Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия синтетических генов антибактериальных пептидов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мартемьянов, Кирилл Анатольевич, Пущино

в!'

99' Ь /8 9 Ч- У

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БЕЖА

На правах рукописи

МАРТЕМЬЯНОВ Кирилл Анатольевич

УДК: 577.213.7

ЭКСПРЕССИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ ГЕНОВ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПЕПТИДОВ

Научные руководители: д.х.н., профессор А.Т. Гудков д.б.н., академик A.C. Спирин

Пущино - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................5

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................7

1. Антибактериальные пептиды

1.1. Открытие и разнообразие антибактериальных пептидов.......................7

1.2. Классификация антибактериальных пептидов.......................................10

1.3. Структура антибактериальных пептидов...............................................16

1.4. Механизм антибактериального действия...............................................19

1.5. Биосинтез антибактериальных пептидов и организация их генов.......23

2. Клонирование и экспрессия генов . ;

2.1. Подходы к конструированию синтетических генов..............................25

2.2. Прокариотические системы экспрессии генов in vivo...........................26

2.3. Прокариотические системы экспрессии генов in vitro.........................27

2.4. Клонирование и экспрессия генов антибактериальных пептидов.......29

Резюме........................................................................................................................32

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

III. МАТЕРИАЛЫ...............................................................................................................34

1. Оборудование.........................................................................................................34

2. Реактивы.................................................................................................................35

3. Буферные растворы и среды..................................................................................36

4. Бактериальные штаммы.........................................................................................36

5. Олигонуклеотиды...................................................................................................36

IV. МЕТОДЫ.........................................................................................................................38

1. Синтез и очистка олигонуклеотидов.....................................................................38

2. РРЬС-хроматография.............................................................................................38

3. Обессоливание и концентрирование ДНК............................................................39

4. Фосфорилирование олигонуклеотидов.................................................................40

5. Электрофорез белков и пептидов в полиакриламидном геле.............................40

6. Электрофорез нуклеиновых кислот.......................................................................42

7. Авторадиография и флюорография......................................................................43

8. Приготовление компетентных клеток...................................................................44

9. Трансформация компетентных клеток..................................................................44

10. Выделение ДНК плазмид.....................................................................................45

11. Рестрикция ДНК...................................................................................................46

12. Дефосфорилирование 5' концов ДНК.................................................................47

13. Отжиг олигонуклеотидов и лигирование............................................................48

14. Полимеразная цепная реакция.............................................................................48

15. Определение нуклеотидной последовательности...............................................50

16.1п укго транскрипция/трансляция в Б-ЗО экстракте............................................50

17. Индукция т экспрессии генов......................................................................52

18. Разрушение клеток и приготовление Б-100 экстракта........................................53

19. Выделение гибридных белков..............................................................................54

20. Расщепление белка по метионину........................................................................54

21. Обнаружение антибактериальной активности...................................................54

V. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................56

1. Конструирование генов..........................................................................................56

1.1. Выбор антибактериальных пептидов......................................................56

1.2. Экспериментальный подход к синтезу генов

антибактериальных пептидов........................................................................57

2. Синтез и клонирование генов антибактериальных пептидов..............................59

2.1. Получение олигодезоксирибонуклеотидов.............................................59

2.2. Сборка и клонирование генов пептидов.................................................59

3 Прямая экспрепссия генов антибактериальных пептидов....................................63

3.1. Создание генетических конструкций.......................................................63

3.2. In vivo экспрессия генов пептидов в E.coli..............................................65

3.3. In vitro экспрессия генов антибактериальных пептидов в бесклеточной системе трансляции.................................................................66

4 Экспрессия химерных генов антибактериальных пептидов................................70

4.1. Разработка метода мультимеризации генов...........................................71

4.2. Генетческие конструкции для экспрессии

химерных генов антибактериальных пептидов............................................74

4.3 In vivo экспрессия генов химерных белков..............................................80

4.4. In vitro экспрессия генов химерных белков............................................83

4.4.1. Экспрессия тандемно повторенного гена цекропина..........................83

4.4.2. Экспрессия химерного гена GFP-тандемно повторенный цекропин..85

5. Биосинтез белка в полностью бесклеточной системе...........................................89

6. Заключение..............................................................................................................94

VI. ВЫВОДЫ.........................................................................................................................95

VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................96

VIII. БЛАГОДАРНОСТИ...................................................................................................ИЗ

I. ВВЕДЕНИЕ

Возможность существования живых организмов неразрывно связана с их способностью защищать собственную внутренную среду от влияния повреждающих факторов. Все высшие организмы, в частности, способны защищать себя от естественной и патогенной флоры бактерий.

Организация иммунной системы, выполняющей эту функцию, у представителей разных форм организмов отличается. Общим для всех многоклеточных организмов оказывается существование наиболее древнего звена, так называемой неспецифической иммунной системы, выполняющей роль перманентной защиты организма от инвазии (Medzhitov and Janeway, 1997). Среди множества белковых факторов, выполняющих эту функцию наиболее общими являются пептиды с выраженной антибактериальной активностью, называемые антибактериальными пептидами. Несмотря на то, что эти агенты были открыты менее 20 лет назад, к настоящему времени неоспоримым фактом можно считать их существование у всех животных и растений. Данные пептиды обладают широким спектром антибактериальной и фунгицидной активности, что делает их универсальными защитными агентами.

Вследствии очевидной важности антибактериальных пептидов для обеспечения жизнеспособности организмов, несомненным является все возрастающий интерес к изучению принципов их организации и особенностей действия. Возможной практической стороной результатов таких исследований могло бы оказаться применение антибактериальных пептидов для лечения и профилактики различных заболеваний.

Уникальность антибактериальных пептидов среди прочих антимикробных агентов заключается в том, что информация об их структуре кодируются ДНК, а сами пептиды синтезируются в виде предшественников белок - синтезирующим аппаратом

клетки на рибосомах. Следовательно, существует возможность синтезировать такие пептиды биосинтетическим путем. В последнее время все больше обращают на себя внимание попытки получать пептиды используя технологию рекомбинантных ДНК. Несмотря на очевидные преимущества этого способа, существуют многочисленные трудности, препятствующие его реализации. Для осуществления биологического синтеза антибактериальных пептидов необходимо получение генов этих пептидов, изучение факторов, влияющих на их целенаправленную экспрессию и создание эффективных экспрессионных систем.

Целью настоящей работы является разработка способов биосинтетического производства пептидов, включающая в себя решение таких задач, как: синтетическое получение генов антибактериальных пептидов, создание экспрессионных конструкций для них, изучение факторов, влияющих на уровень экспрессии синтетических генов пептидов и их биосинтетическое производство.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПЕПТИДЫ

1.1. Открытие и разнообразие антибактериальных пептидов

Существование антибиотиков пептидной природы у животных было открыто как результат работы по двум независимыми направлениям исследований: а) изучению механизмов, с помощью которых неклеточное содержимое гемолимфы иммунизированных насекомых вызывает гибель бактерий; б) изучению механизмов лизиса фагоцитированных бактерий в вакуолях фагоцитов млекопитающих.

Так, в результате десятилетней кропотливой работы по изучению иммунной системы насекомых, нацеленной на поиск источника антибактериальной активности, вызываемой бактериальной инфекцией у Drosophila и у личинки гигантской бабочки Cecropia, были открыты 2 первых антибактериальных агента полипептидной природы, названные цекропинами А и В. У выделенных пептидов была продемонстрирована способность вызывать лизис бактерий и неспособность действовать на клетки насекомых и млекопитающих (Steiner et al., 1981).

Практически в тоже самое время, в 1980 году, другая группа исследователей, работавшая с макрофагами кролика, выделила из этого источника в чистом виде антибактериальные пептиды, названные впоследствии дефензинами. Аминокислотная последовательность этих пептидов была опубликована лишь спустя три года (Selsted et al.,1983).

На протяжении последующих десяти лет, было открыто огромное множество антибактериальных пептидов из самых разнообразных организмов и к настоящему времени известно около 100 аминокислотных последовательностей таких пептидов. Помимо гемолимфы насекомых и макрофагов млекопитающих, пептиды с антимикробным действием были выделены из кожи земноводных, кишечника, семенной жидкости, кожи, легких млекопитающих, тканей растений. Примеры наличия

антибактериальных пептидов среди различных организмов и спектр активности таковых приведены в (Таблице 1). Эта таблица не включает в себя всех известных на сегодняшний день пептидов с антибактериальным действием. В ней приведены лишь довольно известные формы, к тому же их список непрерывно пополняется.

К настоящему моменту, стало очевидным, что антибактериальные пептиды являются широко распространенным феноменом и неотъемлемой частью неспецифической иммунной системы всех многоклеточных организмов. Общим для всех таких пептидов является маленький размер, они, как правило, варьируют по своему размеру от 12 до 70 аминокислотных остатков в длину, содержат минимум 4 Lys и/или Arg и многочисленны, в основном, в клетках и тканях, выполняющих барьерную функцию. Антимикробные пептиды обладают широким антибактериальным спектром активности, зависящим от вида организма в котором они встречаются. Многие антибактериальные пептиды получаются в результате протеолитического расщепления предшественников, зачастую не обладающих бактерицидными свойствами.

В последнее время появляются сообщения об антимикробных свойствах протеолитических фрагментов некоторых экскреторных белков, так например, фрагмент 165-203 белка молока казеина, проявляющий сильные антибактериальные свойства, был назван казоцидином-1 (Zucht et al.,1995). Такие факты значительно расширяют рамки представлений о семействе антибактериальных пептидов. Рассматривая это семейство, нельзя не упомянуть лизоцим - первый антимикробный агент, выделенный из насекомых. Лизоцим активен только против грам-положительных бактерий и его функция состоит в удалении муреинового слоя, остающегося после действия цекропинов и аттацинов (Boman et al., 1991). По механизму действия и общим чертам структуры, антибактериальные пептиды близки к семейству гемолитических пептидов, являющихся еще одной ветвью бесклеточного иммунитета (Saberwall & Nagaraj, 1994).

Таблица 1. Группы антибактериальных пептидов различного происхождения

Название Источник Активность

Апидецин Пчела Действует против грам-отрицательных бактерий, симбиотических бактерий, животных, растений и человека.

Андропин Семявыносящий проток Drosophila Активен против грам-положительных бактерий.

Бактенецин Нейтрофилы быка Активны как против грам-положительных, так и против грам-отрицательных бактерий.

Цекропины: (A,B,D,P) Насекомые: Cecropia Bombyx Hyalophora Drosophila Свинья Цекропины А,В,Р активны против грам-положительных и грам-отрицательных бактерий. Цекропин О действует только против грам-отрицательных бактерий.

Дефензины: Млекопитающие: человек свинья кролик крыса Действуют против грам -отрицательных и грам- положительных бактерий, грибов, некоторых вирусов.

Индолицин Гранулоциты быка Действует против грам-отрицательных и грам- положительных бактерий.

Магаинины и родственные пептиды Кожа Xenopus laevis Активны против грибов, простейших, грам-положительных и грам-отрицательных микроорганизмов.

Бревенин и эскулетин кожа Rana esculenta Аналогично цекропинам.

Гаегурины Кожа Rana rugosa Фунгицидная, антипротозойная и антибактериальная активности.

Семиноплазмин семенная жидкость быка Активен против грам-отрицательных и грам-положительных бактерий.

Антимикробные пептиды из растений Семена Ipomoea purga Действуют только против грам -положительных микроорганизмов.

Бомбинин и бомбининоподобные пептиды Bombina variegata и другие земноводные Специфическая активность против некоторых грам-положительных и грам-отрицательных бактерий.

Секретолитин и казоцидин Протеолитические фрагменты секреторных белков Грам - отрицательные и грам-положительные бактерии.

1.2. Классификация антибактериальных пептидов

Долгое время, с момента своего открытия, антибактериальные пептиды считалось естественным подразделять на группы, исходя из источника их происхождения. Так, выделяли пептиды, вовлеченные в иммунный ответ у насекомых (Boman and Hultmark, 1987; Hultmark, 1993) или дефензин - подобные пептиды из фагоцитирующих клеток (Lehrer et al.,1993). Однако, по мере того как открывались все новые и новые пептиды, более логичным стало группировать их по совокупности общих химических и биохимических характеристик. Для некоторых семейств пептидов существует значительная гомология аминокислотных последовательностей, что позволяет объединять их в одну группу. С другой стороны, существенной деталью

оказывается схожесть пространственных структур пептидов, при отсутствии схожести в аминокислотных последовательностях. Предложенная классификация (Boman, 1995) основывается на анализе данных о схожести аминокислотных последовательностей, пространственных структур и функциональных особенностей.

Группа I: Линейные, a-спиральные пептиды, не содержащие цистеина.

К данной группе пептидов относятся, в первую очередь, все виды цекропинов. Они распространены в основном у насекомых, причем, содержатся практически у всех представителей этого класса, что было показано либо прямым выделением этих пептидов из огромного множества источников, либо анализом последовательности ДНК (Boman, 1994). Любопытно, что цекропины присутствуют также и у млекопитающих. Первый такой пептид был выделен из кишечника свиньи (Lee et

В пределах этой группы наблюдается значительная гомология аминокислотных последовательностей, со степенью идентичности 60- 70%. Все цекропины имеют сильно основную 1Я-концевую часть и протяженный гидрофобный участок на С-конце, соединенные перетяжкой из глицина и/или пролина. Общая длина цекропинов превышает 30 аминокислотных остатков. С-концевая аминокислота амидирована у всех цекропинов насекомых, что однако, не является необходимым условием для цекропинов из млекопитающих. Наличие строго консервативных аминокислот в первичной структуре цекропинов позволяет вывести их консенсусную последовательность:

Цекропины активны против грам-отрицательных и только немногих грам-положительных микроорганизмов, в некоторых случаях они оказывают более сильное

al.,1989).

-W-K-KKI-E-L

-R----1—G-GIA---G

V AV А

действие, чем такой антибиотик как тетрациклин (Boman, 1995). Совсем недавно было открыто цитотоксичное действие цекропинов на опухолевые клетки (Winder et al., 1998).

Наряду с цекропинами, к данной группе относят также, схожие с ними по структурной организации, семейства антибактериальных пептидов, выделенные из кожи и гастроинтестинального тракта лягушек: магаинины (Zasloff, 1987), бомбинины (Simmaco et al., 1991), темпорины (Simmaco et al., 1996) и PGLa-пептиды (Giovannini et al., 1987). Вышеперечисленные семейства представлены наиболее разнообразно, но, не смотря на их сходство, они сугубо специфичны у организмов в которых встречаются.

Магаинины являются основными пептидами, размером 23 аминокислотных остатка и оказывают литическое действие на простейшие, грибы и, как грам-отрицательные, так и грам - положительные бактерии (Zasloff, 1987). Недавно было показано, что магаинины обладают также противовирусными и антираковыми свойствами (Bevins & Zasloff, 1990; Ohsaki et al., 1992). В тоже время, они имеют в 10 раз меньшую специфическую активность нежели цекропины. С- конец магаининов не амидирован.

В целом, ма�