Некоторые биологические свойства монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus и особенности их действия на перитонеальные макрофаги мышей.

Изикаев, Венер Миниварисович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Некоторые биологические свойства монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus и особенности их действия на перитонеальные макрофаги мышей.
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Некоторые биологические свойства монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus и особенности их действия на перитонеальные макрофаги мышей."

На правах рукописи

Изикаев Венер Миниварисович

НЕКОТОРЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МОНОКУЛЬТУР И СОКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ВАРИАЦИЙ БАКТЕРИЙ ^ОДА ENTEROBACTER И STAPHYLOCOCCUS AUREUS И ОСОБЕННОСТИ ИХ ДЕЙСТВИЯ НА ПЕРИТОНЕАЛЬНЫЕ МАКРОФАГИ МЫШЕЙ

03.02.03 - Микробиология

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 8 НОЯ 2013

005540317

Челябинск-2013

005540317

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Габидуллин Зайнулла Гайнулинович доктор медицинских наук, доцент Ахтариева Айгуль Атласовна

Официальные оппоненты: Амирова Виктория Радековна доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, кафедра госпитальной педиатрии, профессор

Волосников Дмитрий Кириллович доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, кафедра госпитальной педиатрии, клинической иммунологии и аллергологии, заведующий

Ведущая организация: Институт экологии и генетики микроорганизмов УрРО РАН, г. Пермь

Защита диссертации состоится 2013 года в _ часов на

заседании Диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автореферат разослан 2013 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Ю.С. Шишкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень её разработанности

Изучение частоты встречаемости инфекционных заболеваний, вызванных ассоциациями грамотрицательных и грамположительных бактерий, является весьма своевременным. Изменение этиологического спектра возбудителей многие исследователи связывают как с особенностями симбиотических взаимоотношений между бактериями, так и снижением иммунной реактивности организма в условиях ухудшения экологии и селективного воздействия антибактериальных препаратов (Proca Е. et al. Clinical comment on management of urosepsis in a general urological department / E. Proca et al. // Acta. Urol. Belg.1992.Vol. 60, N 1. P. 41-56; Deal E.N. et al. Predictors of in-hospital mortality for bloodstream infections caused by Enterobacter species or Citrobacter freundii / E.N. Deal et al. // Pharmacother. 2007. N 2. P. 191-199; Smarda J. et al. Occurrence of strains producing specific antibacterial inhibitory agents in five general of Enterobacteriaceae / J. Smarda et al. // Curr. Microbiol. 2007. Vol.54, N.2. P.l 13-118).

В последние годы показана этиологическая роль целого ряда условно-патогенных бактерий в возникновении инфекционного процесса различной локализации (Chang En-Pen et al. Clinical characteristics and predictors of mortality in patients with Enterobacter aerogenes bacteremia // En-Pen Chang et al. // J .Microbiol. Immunol. Infect. 2009. Vol.42, P. 329-335; Dezinor O.Y. et al. Neonatal Sepsis and Meningitis in Haiti / O.Y. Dezinor // J.Trop. Pediatr. 2004. Vol. 50, N 1. P. 48-50). Однако в отношении микробных ассоциаций Enterobacter spp. и Staphylococcus aureus данный вопрос недостаточно изучен. Практически отсутствуют сравнительные данные о биологических свойствах сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus.

Как отмечают некоторые исследователи, инициируя патологический процесс, грамположительные кокки определяют условия для возможного развития в патологическом очаге как в особой экологической нише грамотрицательных микроорганизмов с имеющимся высоким персистентным потенциалом, что повышает вероятность развития тяжелого хронического процесса (Карпов И.А., Качанко Е.Ф. Стафилококковая инфекция: клинические аспекты и перспективы / И. А. Карпов, Е.Ф. Качанко // Медицинские новости. 2005. №9. С.53-56).

Актуальность этой проблемы также обусловлена широким распространением лекарственно-устойчивых штаммов в популяциях условно-патогенных бактерий и приспособлением их к внутренней среде организма (Зузова А.П., Козлова С.Н. Антимикробная терапия вентилятор-ассоциированной пневмонии: проблемы роста и распространения резистентных возбудителей/ А.П. Зузова С.Н. Козлова // Consilium medicum. 2006. Т.8, №3. С.26-32).

В настоящее время сложилось устойчивое мнение о том, что формирование популяции полирезистентных штаммов возбудителей станет основной характеристикой микробной патологии (Yu Wen-Liang et al.

Extended-spectrum beta-lactamases in Taiwan: epidemiology, detection, treatment and infection control / Wen-Liang Yu et al. // J. Microbiol. Immunol. Infect. 2006. Vol. 39, P. 264-277; Smarda J. et al. Occurrence of strains producing specific antibacterial inhibitory agents in five genera of Enterobacteriaceae / J. Smarda et al. // Curr. Microbiol. 2007. Vol.54, N.2. P.l 13-118).

Одновременное присутствие нескольких возбудителей приводит не только к суммированию патогенных свойств, но и вызывает взаимное усиление факторов вирулентности ассоциантов (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хуснутдинова, JI.M. Межбактериальные взаимодействия / О.В. Бухарин, Б .Я. Усвяцов, Л.М. Хуснутдинова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2003. № 4. С. 3-8; Габидуллин З.Г. и соавт. Характеристика свойств, определяющих персистенпшо моно- и ассоциированных культур условно-патогенных энтеробактерий / 3. Г. Габидуллин и соавт. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2006. № 4. С. 62-64). Наряду с этим меняется и ответная реакция хозяина (макропартнера).

В иммунном ответе огромную роль играют начальные этапы инфекционного процесса, связанные с фагоцитарной активностью макрофагов (Фрейдлин И.С. Методы изучения фагоцитирующих клеток при оценке иммунного статуса человека: учебное пособие / И.С. Фрейдлин. Л., 1986. 261с.; Долгушин И.И. Андреева, Ю.С. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: метод обнаружения и оценки эффективности управления бактерий / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева / Журн. микробиол. 2009. №2. С. 65-67; Numan J. et al. In vitro phagocytosis of methicillin resistant and methicillin sensitive Staphylococcus aureus by human polymorphonuclear leucocytes / J. Numan et al. / J.Ayub. Med. Coll. Abbottabad. 2009. V.21, N2. P.49-52.).

Основные механизмы, обеспечивающие естественную резистентность макроорганизма, в той или иной степени представлены в литературе (Фрейдлин И.С. Методы изучения фагоцитирующих клеток при оценке иммунного статуса человека: учебное пособие /И.С. Фрейдлин. Л., 1986. 261 е.; Stevens D.L. Superantigens: their role in infectious diseases / D.L. Stevens // Immunol. Invest. 1997. Vol. 26. P. 275-281.).

В доступной литературе имеется крайне малочисленная информация о биологических особенностях монокультур и сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus и их действии на фагоцитоз и кислородзависимый метаболизм перитонеальных макрофагов животных (Габрилович И.М., Бозиев В.Б., Габрилович М.И. Гетерогенность антилизоцимной активности в популяциях условно-патогенных энтеробактерий / И.М. Габрилович, В.Б. Бозиев, М.И. Габрилович // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. № 4. С. 32-33; Белобородое В.Б., Митрохин С.Д. Стафилококковые инфекции / В.Б. Белобородое, С.Д. Митрохин // Инфекции и антимикробная терапия. 2003. №1, Т.5. С.22-25; Гончарук Ю.Н. и соавт. Функциональная активность перитонеальных макрофагов мышей, зараженных грамположительными бактериями / Ю.Н. Гончарук и соавт. // Журн. микробиол. 2006. №1. С. 48-51.).

Цель исследования

Изучить особенности некоторых биологических свойств монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus и их влияние на фагоцитоз и кислородзависимый метаболизм перитонеальных макрофагов мышей.

Задачи исследования

1. Провести сравнительное изучение у монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus адгезивной, гемолитической (а- и тиолзависимый гемолизин), лецитиназной, дезоксирибонуклеазной, антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной активностей, а также их термолабильной энтеротоксигенности и вирулеитности.

2. Определить спектр лекарственной устойчивости у монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus.

3. Дать сравнительную характеристику профиля плазмидной дезоксирибонуклеиновой кислоты монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus.

4. Провести сравнительное изучение влияния монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей.

5. Дать сравнительную оценку кислородзависимого метаболизма перитонеальных макрофагов мышей при воздействии монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus.

Методология и методы исследования

Клинический материал был получен из бактериологических лабораторий ГБУЗ Республиканская детская клиническая больница и ГБУЗ Республиканская клиническая больница им. Г.Г.Куватова г.Уфы.

Эксперименты выполнялись на белых мышах-самцах (беспородных и линии СВА) массой 18-20 г и на кроликах массой 2,5-3,0 кг. Животные содержались в условиях вивария ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России в естественном световом режиме на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТ Р50258-92) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96). Животные получены из питомника лабораторных животных уфимского филиала «Иммунопрепарат» ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ.

урологическими заболеваниями и 26 (33,3%) - от 396 с гнойно-воспалительными процессами.

От 987 больных с гнойным воспалением околоносовых пазух, с абсцессами мягких тканей, с трофическими язвами нижних конечностей, с гнойными заболеваниями легких и плевры было выделено 78 (7,9%) штаммов S.aureus.

В качестве проб клинического материала были исследованы раневое отделяемое, моча, кровь, испражнения, мазки из носа и зева, трупный материал, мазок из влагалища, смывы с медицинских инструментов, плевральная жидкость, мокрота.

Кроме того, 10 (2,7%) штаммов Enterobacter spp. и 10 (3,2%) штаммов S.aureus были выделены от 365 и 312 практически здоровых людей соответственно.

В качестве эталонных культур использовали штаммы Enterobacter gergoviae (ГИСК им. Тарасевича №259), Enterobacter cloacae (ГИСК им. Тарасевича №258), Salmonella tuphimurium №415 (несущий плазмиду массой 60 МД), Proteus vulgaris Rts-1 (несущий плазмиду 120 МД), Escherichia coli K12G62RifR (бесплазмидный).

Идентификацию выделенных культур проводили по стандартной схеме («Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования», Приказ МЗ СССР №535 (1985) с использованием тест-систем «Enterotest» (Lachema,Чехия) и API (BioMeruiox, Франция).

Изучение клеточной поверхности и морфологических особенностей культур Enterobacter spp. и S.aureus проводили с помощью оптического («Биолам», Россия) и электронного («JEM- 100В», Япония) микроскопов. Адгезивную активность изучали в реакции гемагглютинации с эритроцитами птиц (Габидуллин З.Г. Биологическая характеристика штаммов бактерий рода Proteus, выделенных при инфекционных процессах различной локализации: автореф. дисс... д-ра мед.наук / З.Г. Габидуллин. Саратов, 1989. 45с.) и 1(0) группы крови системы ABO (Брилис В.И. Методика определения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Брилис, Т.А. Ленцнер, A.A. Ленцнер // Лаб. дело. 1986. № 4. С. 210-212. Продукцию а- и тиолзависимого гемолизина определяли по рекомендациям З.Г. Габидуллина (Габидуллин З.Г. Биологическая характеристика штаммов бактерий рода Proteus, выделенных при инфекционных процессах различной локализации: автореф. дисс... д-ра мед.наук / З.Г. Габидуллин. Саратов, 1989. 45с.) и Albesa J. et al. (Albesa J. A tiol-activated hemolysin in gram-negative bacteria / J. Albesa, LJ. Barberis, M.C. Pajaro // Can. J. Microbiol. 1985. Vol.31.P.297-300. Определение лецитиназной активности проводили на желточном агаре Чистовича Ю.Н. (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования: руководство для врачей / под ред. М.О. Берге. Москва: 1982. 462 е.), антилизоцимную активность (АЛА) определяли по методу Бухарина О.В. и др. (Бухарин О.В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов / О.В. Бухарин, А.П. Усвяцов, Н.В. Малышкин, Н.В.

Намуева // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1984. № 2. С. 2728), антиинтерфероновую активность (АИА) - по методу Соколова Ю.В. (Персистенция микроорганизмов / под ред. О.В. Бухарина. Куйбышев, 1990. С. 83-93.), антикомплементарную активность (АКА) - по методу Бухарина О.В. (Бухарин О.В. Изучение антикомплементарной активности стафилококков / О.В. Бухарин, Ю.А. Брудастов, Д.Т. Дерябин // Клин. лаб. диагн. 1992. № 11. С. 68-70.), ДНК-азную активность - по Jeffries C.D. et al. (Jeffries C.D. Rapid method for determining the activity of microorganisms on nuclear acids / C.D. Jeffries, D.F. Holtman, D.G. Gus // J. Bacteriol. 957. Vol. 73, N 4. P. 590-591). Устойчивость бактерий к антибиотикам определяли методом диффузии в агар с помощью бумажных дисков, пропитанных противомикробными препаратами, согласно Инструкции МЗ СССР от 1986 года, утвержденной Управлением по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники (Лабораторные методы исследования в клинике: справочник / под редакцией проф. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987, с.341- 343.). Вирулентность оценивалась по способности вызывать гибель при «интраназальном заражении» белых мышей (Войпо-Ясенецкая М.К. Опыт изучения дизентерийной инфекции у лабораторных животных / М.К. Войно-Ясенецкая // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1957. № 4. С. 65-69), токсигенность - в тесте «отек лапки» (Вартанян Ю.П. и соавт. Отек лап белых мышей - тест для оценки активности энтеротоксинов / Ю.П. Вартанян и соавт. // Бюлл. эксп. биол. и медицины. 1978. № 2. С. 150-152) и модели «лигированная петля тонкого кишечника кролика» (Gianella R. А. Suckling mouse model for detection of heat-stable Escherichia coli enterotoxin: characteristics of the model / R. A. Gianella // Infect. Immun. 1976. Vol. 14. P. 95-99.). Выделение плазмидной ДНК бактерий проводили по методу Kado С.Т., Liu S.T. (Kado C.T., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids / C.T. Kado, S.T. Liu // J. Bacteriol. 1981. Vol. 145. P. 1365-1373.).

В качестве объекта для экспериментальных исследований на животных были выбраны штамм E.cloacae ГНИИСК №258 (патент РФ №2164946) и клинический штамм S.aureus, обладающий факторами патогенности.

Экспериментальные исследования проводились на 80 мышах-самцах линии СВА массой 16-18г - 20 животных в контрольной и по 20 животных в экспериментальных группах:

- Т экспериментальная группа: моделирование экспериментальной моноинфекции осуществляли внутрибрюшинным введением центрифугата суточной бульонной культуры E.cloacae в дозе LD50, содержащей ЛТ-энтеротоксин, - 5-Ю8 КОЕ/мл (термолабильный энтеротоксин);

- П экспериментальная группа: моделирование экспериментальной моноинфекции осуществляли внутрибрюшинным введением центрифугата суточной бульонной культуры S.aureus в дозе LD50 - 5-10 КОЕ/мл (термолабильиый энтеротоксин);

- III экспериментальная группа: моделирование экспериментальной микстинфекции осуществляли внутрибрюшинным введением центрифугата суточной бульонной культуры E.cloacae и S.aureus в дозе LD50- 5-108 КОЕ/мл (термолабильный энтеротоксин);

- контрольная группа: внутрибрюшинное введение 0,9% раствора NaCl. Оценку всех тестируемых параметров проводили на 1, 3, 5 и 15 сутки.

В качестве объекта исследования in vitro были использованы перитонеальные макрофаги белых мышей линии СВА, которые получали промыванием брюшной полости охлажденной средой 199 с гепарином в концентрации 10 ед/мл. Клетки после отмывания доводили до концентрации 106 кл/мл средой 199, содержащей 200 мг/л L-глютамина. Полученные суспензии клеток фильтровали через слой капроновой сетки, отмывали средой 199 посредством центрифугирования в течение 10 минут при 1000 об/мин. Осадок ресуспензировали в охлажденной среде 199 и определяли число клеток в камере Горяева. С помощью 0,1% раствора трипанового синего подсчитывали количество живых клеток. Полученные клеточные взвеси разводили средой 199 и использовали для постановки реакций. Все манипуляции проводили при температуре тающего льда.

Для изучения функциональной активности перитонеальных макрофагов мышей проводили: 1) оценку способности ПМф поглощать частицы полистирольного латекса (Фрейдлин И.С. Методы изучения фагоцитирующих клеток при оценке иммунного статуса человека: учебное пособие / И.С. Фрейдлин. Ленинград, 1986. 261 е.); 2) изучение НСТ-редуцирующей активности ПМф по спонтанному и индуцированному тестам (Маянский А.Н. и соавт. Характеристика функциональной активности нейтрофилов крови человека с помощью реакции восстановления нитросинего тетразолия / А.Н. Маянский и соавт. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1977. № 6. С. 108-110); 3) изучение уровня суммарного свечения лизосом в цитоплазме перитонеальных макрофагов мышей (Зеленин A.B. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой / A.B. Зеленин. Москва: Наука, 1971.231 е.).

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений и использовании современных методов статистической обработки материалов исследования, при консультативном участии специалистов в области математического анализа, с использованием программ: BIOSTATISTICA, STATISTICA v.7.0, Microsoft Excel 2000.

Для анализа соответствия распределения количественных переменных закону нормального распределения нами применен критерий Шапиро-Уилка (W). При значениях р<0,05 мы отвергали нулевую гипотезу и принимали альтернативную об отличии от нормального распределения исследуемой переменной. Для описания нормально распределенных количественных

переменных использовали показатели: среднее значение признака (М), стандартное отклонение (5), стандартную ошибку среднего (т). Для сравнения категориальных переменных проводился анализ таблиц сопряженности с использованием критерия у2, для множественных сравнений использовался параметрический однофакторный дисперсионный анализ с последующим сравнением в группах по критерию Ньюмена-Кейлса.

Статистически достоверными считалось различие между сравниваемыми рядами с уровнем достоверной вероятности 95% (р<0,05) (Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных: применение пакета прикладных программ Statistica / О.Ю. Реброва. Москва: Медицина, 2002.312 с.).

Результаты работы были представлены па Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ «Вопросы теоретической и практической медицины» (г.Уфа, 2010, 2011); X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (г.Москва, 2012); обсуждены на совместном заседании кафедр общей гигиены с экологией с курсом гигиенических дисциплин, эпидемиологии, биологии, микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Башкирского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов с участием ведущих научных сотрудников уфимского филиала «Иммунопрепарат» ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ.

Автор лично участвовал в проведении экспериментов, статистической обработке, интерпретации полученных данных и подготовке диссертационной работы в журнальных статьях и тезисах конференций.

Положения, выносимые на защиту

1. У сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus более выражена способность к адгезии, продукции гемолизинов, лецитиназы, дезоксирибонуклеазы, термолабильного энтеротоксина, персистентные свойства и вирулентность, чем у монокультур.

2. При совместном культивировании бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus происходит увеличение количества клонов, несущих плазмиду массой 60 МД, детерминирующих продукцию термолабильного энтеротоксина по сравнению с их монокультурами.

3. Сокультивируемые вариации бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus чаще подавляют фагоцитоз, образование активных форм кислорода и лизосомальную активность макрофагов, чем их монокультуры.

Научная новизна

С помощью электронного микроскопа («JEM-100B», Япония) впервые обнаружены контакты между клетками сокультивируемых бактерий Enterobacter spp. и S.aureus.

Впервые приведена характеристика данных об адгезивной, гемолитической, лецитиназной, ДНК-азной, антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной активностях и ЛТ-энтеротоксигенности и вирулентности у сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter spp. и S.aureus.

Показано расширение спектра антибиотикоустойчивости у сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus по сравнению с их монокультурами.

Впервые была проведена оценка функциональной активности перитонеальных макрофагов мышей при экспериментальных моно- и микстинфекциях, вызванных бактериями E.cloacae и S.aureus.

При воздействии на перитонеальные макрофаги E.cloacae и S.aureus по сравнению с их монокультурами установлено преимущественное подавление фагоцитоза, продукции кислородных радикалов макрофагами и их лизосомальной активности.

Теоретическая и практическая значимость работы

Данные о повышении у сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus адгезивной, гемолитической, лецитиназной, ДНК-азной, антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной активностей, ЛТ-энтеротоксигенности и вирулентности расширяют представление о роли ассоциаций этих бактерий в этиологии инфекционных заболеваний человека.

Результаты о распространенности и выраженности факторов патогенности, персистенции, вирулентности и энтеротоксигенности у сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus могут быть использованы при прогнозировании течения инфекционно-воспалительных заболеваний.

Данные об изменениях в иммунной системе могут быть использованы при расшифровке механизмов развития и конкретной оценке иммунологических нарушений, вызываемых ассоциацией бактерий Enterobacter spp. и S.aureus. Результаты работы расширяют экспериментальную базу для изучения патологических процессов при микстинфекциях.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования используются в бактериологических лабораториях ГБУЗ Республиканская детская клиническая больница и ГБУЗ Республиканская клиническая больница имени Г.Г.Куватова г.Уфы.

Материалы исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах микробиологии, вирусологии и иммунологии; детских инфекционных болезней и общей гигиены с экологией с курсом гигиенических дисциплин ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Публикации

Соискатель имеет 5 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 5 научных работ общим объёмом 1,97 печатных листов, в том

числе 5 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 128 страницах, иллюстрирована 21 таблицей и 19 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 59 отечественный и 151 иностранный источник.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Результаты исследования

Культуральные, морфологические и биохимические свойства бактерий Enterobacter spp. и S.aureus были типичными для представителей своего рода.

Световое и электронно-микроскопическое исследования показали, что бактерий Enterobacter spp. имеют размеры длиной 1,97±0,59 и шириной 0,72±0,18 мкм (исследовано 50 бактериальных клеток E.aerogenes). Количество жгутиков варьирует от 7 до 60.

Клетки бактерий S.aureus были разных размеров от 0,97±0,39 мкм до 1,72±0,68 мкм, располагались в виде скоплений (исследовано 50 бактериальных клеток S.aureus). Электронно-микроскопическое исследование монокультур Enterobacter spp., S.aureus и их сокультивируемых вариаций показали, что между клетками сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus, по сравнению с монокультурами, чаще образуются контакты - «бок в бок», «конец в конец» и «конец в бок»

Рисунок 1 - Электронограмма снимков колоний бактерий Enterobacter spp. и S.aureus: а - контакты между монокультурами Enterobacter spp. (ув. хЮООО); б - контакты между монокультурами S.aureus (ув. хЮООО); в -контакты между сокультивируемыми бактериями Enterobacter spp. и S.aureus (ув. хЮООО).

При постановке реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка были выявлены существенные различия у монокультур и сокультивируемых

вариаций Enterobacter spp. и S.aureus давать Д-маннозочувствительную и Д-маннозорезистентную реакции гемагглютинации.

Сравнительное изучение способности монокультур и сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus давать Д-маннозочувствительную и Д-маннозорезистентную реакцию

гемагглютинации показали, что сокультивируемые вариации Enterobacter spp. и S.aureus достоверно чаще, чем монокультуры, проявляли Д-маннозочувствительную реакцию гемагглютинации, что свидетельствовало о высокой колонизационной способности сокультивируемых бактерий. Так, положительную Д-маннозочувствительную реакцию давали 59 (75,6%) сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus (против 27 (34,6%) монокультур Enterobacter spp., х2=26,5; р=0,001 и 19 (24,4%) монокультур S.aureus, у2~41; р=0,001), тогда как положительную Д-маннозорезистентную реакцию гемагглютинации давали 37 (47,4%) сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus (против 22 (28,2%) монокультур Enterobacter spp., %2=6,13; р-0,013 и 13 (16,6%) монокультур S.aureus, х2=16,95; р=0,001).

Среди штаммов Enterobacter spp. и S.aureus, выделенных от здоровых людей, адгезивная активность была выявлена по одной культуре.

В следующей серии опытов мы провели оценку адгезивной активности - среднего показателя адгезивности (СПА) в опытах на формализированных эритроцитах I группы крови человека при микроскопическом учете результатов в соответствии с методом, описанным Брилисом В.И с соавт. (Брилис В.И. Методика определения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Брилис, Т.А. Ленцнер, A.A. Ленцнер // Лаб. дело. 1986. № 4. С. 210212.).

Результаты исследования показали, что сокультивируемые вариации Enterobacter spp. и S.aureus проявляли адгезивные свойства чаще, чем монокультуры: 55 (70,5%) против 33 (42,3%) монокультур Enterobacter spp.; %2=11,49; р=0,001 и 42 (53,9%) монокультур S.aureus; %2=4,61; р=0,032) (рисунок 2).

Колггчество активных штаммов □ Количество неактивных штаммов

Сокультивиремые вариации Enterobacter spp. и S.aureus

Монокультуры Enterobacter spp.

Монокультуры S.aureus

Рисунок 2 - Распределение показателей адгезивности монокультур Enterobacter spp., S.aureus и их сокультивируемых вариаций (п=78) *-различия достоверны при сравнении монокультур Enterobacter spp., S.aureus и их сокультивируемых вариаций (критерий у2)

Таким образом, адгезия бактерий рода Enterobacter и S.aureus представляет собой сложный процесс и зависит от наличия определенных

структурных компонентов и, возможно, продуктов жизнедеятельности бактериальной клетки, с помощью которых происходит специфическое взаимодействие бактериальной клетки с определенными рецепторами клеток хозяина и согласуется с данными З.Г. Габидуллина (Габидуллин З.Г. Биологическая характеристика штаммов Proteus, выделенных при инфекционных процессах различной локализации: автореф. дис...д-ра мед.наук. / З.Г. Габидуллин, Саратов. 1989. 45с.).

Колонизация эпителиальных поверхностей бактериальными клетками параллельно сопровождается секрецией гемолизинов. Среди них наиболее известны а- и тиолзависимый гемолизины.

Анализ а-гемолитической активности показал, что сокультивируемые вариации Enterobacter spp. и S.aureus проявляли а-гемолитическую активность достоверно чаще, чем монокультуры. Так, из 78 сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus 32 (41,1%) продуцировали а-гемолизин (против 18 (23,1%) монокультур Enterobacter spp, /2=5,77; р=0,016 и против 19 (24,4%) монокультур S.aureus, "/2=4,92; р=0,027).

Способность синтезировать тиолзависимый гемолизин была обнаружена у 35 (44,9%) сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus против 22 (28,2%) монокультур Enterobacter spp. (^2=4,67; р-0,031) и 19. (24,4%) монокультур S.aureus (/2=7,25; р=0,001). При этом сокультивируемые вариации Enterobacter spp. и S.aureus статистически достоверно чаще, чем монокультуры, проявляли высокую тиолзависимую гемолитическую активность: 16 (45,7%) против 4 (18,2%) монокультур Enterobacter spp., %2=6,94; р=0,008 и 3 (15,8%) монокультур S.aureus, /2-8,63; р=0,003).

Среди культур Enterobacter spp. и S.aureus, выделенных от здоровых людей, по одному штамму обладали низкой тиолзависимой активностью.

Лецитиназной активностью из 78 сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus обладали 38 (48,7%) против 26 (33,3%) монокультур Enterobacter spp. (/2-3,82; р<0,05) и против 25 (32,1%) монокультур S.aureus (/2=4,50; р=0,034). Сокультивируемые вариации Enterobacter spp. и S.aureus достоверно чаще проявляли среднюю степень активности, чем их монокультуры: 18 (47,3%) против 7 (26,9%) монокультур Enterobacter spp. (-/2=5,76; р=0,016) и 5 (20%) монокультур S.aureus (/2=8,62; р=0,003).

При исследовании ДНК-азной активности из 78 сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus ДНК-азной активностью обладали 38 (48,7%) против 24 (30,8%) монокультур Enterobacter spp. (/2=5,25; р=0,022) и 25 (32,1%) монокультур S.aureus (/2=4,50, р=0,034).

К факторам, обеспечивающим персистентные свойства микробной клетки, относятся «антиинтерфероновая» (АИА), «антикомплементарная» (АКА) и «антилизоцимная» (АЛА) активности. При этом частота выявления АКА бактерий находится в тесной зависимости от источника их выделения и

мало коррелирует с их видовой принадлежностью (Бухарин О.В., Усвяцов БЛ., Шеенков Н.В. Характеристика антилизоцимной активности золотистого стафилококка при разных типах течения экспериментальной инфекции / О.В. Бухарин, БЛ. Усвяцов, Н.В. Шеенков // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1993. №2. С.178-180).

Исследование АЛА показало, что из 78 сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus лизоцим инактивировали 39 (50%) культур против

26 (33,3%) монокультур Enterobacter spp, х2=4>46; р=0,035 и 25 (32,1%) монокультур S.aureus, х2=5,19; р=0,023.

Среди штаммов Enterobacter spp. и S.aureus, выделенных от здоровых людей, только один штамм Enterobacter spp. проявлял среднюю активность.

Изучение АКА свидетельствует, что из 78 сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus активностью обладали 39 (50%) против 25 (32,1%) монокультур Enterobacter spp. (х2=5,19; р=0,023) и 23 (29,5%) монокультур S.aureus (-/2-6,85; р=0,009).

Сокультивируемые вариации Enterobacter spp. и S.aureus по сравнению с монокультурами достоверно чаще проявляли среднюю антиинтерфероновую активность: 19 (48,7%) против 7 (28%) монокультур Enterobacter spp. (-/2=6,65; р=0,009) и 8 (34,8%) монокультур S.aureus (Х2=5,42; р=0,02).

Из 78 сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus АИА проявляли 34 (43,6%) против 19 (24,4%) монокультур Enterobacter spp. (Х2=6,43; р=0,011) и 21 (26,9%) монокультуры S.aureus (х2=4,75; р=0,029).

Таким образом, сокультивируемые вариации Enterobacter spp. и S.aureus по сравнению с их монокультурами чаще обладают факторами патогенности, персистенции, чем их монокультуры, что необходимо учитывать при оценке этиологической значимости этих бактерий, выделенных в виде ассоциаций.

Способность бактерий продуцировать токсин является одним из ведущих показателей этиологической значимости возбудителя при развитии многих инфекционных заболеваний. В связи с этим было проведено изучение вирулентности на модели «интраназального заражения» беспородных белых мышей, способности продуцировать термолабильное токсическое вещество типа ЛТ-энтеротоксина на моделях «отек лапки» и «изолированной петли тонкого кишечника кролика».

В результате изучения вирулентности на модели «интраназального заражения» беспородных белых мышей-самцов весом 18-20г. из 78 сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus вирулентные свойства проявляли 26 (33,3%) против 13 (16,7%) монокультур Enterobacter spp. (х2=4,46; р-0,05) и 14 (17,9%) монокультур S.aureus (х2=4,64; р=0,05).

Штаммы Enterobacter spp. и S.aureus, выделенные от практически здоровых людей, оказались авирулентными.

Опыты теста «отек лапки» мышей указывают на наличие способности у

27 (34,6%) культур сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus

вызывать разницу в массе между контрольными и опытными лапками свыше 65 мг против 12 (15,4%) монокультур Enterobacter spp. (х2=7,69; р=0,006) и 14 (17,9%) монокультур S.aureus (х2=5,59; р-0,018).

Штаммы Enterobacter spp. и S.aureus, выделенные от здоровых людей, не давали положительного теста - отека лапки мышей.

В следующей серии опытов для подтверждения способности клинических штаммов Enterobacter spp. и S.aureus продуцировать JIT-энтеротоксин мы использовали модель "легированная петля тонкого кишечника кролика". За положительную реакцию принимали показатель объема экссудата к длине легированного участка кишечника (V/L) 1,0 и более.

Данные исследования показали, что наибольшей активностью обладали сокультивируемые вариации Enterobacter spp. и S.aureus: 25 (32,1%) против 13 (16,7%) монокультур Enterobacter spp. (х2=5,01; р=0,025) и 12 (15,4%) монокультур S.aureus (х2=5,99; р=0,014). Однако по степени выраженности признака достоверных различий не выявлено. Ни один из штаммов Enterobacter spp. и S.aureus, выделенных от практически здоровых людей, указанным свойством не обладал.

Таким образом, сокультивируемые вариации Enterobacter spp. и S.aureus по сравнению с монокультурами достоверно чаще обладают вирулентностью и токсигенностью, что необходимо учитывать при оценке этиологической значимости в развитии инфекционного процесса, вызванного ассоциацией указанных культур.

В следующей серии опытов мы проводили сравнительное изучение антибиотикорезистентности монокультур Enterobacter spp., S.aureus и их сокультивируемых вариаций к ряду антибиотиков ингибиторов синтеза и функций клеточной стенки бактерий (цефалотина, цефиксима, цефамондала, цефаклора, цефуроксима, цефатоксима, цефалексина, ампициллина, бензилпенициллина, азтреонама, ванкомицина, оксациллина, пиперациллина), ингибиторов синтеза белка на уровне рибосом (канамицина, тетрациклина, стрептомицина, эритромицина, левомицетина, ристомицина, азитромицина, кларитромицина, клиндамицина, линкомицина, доксициклина, олеандомицина, рокситромицина, фузидина), ингибиторов синтеза и функций нуклеиновых кислот (рифампицина, налидиксовой кислоты, фурадонина, фурагина), ингибиторов синтеза и функций цитоплазматических мембран (полимиксина).

Результаты исследования показали, что из 78 монокультур Enterobacter spp. 32 были устойчивы к 17; 24 - к 12 и остальные были устойчивы к 3-4 антибиотикам. Из 78 монокультур S.aureus 25 были устойчивы к 21; 17 - к 12, а остальные были устойчивы к 4-5 антибиотикам.

Сравнительное изучение антибиотикоустойчивости среди совместно культивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus выявило расширение спектра резистентности изученных культу}). Так, из 78 сокультивируемых

вариаций Enterobacter spp. и S.aureus 41 была устойчивой к 27 препаратам, 19 - к 18, а остальные были устойчивы к 6-7 антибиотикам.

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют, что при совместном культивировании Enterobacter spp. и S.aureus происходит расширение спектра устойчивости к антибактериальным препаратам по сравнению с их монокультурами, что, возможно, связано с обменом мобильных внехромосомных элементов (R-плазмид) между клонами изучаемых нами бактерий.

Изменение структуры ДНК бактериальной клетки в процессе жизнедеятельности дает микроорганизму широкие адаптационные возможности в различных экологических нишах.

В этой связи мы изучали профиль плазмидный ДНК монокультур Enterobacter spp. и S.aureus и их сокультивируемых вариаций.

Молекулярные массы плазмид значительно различались. Так, электрофоретически было установлено, что монокультуры Enterobacter spp. могут нести плазмиды с молекулярной массой 120; 60; 38; 3,2; 1,4 МД и другие, а монокультуры S.aureus - плазмиды с молекулярной массой 120; 60; 38; 3,2; 1,4 МД и другие.

В следующей серии опытов у штаммов с адгезивной активностью провели элиминирование плазмид в бульоне Хоттингера, содержащем 5% додецилсульфата натрия. Тестирование изогенных пар на их способность давать MS- и MR-реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка показало, что штаммы в одинаковой степени агглютинировали эритроциты птиц. Результаты этих исследований дают основание полагать, что генетической детерминантой, контролирующей MS- и MR-реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка у Enterobacter spp., возможно, являются, структурные элементы хромосомной природы.

В дальнейшем мы попытались выяснить природу генетического детерминанта, контролирующего у бактерий Enterobacter spp. и S.aureus продукцию ЛТ-энтеротоксина. Для этого были отобраны 6 монокультур Enterobacter spp. и 8 S.aureus, способных вызывать отек лап мышей 95 мг. При этом только штаммы Enterobacter spp. и S.aureus, вызывающие отек лап мышей более 95 мг, несли плазмиды молекулярной массы 60 МД.

При исследовании профиля плазмидной ДНК у клонов совместно культивируемых штаммов Enterobacter spp. и S.aureus, дающих отек лап более 95 мг, было показано увеличение клонов, несущих плазмиды молекулярной массы 60 МД.

В последующем штаммы Enterobacter spp. и S.aureus, несущие плазмиды 60 МД и дающие отек лап более 95 мг, культивировали в бульоне Хоттингера, содержащем 5% додецилсульфат натрия, и тем самым элиминировали плазмиду 60 МД. Затем у клонов (не менее 50), утративших свойство продуцировать JIT-энтеротоксин, изучали профиль плазмидной ДНК. Из 50 клонов каждого штамма, утративших свойство продуцировать ЛТ-энтеротоксин, у двух и не более на фореграмме просматривалась

плазмида с молекулярной массой 60 МД, остальные оказались не несущими плазмид.

Исследования профиля плазмидной ДНК у клонов совместно культивированных штаммов Enterobacter spp. и S.aureus, дающих отек лап более 95 мг, показали увеличение на 30% клонов, несущих плазмиды молекулярной массы 60 МД.

Учитывая важную роль гемолизинов в патогенезе инфекции, мы попытались выяснить природу генетического детерминанта, контролирующего свойство продуцировать а-гемолизин.

Согласно результатам исследования, среди клонов 18 монокультур Enterobacter spp. и 19 S.aureus, обладающих а-гемолитической активностью, 6 монокультур Enterobacter spp. и 7 монокультур S.aureus имели плазмиду с молекулярной массой 120 МД, что указывает на возможную роль данной плазмиды в продукции а - гемолизина.

В дальнейшем, культивируя по 4 штамма а-гемолитически активные монокультуры Enterobacter spp. и S.aureus в бульоне Хоггингера, содержащем 75 мкг/мл акридин оранжевый, при 37 °С в течение 38 часов элиминировали у бактерий плазмиду молекулярной массы 120 МД, и у клонов изучали профиль плазмидной ДНК. Были получены 2 генетически родственные изогенные пары штаммов Enterobacter spp. и S.aureus, различающихся по наличию плазмиды с молекулярной массой 120 МД. При этом клоны 2 штаммов Enterobacter spp. и 4 штаммов S.aureus не продуцировали а-гемолизин.

Данные этих исследований показывают, что в продукции а-гемолизина, помимо плазмиды 120 МД, возможно, участвуют другие структурные элементы и факторы бактерий рода Enterobacter и S.aureus, выяснение которых требует специальных исследований.

Проведенные нами опыты по изучению профиля плазмидной ДНК, элиминации и конъюгативной передачи плазмид не привели к выявлению новых плазмид, контролирующих синтез ДНК-азы и лецитиназную, антилизоцимную и антиинтерфероновую активности клинических штаммов Enterobacter spp.

Наличие у ряда клинических штаммов Enterobacter spp. и S.aureus факторов патогенности (JIT-энтеротоксина, а-гемолизина, лецитиназы, ДНК-азы), свидетельствует о том, что среди культур Enterobacter spp. и S.aureus встречаются штаммы, которые следует рассматривать как конкретные патовары условно-патогенных бактерий рода Enterobacter и S.aureus.

Условно-патогенные микроорганизмы, обладая рядом факторов патогенности, способны вызывать инфекционный процесс при снижении естественной резистентности хозяина и особенно часто, если они выступают в роли ассоциантов с другими бактериями. При этом одновременное присутствие нескольких возбудителей приводит не только к суммированию болезнетворных возможностей, но и вызывает взаимное усиление факторов вирулентности ассоциантов. Наряду с этим метается и иммунная

реактивность макроорганизма, при которой первой линией защиты выступают макрофаги.

Макрофаги являются одними из главных клеток врожденного иммунитета, осуществляющих первую линию защиты от патогена. В основе их защитной функции лежит фагоцитарный процесс, благоприятным исходом которого является разрушение патогена и его элиминация. Для изучения функционального состояния макрофагов создавали модель острой экспериментальной моно- и микстинфекций в 3 экспериментальных группах мышей линии СВА: 1 группу заражали центрифугатом суточной бульонной культуры E.cloacae, содержащей ЛТ-энтеротоксин, в дозе LD50 - 5-108 КОЕ/мл (термолабильный энтеротоксин); 2 группу - центрифугатом суточной бульонной культуры S.aureus в дозе LD50 - 5-10 КОЕ/мл (термолабильный энтеротоксин); 3 группу - центрифугатом суточной бульонной культуры E.cloacae и S.aureus в дозе LD50 - 5-108 КОЕ/мл (термолабильный энтеротоксин) и контрольную группу - 0,9% раствора NaCl (контроль).

На первом этапе нами изучены активность и интенсивность фагоцитоза фагоцитов мышей, являющиеся показателем их функционального состояния.

Изучение фагоцитарной активности выявило тенденцию к повышению активности фагоцитоза во всех экспериментальных группах с 1-го дня исследования, и имела статистически достоверные различия по сравнению с контролем.

Проведенный дисперсионный анализ с последующим множественным сравнением по критерию Ньюмена-Кейлса в экспериментальных группах и с группой контроля показали, что во все дни наблюдения показатели статистически значимо отличались от группы контроля. В III группе животных активность фагоцитоза во все дни наблюдений была ниже по сравнению с I и II группами (р<0,05). Так, в I группе животных активность фагоцитоза через сутки относительно контроля составила 72,15±3,64% (р<0,05), на 3-й сутки - 85,70+3,13% (р<0,05), на 5-е сутки - 92,25±2,04% (р<0,05), и на 15-е сутки - 92,60±1,78% (р<0,05). Во II группе активность фагоцитоза относительно контроля составила через сутки 78,0±2,88% (р<0,05), на 3-й сутки - 95,75±2,40% (р<0,05), на 5-е сутки - 102,20±2,84% (р<0,05), на 15-е сутки - 112,9±7,60% (р<0,05). В Ш группе животных активность фагоцитоза относительно контроля была через сутки 58,30±2,0% (р<0,05), на 3-й сутки - 65,30±5,41% (р<0,05), на 5-е сутки - 71,45±1,35% (р<0,05), на 15-е сутки - 78,55±3,12% (р<0,05). В контрольной группе мышей показатели активности фагоцитоза были относительно постоянными и составили через сутки 43,0±1,25 %, через 3-е суток - 44,15±2,49%, через 5 суток - 44,40±2,39% и через 15 суток - 44,45±2,37 %.

В следующей серии опытов была изучена интенсивность фагоцитоза.

Установлено, что в I группе животных интенсивность фагоцитоза относительно контроля через сутки составила 3,65±0,27 усл.ед. (р<0,05), через 3-е суток - 4,10±0,24 усл.ед. (р<0,05), через 5 суток - 4,85±0,24 усл.ед. (р<0,05) и через 15 суток - 4,80±0,29 усл.ед. (р<0,05). В П группе интенсивность фагоцитоза была сопоставима с I группой и относительно

контроля через сутки составила 3,90±0,21 усл.ед. (р<0,05), через 3-е суток -4,85±0,28 усл.ед. (р<0,05), через 5 суток - 5,70±0,23 усл.ед. (р<0,05) и через 15 суток - 6,65±0,28 усл.ед. (р<0,05). В III группе интенсивность фагоцитоза относительно контроля через сутки была 2,95±0,28 усл.ед. (р>0,05), через 3-е суток - 3,25±0,21 усл.ед. (р>0,05), через 5 суток - 3,45±0,20 усл.ед. (р<0,05) и через 15 суток - 3,90±0,27 усл.ед. (р<0,05). В контрольной группе мышей показатели интенсивности фагоцитоза оставались относительно постоянными и составили через сутки 2,60±0,29 усл.ед., через 3-е суток -2,62±0,25 усл.ед., через 5 суток - 2,70±0,27 усл.ед., а через 15 суток -2,66±0,24 усл.ед.

Сравнительное изучение интенсивности фагоцитоза показало, что в III группе животных, зараженных сокультивируемой вариацией Е.с1оасае и Б.аигеиз, показатель интенсивности фагоцитоза на 5 и 15 сутки был достоверно ниже, чем в других экспериментальных группах (р<0,05).

Процесс фагоцитоза сопровождается активацией лизосомальных ферментов, что характеризует функциональную активность и полноценность фагоцитирующих клеток.

В ходе исследований было показано нарушение функции лизосомального аппарата фагоцитов, о чем свидетельствует постепенное "опустошение" ферментов лизосом в экспериментальных группах мышей, особенно в Ш группе животных, зараженных сокультивируемой вариацией Е.с1оасае и 8.аигеш. Установлено, что в I группе животных лизосомальная активность относительно контроля через сутки составила 559,9±31,9 усл.ед. (р<0,05), через 3-е суток - 560,2±34,53 усл.ед. (р<0,05), через 5 суток -519,0±37,41 усл.ед. (р<0,05) и через 15 суток - 491,2±36,6 усл.ед. (р<0,05). Во II группе животных лизосомальная активность относительно контроля составила через сутки 743,5+32,9 усл.ед. (р<0,05), через 3-е суток -732,2±37,25 усл.ед. (р<0,05), через 5 суток - 658,0±44,9 усл.ед. (р<0,05) и через 15 суток - 641,5±53,7 усл.ед. (р<0,05). В III группе лизосомальная активность относительно контроля составила через сутки 451,5±37,02 усл.ед. (р<0,05), через 3-е суток - 448,4±46,05 усл.ед. (р<0,05), через 5 суток -402,3±39,82 усл.ед. (р>0,05). и через 15 суток - 377,10±30,58 усл.ед. (р<0,05). В контрольной группе мышей показатели оставались относительно постоянными и составили через сутки 328,9±36,75 усл.ед., через 3-е суток -327,5±31,84 усл.ед., через 5 суток - 325,7±32,93 усл.ед., а через 15 суток -323,1±30,74 усл.ед.

Сравнительный анализ результатов показал, что в 1П группе лизосомальная активность по сравнению с другими экспериментальными группами была достоверно ниже (р<0,05).

Эффективный фагоцитоз сопряжен с наработкой активных форм кислорода с последующим внутриклеточным киллингом патогена (Тартаковский И.С. и соавт. Механизмы внутрифагоцитарного переваривания легионелл / И.С. Тартаковский и соавт. // Журн. микробил. 1989. №12. С.92-100.).

Наиболее доступным и часто используемым подходом для оценки активности кислородзависимых систем бактерицидности фагоцитов является НСТ-тест (спонтанный и индуцированный).

Исследование в динамике спонтанной активации фагоцитов к восстановлению нитросинего тетразолия в диформазан сопровождается первоначальной активацией системы НАДФН-оксидазы с последующим снижением количества образования активных форм кислорода. Так, в I группе животных показатель спонтанной активации относительно контроля через сутки составил 66,45±3,03% (р<0,05), на 3-й сутки - 63,50±4,09% (р<0,05), на 5-е сутки - 59,95±4,21% (р<0,05) и на 15-е сутки -55,05±4,21%(р<0,05). Во П группе показатель спонтанной активации относительно контроля был через сутки 87,50±4,34% (р<0,05), на 3-й сутки -85,25±6,11% (р<0,05), на 5-е сутки - 81,75±6,10% (р<0,05), на 15-е сутки -74,65±6,51% (р<0,05). В П1 группе животных показатель спонтанной НСТ-реакции относительно контроля составил через сутки 53,6±5,54% (р<0,05), на 3-й сутки - 50,15±4,14% (р>0,05), на 5-е сутки - 45,25±4,21% (р>0,05) и на 15-е сутки - 40,15±3,95% (р>0,05). В контрольной группе мышей показатель спонтанной НСТ-реакции имел следующие значения: через сутки 35,2±3,47 %, через 3-е суток - 34,85±3,63%, через 5 суток - 33,95±3,25% и через 15 суток 34,55±3,18 %.

В перитонеальных макрофагах мышей Ш группы активность процессов образования активных форм кислорода статистически значимо ниже, чем в других экспериментальных группах (р<0,05).

В другой серии экспериментов была изучена индуцированная НСТ-реакция перитонеальных макрофагов. Установлено, что индуцированная НСТ-реакция перитонеальных макрофагов была ниже, чем спонтанная, и имела тенденцию к снижению. Так, в I группе животных активность индуцированной НСТ-реакции относительно контроля составила через сутки 68,80±5,61% (р>0,05), на 3-й сутки - 58,98±4,19% (р>0,05), на 5-е сутки -54,86±4,28% (р>0,05) и 15-е сутки - 52,9±4,26% (р>0,05). Во П группе активность индуцированной НСТ-реакции относительно контроля была через сутки 91,70±6,87% (р<0,05), на 3-й сутки - 96,65±6,48% (р<0,05), на 5-е сутки - 86,05±6,79% (р<0,05), на 15-е сутки - 82,70±6,38% (р<0,05) . В Ш группе животных активность индуцированной НСТ-реакции относительно контроля составила через сутки 50,2±4,52% (р<0,05), на 3-й сутки - 43,40±4,05% (р<0,05), на 5-е сутки - 40,5±4,12% (р<0,05), на 15-е сутки - 38,05±3,86% (р<0,05). В контрольной группе мышей показатели индуцированной НСТ-реакции были относительно постоянными и составили через сутки 35,2±2,57 %, через 3-е суток - 34,85±4,65%, через 5 суток - 64,2±4,16% и через 15 суток -63,9±4,34%.

Индуцированная НСТ-восстанавливающая способность в Ш группе была ниже, чем в других экспериментальных группах во все дни наблюдения (р<0,05).

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить особенности биологических свойств монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter spp. и S.aureus и их действия на фагоцитоз, продукцию активных форм кислорода и лизосомальную активность перитонеальных макрофагов мышей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая результаты наших исследований, следует заключить, что сокультивируемые вариации бактерий Enterobacter spp. и S.aureus по сравнению с их монокультурами чаще обладают факторами персистенции, вирулентности и токсигенности, вызывают супрессию фагоцитоза, продукции активных форм кислорода перитонеальными макрофагами и их лизосомальной активности. Полученные данные могут быть использованы при выяснении этиологической значимости штаммов Enterobacter spp. и S.aureus, выделенных от больных с желудочно-кишечными, урологическими и гнойно-воспалительными заболеваниями в виде ассоциаций, а данные иммунологических исследований могут быть использованы в перспективе при расшифровке механизмов развития иммунологических нарушений, вызываемых ассоциацией бактерий Enterobacter spp. и S.aureus.

ВЫВОДЫ

1. Клинические штаммы бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus, выделенные от больных с инфекционными процессами различной локализации, при совместном культивировании статистически достоверно чаще проявляли адгезивную, гемолитическую (а-, тиолзависимый гемолизин), лецитиназную, дезоксирибонуклеазную, антилизоцимную, антиинтерфероновую, антикомплементарную активности и термолабильную энтеротоксигенность и вирулентность, по сравнению с их монокультурами.

2. При сокультивировании бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus происходит увеличение количества клонов, несущих плазмиды с молекулярной массой 60 МД, по сравнению с их монокультурами.

3. При совместном культивировании бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus происходит расширение спектра резистентности бактерий к широко применяемым антибиотикам.

4. Сокультивируемые бактерии Enterobacter cloacae и Staphylococcus aureus по сравнению с их монокультурами более значительно подавляют активность и интенсивность макрофагального фагоцитоза (р<0,05).

5. Сокультивируемых бактерий Enterobacter cloacae и Staphylococcus aureus, по сравнению с их монокультурами, вызывает достоверное снижение активности лизосом и продукции активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах (р<0,05).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Суфияров, P.C. Комплексное лечение гнойно-воспалительных заболеваний, вызванных ассоциациями грамположительных и грамотрицательных бактерий (на примере S. aureus с Pr.vulgaris, Morganella morganii и Enterobacter aggl.) / P.C. Суфияров, M.B. Тимербулатов, З.Г. Габидуллин, С.И. Рахматуллин, A.A. Ахтариева, P.P. Суфияров, В.Г. Туйгуиова, В.М. Изикаев, Г.А. Идиатуллина, H.H. Гибазов // Медицинский вестник Башкортостана. -

2010. - Т.5, №3. - С.60-64.

2. Изикаев, В.М. Исследование фагоцитоза и кислородзависимого метаболизма перитонеальных макрофагов мышей после воздействия сокультивируемых бактерий Enterobacter cloacae и Staphylococcus aureus / В.М. Изикаев, З.Г. Габидуллин, A.A. Ахтариева, P.C. Суфияров, P.P. Суфияров, A.A. Камалова, Ю.З. Габидуллин // Медицинский вестник Башкортостана. - 2011. -Т.6, №1. - С.92-95.

3. Изикаев, В.М. Сравнительное изучение функциональной активности перитонеальных макрофагов мышей при экспериментальной моно- и микстинфекции / В.М. Изикаев, З.Г. Габидуллин, A.A. Ахтариева, P.C. Суфияров, P.P. Суфияров A.A. Камалова, Ю.З. Габидуллин, А.Р. Гайсина // Медицинский вестник Башкортостана. - 2011. - Т.6, №4. - С.110-115.

4. Суфияров, P.C. Лечение гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей протейно-энтеробактерной природы / P.C. Суфияров, З.Г. Габидуллин, М.В. Тимербулатов, P.P. Суфияров, A.A. Ахтариева, H.H. Гибазов, Ю.З. Габидуллин, В.М. Изикаев, Г.А. Идиатуллина, В.Г. Туйгунова, Р.Ф. Насырова И Медицинский вестник Башкортостана. -

2011. - Т.6, №6. - С.94-98.

5. Изикаев, В.М. Сравнительное изучение антилизоцимной активности у монокультур бактерий Enterobacter spp. и Staphylococcus aureus и их сокультивируемых вариаций / В.М. Изикаев, З.Г. Габидуллин, A.A. Ахтариева, A.A. Камалова // Инфекция и иммунитет. -

2012. - Т.2, №1-2. - С.272.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЛТ-энтеротоксин - термолабильный энтеротоксин АЛА - антилизоцимная активность АКА - антикомплементарная активность АИА - антиинтерфероновая активность

НАДФ-оксидаза - никотинамидадениндинуклеотидфосфат-оксидаза

ЛПС - липополисахарид

ПМф - перитонеальный макрофаг

СПА - средний показатель адгезивности

УПЭ - условно-патогенные энтеробактерии

усл.ед. - условные единицы

КОЕ - колониеобразующие единицы

ЬВ50 - минимальная доза вещества, вызывающая гибель

экспериментальных животных

МД - мегадальтон, молекулярная масса

линия СВА — гибридные виды животных

МБ- реакция - маннозочувствительная реакция

МЫ-реакция - маннозорезистентная реакция

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

/f-

Изикаев Венер Миниварисович

НЕКОТОРЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МОНОКУЛЬТУР И СОКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ВАРИАЦИЙ БАКТЕРИЙ РОДА ENTEROBACTER И STAPHYLOCOCCUS AUREUS И ОСОБЕННОСТИ ИХ ДЕЙСТВИЯ НА ПЕРИТОНЕАЛЬНЫЕ МАКРОФАГИ МЫШЕЙ

03.02.03 - Микробиология

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 08/11/13. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. ТираЮО экз. Заказ 1172. Гарнитура «Тш1ез№\уКотап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 5. т/ф: 8(347) 27-27-600,27-29-123

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Изикаев, Венер Миниварисович, Челябинск

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

04201454107

Изикаев Венер Миниварисович

03.02.03 - Микробиология

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители: Габидуллин Зайнулла Гайнулинович заслуженный деятель науки РФ. доктор медицинских наук, профессор

Ахтариева Айгуль Атласовна доктор медицинских наук, доцент

Челябинск - 2013

Оглавление

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Бактерии рода Enterobacter и Staphylococcus aureus в инфекционной патологии человека......................................................................................12

1.2. Факторы патогенности бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus............................................................................................................................16

1.3. Взаимоотношения микробов с иммунной системой хозяина............................................................................... 25

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3 2

ГЛАВА 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Морфологические, культуральные и биохимические свойства бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus.................................................................................. 47

3.2. Факторы патогенности монокультур бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus и их сокультивируемых вариаций

3.2.1.Адгезивная активность............................................................................................51

3.2.2.Гемолитическая активность..............................................................................55

3.2.3.Лецитиназная активность........................................................................................58

3.2.4.ДНК-азная активность............................................................................................60

3.2.5. Персистентные свойства монокультур бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus и их сокультивируемых вариаций............................................................................................................................................................62

3.3. Изучение токсигенности и вирулентности монокультур

бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus и их сокультивируемых вариаций на биологических моделях.................

3.3.1. «Легочная модель»................................................. 66

3.3.2. Тест «отек лапки»................................................... 68

3.3.3. Модель «петля тонкого кишечника кролика»..............................70

3.3.4. Изучение антибиотикорезистентности монокультур бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus и их сокультивируемых вариаций......................................................................................................72

3.4. Генетическая природа некоторых факторов патогенности монокультур бактерий рода Enterobacter, S.aureus и их сокультивируемых вариаций........................................................................................................74

3.5. Взаимоотношения в системе патоген-хозяин....................................81

3.5.1. Влияние монокультур Е.cloacae, Staphylococcus aureus и их сокультивируемых вариаций на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей................................................................................82

3.5.2. Влияние монокультур Е.cloacae и Staphylococcus aureus и их сокультивируемых вариаций на лизосомальную активность перитонеальных макрофагов мышей................................................................................85

3.5.3. Влияние монокультур Е.cloacae и Staphylococcus aureus и их сокультивируемых вариаций на внутриклеточный кислородзависимый метаболизм перитонеальных макрофагов мышей............................................................................................................................................................87

ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................................................91

ВЫВОДЫ................................................................... 105

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ............................................................... 106

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................ 107

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень её разработанности

В последние годы показана этиологическая роль целого ряда условно-патогенных бактерий в возникновении инфекционного процесса различной локализации [71,87]. Однако в отношении микробных ассоциаций Enterobacter spp. и Stahpylococcus aureus данный вопрос недостаточно изучен. Практически отсутствуют сравнительные данные о биологических свойствах сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus.

В настоящее время скложилось устойчивое мнение о том, что формирование популяции полирезистентных штаммов возбудителей станет основной характеристикой микробой патологии [189,210].

В иммунном ответе на ряд патогенных агентов огромную роль играют начальные этапы инфекционного процесса, связанные с фагоцитарной активностью макрофагов [23,57,195].

Основные механизмы, обеспечивающие естественную резистентность макроорганизма, в той или иной степени представлены в литературе [23,25,89].

Цель исследования

Задачи исследования

Методология и методы исследования

Клинический материал бактерий рода Enterobacter и S.aureus был получен из бактериологических лабораторий ГБУЗ Республиканская детская клиническая

больница и ГБУЗ Республиканская клиническая больница им. Г.Г.Куватова г.Уфы.

При обследовании 1190 больных было выделено 78 (6,5%) штаммов Enterobacter spp., в том числе 29 (37,2%) штаммов Enterobacter spp. от 445 больных с желудочно-кишечными инфекциями, 23 (29,5%) - от 349 больных с урологическими заболеваниями и 26 (33,3%) - от 396 больных с гнойно-воспалительными процессами.

В качестве эталонных культур использовали штаммы Enterobacter gergoviae (ГИСК им. Тарасевича №259), Enterobacter cloacae (ГИСК им. Тарасевича №258),

Salmonella tuphimurium №415 (несущий плазмиду массой 60 МД), Proteus vulgaris Rts-1 (несущий плазмиду 120 МД), Escherichia coli K12G62RifR (бесплазмидный).

Для решения поставленных цели и задач исследования использовались следующие методы: микроскопический, культу рал ьный, молекулярно-генетический, иммунологический.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Результаты работы были представлены на Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ «Вопросы теоретической и практической медицины» (г.Уфа, 2010, 2011); X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (г.Москва, 2012); обсуждены на совместном заседании кафедр общей гигиены с экологией с курсом гигиенических дисциплин, биологии, микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Башкирского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, а также с ведущими научными сотрудниками уфимского филиала «Иммунопрепарат» ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ.

Положения, выносимые на защиту

Научная новизна

Впервые приведена характеристика данных об адгезивной, гемолитической, лецитиназной, ДНК-азной, антилизоцимной, антиингерфероновой, антикомплементарной активностях и ЛТ-энтеротоксигенности и вирулентности у сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter spp. и S.aureus.

Теоретическая и практическая значимость работы

Данные о повышении у сокультивируемых вариаций Enterobacter spp. и S.aureus адгезивной, гемолитической, лецитиназной, ДНК-азной,

антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной активностей, J1T-энтеротоксигенности и вирулентности расширяют представление о роли ассоциаций этих бактерий в этиологии инфекционных заболеваний человека.

Внедрение результатов исследования в практику

Материалы исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах микробиологии, вирусологии и иммунологии; детских инфекционных болезней и общей гигиены с экологией с курсом гигиенических дисциплин ГБОУ ВГ10 «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1Л Бактерии рода Enterobacter и Staphylococcus aureus в инфекционной

патологии человека

В последние годы проблема инфекционной патологии стала одной из актуальных проблем современной медицины. Данная проблема связана с неуклонной тенденцией к росту доли условно-патогенных микроорганизмов, в частности представителей родов Enterobacter, Staphylococcus и их ассоциациий в возникновении целого ряда инфекционных заболеваний [4,7,51,170,171,].

Условно-патогенные бактерии нередко обнаруживаются у здоровых людей и вызывают инфекционных процесс лишь при особых условиях, а именно при снижении естественной резистентности организма [202].

В многочисленных исследованиях установлено, что в большинстве случаев возбудители входят в состав нормальной эндогенной флоры больных [34,67,143,187].

В.М. Бондаренко с соав. [7] показали, что бактерии рода Enterobacter на 3,08,3% чаще выделяются от больных с острыми кишечными заболеваниями, чем от здоровых людей.

При различных состояниях, сопровождающихся ослаблением резистентности макроорганизма, бактерии рода Enterobacter могут вызывать от 14 до 53% случаев бактериемий [84,224], причинами которых является частая контаминация микробами растворов для парентерального питания, крови для переливания, катетеров, инструментов для манипуляций [72,73,76,164, 184].

Около 20-30%) бактериемий протекает по типу микстинфекций, при которых наиболее часто встречаются ассоциации Enterobacter spp. с коагулазоотрицательными стафилококками и энтерококками [205]. Сведения о клинической картине инфекций, вызванных ассоциациями Enterobacter spp. и S.aureus, многочисленны и одновременно противоречивы.

Условия обитания на разных участках человеческого тела (кожа, слизистые оболочки) нередко определяют формирование специфических ассоциаций (биотопы) микроорганизмов, состоящих из разных видовых сочетаний. В результате длительного взаимодействия между макроорганизмом и окружающими его микроорганизмами происходит отбор определенных видов бактерий, использующих организм хозяина как среду обитания. Однако при превышении некоторой пороговой величины отрицательно воздействующих на организм токсических факторов микробиоценозы выходят из состояния равновесия, что вызывает микроэкологические и иммунные нарушения [196]. Это приводит к доминированию условно-патогенных микробов, усилени�

Информация о работе

Изикаев, Венер Миниварисович
кандидата медицинских наук
Челябинск, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Некоторые биологические свойства монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphylococcus aureus и особенности их действия на перитонеальные макрофаги мышей. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы