Изучение феномена продукции низкомолекулярного антибактериального пептидного фактора культурой Staphylococcus warneri IEGM KL-1

Полюдова, Татьяна Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение феномена продукции низкомолекулярного антибактериального пептидного фактора культурой Staphylococcus warneri IEGM KL-1
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение феномена продукции низкомолекулярного антибактериального пептидного фактора культурой Staphylococcus warneri IEGM KL-1"

На правахрукописи

ПОЛЮДОВА Татьяна Вячеславовна

ИЗУЧЕНИЕ ФЕНОМЕНА ПРОДУКЦИИ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПЕПТИДНОГО ФАКТОРА КУЛЬТУРОЙ STAPHYLOCOCCUS WARNER1 IEGM KL-1

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 2004

Диссертация выполнена в лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, доцент Коробов Владимир Павлович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кузяев Рафаэль Зиафутдинович кандидат биологических наук Куюкина Мария Станиславовна

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская область

Защита состоится » ^ХЛ ^/иЛ- 2004 г. в ¿Г

часов на заседании

диссертационного совета' Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс:(3422)446711.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат «^^авослан^^*^- 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

член-корреспоидентР^Н / Р Ившина Ирина Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Повышенный интерес исследователей к классу низкомолекулярных катионных пептидов отражает важную роль этих соединений в биологических системах. Широкое распространение в природе позволяет рассматривать низкомолекулярные пептиды как один из инструментов антибактериальной защиты организмов, проявляющейся в многочисленных реакциях антагонизма на всех уровнях организации жизни (Кокряков, 1999; Бухарин и др., 2000).

Наибольшее количество продуцентов низкомолекулярных катионных пептидов обнаружено среди грамположительных бактерий (Oscariz, Pisabarro, 2001). Синтезируемые ими пептиды обладают широким спектром антибактериального действия. Способность к секреции данных соединений наиболее распространена среди представителей родов Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus и Streptococcus (Егоров, Баранова, 1999). В значительно меньшей степени этот признак описан у бактерий рода Staphylococcus. Так, из известных в настоящее время 38 видов Staphylococcus способность продуцировать антибактериальные пептиды исследована лишь у стафилококков, принадлежащих к видам S. epidermidis (Allgaier et al., 1986), S. gallinarum (Kellner et al, 1988), S. cohnii (Furmanek et al, 1999), S. aureus (Crupper, Iandolo, 1996; Crupper et al, 1997, Navarata et al, 1998). В процессе поиска новых продуцентов низкомолекулярных катионных пептидов сотрудниками лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН выделен штамм IEGM KL-1, принадлежащий к виду S. warneri и активно синтезирующий антибактериальные соединения (Коробов, Лемкина, 1996; Коробов и др., 2003).

Изучение низкомолекулярных катионных антибактериальных пептидов имеет важное значение для понимания путей быстрой колонизации стафилококками характерных экологических ниш (лечебных стационаров, в частности) и представляет особую значимость для создания новых лекарственных средств класса природных антибиотиков. Последнее особенно актуально, поскольку в настоящее время наблюдается стремительное распространение антибиотикорезистентных форм микроорганизмов благодаря высокой мобильности их генома, способствующей быстрому формированию защитных механизмов к новым антибактериальным препаратам.

ЮСИАЦЙОМДМАЯ!

м«м»м* !

Цель настоящей работы - детальное изучение закономерностей процесса продукции низкомолекулярного антибактериального фактора клетками S. warnen IEGM KL-1.

Основные задачи исследования

1. Выявить оптимальные условия культивирования S. warnen IEGM KL-1, обеспечивающие максимальный выход антибактериального фактора.

2. Исследовать возможные механизмы регуляции синтеза антибактериального фактора клетками S. warnen IEGM KL-1.

3. Разработать эффективный способ получения очищенного антибактериального фактора, изучить его физико-химические и биологические особенности.

4. Разработать способ повышения секреторной активности S. warnen IEGM KL-1 - продуцента низкомолекулярного антибактериального фактора.

Положения, выносимые на защиту

1. Продукция антибактериального фактора клетками S. warnen IEGM KL-1 зависит от условий их культивирования, фазы роста, контролируется внутрипопуляционными механизмами.

2. Антибактериальный фактор, продуцируемый S. warnen IEGM KL-1, -новый термо- и кислотоустойчивый низкомолекулярный катионный пептид гидрофобной природы. Информация о его синтезе локализована в бактериальной хромосоме.

3. Низкомолекулярный пептид, секретируемый клетками S. warnen IEGM KL-1, обладает широким спектром антибактериальной активности, степень проявления которой зависит от условий внешней среды.

4. Воздействие на клетки S. warnen IEGM KL-1 ультрафиолетовым светом и оптимизация состава питательной среды способствуют существенному повышению уровня продукции- низкомолекулярного антибактериального фактора.

Научная новизна, теоретическое и практическое значение работы. Впервые обнаружена продукция антибактериального фактора клетками стафилококков, принадлежащих к редкому виду S. warnen. Экспериментально обосновано, что антибактериальный фактор, выделенный из среды культивирования S. warneri IEGM KL-1, является новым низкомолекулярным катионным пептидом с молекулярной массой 2999 Да. Установлено, что продукция пептида зависит от фазы роста, условий культивирования клеток S. warnen IEGM KL-1, контр ол ируется внутрипопуляционными механизмами.

Информация о его синтезе и секреции локализована в бактериальной хромосоме. Показано, что низкомолекулярный пептидный фактор обладает широким спектром антибактериальной активности в отношении стафилококков S. aureus и S. epidermidis, а также представителей родов Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Rhodococcus, Streptococcus. Полученные результаты расширяют представление о микробной продукции низкомолекулярных катионных пептидов.

В результате проведенных исследований разработан оптимальный состав среды культивирования S. warneri IEGM KL-1, обеспечивающий 16-кратное повышение уровня продукции антибактериального фактора. Обоснована возможность использования ультрафиолетового света для увеличения секреторной активности продуцента низкомолекулярного катионного антибактериального пептида. Выявленный широкий спектр антимикробного действия низкомолекулярного катионного пептида, продуцируемого клетками S. warneri IEGM KL-1, открывает перспективы его практического использования в качестве эффективного противомикробного средства.

Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета: материалы диссертации используются в лекционном курсе "Биохимия микроорганизмов" и Большом практикуме по общей микробиологии.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Региональной конференции молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии", Пермь, 1999; II Российской конференции молодых ученых "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 2001; V Международной научной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды", Пермь-Волгоград, 2001; Международной конференции "Микробиология и биотехнология XXI столетия", Минск, 2002; Международной конференции "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии", Минск, 2004.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме "Изучение роли эндогенных и экзогенных факторов в регуляции роста

популяций микроорганизмов" (Индекс приоритетного направления 4.1.2, номер госрегистрации 01.9.10055303).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц, 36 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 162 литературных источников, из них 25 отечественных и 137 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали штамм S. warneri IEGM KL-1 в качестве продуцента антибактериального фактора (АБФ). Спектр антибактериальной активности фактора определяли на штаммах Arthrobacterglobiformis ВКМ 193, Bacillus subtilis ИЭГМ 869, Cory neb acterium ammoniagenes ИЭГМ 1862, Escherichia coliM 17, Micrococcus luteus ИЭГМ 391, Pseudomonas aeruginosa ИЭГМ 829, Rhodococcus ruber ИЭГМ 70, Salmonella minnesota Re-595, S. guinea S, S. aureus209P, 51 epidermidis33, Streptococcuspneumoniae264, S. pneumoniae 317, S. pneumoniae 6144, 5. pyogenes Dick 1. Бактериальные культуры были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов, ВКМ, Москва; Уральской профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов, ИЭГМ, Пермь; Научно-производственного объединения "Биомед", Пермь, а также любезно предоставлены профессором В.В. Тецом, кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени И.П. Павлова.

Вырашцвание S. warneri IEGM KL-1 проводили в среде LB в колбах на термостатируемом шейкере УВМТ-12-250 при 150 об/мин и температуре 37°С. О росте культуры судили по изменению оптической плотности при 540 нм. Культивирование продолжали до перехода бактериальных клеток в стационарную фазу роста. На разных стадиях развития бактериальной популяции клетки осаждали центрифугированием при 6000g в течение 10 мин и отбирали надосадочную жидкость. Клетки дважды промывали 0,14М NaCl, суспендировали в воде и подвергали ультразвуковой обработке на дезинтеграторе УЗДН-1 при 4°С в течение 5 мин. Разрушенные клетки осаждали центрифугированием при 12000g в течение 10 мин. В полученных супернатантах и надосадочной жидкости определяли антибактериальную

активность методом двукратных разведений (Scott et al, 1999), используя в качестве тест-культуры S. epidermidis 33. За условную единицу антибактериальной активности (ЕА) принимали обратную величину максимального разведения, при котором наблюдается полное торможение роста тест-бактерий при инкубации в течение 16-18 ч. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) фактора для различных штаммов микроорганизмов определяли путем сравнения с таковой референс-образца с известным количеством пептида. Для выделения антибактериального фактора использовали супернатант культуры S. warneri IEGM KL-1, который подвергали истощающей фильтрации в системах Centricon ("Amicon") и Centriplus ("Millipore"), очистке на колонках с Heparin-agarose ("Sigma") и Sephadex G-25 ("Amersham Biosciences"). Оценку гомогенности выделенного фактора проводили с помощью электрофореза в 15% полиакриламидном геле (ПААГ) с мочевиной, детекцию биологической активности в гелях осуществляли в системе "gel-overlay" (Lehrer et al., 1991). Для определения аминокислотного состава выделенный пептид гидролизовали в 6М НС1 в течение 24 ч при 105°С. Состав гидролизата исследовали на аминокислотном анализаторе Т-339 (ЧССР). Масс-спектрометрический анализ лиофилизированных препаратов антибактериального фактора проводили на приборе Voyager-DE STR Biospectrometry Workstation ("Perseptive Biosystems"). Для изучения динамики связывания АБФ с поверхностью микробной клетки использовали препарат меченого фактора, полученный из супернатанта культуры S. warneri IEGM KL-1, выращенной в присутствии радиоактивного гидролизата 14С-белков хлореллы ("Amersham LIFE SCIENCE"). Подсчет радиоактивности препаратов производили на жидкостном сцинтилляционном счетчике Wallac 1414 ("Guardian"). Для ультрафиолетового облучения использовали клетки культуры S. warneri IEGM KL-1, находящейся в начале fog-фазы роста. Для этого клетки центрифугировали, отмывали 0.14М раствором NaCl и готовили суспензию, содержащую 108 клеток/мл (Миллер, 1976). УФ-облучение проводили в открытых чашках Петри. В качестве источника излучения использовали бактерицидную лампу ОКН-11-М. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Birnboim, Doli, 1979) и исследовали методом горизонтального электрофореза в 0,9%-ном агарозном геле (Маниатис и др., 1984). Количество жизнеспособных клеток определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве на плотную питательную среду (Веслополова, 1995).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ Exel 2000 (Microsoft Inc, 1999), Statistica for Windows, v.5.0 (StatSoft Inc., 1995), рассчитывая среднее арифметическое, доверительные интервалы, стандартное отклонение. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что рост бактериальных клеток находится в строгой зависимости от условий окружающей среды, факторы которой (источники углерода и энергии, температура, рН, редокс-потенциал, присутствие ингибиторных соединений) определяют характер развития микроорганизмов и их биосинтетическую активность (Печуркин, 1978).

По нашим данным, значительное влияние на продукцию антибактериального фактора клетками S. warneri IEGM KL-1 оказывают температура культивирования, аэрация и исходное значение кислотности питательной среды. Так, оптимальными условиями для культивирования штамма-продуцента на среде LB, при которых максимальный уровень накопления антибактериального фактора в среде достигается через 9-10 ч роста культуры и остается неизменным в последующие часы культивирования, являются исходное значение рН 6,0, температура культивирования 37°С и аэрация при скорости вращения шейкера 150 об/мин (рис. 1). В этих условиях антибактериальная активность регистрируется только в среде культивирования S. warneri IEGM KL-1, поскольку в ультразвуковых экстрактах клеток антибактериальная активность не обнаруживается. Это позволяет сделать предположение о существовании внутри клетки некоего предшественника антибактериального соединения, не обладающего антимикробной активностью, превращение которого в активную форму происходит во время или после его переноса через клеточную мембрану. Наличие подобных промежуточных соединений является характерным для многих известных пептидных бактериоцинов (Nes, Tagg, 1996; Jack, Jung, 2000). Анализ влияния условий культивирования на рост и продукцию клетками S. warneri IEGM KL-1 антибактериального фактора позволяет отметить факт торможения продукции, наблюдавшийся во всех использованных нами условиях культивирования при переходе бактериальных клеток в стационарную фазу.

4 ■ 3,53 ■ 241,3" 1 -0,5 -0^

I 23 4 567 89 10 1) Время, ч

Рис. 1. Рост ^атпег1 IEGM ИИ и продукция антибактериального фактора при культивировании на среде ЬБ.

1 - рост культуры; 2 - антибактериальная активность.

Это, по-видимому, свидетельствует о том, что факторы окружающей среды, действуя через сигнальные механизмы, контролируют биосинтетическую активность клеток wатвп 1ЕОМ КЬ-1. Наличие подобных регуляторных механизмов показано для продуцентов катионных низкомолекулярных антибактериальных пептидов низина (Е^е1ке в( а1и 1994) и эпидермина (РевсЬе1 в( ак, 1993).

Имеющиеся данные (СЫисЫо1о в( ак, 2001; Е^пк в( ак, 2001) указывают на зависимость уровня продукции бактериоцинов от стадии роста бактериальной культуры. В большинстве описанных случаев секреция антибактериальных соединений в среду начинается, как правило, при переходе культуры продуцента в стационарную фазу развития. По нашим данным, выделение антибактериального соединения клетками 5. ^атвп 1ЕОМ КЬ-1 происходит значительно раньше - с момента перехода бактериальных клеток в экспоненциальную стадию роста. В конце логарифмической фазы и при торможении роста антибактериальная активность в среде достигает максимального уровня и в дальнейшем не нарастает, что позволяет предполагать наличие в культуральной жидкости особых индуцирующих сигнальных соединений, способствующих интенсивному выделению

антибактериального фактора уже на ранних этапах роста бактериальной популяции (см. рис. 1).

Сигналами, индуцирующими синтез антибактериальных соединений, могут быть не только специфические продукты метаболизма бактерий, но и неспецифические факторы среды, такие как изменение кислотности, температуры и осмолярности (Ennahar et al, 2000; Hindre et al, 2004). Известно, что под действием стресс-факторов происходят масштабные перестройки метаболизма бактериальных клеток, которые осуществляются путем регуляции экспрессии особых генов и функционирования их специфических продуктов (Locke, Noble, 1995). Такая "мобилизация" генетической информации клеток при стрессовых ситуациях может проявляться и в изменении регуляции синтеза соединений, не имеющих прямого отношения к ответу бактерий на типичные шоковые воздействия.

Нами установлено, что кратковременное воздействие экстремальных условий на клетки S. warneri IEGM KL-1 приводит к повышению скорости продукции АБФ. Так, увеличение скорости продукции фактора ( ДЛЕА/ДОБ) обнаруживается после прогревания инокулума при 50°С в течение 5 мин, а также выдерживания в течение одного часа в закисленой среде и гиперосмолярных условиях (рис. 2).

§ 350

Рис. 2. Изменение скорости продукции антибактериального фактора клетками магпеп IEGM претерпевшими стрессовые воздействия.

Следует отметить, что краткосрочные стрессовые воздействия на бактериальные клетки перед засевом в свежую среду могут быть использованы для направленного увеличения скорости выделения антибактериального фактора и сокращения времени культивирования бактерий до наступления максимального уровня антибактериальной активности в среде роста.

Таким образом, имеющиеся в литературе данные и результаты собственных исследований характеризуют синтез антибактериальных соединений как лабильный регулируемый процесс, тесно связанный с условиями культивирования продуцентов.

Поскольку в процессе роста бактериальной популяции warneri 1ЕвМ КЬ-1 антибактериальное соединение полностью секретируется в окружающую среду, для выделения антибактериального фактора мы использовали супернатант 9-10 часовой культуры, стерилизованный с помощью мембранной фильтрации. Использование систем СеПпсоп 100 и 10 и Сеш11р1щ УМ-3 позволило установить, что антибактериальное соединение обладает молекулярной массой около 3000 Да. При нанесении ультрафильтрата на колонки с гепарин-агарозой антибактериальный фактор элюируется в узком градиенте хлорида натрия (рис. 3).

600 -1

24М"

200-

500 •

ИК>-

100 -

0 1 I I I I

ЕЗЗАБФ —N«01

ТТТТТТТТ+ 0

■0,5

0 3 10 К 20 25 Фракции

Рис. 3. Хроматография ультрафильтрата среды культивирования & юагпеН IEGM КЬ-1, содержащего антибактериальный фактор, на колонке с гепарин-агарозой.

Изучение физико-химических характеристик полученного антибактериального фактора показало, что он обладает выраженной термо- и кислотоустойчивостью (табл. 1, рис. 4).

Таблица 1.

Действие высоких температур на активность вьщеленного фактора

Воздействие Время воздействия, мин Активность, %

Кипячение на 60 100

водяной бане

105°С (0,5 атм) 30 100

119,6°С(1,0 атм) 15 100

Рис. 4. Антибактериальная активность фактора, продуцируемого клетками 5!. юагпеН ГЕЮМ КЬ-1, после 2-часовой обработки при различных значениях рН.

Природа низкомолекулярного антибактериального фактора, продуцируемого клетками waraeи ГЕвМ КЬ-1, была установлена после обработки с помощью различных гидролаз (табл. 2). Так, инкубация препаратов АБФ с ДНК-азой, РНК-азой и карбоксипептидазой не оказывает влияния на его антибактериальную активность. Напротив, воздействие протеазами трипсином, пепсином и протеиназой К приводит к полному исчезновению

антибактериальной активности фактора. Обнаруженная нами высокая чувствительность к действию протеаз свидетельствует о пептидной природе антибактериального фактора.

Таблица 2.

Влияние ферментативной обработки на антибактериальную активность фактора, продуцируемого клетками магпеп ГЕСМ КЬ-1

Воздействие Время воздействия, ч Активность, %

ДНКаза 2 100

РНКаза 2 100

Карбоксипептидаза 2 100

Протеиназа К 2 0

Пепсин 2 0

Трипсин 2 0

Электрофоретическое исследование выделенного АБФ в ПААГе с окраской серебром выявило наличие в нем одной пептидной фракции (рис. 5А), проявление антибактериальной активности которой продемонстрировано постэлектрофоретическим анализом в системе "gel-overlay " (рис. 5Б).

Гомогенность полученного в результате очистки антибактериального пептидного фактора подтверждена масс-спектрометрическим исследованием. Как видно из рис. 6, препарат содержит практически один пептид с молекулярной массой 2999 Да.

С помощью аминокислотного анализа в составе выделенного пептида нами выявлено 15 остатков аминокислот (табл. 3), среди которых около трети приходится на долю гидрофобных аминокислот аланина, валина, лейцина и изолейцина. Важнейшей характеристикой пептида является абсолютное превалирование в его составе положительно заряженной аминокислоты лизина. Ориентировочный расчет показал, что в кислых и нейтральных условиях остатки лизина могут придавать молекуле суммарный положительный заряд, достигающий 5-6 единиц. Полученные данные свидетельствуют о выраженных гидрофобных и катионных свойствах исследуемого соединения, которые имеют существенное значение для взаимодействия пептида с клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной бактериальных клеток-мишеней.

Рис. 5. Электрофорез очищенного антибактериального фактора в ПААГ с мочевиной (A), "gel-overlay " в агарозе, содержащей индикаторную культуру S. epidermidis 33 (Б)

1 - локализация антибактериального фактора после электрофореза в мочевине, 2, 3 - локализация антибактериальной активности после электрофореза (нанесено 50 и 5 мкг белка, соответственно).

Рис 6 Масс-спектрометрическая характеристика выделенного антибактериального фактора, продуцируемого клетками S. warneri IEGM KL-1.

Таблица 3.

Аминокислотный состав антибактериального пептидного фактора, продуцируемого клетками 5. пагпеп ТЕОМ КЬ-1

Аминокислота Содержание, %

Алании 6,3 ±0,78

Аспарагиновая к-та 5,9 ±0,41

Валин 5,3 ±0,75

Гистидин 5,9 ±0,50

Глицин 8,8 ±1,75

Глутаминовая к-та 7,3 ±1,98

Изолейцин 4,5 ±0,72

Лейцин 5,8 ±1,20

Лизин 30,2 ±1,89

Метионин 1,4 ±0,13

Пролин 4,9 ±0,05

Серии 4,6 ±3,13

Тирозин 1,6 ±0,08

Треонин 3,5 ±0,25

Фенилаланин 2,2 ±0,57

При изучении антибактериальной активности выделенного фактора нами обнаружено его ингибирующее действие на рост грамположительных бактерий. Высокая чувствительность к фактору выявлена не только среди представителей рода Staphylococcus и близких родов Micrococcus и Streptococcus (среди которых чувствительными оказались и бактерии некоторых штаммов S. pneumoniae), но и бактерий, филогенетически далеко отстоящих от S. warneri и принадлежащих к родамArthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Rhodococcus (табл. 4). Установлено, что антибактериальное действие пептида проявляется в отношении лишь одного из исследованных штаммов грамотрицательных бактерий, в частности, S. minnesota Re-595, дефектного по липополисахаридам клеточной стенки (Timmons et al., 1986).

Таблица 4.

Чувствительность микроорганизмов к антибактериальному фактору, продуцируемому клетками S. кишеп IEGM KL-1

Род, вид Штамм МПК, мкг/мл

A. globiformis BKM193 1,0

В. subtilis ИЭГМ 869 8,0

С. ammoniagenes ИЭГМ 1862 0,25

Е. coli M-17 0

М. luteus ИЭГМ 391 0,25

P. aeruginosa ИЭГМ 829 0

R. ruber ИЭГМ 70 0,5

S. minnesota Re-595 75,0

S. guinea S 0

S. aureus 209 P 0,5

S. epidermidis 33 0,25

S. pneumoniae 264 500,0

S. pneumoniae 317 125,0

S. pneumoniae 6144 2,0

S. pyogenes Dick 1 0,25

Известно, что активность некоторых антибактериальных пептидов во многом определяется солевым составом среды (АЬее et ah, 1994; "Ми et ah, 1999). Как видно из рис. 7, чувствительность бактерий 5". epidermidis 33 к выделенному пептиду снижается при повышении содержания в среде инкубации хлоридов натрия и магния. При этом необходимо отметить, что эквивалентное подавление антибактериального эффекта пептида достигается при значительно более низких концентрациях хлорида магния (рис. 7Б). Анализ данных, представленных на рис. 7, указывает на то, что подавление антибактериального действия пептида обусловлено действием катионов, связывающихся с отрицательными зарядами кислотных компонентов клеточной стенки и заряженными группами анионных фосфолипидов бактериальной мембраны. Нарушая электростатические взаимодействия между положительными зарядами молекул пептида и отрицательно заряженными

группами поверхности клетки-мишени, ионы и М§2+, по-видимому, приводят к значительному ослаблению сорбции пептида на бактериальных клетках.

Рис. 7. Зависимость антибактериальной активности фактора, продуцируемого клетками юагпеп 1ЕОМ КЬ-1, от концентрации солей в среде.

Экспериментально показано, что антибактериальный эффект выделенного пептида зависит от рН среды инкубации (рис. 8). Внесение пептида совместно с инокулумом в среды с различными значениями рН приводит к резкому подавлению роста S. epidermidis 33 при исходных значениях рН 7 и 8. Выявленное снижение антибактериальной активности исследуемого пептида при рН 6 и резкое возрастание её в средах при рН 7 и 8, вероятно, связано с характером диссоциации ионогенных групп как самого пептида, так и поверхностных структур клеток-мишеней. В среде с низкими значениями рН ослаблена диссоциация кислотных группировок тейхоевых и липотейхоевых кислот, являющихся важнейшими компонентами клеточных стенок стафилококков. Это приводит к уменьшению количества отрицательно заряженных зон на поверхностях клеток-мишеней и, соответственно, к снижению эффективности связывания молекул пептида за счет электростатического взаимодействия с анионными сайтами клеточной стенки. В нейтральной и слабощелочной средах отрицательный заряд поверхности бактериальных клеток, по сравнению с кислой зоной, возрастает, благодаря чему происходит интенсивное связывание молекул пептида с клеточной стенкой бактерий, способствующее более полной реализации его антибактериального эффекта.

1000] А

1000-Т Б

О 200 400 600 МО 1000 Концентрация ШС[, мМ

о ю ао эо т я

КацзпращяМ^^нМ

Значения рН

Рис. 8. Антибактериальная активность фактора при инкубации клеток epidermidis 33 в течение 5 часов при различных рН.

1 - накопление биомассы клеток при инкубации без АБФ; 2 - накопление биомассы клеток при инкубации в присутствии АБФ.

Падение антибактериальной активности при рН 9, по-видимому, связано со снижением поверхностного заряда молекул самого пептида, поскольку при этом значении рН диссоциация еШ3+ групп остатков лизина становится менее выраженной (рК 10,5).

Особенности динамики сорбции антибактериального фактора на клетках-мишенях были подробно изучены с использованием препарата меченого 14С-пептида. Данные исследования показали практически моментальное связывание метки с клетками (рис. 9). Уже через 5 сек после внесения с бактериальными клетками связывается значительное количество метки, а через одну минуту наступает сорбционное насыщение и кривая, отражающая динамику связывания, выходит на плато.

Как было показано нами ранее (см. рис. 7, 8), эффективность ингиби-рующего действия пептида на рост бактерий тест-штамма в значительной степени определяется значениями рН среды культивирования и наличием в ней солей. Действительно, кислотность среды оказывает существенное влияние на взаимодействие меченого пептида с бактериями. При этом сорбционные свойства клеток и пептида наиболее полно проявляются в нейтральной среде, в то время как закисление среды приводит к заметному снижению связывания метки с бактериальными клетками (рис. 10).

700 -.

1 600 -

§ 500 •

"2 # 400-

1 300-

1 200-

100-

Время взаимодействия, сек

Рис. 9. Динамика связывания антибактериального 14С-пептида, продуцируемого Б. м>агпвпIEGM ^-1, с клетками Б. epidermidis33.

100

О 20 40 60

Время взаимодействия, сек

Рис. 10. Связывание антибактериального 14С-пептида с клетками S.epidermidis при различных значениях рН среды инкубации.

1 - связывание при рН 7,0-7,2; 2 - связывание при рН 5,9-6,0.

Солевой состав среды также оказывает значительное влияние на связывание пептида с клетками-мишенями, которое в значительной степени подавляется при увеличении концентрации хлорида натрия в среде инкубации (рис.11).

Рис. 11. Зависимость связывания антибактериального 14С-пептида, продуцируемого клетками Б. м>атег1 IEGM Е1г1, от концентрации хлорида натрия в среде инкубации.

Кинетика бактерицидного действия пептида была исследована нами путем периодического определения числа жизнеспособных клеток 8. epidermidis 33 после внесения антибактериального фактора в среду инкубации тест-бактерий (рис. 12 А, Б).

Рис. 12. Кинетика гибели клеток Б. ергйеттгМь 33 под действием антибактериального фактора, продуцируемого клетками Б. м>атеп IEGM ЮЛ.

1 - контроль; 2 - инкубация в 0,14М 3 - инкубация в воде.

При инкубировании бактерий в воде и в присутствии 0,14М №С1 значительный бактерицидный эффект пептида в обоих случаях наблюдается уже через 1 мин после внесения и проявляется в снижении их количества в 2,0 и 1,5 раза, соответственно. Через 6 ч инкубации с пептидом количество живых клеток снижается на 2 порядка в присутствии хлорида натрия и на 5 порядков в среде без соли. Быстрое проявление бактерицидного действия пептида свидетельствует о мембранной направленности действия АБФ, характерного для большинства известных катионных пептидов (Вго12 et а1., 1998).

На заключительном этапе работы был предпринят поиск путей повышения продукции антибактериального фактора клетками 5. м>атеп 1ЕвМ КЬ-1, как необходимого условия масштабирования получения пептида в количествах, достаточных для проведения его биологических испытаний. Одним из способов повышения продукции антибактериального фактора явилось воздействие на клетки продуцента ультрафиолетовым светом. В результате ультрафиолетового мутагенеза нами получены вариант штамма 5. warneri 1ЕвМ КЬ-1, обладавший повышенной в 4 раза продукцией антибактериального фактора, по сравнению с исходным штаммом, а также вариант штамма, потерявший способность к продукции фактора. Сравнение плазмидного состава обоих вариантов и исходного штамма 5. м>атеп 1ЕвМ КЬ-1 позволяет сделать вывод о том, что продукция пептида, по-видимому, не связана с наличием плазмид (рис. 14).

2,7 Т.П.Н.

пава

Рис. 14. Плазмидная ДНК исследуемых вариантов штамма пагпеп.

1 - маркер - плазмида риС19, 2,7 т.п.н.; 2 - клетки исходного штамма; 3 -клетки модифицированного штамма с повышенной АБА; 4 - клетки модифицированного штамма без АБА.

Как представлено на рис. 14, плазмидный спектр бактерий после ультрафиолетового мутагенеза не претерпевает каких-либо качественных изменений. В клетках исследуемых штаммов обнаруживается одинаковая плазмидная ДНК размером около 2,7 т.п.н. и различия проявляются лишь в уровне копийности данной плазмиды.

Полученные результаты свидетельствуют о локализации информации о синтезе и продукции антибактериального фактора в бактериальной хромосоме.

Учитывая высокие потребности стафилококков в питательных компонентах, для повышения биосинтетической активности клеток S. warneri IEGM KL-1 и продукции антибактериального фактора в среду культивирования была поставлена серия экспериментов по разработке нового состава питательной среды. На основании результатов использования комбинаций различных компонентов, рекомендуемых для обеспечения оптимального роста Staphylococcus spp. (Atlas, 1993), для культивирования S. warneri IEGM KL-1 была разработана и апробирована среда, при росте на которой биомасса бактериальных клеток превышала таковую, по сравнению с развитием на питательной среде LB в 1,3 - 1,5 раза, а уровень антибактериальной активности уже через 7-8 ч роста возрастал более, чем в 10 раз (рис. 13).

Рис. 13. Продукция антибактериального фактора культурой ^атпеН ¡ЕСМ КЬ-1 при культивировании на разных средах.

1 - продукция при росте на среде ЬВ; 2 - продукция при росте на разработанной среде.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что синтезируемый клетками S. warneri IEGM KL-1 антибактериальный фактор представляет собой низкомолекулярный пептид, обладающий молекулярной массой 2999 Да. Пептид характеризуется выраженной термостабильностью и кислотоустойчивостью, обладает катионными и гидрофобными свойствами. Совокупность выявленных физико-химических свойств и особенности аминокислотного состава позволяют рассматривать его в качестве нового представителя семейства антимикробных катионных пептидов, обладающего широким спектром антибактериального действия.

Полученные нами данные и результаты исследований других авторов, свидетельствуют о том, что детальное изучение низкомолекулярных антибактериальных пептидов как важного биологического феномена представляет не только фундаментальный интерес, но и, принимая во внимание выраженную антибиотическую активность катионных пептидов, имеет существенное значение для разработки путей использования природных антибиотиков в практической деятельности человека.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что максимальный уровень продукции антибактериального фактора клетками S. warneri IEGM KL-1 достигается в конце логарифмической фазы роста культуры при температуре 37°С и кислых (6,0) значениях рН. Продукция фактора находится под контролем внутрипопуляционных механизмов. Информация о его синтезе локализована на хромосоме.

2. Антибактериальный фактор, продуцируемый клетками S. warneri IEGM KL-1, получен в очищенном виде. Экспериментально обосновано, что выделенный антибактериальный фактор представляет собой новый термо- и кислотоустойчивый амфипатический пептид семейства низкомолекулярных бактериоцинов с молекулярной массой 2999 Да, в составе которого преобладают гидрофобные аминокислоты и катионная аминокислота лизин.

3. Выявлено, что низкомолекулярный катионный пептид, продуцируемый клетками S. warneri IEGM KL-1, обладает широким спектром антибактериальной активности в отношении стафилококков S. aureus, S. epidermidis и представителей родов Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Rhodococcus, Streptococcus.

4. Обнаружено, что связывание антибактериального пептида с микробными клетками и его бактерицидное действие наиболее выражены при нейтральном и слабощелочных значениях рН. При повышении в среде концентрации хлоридов натрия и магния (до 1М и 0,02 М, соответственно) антибактериальное действие низкомолекулярного катионного пептида полностью ингибируется.

5. Обоснована возможность повышения уровня продукции антибактериального пептида при помощи ультрафиолетового облучения клеток (в 4 раза), а также за счет оптимизации состава среды культивирования S. warneriIEGM KL-1 (в 16 раз).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коробов В.П., Лемкина Л.М., Полюдова Т.В. Продукция антибактериального фактора клетками Staphylococcus sp. при изменении условий роста бактериальной культуры//Проблемы загрязнения окружающей среды: Тез. докл. Междунар. конф. Москва, 1998. - С. 62.

2. Лемкина Л.М., Полюдова Т.В. Изучение выделения антибактериального фактора культурой Staphylococcus sp. при действии некоторых внешних факторов//Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: Матер. Регион, конф. молодых ученых. -Пермь, 1998.-С. 101-102.

3. Полюдова Т.В. Эффект шоковых воздействий на продукцию антибактериального пептидного фактора культурой Staphylococcus warneri// Охрана природы и здоровья человека: Тез. докл. III Регион, научно-практич. конф. - Оренбург, 2000. - С. 24.

4. Коробов В.П., Лемкина Л.М., Полюдова Т.В. Изучение спектра антибактериальной активности низкомолекулярного пептидного фактора, выделяемого культурой Staphylococcus 8р.//Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: Матер. II Рос. конф. молодых ученых. - Москва, 2001. -С.333.

5. Коробов В.П., Лемкина Л.М., Полюдова Т.В. Изменение продукции низкомолекулярного антибактериального пептида культурой Staphylococcus warneri при действии факторов среды//Проблемы загрязнения окружающей среды: Тез. докл. Междунар. конф. - Волгоград-Пермь, 2001. - С. 88.

6. Титова А.В., Коробов В.П., Лемкина Л.М., Полюдова Т.В., Ситникова СМ. Антибактериальное действие поликатионного пептида варнерина на клетки Staphylococcus epidermidis, обработанные различными по механизму действия антибиотиками//Проблемы загрязнения окружающей среды: Тез. докл. Междунар. конф. - Волгоград-Пермь, 2001. - С. 98.

7. Пицик Е.В., Лемкина Л.М., Полюдова Т.В. Изменение продукции антибактериального пептидного фактора культурой Staphylococcus warneri под действием ультрафиолетового излучения//Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: Тез. докл. Регион. конф. молодых ученых. -Пермь, 2002. - С. 63-64.

8. Полюдова Т.В. Изменение продукции антибактериального катионного пептидного фактора культурой Staphylococcus warneri IEGM KL-1 под влиянием некоторых стрессовых воздействий//Микробиология и биотехнология XXI столетия: Матер. Междунар. конф. - Минск. 2002. - С. 66.

9. Коробов В.П., Лемкина Л.М., Полюдова Т.В. Продукция антибактериального фактора широкого спектра действия клетками Staphylococcus warneri/^оклады академии наук. - 2003. - Т. 390. N. 5. - С. 1-3.

10.Коробов В.П., Лемкина Л.М., Полюдова Т.В. Изучение взаимодействия низкомолекулярного антибактериального пептидного фактора с клетками чувствительного штамма Staphylococcus epidermidis//Coвременное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: Матер. Междун. конф. - Минск, 2004. - С. 98-100.

11.Коробов В.П., Лемкина Л.М., Полюдова Т.В., Акименко В.К. Питательная среда для выращивания Staphylococcus warneri - продуцента антибактериального пептидного фактора//Положительная справка ФИПС на выдачу патента на изобретение РФ от 03.10.2004.

ПОЛЮДОВА Татьяна Вячеславовна

ИЗУЧЕНИЕ ФЕНОМЕНА ПРОДУКЦИИ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПЕПТИДНОГО ФАКТОРА КУЛЬТУРОЙ 8ТАРНУЬ0С0ССтЦ^АтЕШ1Е0МК1-1

Автореферат

Лицензия ПД № 00994 от 15.03.2001

Подписано в печать 11.11.04. Формат 60x84 Набор компьютерный. Усл.-печ. л. 1,75. Тираж 100 экз. Заказ № К2ГХ00749С

Отпечатано на ризографе в ООО Печатный салон "Гармония" 614000, г. Пермь, ул. Кирова, 34, тел./факс 12-01-13,12-82-09,12-64-59

$257 7 $

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Полюдова, Татьяна Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПЕПТИДЫ, КАК ФАКТОРЫ АНТАГОНИЗМА В МИРЕ МИКРОБОВ.

1.1 Антагонизм в мире микробов.

1.1.1. Нерибосомально синтезируемые пептидные антибиотики.

1.1.2. Антибактериальные пептиды, синтезируемые на рибосомах.

1.1.3. Бактериоцины грамотрицательных бактерий.

1.1.4. Бактериоцины грамположительных микроорганизмов.

1.1.5. Лантибиотики.

1.2. Регуляция продукции антибактериальных факторов.

1.2.1. Регуляция продукции колицинов.

1.2.2. Регуляция синтеза микроцинов.

1.2.3. Регуляция синтеза низкомолекулярных катионных пептидов грамположительных бактерий.

1.2.4. Quorum sensing.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Бактериальные штаммы и среды.

2.2. Подготовка инокулумов и культивирование микроорганизмов.

2.3. Моделирование стрессовых условий.

2.4. Постановка антибактериального теста.

2.5. Выделение антибактериального фактора из супернатанта культуры-продуцента.

2.6. Изучение химической природы антибактериального фактора и его устойчивости к внешним воздействиям.

2.7. Электрофоретическое исследование антибактериального фактора

2.8. Масс-спектроскопия и аминокислотный анализ антибактериального фактора.

2.9. Определение минимальной подавляющей концентрации антибактериального фактора.

2.10. Изучение действия антибактериального фактора на клетки S. epidermidis 33 при различных значениях рН среды культивирования.

2.11. Изучение динамики гибели клеток S. epidermidis 33 под действием антибактериального фактора.

2.12. Определение количества жизнеспособных клеток.

2.13. Получение 14С-антибактериального фактора.

2.14. Изучение взаимодействия антибактериального фактора с бактериальной клеткой.

2.15. Индукция мутаций под действием ультрафиолетового света.

2.16. Выделение плазмидной ДНК и анализ плазмидного спектра.

2.17. Статистическая обработка экспериментальных данных.

Глава 3. ФИЗИОЛОГИЯ РОСТА STAPHYLOCOCCUS WARNER! IEGM KL-1 И ПРОДУКЦИИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ФАКТОРА.

3.1.1. Характеристика роста и продукции фактора на богатой и синтетической питательных средах.

3.1.2. Интенсивность развития S. warneri IEGM KL-1 и продукции антибактериального фактора в зависимости от состояния инокулума.

3.1.3. Рост и продукция фактора клетками S. warneri IEGM KL-1 при различных температурных режимах культивирования---------.

3.1.4. Зависимость скорости роста S. warneri IEGM KL-1 и интенсивности продукции антибактериального фактора от степени аэрирования культуры.

3.1.5 Оценка влияния исходного значения рН среды культивирования на рост S. warneri IEGM KL-1 и продукцию антибактериального фактора.

3.1.6. Изучение продукции антибактериального фактора при росте S. warneri IEGM KL-1 на плотной питательной среде.

3.2. Продукция антибактериального фактора клетками S. warneri ф IEGMKL-1, претерпевшими стрессовые воздействия.

3.3. Регуляция продукции антибактериального пептидного фактора клетками S. warneri IEGM KL-1.

3.4. Выделение антибактериального фактора из супернатанта культуры S. warneri IEGM KL-1.

3.5. Физико-химические свойства выделенного антибактериального фактора, продуцируемого клетками S. warneri IEGM KL-1.

3.5.1. Чувствительность антибактериального фактора к гидролитическим ферментам.

3.5.2. Чувствительность антибактериального фактора, продуцируемого клетками S. warneri IEGM KL-1 к действию высоких температур.

3.5.3. Устойчивость фактора при различных значениях кислотности среды.

3.5.4. Стабильность антибактериальной активности выделенного пептида при хранении.

3.5.5. Электрофоретическая подвижность выделенного антибактериального фактора, продуцируемого клетками S. warneri IEGM KL-1.

3.5.6. Масс-спектрометрические характеристики очищенных препаратов антибактериального фактора.

3.5.7. Аминокислотный состав выделенного антибактериального

Ф фактора продуцируемого клетками S. warneri IEGM KL-1.

3.6. Характеристика биологических свойств выделенного антибактериального пептида продуцируемого культурой

S. warneri IEGM KL-1.

3.6.1 Спектр антибактериальной активности.

3.6.2. Зависимость антибактериального действия пептидного фактора от содержания катионов в среде инкубации.

3.6.3. Влияние рН среды культивирования S. epidermidis на проявление антибактериальной активности фактора.

3.6.4. Кинетика связывания антибактериального пептида с клетками чувствительных бактерий S. epidermidis.

3.6.5. Кинетика бактерицидного действия антибактериального фактора

3.7. Использование воздействия на клетки S. warneri IEGM KL-1 ультрафиолетом для увеличения продукции антибактериального фактора.

3.8. Оптимизация питательной среды для бактерий S. warneri IEGM KL-1 для повышения выхода антибактериальной активности и облегчения выделения пептида из супернатанта культурыпродуцента.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение феномена продукции низкомолекулярного антибактериального пептидного фактора культурой Staphylococcus warneri IEGM KL-1"

Актуальность проблемы

Растущий интерес исследователей к классу низкомолекулярных катионных антибактериальных пептидов отражает чрезвычайно важную роль этих соединений в биологических системах. Широкое распространение в природе позволяет рассматривать антибактериальные пептиды как особый вид защиты, проявляющийся в многочисленных реакциях антагонизма на всех уровнях организации жизни (Hancock et al., 1995).

Характерные физико-химические особенности - катионный заряд и липофильность, обеспечивают пептидам избирательную сорбцию на анионных поверхностных и мембранных структурах бактериальных клеток-мишеней с проникновением в гидрофобные зоны мембран. Результатом такого взаимодействия являются необратимое нарушение структуры и функции мембранного аппарата бактерий и их гибель (Yeaman et al., 2003). Таким образом, продукция и реализация биологической активности низкомолекулярных катионных пептидов составляют самостоятельную категорию явлений.

Особенно большое количество продуцентов катионных пептидов обнаружено среди грампозитивных бактерий. Синтезируемые ими низкомолекулярные пептиды обладают, в отличие от классических бактериоцинов, широким спектром антибактериального действия (Oscariz, Pisabarro, 2001). В бактериальных системах эти соединения, по-видимому, обеспечивают необходимый уровень антагонизма, способствуя заселению благоприятных ниш и быстрому развитию популяций продуцирующих пептиды бактерий.

Образование антибиотических веществ можно рассматривать и как ответную реакцию, формирующуюся у микроорганизмов в ответ на изменение условий внешней среды и окружения с целью подавления конкурентов. Принимая во внимание высокую чувствительность бактерий к внешним воздействиям, можно предполагать, что при создании определенных условий культивирования образование антибактериальных соединений может как стимулироваться, так и подавляться. В этой связи разработка способов регуляции синтетической активности бактерий в нужную для практики сторону - одна из важнейших проблем современной микробиологии.

Изучение антибактериальных пептидов представляет также особую значимость для создания новых лекарственных средств класса природных антибиотиков (Hancock, Lehrer, 1998). Это весьма актуально для настоящего времени, когда наблюдается стремительное распространение антибиотикорезистентных форм бактерий, обусловленное высокой мобильностью бактериального генома, способствующей быстрому развитию защитных механизмов к новым антибактериальным препаратам (Сазыкин, 1999).

В свете представленного, низкомолекулярные катионные пептиды становятся реальными кандидатами на роль антибиотиков нового поколения (Коробов, 2001; Zasloff, 2002), поскольку широкое использование их во многих странах в качестве пищевых консервантов в течение длительного времени не привело к формированию резистентных форм (Delves-Broughton, 1996). Антибактериальные пептидные соединения могут быть эффективными средствами в противомикробной терапии как самостоятельно, так и в сочетании с другими антибиотическими соединениями. Экспериментально показано, что некоторые из низкомолекулярных катионных пептидов усиливают действие традиционных антибиотиков (McCafferty et al., 1999; Титова и др., 2004).

В процессе поиска новых продуцентов антибактериальных катионных пептидов в Лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН был выделен штамм грампозитивных кокков, продуцирующий при росте на жидких средах низкомолекулярное соединение широкого спектра антибактериальной активности.

Цель настоящей работы - детальное изучение закономерностей процесса продукции низкомолекулярного антибактериального фактора клетками S. warneri IEGM KL-1.

Основные задачи исследования

1. Выявить оптимальные условия культивирования S. warneri IEGM KL-1, обеспечивающие максимальный выход антибактериального фактора.

2. Исследовать возможные механизмы регуляции синтеза антибактериального фактора клетками S. warneri IEGM KL-1.

4. Разработать способ повышения секреторной активности S. warneri IEGM KL-1 - продуцента низкомолекулярного антибактериального фактора.

Положения, выносимые на защиту

1. Продукция антибактериального фактора клетками S. warneri IEGM KL-1 зависит от условий их культивирования, фазы роста, контролируется внутрипопуляционными механизмами.

2. Антибактериальный фактор, продуцируемый S. warneri IEGM KL-1, - новый термо- и кислотоустойчивый низкомолекулярный катионный пептид гидрофобной природы. Информация о его синтезе локализована в бактериальной хромосоме.

3. Низкомолекулярный пептид, секретируемый клетками S. warneri IEGM KL-1, обладает широким спектром антибактериальной активности, степень проявления которой зависит от условий внешней среды.

4. Воздействие на клетки S. warneri IEGM KL-1 ультрафиолетовым светом и оптимизация состава питательной среды способствуют существенному повышению уровня продукции низкомолекулярного антибактериального фактора.

Научная новизна, теоретическое и практическое значение работы

Впервые обнаружена продукция антибактериального фактора клетками стафилококков, принадлежащих к редкому виду S. wameri. Экспериментально обосновано, что антибактериальный фактор, выделенный из среды культивирования S. warneri IEGM KL-1, является новым низкомолекулярным катионным пептидом с молекулярной массой 2999 Да. Установлено, что продукция пептида зависит от фазы роста, условий культивирования клеток S. warneri IEGM KL-1 и контролируется внутрипопуляционными механизмами. Информация о его синтезе и секреции локализована в бактериальной хромосоме. Показано, что низкомолекулярный пептидный фактор обладает широким спектром антибактериальной активности в отношении стафилококков S. aureus и S. epidermidis, а также представителей родов Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Rhodococcus, Streptococcus. Полученные результаты значительно расширяют представления о микробной продукции низкомолекулярных катионных пептидов.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Полюдова, Татьяна Вячеславовна

выводы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Убиквитарность распространения низкомолекулярных антибактериальных катионных пептидов, подтверждает их чрезвычайно важную роль в антимикробной защите организмов. Широкий спектр антибактериального действия катионных пептидов, в том числе на антибиотикорезистентные штаммы, отсутствие устойчивых к ним форм микроорганизмов, делает эти соединения перспективными кандидатами на смену традиционным антибиотикам, большинство из которых оказались не эффективными в связи с быстрым появлением у микроорганизмов не чувствительных мишеней, специальных ферментов деградации или модификации антибиотиков до неактивного состояния, а также особых систем активного выброса этих чужеродных соединений из бактериальных клеток (Сазыкин и др., 1999).

Среди грамположительных микроорганизмов продукция низкомолекулярных катионных пептидов наиболее распространена среди родов Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus и Streptococcus (Егоров, Баранова, 1999).

В значительно меньшей степени этот признак характерен для бактерий рода Staphylococcus, из которых наиболее активными продуцентами бактериоцинов являются штаммы вида S. epidermidis, выделяющие эпидермин (Allgaier et al., 1986), PepS (Sahl, Brandis, 1981), эпицидин (Heidrich et al., 1998) и эпиланцин (Van de Kamp et al., 1995). Продукция низкомолекулярного пептида галлидермина обнаружена у одного из штаммов вида S. gallinarum (Kellner et al., 1988). Природный вариант этого пептида - стафилококцин Т, секретируется бактериями другого вида - S. cohnii Т (Furmanek et al., 1999). Среди золотистых стафилококков известна продукция ауреоцинов А70 (Netz et al., 2001) и А 53 (Netz et al., 2002), стафилококцинов C55 (Navarata, 1998), Вас R1 (Crupper et al1997), Bac201 (Iqbal et al., 2001) и Bacl829 (Crupper, Iandolo, 1996). В связи с высокой эпидемиологической значимостью скрининг стафилококков на антибактериальную активность имеет важное значение для понимания путей быстрой колонизации этими бактериями характерных экологических ниш (Бухарин и др., 2002), так как выделение стафилококками антибактериальных соединений широкого спектра действия, по-видимому, может быть одним из факторов, способствующих подавлению ближайшего бактериального окружения и тем самым обеспечивающих преимущества для экстенсивного развития и более длительного функционирования бактериальной популяции.

В результате проведенных исследований было установлено, что выделенный в Лаборатории биохимии развития микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН штамм грамположительных кокков является одним из штаммов вида Staphylococcus warneri. Штамм продуцирует бактериоцин-подобное соединение, подавляющее развитие индикаторной культуры S. epidermidis 33.

Синтезируемый S. warneri IEGM KL-1 антибактериальный фактор представляет собой низкомолекулярный пептид, обладающий массой 2999 Да. Пептид характеризуется выраженными термостабильностью и кислотоустойчивостью, в его составе преобладают гидрофобные и катионные аминокислоты. Совокупность выявленных свойств и особенности аминокислотного состава позволяют рассматривать его в качестве нового представителя семейства антимикробных катионных пептидов.

Эксперименты показали, что секретируемый бактериями S. warneri IEGM KL-1 пептид обладает широким спектром антибактериального действия, распространяющимся на грамположительные микроорганизмы не только близкородственных видов S. epidermidis и S. aureus и родов Micrococcus и Streptococcus, но и на бактерии филогенетически далеких родов Arthrobaeter, Bacillus, Corynebacteriwn и Rhodococcus. Бактерицидный эффект пептида наблюдается с первой минуты его взаимодействия с клетками индикаторного штамма, что может свидетельствовать о мембранной направленности действия АБФ, как это показано для большинства известных катионных пептидов.

Несмотря на то, что нам не удалось обнаружить ингибирующего действия пептида на грамотрицательные бактерии, выявлено, что АБФ подавлял рост мутантного штамма грамотрицательных бактерий - Salmonella minnesota Re-595. Особенностью данного штамма сальмонелл является отсутствие в коре, центральной части липополисахарида, одного остатка гептозы и О-полисахаридных цепей в его наружной части (Timmons et al., 1986). Таким образом, можно предположить, что поверхостные слои клеточных стенок грамотрицательных бактерий являются для исследуемого антибактериального пептида препятствием, закрывающим молекулам АБФ доступ к мембранным структурам бактериальных клеток, и тем самым обеспечивающим резистентность этой группы бактерий к ингибирующему действию АБФ.

Выделение антибактериального фактора клетками S. warneri IEGM KL-1 в среду происходит во время экспоненциального роста и достигает максимального уровня при переходе культуры в стационар. Близкая динамика секреции характерна и для стафилококцина BacRl, продуцируемого бактериями S. aureus UT0007 (Crupper et al., 1997). Однако, для большинства бактериоцинов известно, что их выделение начинается в конце логарифмической или в начале стационарной фазы роста. Выраженная зависимость продукции катионных пепидов от фазы развития бактериальной популяции связана с функционированием многокомпонентных регуляторных систем (Kleerebezem et al., 2001).

Результаты наших экспериментов по выяснению возможных путей регуляции синтеза АБФ культурой S. warneri IEGM KL-1, позволили предположить наличие фактора(ов), индуцирующего секрецию, который присутствует в среде роста на самых ранних этапах развития культуры продуцента и к моменту наступления экспоненциальнй фазы вызывает интенсивное выделение антибактериального пептида. Супернатант культуры этого периода роста при внесении совместно с инокулумом запускает синтез АБФ в самом начальном периоде развития бактериальной популяции. При переходе культуры в стационарную фазу роста увеличение антибактериальной активности в среде инкубации S. warneri IEGM KL-1 прекращается. Это указывает на зависимость между стадией развития культуры и интенсивностью выделения АБФ, и, возможно, свидетельствует о взаимосвязи механизмов регуляции развития бактериальной популяции с системой контроля синтеза антибактериального пептида.

Ранее Р.А. Пшеничновым с соавторами было установлено наличие аутометаболического фактора, лимитирующего численность микробной популяции и обуславливающего закономерное наступление фазы отрицательного ускорения и стационарной фазы (Пшеничное и др. 1973). Результаты этих исследований по выявлению системы саморегуляции развития микробной популяции, проведенные на грамотрицательных бактериях Е. coli, показали наличие специфических информативных сигналов, играющих, наряду с общими неспецифическими механизмами, немаловажную роль в регуляции развития бактериальной популяции. В настоящее время регуляторные механизмы, позволяющие координировать деятельность микроорганизмов на популяционном уровне описаны как для грамположительных, так и для грамотрицательных микроорганизмов (Miller, Bassler, 2001).

Не смотря на то, что значительное количество работ свидетельствуют о том, что в регуляции продукции антибактериальных пептидов ключевую роль играют факторы индукции и репрессии синтеза, в большинстве случаев, соединения, выполняющие эти функции не идентифицированы.

Индуцирующий экспрессию генов бактерноцинов фактор описан для сакацина Р, продуцируемого Lactobacillus sake. Он представляет собой небольшой пептид, состоящий из 19 аминокислотных остатков (Eijsink et al., 1996). Интересно, что в ряде случаев индукция синтеза антибактериальных петидов осуществляется молекулами самих бактерноцинов (Kuipers et al., 1995).

Таким образом, результаты исследования других авторов и полученные нами данные свидетельствуют о том, что изучение природы, биологической активности и закономерностей продукции антибактериальных соединений бактерий рода Staphylococcus представляет не только фундаментальный интерес, как изучение биологического феномена, но, принимая во внимание выраженную антибактериальную активность катионных пептидов как природных антибиотиков, имеет существенное значение для использования результатов исследования в практической деятельности человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Полюдова, Татьяна Вячеславовна, Пермь

1. Акатов А.К. Стафилококки/А.К. Акатов, B.C. Зуева М.: Медицина, 1983.-245 с.

2. Бухарин О.В. Антимикробный белок тромбоцитов/О.В. Бухарин,

3. B.А. Черешнев, К.Г. Сулейманов Екатеринбург: УрО РАН, 2000. - 199 с.

4. Бухарин О.В. Биология патогенных кокков/О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов, O.JI. Карташова М.: Медицина, 2002. - 282 с.

5. Веслополова Е.Ф. Микрометод определения численности колониеобразующих микроорганизмов/Е.Ф. Веслополова//Микробиология. -1995. Т. 64, N 2. - С. 279-284.

6. Громов Б.В. Экология бактерий/Б.В. Громов, Г.В. Павленко Изд-во Ленинградского университета, 1989. - 248 с.

7. Дебабов В.Г. Биотехнология: Учеб. пособие для вузов. В 8 кн. Кн. 2. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов/В.Г. Дебабов, В.А. Лившиц. -М.: Высш. шк., 1988. 208 с.

8. Егоров Н.С. Микробы-антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности/Н.С. Егоров. М.: Высш. Школа, 1965.-210 с.

9. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках/Н.С Егоров. М.: Высш. Школа, 1986. - 448 с.

10. Егоров Н.С. Бактериоцины. Образование, свойства, применение/ Н.С. Егоров, И.П. Баранова//Антибиотики и химиотерапия. 1999. - N 6.1. C. 33-40.

11. ЗавильгельскиЙ Г.Б. "Quorum sensing", или как бактерии "разговаривают" друг с другом/Г.Б. ЗавильгельскиЙ, И.В. Манухов// Молекулярная биология. 2001. - Т. 35, N 2. - С. 268-277.

12. Игнатов В.В. Биохимия стафилококков/В.В. Игнатов Изд-во Саратовского университета, 1975. - 113 с.

13. Кокряков В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения/В.Н. Кокряков СПб: Наука, 1999. - 162 с.

14. Коробов В.П. Продукция антистафилококкового белкового фактора культурой грамположи-тельных кокков/В.П. Коробов, JI.M. Лемкина//Матер. Междунар. конф. "Микробное разнообразие: состояние стратегия сохранения, экологические проблемы". Пермь, 1996. С. 182

15. Коробов В.П. Катионные пептиды бактерий природные антибиотики нового поколения/В.П. Коробов//Матер. междунар. семинара «Научно-технический потенциал Западного Урала в области конверсии военно-промышленного комплекса». Пермь. - 2001.

16. Коробов В.П. Штамм Staphylococcus warneri IEGM KL-1 продуцент низкомолекулярного пептидного соединения, ингибирующего рост клеток грампозитивных бактерий: Патент на изобретение №2200195/ В.П. Коробов, Л.М. Лемкина, В.К. Акименко. - 2003.

17. Коротяев А.И. Механизмы саморегуляции бактериальной клетки/ А.И. Коротяев М., 1973. - 272 с.

18. Крупин Н.В. Эффект грамицидина С на морфологию и физиологию микроорганизмов/Н.В. Крупин/Микробиология. 1951. - Т. 20, N 2. - С. 122125.

19. Кудлай О.Н. Бактериоциногения/О.Н. Кудлай, С.С. Лиходед. М.: Медицина, 1966. - 367 с.

20. Маниатис Т. Молекулярное клонирование/Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук М., 1984. - 479 с.

21. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике/ Дж. Миллер -М.: Мир, 1976.-436 с.

22. Петров Д.Ф. Новые методы селекции микроорганизмов и использование их для решения некоторых прикладных задач/Д.Ф. Петров// Генетика и селекция микроорганизмов. Новосибирск, 1975. - С. 6-12.

23. Печуркин Н.С. Популяционная микробиология/Н.С. Печуркин. -Новосибирск: Наука, 1978. 278 с.

24. Сазыкин Ю.О. Антибиотикорезистентность и системы активного выброса ксенобиотиков у бактерий/Ю.О. Сазыкин, А.В. Швец, В.П. Иванов// Антибиотики и химиотерапия. 1999. - N 9. - С. 3-6.

25. Щетинин Е.В. Полимиксины новый взгляд на известные антибиотики/Е.В. Щетинин//Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2000. - Том 2, N 3. - С. 68-73.

26. Allgaier H.G. Epidermin: sequencing of a heterodetic tetracyclic 21-peptide amide antibiotic/H.G. Allgaier, G. Jung, R.C. Werner et a/.//Eur. J. Biochem. 1986. - V. 160, N 1. - P. 9-22.

27. Andersson E. Antimicrobial activities of heparin-binding peptides/ E. Andersson, V. Rydengard, S. Sonesson et aU! Eur J Biochem. 2004. - V. 271, N6.-P. 1219-1226.

28. Atlas R.M. Microbiological Media/FLM. Atlas, L.S. Parks. Handbook. -1993.-1080 p.

29. Birnboim H.C. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA/H.C. Birnboim, J.A. Doly//Nicleic Acids Res. 1979. -V. 7.-P. 1513.

30. Blond A. The cyclic structure of microcin J25, a 21-residue peptide antibiotic from Escherichia coli/A. Blond, J. Peduzzi, C. Goulard et alJ/Еш. J. Biochem. 1999. - V. 259. - P. 747-756.

31. Bouttefroy A. Predictive models of the combined effects of curvaticin 13, NaCl and pH on the behaviour of Listeria monocytogenes ATCC 15313 in broth/ A. Bouttefroy, M. binder, J.B. Milliere//J. Appl. Microbiology. 2000. -V. 88. -P. 919-929.

32. Brotz H. The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipid II/H. Brotz, G. Bierbaum, K. Leopold et а/У/Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1998. - V. 42, N 1. - P. 154-160.

33. Brotz H. Role of lipid-bound peptidoglycan precursor in the formation of pores by nisin, epidermin and other lantibiotics/H. Brotz, M. Josten, I. Wiedemann et alJ/Uo\. Microbiol. 1998. - V. 30, N 2. - P. 317-327.

34. Brurberg M.B. Pheromone-induced production of antimicrobial peptides in LactobacillusfMB. Brurberg, I.F. Nes, V.G. Eijsink//Mol. Microbiol. 1997. -V. 26,N2.-P. 347-360.

35. Chiuchiolo M.J. Growth-phase-dependent expression of the cyclopeptide antibiotic microcin J25/M.J. Chiuchiolo, M.A. Delgado, R.N. Farias, P.A. Salomon//J. Bacteriol. 2001. - V. 183, N 5. - P. 1755-1764.

36. Choi H.J. Production of a nisin-like bacteriocin by Lactococcus lactis subsp. Lactis A164 isolated from Kimchi/H.J. Choi, C.I. Cheigh, S.B. Kim, Y.R. Pyun//J. Appl. Microbiol. 2000. - V. 88. - P. 563-571.

37. Clements M.O. Stress resistance in Staphylococcus aureus/ M.O. Clements, S.J. Foster//Trends in microbiology. 1999. - V. 7, N 11. -P. 458-462.

38. Corsini G. The expression of genes involved in microcin maturation regulates the production of active microcin E492/G. Corsini, M. Baeza, O. Monasterio, R. Lagos/ZBiochimie. 2002. - V. 84, N 5-6. - P. 539-544.

39. Corvey C. Activation of subtilin precursors by Bacillus subtilis extracellular serine proteases subtilisin ( AprE), WprA, and Vpr/C. Corvey, T. Stein, S. Dusterhus et a/.//Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. - V. 304, N 1. -P. 48-54.

40. Crupper S.S. Purification and partial characterization of novel antibacterial agent (Вас1829) produced by Staphylococcus aureus KSI1829/ S.S. Crupper, J.J. Iandolo//Appl Environ Microbiol. 1996. - V. 62, N 9. - P. 31713175.

41. Crupper S.S. Purification and characterization of staphylococci BacRl, a broad-spectrum bacteriocin/S.S. Crupper, AJ.Gies, J.J. Iandolo//Appl Environ Microbiol. 1997. - V. 63, N 11. - P. 4185-4190.

42. Daw M.A. Bacteriocins: nature, function and structure/M.A. Daw, F.R. Falkiner/ZMicron. 1996. - V. 27, N 6. - P. 467-479.

43. Delves-Broughton J. Applications of the bacteriocin, nisin/J. Delves-Broughton, P. Blackburn, R.J. Evans, J. Hugenholtz et a/.//Antonie Van Leeuwenhoek. 1996. - V. 69, N 2. - P. 193-202.

44. De Vos W.M. Properties of nisin Z and distribution of its gene, nisZ, in Lactococcus lactisfW.M.de Vos, J.W. Mulders, R.J. Siezen et a/.//Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59, N 1. - P. 213-218.

45. Eijsink V.G. Induction of bacteriocin production in Lactobacillus sake by a secreted peptide/V.G. Eijsink, M.B. Brurberg, P.H. Middelhoven, I.F. NesII J. Bacteriology. 1996. - V. 178, N 8. - P. 2232-2237.

46. Eijsink V.G. Production of class II bacteriocins by lactic acid bacteria; an example of biological warfare and communication/V.G. Eijsink, L. Axelsson, D.B. Diep et a/.//Antonie Van Leeuwenhoek. 2001. - V. 81,N 1-4.-P. 639-654.

47. Engelke G. Regulation of nisin biosynthesis and immunity in Lactococcus lactis 6F3/G. Engelke, Z. Gutowski-Eckel, P. Kiesau et aUIAppl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60. - P. 814-825.

48. Ennahar S. Class Ila bacteriocins: biosynthesis, structure and activity / S.Ennahar, T. Sashihara, K. Sonomoto, A. Ishizaki//FEMS Microbiol. Rev. 2000. -V.24.-P. 85-106.

49. Eraso J.M. Increased production colicin El in stationary phase/ J.M. Eraso, M. Chidambaram, G.M. Weinstock//J. Bacteriology. 1996. - V. 178, N7.-P. 1928-1935.

50. Ersfeld-Dressen H. Plasmid involvement in production of and immunity to the staphylococcin-like peptide Pep5/H. Ersfeld-Dressen, H.G. Sahl, H. Brandis//J. Gen. Microbiol. 1984. - V. 130. - P. 3029-3035.

51. Fang A. Influence of aeration and carbon sourse on production of microcin B17 by Escherichia coli ZK650/A. Fang, A.L. Demain//Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 47. - P. 547-553.

52. Fujita C. Identification of an indispensable amino acid for ppGpp synthesis of Escherichia coli SpoT protein/C. Fujita, M. Maeda, T. Fujii et al.ll Biosci., Biotechnol., Biochem. 2002. - V. 66, N 12. - P. 2735-2738.

53. Furmanek B. Identification, characterization and purification of the lantibiotic staphylococcal T, a natural gallidermin variant/B. Furmanek, T. Kaczorowski, R. Bugalski et el.ilJ. Appl. Microbiol. 1999. - V. 87, N 6. -P. 856-866.

54. Garcia-Bustos J.F. Structure and mode of action of microcin 7, an antibacterial peptide produced by Escherichia co/;/J.F. Garcia-Bustos, N. Pezzi, E. MendezZ/Antimicrobial Agents Chemother. 1985. - V. 27, N 5. - P. 791-797.

55. Garneau S. Two-peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria/ S.Gameau, N.I. Martin, J.C. Vederas/ZBiochimie. 2002. - V. 84, N 5-6. - P. 577592.

56. Geibler S. Serine protease EpiP from Staphylococcus epidermidis catalyzes the processing of the epidermin precursor peptide/S. Geibler, F. Gotz, T.Kupke//J. Bacteriology. 1996. - V. 178, N 1. - P. 284-288.

57. Giacometti A. Combination studies between policationic peptides and clinically used antibiotics against gram-positive and gram-negative bacteria/ A. Giacometti, O. Cirioni, M.S. Del Prete et ^/.//Peptides. 2000. - V. 21, N 8. -P. 1155-1160.

58. Gilmore M.S. Enterococcus faecalis cytolysin and lactocin S of Lactobacillus sake/M.S. Gilmore, M. Skaugen, I.F. Nes//Antonie Van Leeuwenhoek. 1996. - V. 69, N 2. - P. 129-138.

59. Grebe T.W. The histidine protein kinase superfamily/T.W. Grebe, J.B. Stock //Adw. Microb. Physiol. 1999. - V. 41. - P. 139-227.

60. Guder A. Posttranslationally modified bacteriocins-the lantibiotics/ A. Guder, I. Wiedemann, H.G. Sahl//Biopolymers. 2000. - V. 55, N 1. - P. 62-73.

61. Hancock R. Cationic bactericidal peptides / R. Hancock, T. Falla, M. Brown//Adv. Microb. Physiol. 1995. - N 37. - P. 135-175.

62. Hancock R. Cationic peptides a new source of antibiotics/R. Hancock, R. Lehrer/ZTrends in Biotechnology. 1998. - V. 17, N 2. - P. 82-88.

63. Hancock R. Peptide antibiotics/R. Hancock, D. Chappie// Antimicrobial Agents Chemother. 1999. - V. 43, N 6. - P. 1317-1323.

64. Hancock R The role of antimicrobial peptides in animal defenses/ R.Hancock, M.G. Scott//Proc. Natl. Acad. USA. 2000. - V. 97, N 1. - P. 88568861.

65. Hechaid Y. Model of action of modified and unmodified bacteriocins from gram-positive bacteria/Y.Hechard, H.G. SahV/Biochimie. 2002. - V. 84, N5-6.-P. 545-557.

66. Hindre T. Regulation of lantibiotic lacticin 481 production at the transcriptional level by acid pH/T. Hindre, J.P. Le Pennec, D. Haras, A. Dufour// FEMS Microbiol. Lett. 2004. - V. 231, N 2. - P. 291-298.

67. Heidrich H. Isolation, characterization, and heterologous expression of the novel lantibiotic epicidin 280 and analysis of its biosynthetic gene cluster/ H. Heidrich, U. Pag, M. Josten et я/.//Арр1. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64, N9.-P. 3140-3146.

68. Holo H. Plantaricin W from Lactobacillus plantarum belongs to a new family of two-peptide lantibiotics/H. Holo, Z. Jeknic, M. Daeschel et al.// Microbiology. 2001. - V. 147. - P. 643-651.

69. Horn N. Production of pediocin PA-1 by Lactococcus lactis using the lactococcin A secretory apparatus/N. Horn, M.I. Martinez, J.M. Martinez et al.H Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64, N 3. - P. 818-823.

70. Huang EW. Action of antimicrobial peptides: two-state model/ H.W. HuangZ/Biochemistry. 2000. - V. 39, N 29. - P. 8347-8352.

71. Iqbal A. Production, purification and some properties of Bac201, a bacteriocin-like inhibitory substance produced by Staphylococcus aureus АВ201/

72. A.Iqbal, S.A. Ali, A. Abbasi et a/.//J.Basic Microbiol. 2001. - V. 41, N 1. -P. 25-36.

73. Israil A. Lantibiotics/A. Israil/ZBacteriol. Virusol. Parazitol. Eoidemiol. -1992.-V. 37,N3-4.-P. 1-8.

74. Jack R.W. Bacteriocins of gram-positive bacteria/R.W. Jack, J.R. Tagg,

75. B. Ray//Microbiol. Rev. 1995. - V. 59, N 2. - P. 171-200.

76. Jack R.W. The genetics of lantibiotic biosynthesis/R.W. Jack, G. Bierbaum, C. Heidrich, H.G. Sahl//Bioassays. 1995. - V. 17, N 9. - P. 793802.

77. Jack R.W. Lantibiotics and microcins: polipeptides with unusual chemical diversity/RW. Jack, G. Jung//Current Opinion in Chemical Biology. 2000. - V. 4. -P. 310-317.

78. Juares T. Influence of pH, temperature and culture media on the growth and bacteriocin production by vaginal Lactobacillus salivarius CRL 1328/ T. Juares, E. Bru, B. Wiese, et alJ/J. Appl. Microbiol. 2002. - V. 93, N 4. - P. 714-724.

79. Kaletta C. Propeptide sequence of cinnamycin (Ro 09-0198): the first structural gene of a duramycin-type lantibiotic/C. Kaletta, K.D. Entian, G. Jung// Eur. J. Biochem. 1991. - V. 199, N 2. - P. 411-415.

80. Kellner R. Gallidermin: a new lantionin-containing polypeptide antibiotic/R. Kellner, G. Jung, T. Homer et aU/Eur. J. Biochem. 1988. - V. 177, N1.-P. 53-59

81. Kleerebezem M. A two-component signal-transduction cascade in Camobacterium piscicola LV17B: two signaling peptides and one sensortransmitter/M. Kleerebezem, O.P. Kuipers, W.M. de Vos et aU!Peptide. 2001. -V. 22, N10.-P. 1597-1601.

82. Kleerebezem M. Peptide pheromone-dependent regulation of antimicrobial peptide production in gram-positive bacteria: a case of multicellular behavior/M. Kleerebezem, L.E. Quadri//Peptide. 2001. - V. 22, N 10 - P. 15791596.

83. Klein C. Genes involved in self-protection against the lantibiotic subtilin produced by Bacillus subtilis ATCC 6633/C. Klein, K.D. Entian//Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60, N 8. - P. 2793-2801.

84. Kleinkauf H. Nonribosomal biosynthesis of peptide antibiotics/

85. H.Kleinkauf, H. von Dohren//Eur. J. Biochem. 1990. - V. 192, N 1. - P. 1-15.

86. Kuhar I. Transcription regulation of the colicin К ска gene reveals induction of colicin synthesis by differential responses to environmental signals/

87. Kuhar, D. Zgur-Bertok//J. Bacteriology. 1999. - V. 181, N 23. - P. 7373-7380.

88. Kuhar I. Codon-usage based regulation of colicin К synthesis by the stress alarmone ppGpp/I. Kuhar, J. van Putten, D. Zgur-Bertok et 0/.//M0I. Microbiol. -2001. -V. 41, N 1. P. 207-216.

89. Kuipers O.P. Autoregulation of nisin biosynthesis in Lactococcus lactis by signal transduction/O.P. Kuipers, M.M. Beerthuyzen, P.G. de Ruyter et al.H J. Biol. Chem. 1995. - V. 270, N 45. - P. 27299-27304.

90. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4/U.K. Laemmli//Nature. 1970. - V. 227, N 259. -P. 680-685.

91. Lavina M. Microcin H47, a chromosome-encoded microcin antibiotic of Escherichia colitM. Lavina, C. Gaggero, F. Moreno//J. Bacteriology. -1990. -V. 172, N 11. P. 6585-6588.

92. Lazdunski C. Colicins: a minireview/C. Lazdunski, D. Cavard// Toxicon. 1982. - V. 20, N 1. - P. 223-228.

93. Lee I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins/I. Lee, Y. Cho, R. Lehrer/ZInfection and Immunity. 1997. - V. 65, N 7. -P. 2898-2903.

94. Lehrer R.I. Ultrasensitive assays for endogenous antimicribial polipeptides/R.I. Lehrer, M. Rosenman, S. Harwig et alJ/J. Immunol. Methods. -1991.-V. 137.-P. 167-173.

95. Liu J. Microcin В17: Posttranslational modifications and their biological implications/J. Liu//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. -P. 4618-4620

96. Locke M. Stress proteins: the exercise response/M. Locke, E.G. Noble //Can. J. Appl. Physiol. 1995. - V. 20, N 2. - P. 155-167.

97. Maduwe A.D. Two-component anti-Staphylococcus aureus lantibiotic activity produced by Staphylococcus aureus C55/A.D. Maduwe, H.D. Sahl, J.R. Tagg//Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64, N 12. - P. 4803-4808.

98. Mattick A. A powerful inhibitory substance produced by group N streptococci/A. Mattick, A. Hirsch//Nature (London). 1944. - V. 154. - P. 551.

99. Mattick A. Further observation on an inhibitory substance (nisin) from lactic streptococci/A. Mattick, A. Hirsch/ZLancet. 1947. - V. 2. - P. 5-12.

100. McAuliffe O. Lacticin 3147, a broad-spectrum bacteriocin which selectively dissipates the membrane potential/O. McAuliffe, M.P. Pyan, R.P. Ross et alJIAppl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64, N 2. - P. 439-445.

101. McAuliffe O. Lantibiotics: Structure, biosynthesis and mode of action/ O. McAuliffe, RP. Ross, C. Hill//FEMS Microbiol. Rev. 2001. - V. 25. - P. 285-308.

102. McCafferty D.G. Synergy and duality in peptide antibiotic mechanisms/D.G. McCafferty, P. Cudic, M.K. Yu et a/.//Current Opinion in Chemical Biology. 1999. - V. 3, N 6 - P. 672-680.

103. Miller M.B. Quorum sensing in bacteria/M.B. Miller, B.L. Bassler// Annu. Rev. Microbiol. 2001. - V. 55. - P. 165-199.

104. Moll G.N. Mechanism of lantibiotic induced pore formation / G.N. Moll,

105. G.C. Roberts, W.N. Konings, A.J. Driessen//Antonie Van Leeuwenhoek. 1996. -V. 69, N 2. - P. 185-191.

106. Montville T.J. Mechanistic action of pediocin and nisin: recent progress and unresolved questions/T.J. Montville, Y. Chen//Appl. Microbiol. Biotechnol. -1998.-V. 50.-P. 511-519.

107. Moreno F. The regulation of microcin В, С and J operons/F. Moreno, J.E. Gonzalez-Pastor, M.R. Baquero, D. Bravo//Biochimie. 2002. - V. 84, N 5-6. -P. 521-529.

108. Navarata M.A. Two-component anti-Staphylococcus aureus lantibiotic activity produced by Staphylococcus aureus С 55/M.A. Navarata, H.G.Sahl, J.R. Tagg//Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64, N 12. - P. 4803-4808.

109. Neilan B.A. Nonribosomal peptide synthesis and toxigenicity of cyanobacteria/B.A. Neilan, E. Dittmann, L. Rouhiainen et alJ/J. Bacterid. 1999. -V. 181, N 13. - P. 4089-4097.

110. Nes I.F. Novel lantibiotics and their pre-peptides/I.F. Nes, J.R. Tagg// Antonie Van Leeuwenhooek. 1996. - V. 69, N 2. - P. 89-97.

111. Nes I.F. Class II antimicrobial peptides from lactic acid bacteria/I.F. Nes,

112. H. Holo//Biopolymers. 2000. - V. 55, N 1. - P. 50-61.

113. Netz D.J. Molecular characterization of aureocin A70, a multi-peptide bacteriocin isolated from Staphylococcus aureusfDJ. Netz, H.G. Sahl, R. Marcolino et aU/J. Mol. Biol. 2001. - V. 311, N 5. - P. 939-949.

114. Netz D.J. Biochemical characterization and genetic analysis of aureocin A53, a new, atypical bacteriocin from Staphylococcus aureus/D.J. Netz, R. Pohl, A.G. Beck-Sickinger et all/J. Mol. Biol. 2002. - V. 319, N 3. - P. 745-756.

115. O'Connor E.M. Halocins and sulfolobicins: the emerging story of archeal protein and peptide antibiotics/J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2000. -V. 28, N 1. -P. 23-31.

116. Oscariz J. Classification and mode of action of membrane-active bacteriocins produced by gram-positive bacteria/J. Oscariz, A.G. Pisabarro//Int. Microbiol. 2001 - V. 4, N 1. - P. 13-19.

117. Ottenwalder B. Isolation and characterization of genetically engineered gallidermin and epidermin analogs/B. Ottenwalder, T. Kupke, S. Brecht et <z/.//Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61, N 11. - P. 3894-3903.

118. Pag U. Molecular analysis of expression of the lantibiotic Pep5 immunity phenotype/U. Pag, H. Heidrich, G. Bierbaum, H.G. Sahl//Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65, N 2. - P. 591-598.

119. Peschel A. Regulation of epidermin biosynthetic genes by Epi Q/ A. Peschel, J. Augustin, T. Kupke et alJlMol. Microbiol. 1993. - V. 9, N 1. -P. 31-39.

120. Patzer S.I. The colicin G, H and X determinants encode microcins M and H47, which might utilize the catecholate siderophore receptors FerA, Cir, Fiu and IroN/S.I. Patzer, M.R. Baquero, D. Bravo et ^/.//Microbiology. 2003. - V. 149. -P. 2557-2570.

121. Peypoux F. Recent trends in the biochemistry of surfactin/F. Peypoux, J.M. Bonmatin, J. Wallach//Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. - V. 51, N 5. -P. 553-563.

122. Pons A.M. Microcin E 492 is an unmodified peptide related in structure to colicin V/A.M. Pons, N. Zorn, D. Vignon et alJl Antimicrob. Agents Chemother. -2002. V. 46, N 1. - P. 229-230.

123. Pressler U. Structural and Functional properties of colicin B/U. Pressler, V. Braun, B. Wittmann-Liebold, R. Benz//J. Biol. Chem. 1986. - V. 261, N 6. -P. 2654-2659.

124. Qi F. Functional analyses of the promoters in the lantibiotic mutacin II biosynthetic locus in Streptococcic mutans/F. Qi, P. Chen, P.W. Caufield//Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65, N 2. - P. 652-658.

125. Riley M.A. Positive selection for colicin diversity in bacteria/ M.A. Riley//Mol. Biol. Evol. 1993. - V. 10, N 5. - P. 1048-1059.

126. Riley M.A. Molecular mechanisms of colicin evolution/M.A. Riley//Mol. Biol. Evol. 1993. - V. 10, N 6. - P. 1380-1395.

127. Riley M.A. Bacteriocins: evolution, ecology and application/M.A. Riley, J.E. Wertz//Ann. Microbiol. 2002. - V. 56. - P. 117-137.

128. Risoen P.A. Functional analysis of promoters involved in quorum sensing-based regulation of bacteriocin production in Lactobacillus/?.A. Risoen, M.B. Brurberg, V.G.H. Eijsink, I.F. Nes//Mol. Microbiol. 2000. - V. 37, N 3. -P. 619-628.

129. Risoen P.A. Regulation of bacteriocin production in Lactobacillus plantarum depends on a conserved promoter arrangement with consensus binding sequence/P.A. Risen, O. Johnsborg, D.B. Diep et alJ/MoX. Gen. Genet 2001. -V. 265.-P. 198-206.

130. Rodriguez J.M. PCR detection of the lactocin S structural gene in bacteriocin-producing lactobacilli from meat/J.M. Rodriguez, L.M. Cintas, P. Casaus, A. Suarez//Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61, N 7. - P. 28022805.

131. Sablon E. Antimicrobial peptides of lactic acid bacteria: mode of action, genetics and biosynthesis/E. Sablon, B. Contrerar, E. Vandamme//Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2000. - V. 68. - P. 21-60.

132. Sahl H.G. Production, purification and chemical properties of an antistaphylococcal agent produced by Staphylococcus epidermidis/H.G. Sahl, H. Brandis//J. Gen. Microbiol. 1981. - V. 127. - P. 377-384.

133. Sahl H.G. Gene-encoded antibiotics made in bacteria/H.G. Sahl//Ciba Found Symp. 1994. - V. 186. - P. 27-42.

134. Sahl H.G. Lantibiotics: biosynthesis and biological activities of uniquely modified peptides from gram-positive bacteria/H.G. Sahl, G. Bierbaum//Annu. Rev. Microbiol.- 1998.-V. 512.-P. 41-79.

135. Salles B. Interaction of the CRP-cAMP complex with the cea regulatory region/B. Salles, G.M. Weinstock//Mol. Gen. Genet. 1989. - V. 215, N 3. -P. 537-542.

136. Sanders J.W. Environmental stress responses in Lactococcus lactis! J.W. Sanders, G. Venema, J. Kok//FEMS Microbiol. Rev. 1999. - V. 23. -P. 483-501

137. Saris P.E. Immuniti to lantibiotics/P.E. Saris, T. Immonen, M. Reis, H.G. Sahl//Antonie van Leewenhock. 1996. - V. 96, N 2. - P. 151-159.

138. Schauder S. The languages of bacteria/S. Schauder, B.L. Bassler// Genes and Development. 2001. - V. 15. - P. 1468-1480.

139. Schnell N. Structural gene isolation and prepeptide sequence of gallidermin, a new lantionin containing antibiotic/N. Schnell, K.D. Entian, F. Gotz et a/.//FEMS Microbiol. Lett. 1998. - V. 49, N 2-3. - P. 263-267.

140. Sen A.K. Post-translational modification of nisin/A.K. Sen, A. Narbad, N. Horn et a/.//Eur. J. Biochem.- 1999.-V. 261.-P. 524-532.

141. Schleifer K.H. A simple test system for the separation of staphylococci from micrococci/K.H. Schleifer, W.E. Kloos//J. Clinical Microbiol. 1975. - V. 1, N3.-P. 337-338.

142. Siegers K. Biosynthesis of lantibiotic nisin/K. Siegers, S. Heinzmann, K.D. Entian//J. Biol. Chem. 1996. - V. 271, N 2. - P. 12294-12301.

143. Smajs D. Colicin U, a novel colicin produced by Shigella boydii! D. Smajs, H. Pilsl, V. Braun//J. Bacteriology. 1997. - V. 179, N 15. - P. 49194928.

144. Spangler R. Colicin synthesis and cell death/R. Spangler, S.P. Zhang, J. Krueger, G. Zubay//J. Bacteriology. 1985. - V. 163, N1. - P. 167-173.

145. Stachelhaus T. Peptide bond formation in nonribosomal peptide biosynthesis/T. Stachelhaus, H.D. Mootz, V. Bergendahl, M.A. Marahiel//J. Biol. Chem. 1998. - V. 273, N 35. - P. 22773-22781.

146. Stein T. Dual control of subtilin biosynthesis and immunity in Bacillus subtilistT. Stein, S. Borchert, P. Kiesau et а/У/Mol. Microbiol. 2002. - V. 44, N 2. -P. 403-416.

147. Sturme M.H. Cell to cell communication by autoinducing peptides in gram-positive bacteria/M.H. Sturme, M. Kleerebezem, J. Nakayama et a/.//Antonie Van Leeuwenhoek. 2002. - V. 81, N 1-4. - P. 233-243.

148. Timmons S. Mechanism of human platelet activation by endotoxic glycolipid-bearing mutant/S. Timmons, Huzoor-Akbar, J. Crabarek et a/V/Blood. -1986.-V. 68, N5.-P. 1015-1023.

149. Van de Kamp M. Elucidation of the primary structure of the lantibiotic epilancin K7 from Staphylococcus epidermidis K7. Cloning and characterization of the epilancin K7 encoding gene and NMR analysis of mature epilancin К7/

150. M.Van de Kamp, H.W.Van den Hooven, R.N. Konings et alJ!Eur. J. Biochem. -1995. V 230, N 2. - P. 587-600.

151. Van Kraaij C. Engineering a disulfide bond and free thiols in the lantibiotie nisin Z/C. Van Kraaij, E. Breukink, H.S. Rollema et alJ/Exxr. J. Biochem.- 2000. V. 267. - P. 901-909.

152. Vertesy L. Ala(0)-actagardine, a new lantibiotie from cultures of Actinoplanes liguriae ATCC 31048/L. Vertesy, W. Aretz, A. Bonnefoy et al.ll J. Antibiot (Tokyo). 1999. - V. 52, N 8. - P. 730 - 741.

153. Wendrich T.M. Dissection of the mechanism for the stringent factor RelA/T.M. Wendrich, G. Blaha, D.N. Wilson et all IMol. Cell. 2002. - V. 10, N4.-P. 779-788.

154. Winans S.C. Mob Psychology/S.C. Winans, B.L. Bassler//J. Bacteriology.- 2002. V. 184. N 4. - P. 873-883.

155. Woodgate R. Evolution of the two-step mode for UV-mutagenesis/ R.Woodgate//Mutation Research. 2001. - V. 485, N 1. - P. 83-92.

156. Wu M. Mechanism of interaction of different classes of cationic antimicrobial peptides with planar bilayers and with the cytoplasmic membrane of Escherichia coli!M. Wu, E. Maier, R. Benz, R. Hancock/ZBiochemistry. 1999. -V. 38,N22.-P. 7235-7242.

157. Yeaman M.R. Mechanism of antimicrobial peptide action and resistens/M.R. Yeaman, N.Y. Yount/ZPharmakol. Rev. 2003. - V. 55, N 1. -P. 27-55.

158. Zasloff M. Antibacterial peptides of multicellular organisms/ M. Zaslof&VNature. 2002. - V. 415. - P. 389-395.

159. Zendo T. Identification of the lantibiotie nisin Q, a new natural nisin variant produced by Lactococcus lactis 61-14 isolated from a river in Japan/ T. Zendo, M. Fukao, K. Ueda et alJfBiosci. Biotechnol. Biochem. 2003. - V. 67, N7.-P. 1616-1619.

Информация о работе

Полюдова, Татьяна Вячеславовна
кандидата биологических наук
Пермь, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Изучение феномена продукции низкомолекулярного антибактериального пептидного фактора культурой Staphylococcus warneri IEGM KL-1 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение феномена продукции низкомолекулярного антибактериального пептидного фактора культурой Staphylococcus warneri IEGM KL-1 - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы