодефицита человека в человеческой сыворотке по причине отсутствия в ней гидролазы, способной переводить амид глицина в амид а-гидроксиглицина, которая содержится лишь в животной сыворотке.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Носик H.H., Лаврухина Л.А., Кондрашина Н.Г., Гараев Т.М., Шибнев В.А. Иитерферониндуцирующая и противовирусная активность дипептидов.// Вопр.вирусол. - 2009,- т.55 - №3. - с. 41-43.

2. Шибнев В.А., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Шевченко Е.С., Бурцева Е.И. Новые производные адамантана и пути преодоления резистентности вирусов гриппа А.// Вопр.вирусол - 2011. - т.56. - №2. - с. 36-39.

3. Шибнев В.А., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Шевченко ЕС., Бурцева Е.И. Некоторые пути преодоления резистентности вирусов гриппа А к препаратам адамантанового ряда.// Хим.Фарм.Журн.- 2012. - т.46 - №1. - с. 36-40

4. Шибнев В.А., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Шевченко ЕС., Бурцева Е.И. Новые производные адамантана, способные преодолеть резистентность вирусов гриппа A(HlNl)pdm2009 и A(H3N2) к ремантадину.// Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2012. -т. 153,-№2.-с. 200-203.

5. Шибнев В.А., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Шевченко Е.С., Бурцева Е.И. Исследование путей восстановления противовирусных свойств производных адамантанового ряда в отношении вирусов гриппа A(HlNl)pdm09 и A(H3N2) с помощью аминокислотных и пептидных остатков.// V Российский Симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск), Сборник докладов - 8-12 августа 2011. - с. 425.

6. Шибнев В.А., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Шевченко Е С., Бурцева Е.И. Адамантан-аминокислотные производные как потенциальные источники противовирусных свойств в отношении вируса гриппа A(HlNl)pdm09 и A(H3N2).// Материалы международной конференции «Синтез, выделение и изучение комплексных свойств новых биологически активных соединений» (Таджикский Национальный Университет, г.Душанбе), Сборник докладов - 3-4 октября 2011. -с.53-54.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность и признательность своим научным руководителям доктору химических наук, профессору Шибневу Владимиру Александровичу и доктору медицинских наук Бурцевой Елене Ивановне за помощь и внимательное отношение на всех этапах подготовки работы. Автор также благодарит заведующего лабораторией онтогенеза вирусов д.м.н., проф. Носика Николая Николаевича и его сотрудников за помощь в проведении биологических испытаний синтезированных соединений. Автор благодарен коллегам химикам: к.х.н. М.П.Финогеновой за помощь в подготовке, интерпретации и оформлении результатов диссертации, а также К.В.Зайцевой за помощь в идентификации полученных соединений физико-химическими методами. Автор признателен заведующему Лабораторией иммунодефицитов человека д.м.н., проф. Д.Н.Носику и сотрудникам его лаборатории к.м.н. Л.Б.Калниной и к.б.н. И.А.Киселевой за помощь в проведении биологических исследований. Автор благодарит сотрудников Лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа к.м.н. Е.С.Шевченко и к.б.н. Н.А.Белякову за помощь в работе с высокопатогенными вирусами гриппа. Автор также благодарит коллег и соавторов публикаций, принимавших участие в получении результатов.

Подписано в печать: 10.02.2012 Тираж: 100 экз. Заказ №732 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.74, корп.1 (495) 790-47-77; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гараев, Тимур Мансурович, Москва

61 12-3/680

ФГБУ НИИ Вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития Российской Федерации

На правах рукописи

Гараев Тимур Мансурович

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СВОЙСТВ СОЕДИНЕНИЙ ПЕПТИДНОЙ ПРИРОДЫ

03.01.03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор

В.А.Шибнев доктор медицинских наук Бурцева Е.И.

Москва-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1. Производные адамантанового ряда 7

1.1 Синтез производных адамантана 7

1.2. Фармакологические свойства адамантана 12

1.3. Устройство вириона вируса гриппа А. Протон-проводящий и канал М2

2. Аминофосфоновые и аминофосфиновые кислоты. 26

2.1. Химия аминофосфоновых и аминофосфиновых кислот 27

2.2. Биологическая активность аминофосфоновых и аминофосфиновых кислот

3. Синтетические пептиды из «шарнирной» области иммуноглобулинов

4. Методы получения амидов. 40

4.1. Амидирование карбоновых кислот 40

4.2. Методы синтеза амидов аминокислот и пептидов 41

4.3. Противовирусная активность амидов пептидов в отношении 43 ВИЧ-1

ГЛАВА II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 50

1. Подходы к проблеме преодоления резистентности вирусов 50 гриппа А к препаратам адамантанового ряда.

1.1. Производные аминоадамантанов (ремантадина и амантадина) 52

1.2. Производные адамантанкарбоновых кислот 61

1.3. Производные адамантандикарбоновых кислот 65

2. Пептиды, содержащие а-аминофосфиновые кислоты, и их 68 противовирусные и иммуностимулирующие свойства.

2.1. Интерферониндуцирующая активность фосфопептидов 70

2.2. Противовирусная активность фосфодипептидов 71

3. «Шарнирная» область иммуноглобулинов как потенциальный 72 источник противовирусных пептидов

3.1. Синтез гептапептидного фрагмента ^О 1 человека 73

3.2. Биологические свойства синтетического гептапептида 78

4. Исследование цитотоксического действия амидов пептидов и ^9 их испытание на анти-ВИЧ активность

ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 82

1. Синтез производных адамантана 82

2. Синтез фосфодипептидов 88

3. Синтез амидов ди- и трипептидов 90

4. Синтез гептапептида НС1-Н-Су8^Ви)-Рго-А1а-Рго-С1и-Ьеи-

Р11е-(Ш

ВЫВОДЫ 99

Приложения (масс-спектры наиболее активных соединений) 100

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

109

Принятые сокращения Сокращения, принятые в тексте диссертационной работы для обозначения аминокислотных остатков, защитных групп, пептидных структур и реагентов для пептидного синтеза, соответствуют рекомендациям Комиссии по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB ICBN [120].

AmAd - остаток 1 -аминоадамантана

Ad - остаток 1-дамантановой кислоты

Chm - циклогексометилоксикарбонил

Сге - остаток креатина

DCC - 1ч[,М-дициклогексилкарбодиимид

DMF - диметилформамид

ED А - этилендиамин

GABA - у-аминомасляная кислота

HDA - 1,6-гександиамин

HEPES - Na-соль Н-(2-гидроксил)пиперазин-1\Г-2-этансульфокислоты

NMM - N-метилморфолин

PBS - 0,01 М Na-фосфатный буфер

TOA - липоевая кислота

Таи - остаток таурина

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ИБХФ - изобутилхлорформиат ИФ А - иммуноферментный анализ МС - масс-спектр

С. А. - метод смешанных ангидридов

ВВЕДЕНИЕ

Одним из фундаментальных законов природы является привыкание вирусов и иных микроорганизмов к химическим веществам и вакцинам. Это связано с другим фундаментальным законом - генетической изменчивостью микроорганизмов. Поэтому проблема борьбы с вирусной инфекцией предполагает постоянное совершенствование химических препаратов и вакцин.

Что касается химических препаратов в качестве противовирусных средств, то имеется два направления их применения. Первое - создание молекулярных структур, способных воздействовать непосредственно на жизненно важные элементы вируса и тем самым тормозить или полностью ингибировать его развитие. Второй путь - это создание таких соединений, которые способны с разной степенью эффективности активировать иммунную защиту организма против инфекций.

Эти два направления развиваются параллельно, но с разным успехом. Так, число препаратов, направленных на подавление развития вирусной инфекции, крайне ограничено в связи с недостатком информации о механизме жизнедеятельности того или другого вируса.

К числу препаратов, способных активировать иммунную защиту организма, принадлежит большой спектр соединений, начиная от полифенола госсипола, выделяемого из масла хлопчатника, до пептидных фрагментов из иммуноглобулинов. Однако и в этом случае выбор подходящих природных и синтетических иммуноиндукторов ограничен в связи с проявлением большинством из них высокого уровня токсичности.

Еще несколько десятилетий назад одними из препаратов адамантановой структуры, способными эффективно ингибировать вирус гриппа А, были ремантадин и амантадин. В настоящее время резистентность вирусов гриппа А к этим препаратам достигла 90 и более процентов.

Исходя из знания механизма взаимодействия адамантановых препаратов с вирусной частицей гриппа А, было сделано предположение, что активность этих соединений может быть восстановлена за счет введения в адамантановый карбоцикл дополнительных функциональных групп за счет природных аминокислотных, пептидных и других остатков. Подобные соединения примечательны тем, что в процессе метаболизма образуется нетоксичные аминокислоты и адамантанановый карбоцикл. Синтезированные производные адамантанового карбоцикла обладали различным эффектом ингибирования

вирусов гриппа A(HlNl)pdm2009 и A(H3N2) в культуре клеток. Некоторые из этих соединений проявляли противовирусную активность более 90 %.

Вторым направлением является изучение иммуноактивных соединений пептидной природы, которые могут возникать из иммуноглобулинов в процессе их расщепления протеазами. В этом отношении особый интерес представляет так называемая «шарнирная» область IgG, легко доступная для выщепления сериновыми протеазами. Аминокислотная последовательность этого участка IgG содержит целые кластеры пролинов и богата остатками цистеина, что определяет ее специфическую структуру, содержащую дисульфидные связи.

Для выяснения противовирусных свойств пептидных фрагментов этой области IgG был синтезирован дисульфидсодержащий гептапептид. В результате проведененных истытаний противовирусной активности в отношении вируса гриппа А гептапептид стабильно защищал клетки от воздействия вируса начиная с 50 мкг/мл.

В числе соединений, обладающих иммуностимулирующими свойствами, оказались оригинальные дипептиды, включающие а-аминофофиновые кислоты. Полученные соединения обладали крайне низкой токсичностью, а с другой стороны, были способны индуцировать интерферон в высоком титре как in vitro так и in vivo в организме белых мышей. Показано, что фоосфодипептиды достоверно защищали мышей от экспериментального вирусного энцефалита.

Предпосланный диссертации литературный обзор посвящен синтезу различных производных адамантанового карбоцикла и кристаллографическим исследованиям белка М2 гриппа А, который является мишенью для адамантановых соединений. А также рассмотрена структурная организация «шарнирной» области иммуноглобулина. Имеется раздел, посвященный синтезу и биологическим свойствам аминофосфиновых и аминофосфоновых кислот.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Производные адамантанового ряда.

Производные адамантана как физиологически активные вещества находили широкое применение в медицине с 70-х годов XX века. Сам адамантан (трицикло[3.3.1.1.]декан, СюНхб) принадлежит к числу трициклических нафтенов мостикового типа.

Исследования в области биологической активности производных адамантана (Рис.1) продолжают развиваться. Разрабатываются новые методы направленного синтеза химиотерапевтических препаратов этого типа.

КЗ

Рис. 1. Производные адамантана, где: Ю, 1*2,113,114 = Н; алкан; алкен; фенил; Ш2; №Ж; N1^; М02;

СООН; ССКЖ; ОН; морфолин, пиридин и др.

1.1 Синтез производных адамантана.

Синтез аминоадамантанов.

В литературе описывается метод получения 1-аминоадамантана взаимодействием 1,3-дегидроадамантана (1,3-ДГА) с газообразным аммиаком в условиях барботажа осушенного аммиака через раствор в кипящем диэтиловом эфире [1,2]. Продукт реакции после упаривания растворителя очищался сублимацией в вакууме. Изучение состава реакционной смеси показало, что при использовании неосушенного газообразного аммиака наряду с ожидаемым 1-аминоадамантаном образуется в заметных количествах 1-гидроксиадамантан, присутствие которого может быть объяснено значительно большей скоростью взаимодействия с водой, чем с аммиаком, что следует связать с различием в подвижности протона. Выход 1-аминоадамантана при подаче безводного аммиака в течение 1 часа составил 35-40%.

1ЧН

1\1Н

Схема 1. Взаимодействие 1,3-ДГА с газообразным аммиаком

Для получения аминоалкиладамантанов используется взаимодействие соответствующего нитроалкана в диэтиловом эфире с 1,3-ДГА в атмосфере азота при комнатной температуре (схема 2). После прибавления всего количества 1,3-ДГА растворитель упаривают, доводя температуру реакционной смеси до 100-105°С, после чего ее выдерживают 3 ч до исчезновения нерастворимого в нитрометане 1,3-ДГА. По окончании реакции избыток нитрометана удаляют перегонкой, остаток упаривают при 80°С (3 мм рт.ст.) для удаления непрореагировавшего 1,3-ДГА, после чего продукт перегоняют. Таким образом были получены амантадин, ремантадин и адапромин с выходом более 90% [3, 4].

Стадия восстановления нитроалкиладамантанов осуществляется их взаимодействием с водородом по реакции Зинина. В качестве источника водорода использовались железные опилки и соляная кислота, взятые в 10-кратном избытке по сравнению с необходимым количеством водорода. В качестве растворителя для нитросоединений используют изопропанол. Восстановление проходит при температуре кипения изопропанола и интенсивном перемешивании в течение 8 ч. Синтезированные амины после отгонки растворителя и доведения среды реакционной смеси до щелочной реакции экстрагируют эфиром или толуолом, сушат от следов воды над слоем щелочи и очищают либо вакуумной перегонкой, либо переосаждают через соответствующие

гл

Где Я'-Н, Я2- Н, СН3, С2Н5; СН3, Я2 = СН3.

Схема 2. Метод получения аминоалкиладамантанов взаимодействием нитроалкана

в диэтиловом эфире с 1,3-ДГА

гидрохлориды. Выход аминов на данной стадии составляет 90-92% (для 1-(адамант-1-ил)этиламина (ремантадина) - 90%), что в пересчете на исходный адамантан составляет 61-62% от теоретического.

Также в литературе описываются и другие методы получения аминоадамантанов. Известен способ получения адамант- 1-иламина и его производных, состоящий во введении алкильных радикалов по атому азота адамант-1-иламина с помощью йодистых алкилов путем 12-16 часового кипячения реагентов в ксилоле с последующей обработкой щелочью [5]. Недостатками данного метода являются использование в качестве исходного реагента труднодоступного адамантиламина и йодистых алкилов.

Для получения ненасыщенных гетероциклических производных адамантана, содержащих связь Ы-Н предлагается способ, состоящий в длительном нагревании в запаянной ампуле смеси адамантиламина, окиси этилена и метанола в течение 20 ч с последующей дегидратацией в течение 14 ч образовавшегося промежуточного продукта концентрированной серной кислотой, приводящий к И-адамантилморфолину с общим выходом 60%. [5].

Близким к этому методу является способ получения адамант-1-иламина и его производных путем взаимодействия 1-бромадантана с соответствующими аминами или их производными (н-бутиламин, циклогексиламин, адамантиламин, бензиламин, пиперидин, морфолин, анилин и др.) в запаянной ампуле при 170-190°С, которое приводит к получению соответствующих адамантилсодержащих аминов с выходами 20-70% [6].

Один из новых методов получения аминоадамантанов заключается во взаимодействии производного адамантана с соответствующими аминами или их производными, причем в качестве производного адамантана используется 1,3-дегидроадамантан, а в качестве аминов или их производных - аммиак, трет-бутиламин, формамид, морфолин, пиперидин, пирролидон-2, сукцинимид и фталимид. Процесс проводят в соотношениях компонентов 1:2 соответственно в присутствии каталитических количеств эфирата трехфтористого бора или в его отсутствии в среде инертного растворителя или исходных аминов или их производных при температуре 20-100°С в течение 1-6 ч. [7, 8]. Сущностью метода является одностадийная реакция присоединения к 1,3-дегидроадамантану веществ, содержащих связи 1М-Н, в присутствии катализатора (схема 3).

НР

где Я: ВД, г-ВиИН, ЫНСН=0, м

Схема 3. Синтез гетероциклических производных адамантана.

Синтез 1-адамантанкарбоновой кислоты.

Для получения кислот ряда адамантана широко применяют реакцию Коха - Хаафа. В качестве исходных веществ используют 1-бромадамантан, 1-гидроксиадамантан, а также нитрат 1-гидроксиадамантана [6].

Адамантан-1-карбоновую кислоту получают взаимодействием 1-бром- или 1-гидроксиадамантана с муравьиной кислотой в серной кислоте (схема 4) или адамантана с муравьиной или серной кислотой в присутствии трет-бутилового спирта [5].

Максимальный выход адамантанкарбоновой кислоты достигается при соотношении АсЮН - НСООН - Н2804 (1:1:24). Выход уменьшается при недостатке муравьиной кислоты. Адамантан-1-карбоновая кислота может быть получена из адамантана в 20%-ном олеуме. Предполагают, что реакция протекает через образование адамантильного катиона.

Для получения карбоновых кислот из адамантана используют также его реакцию с монооксидом углерода в серной кислоте или олеуме. При этом образуется смесь адамантан-1-карбоновой и адамантан-1,3-дикарбоновой кислоты в соотношении 1:6 [9].

Схема 4. Способы получения 1-адамантанкарбоновой кислоты

Кроме того, исходными веществами для получения карбоновых кислот могут служить нитраты. Так, адамантан-1-карбоновая кислота получена с выходом 94% из нитрата адамантанола и муравьиной кислоты в серной кислоте.

Синтез Ы-адамантоил-а-аминокислот.

В работах [10, 11] приводится синтез аминокислотных производных 1-адамантанкарбоновой кислоты. В качестве объектов для адаманталирования были выбраны две аминокислоты: гистидин и триптофан. Ацилирование осуществляют 1-адамантоилхлоридом в присутствии триэтиамина при нагревании в течение 17 часов в среде абсолютного толуола; выход составляет 37%. При проведении реакции в присутствии гидроксида натрия в водно-диоксановой (1:1) среде, выход целевого продукта увеличивается до 53% (схема 5). Авторы утверждают, что для повышения степени чистоты получаемого продукта необходимо соблюдение ряда условий (рН=10, температура не выше 25°С, интенсивное перемешивание в процессе прибавления 1-адамантоилхлорида).

а,СН2 й >

Схема 5. Синтез адамантилпроизводных аминокислот.

Полученные соединения представляют собой субстраты для изучения действия на серотониновые рецепторы тромбоцитов.

Синтез 3-(1-адамантанкарбоксамидоэтил)индола (Схема 6) осуществлялся взаимодействием триптамина в толуоле в присутствии триэтиламина с хлорангидридом 1-адамантанкарбоновой кислоты по следующей схеме:

толуол

Схема 6. Синтез адамантил-триптамина.

1.2. Фармакологические свойства адамантана

Биологическая активность производных адамантана обусловлена значительной липофильностью жёсткого углеводородного каркаса, что позволяет им легко проникать через биологические мембраны [12].

Введение в молекулы различных биологически активных соединений адамантильного радикала в значительной мере модифицирует их фармакологическое действие. Таким образом была модифицирована структура ряда антимикробных, противоопухолевых, иммунодепрессивных, гормональных, анальгетических, противовоспалительных, нейротропных средств. Адамантановый цикл, введенный в молекулу действующего вещества, может увеличить продолжительность фармакологического действия препарата. Так, введение радикала адамантила в 1 -(3-0-арабинофуранозилцитозин привело к пролонгированию эффекта исходного соединения. При этом молекулярный механизм действия этого вещества не изменяется, так как для проявления им цитостатической активности требуется гидролиз и освобождение от адамантана. Присоединение адамантильного радикала к пуриновому антиметаболиту 6-тиоинозину также усилило иммуносупрессивную активность производного по сравнению с исходным соединением [12].

Предполагают, что изменение биологической активности связано с изменениями пространственного строения, гидрофобности и липофильности соединений, создающими более благоприятные условия для их транспорта через биологические мембраны [9]. С помощью метода спиновых меток было показано, что адамантан, попадая в липидный бислой, способен разрушать гексагональную упаковку метиленовых группировок, характерную для двойно

Информация о работе

Гараев, Тимур Мансурович
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Синтез и изучение противовирусных свойств соединений пептидной природы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы