Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние факторов внешней среды на первые этапы образования биопленок бактериями Staphylococcus epidermidis

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние факторов внешней среды на первые этапы образования биопленок бактериями Staphylococcus epidermidis"

ЕРОШЕНКО Дарья Владимировна

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ПЕРВЫЕ ЭТАПЫ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЯМИ STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS

03.02.03 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

00556786b 2 9 АПР 2015

Пермь-2015

005567866

Работа выполнена в лаборатории биохимии развития микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь.

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, доцент Коробов Владимир Павлович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов ФБГУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» МЗ РФ, Романова Юлия Михайловна

доктор медицинских наук, начальник отдела препаратов бактериотералии филиала ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»» Несчисляев Валерий Александрович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» МЗ РФ (197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6-8).

Защита состоится « Ч » июня 2015 г. в «часов на заседании диссертационного совета ДМ004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342)

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭГМ УрО РАН и на сайте ИЭГМ УрО РАН (http://www.iegm.ru).

Автореферат диссертации разослан « '1 » 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

2809211.

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Смена парадигмы в микробиологии, обусловленная осознанием выдающейся роли биопленок - организованных сообществ микроорганизмов - в формировании и функционировании биоты нашей планеты, определяет возрастающий интерес исследователей к процессам образования, персистенции и распространения этих особых живых структур.

В настоящее время уровень инфекционных заболеваний, в развитии которых формирование биопленок является важным патогенетическим событием, достигает 80% (Hidron et al., 2008). Характерной особенностью возбудителей этих патологических состояний является их высокая устойчивость к широко используемым в практике антибиотикам (Gill et а!., 2005).

Бактерии рода Staphylococcus, в частности S. epidermidis, являются обычными резидентами кожных покровов и слизистых человека и животных, составляя 65-90% от общей микрофлоры (Дерябин, 2000). Однако, способность стафилококков к образованию биопленок может приводить к серьезным осложнениям, вплоть до летальных исходов. Особенно часто это наблюдается при заболеваниях, связанных с использованием долговременных медицинских устройств - внутрисосудистых и уретральных катетеров, контактных линз и различных полимерных и металлических трансплантатов. Обладая тропностью к различным материалам, коагулазонегативные стафилококки становятся возбудителями внутрибольничных инфекций, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом (Vuong and Otto, 2002). В связи с этим, изучение механизмов колонизации различных поверхностей и, особенно, первых этапов этого процесса, а также поиск путей предотвращения формирования бактериальных пленок имеют существенное значение для разработки стратегий предупреждения формирования биопленок как сапрофитных, так и патогенных бактерий.

Несмотря на значительное количество работ, посвященных изучению роли бактерий S. epidermidis в развитии имплантат-ассоциированных инфекций, механизмы адгезии и формирования биопленок стафилококками до сих пор остаются недостаточно изученными (Otto, 2012). В связи с этим, получение новых данных о процессах бактериальной колонизации может значительно углубить понимание механизмов заселения стафилококками полимерных поверхностей и явиться основой для разработки эффективных способов предупреждения и борьбы с инфекциями, обусловленными формированием биопленок этими бактериями.

Цель настоящей работы - изучение первых этапов процессов образования биопленок бактериями S. epidermidis и их чувствительности к факторам внешней среды и ряду антибактериальных соединений.

Основные задачи исследования:

1. Изучить влияние физико-химических параметров внешней среды (гидродинамические условия, температура, pH, осмолярность среды, концентрация глюкозы) на адгезию бактерий S. epidermidis к поверхностям полистирола и стекла.

2. Оценить роль катионов биоактивных металлов (кальция, магния, цинка и марганца) в процессах адгезии и на первых этапах образования биопленок бактериями S. epidermidis.

3. Охарактеризовать действие факторов, влияющих на свойства поверхностных структур бактериальных клеток (детергенты, мембранотропные соединения и гидролитические ферменты), на сорбционную активность и формирование биопленок бактериями S. epidermidis на поверхностях полистирола.

4. Исследовать влияние антибиотических соединений (линезолид и низкомолекулярные катионные пептиды) на адгезию бактерий S. epidermidis.

5. Оценить роль некоторых белковых компонентов крови в процессах колонизации поверхностей полистирола бактериями S. epidermidis.

6. Проанализировать возможность функционирования механизмов регуляции процессов адгезии бактерий S. epidermidis.

Научная новизна

Впервые показано, что повышение осмолярности среды вызывает практически одинаковое снижение сорбции бактерий исследованного вида S. epidermidis как на гидрофобной, так и гидрофильной поверхностях. Установлен уровень значимости А\|/- и ДрН-компонент мембранного потенциала бактерий S. epidermidis в процессах их сорбции и формирования биопленок. Выявлено стимулирующее действие аутологичной внеклеточной ДНК на адгезию бактерий S. epidermidis. Обнаружена возможность снижения вероятности формирования биопленок бактериями S. epidermidis, в том числе их антибиотикоустойчивыми штаммами, внесением в среду культивирования низкомолекулярных катионных пептидов. Получены временные характеристики продолжительности ингибирующего эффекта низкомолекулярных пептидов варнерина и хоминина на развитие биопленок бактерий S. epidermidis. Показано, что адгезия бактерий S. epidermidis сопровождается выделением во внешнюю среду соединений пептидной природы, по-видимому, обладающих ауторегуляторными функциями.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты расширяют представления об особенностях адгезии и первых этапов образования биопленок бактериями S. epidermidis как при изменении физико-химических параметров внешней среды, так и под действием факторов, влияющих па поверхностные структуры бактериальных клеток. Ингибирующее действие низкомолекулярных катионных антибактериальных пептидов на процессы адгезии и первые этапы формирования биопленок стафилококков свидетельствует о перспективах использования этих соединений для обработки поверхностей медицинских замещающих устройств с целью предупреждения формирования на них биопленок коагулазонегативных стафилококков.

Положения, выносимые на защиту

1. Динамика связывания бактерий S. epidermidis с поверхностями атакуемых материалов существенно зависит от физико-химических параметров внешней среды -гидродинамических условий, температуры, pH, осмолярности и концентрации энергетического субстрата.

2. Изменение характеристик поверхностей бактерий S. epidermidis под действием факторов внешней среды - катионов биоактивных металлов, детергентов, ионофоров, ферментов — оказывает существенное влияние на их адгезию к гидрофобной поверхности полистирола.

3. Низкомолекулярные катионные пептиды семейства лантибиотиков варнерин и хоминин вызывают значительное снижение адгезии бактерий S. epidermidis на поверхностях полистирола, способствующее выраженному ингибированию первых этапов образования на них биопленок.

4. Обработка поверхностей полистирола белковыми компонентами крови приводит к существенным, определяемым природой белков, изменениям сорбции на них бактерий S. epidermidis.

5. Адгезия бактерий S. epidermidis к поверхности полистирола сопровождается выделением ими в среду низкомолекулярных соединений, по-видимому, участвующих в регуляции начальных этапов колонизации бактериями атакуемой поверхности этого материала.

Апробация работы н публикации.

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011); VIII Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2012); 5th Congress of European Microbiologists FEMS (Leipzig, 2013); VI Всероссийском с международным участием Конгрессе молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия» (Иркутск, 2013); 18-ой международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2014); III International Conference on Antimicrobial Research (Madrid, 2014).

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, и 1 статья в журнале «Current Microbiology».

Объем и структура работы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста и включает 20 таблиц и 43 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы содержит 227 источников, в том числе 16 отечественных и 211 зарубежных.

Связь работы с крупными программами и собственный вклад автора.

Работа выполнена в Лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (11-04-96025-р_урал_а, 12-04-01431-а и 14-04-00687), Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (12-П-4-1002) и грантом Министерства образования и науки Пермского края «Международные исследовательские группы» (С-26/632).

Научные положения и выводы полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы. В работе использованы штаммы бактерий S. epidermidis GISK 33 (Государственная коллекция патогенных микроорганизмов ГИСК им Л.А. Тарасевича, сейчас ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, г. Москва), а так же S. epidermidis АТСС 12228 и S. epidermidis АТСС 29887, обладающего устойчивостью к метициллину (Fang and Hedin, 2003). Для оценки влияния гетерологичной экзогенной ДНК на адгезию бактерий S. epidermidis использовали препарат из бактерий Propionibacterium acnes АС-1450 (Всероссийская коллекция микроорганизмов, г. Москва).

Среды и условия культивирования. Бактерии S. epidermidis выращивали на питательной среде LB (Atlas, 1993). Для изучения влияния различных факторов среды на адгезию и образование бактериальных пленок использовали полноценную или не

содержащую KCl среду LB. При определении антибактериальной активности катионных пептидов варнерина и хоминина использовали среду LB, не содержащую KCl. Бактерии S. epidermidis выращивали при 37°С па шейкере Certomat IS («Sartorius», Германия) при 160 об/мип до достижения бактериальной популяцией логарифмической или стационарной фаз роста, затем осаждали в течение 5 мин при 12000g на центрифуге 5415R («Eppendorf», Германия), осадки дважды промывали 0,9% раствором NaCl и суспендировали до 108 КОЕ/мл в среде LB или в 10 мМ фосфатном буфере pH 7,2 (ФБ) в зависимости от поставленных задач.

Тестирование способности бактерий к секреции полимерного межклеточного адгезина (PIA) проводили с использованием агаризованной среды LB с добавлением индикатора Конго красный (Freeman et al., 1989).

Уровень гндрофобности бактериальной поверхности определяли с помощью ВАТН-теста в двухфазной системе с гексадеканом (Rosenberg et al., 1980).

Определение адгезионной способности бактерий: подготовленные суспензии бактерий S. epidermidis (107 КОЕ/мл) в среде с добавлением исследуемых факторов вносили в объеме 2 мл в полистироловые чашки Петри (диаметр 40 мм, «Медполимер», Россия) или на обезжиренные покровные стекла (24><24 мм2, «МиниМед», Россия) в стеклянных стаканах (диаметр 40 мм) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С без перемешивания. Количество связавшихся с поверхностями бактериальных клеток оценивали путем прямого счета с помощью микровизора |iV¡so-103 («Ломо», Россия), просматривая после окрашивания препаратов раствором кристаллического фиолетового (0,1%) не менее 10 полей зрения при увеличении х2500.

Изучение биопленкообразуюшен способности бактерий проводили в плоскодонных 96-луночных полистироловых планшетах («Медполимер», Россия). Подготовленные бактериальные суспензии (107 КОЕ/мл) вносили в объеме 100 мкл в лунки и инкубировали при 37°С в статических условиях в течение 24 ч. Биомассу образованных биопленок определяли путем измерения оптической плотности спиртовых экстрактов связавшегося кристаллического фиолетового (Stepanovic et al., 2007).

Для оценки роли внеклеточной ДНК на адгезию бактерий S. epidermidis 33 использовали препараты полной геномной ДНК, выделенные из ночных культур бактерий этого штамма и P. acnes АС 1450 с применением набора реактивов «Bacterial Genomic DNA Miniperp Kit» («Axygen», США) по прописи фирмы-изготовителя.

Дзета-потенциал бактериальных клеток определяли на лазерном анализаторе размера частиц и дзета-потенциала «Zetasizer NanoZS» («Malvern», Великобритания) с программным обеспечением фирмы-изготовителя. Отмытые бактерии S. epidermidis непосредственно перед измерением суспендировали до концентрации 107 КОЕ/мл в питательной среде LB без KCl, содержащей 2,5 мМ ионов Са2+, Mg2*, Zn2+ или Мп2+. Измерения проводили при 37°С в течение 30 мин.

Предобработку поверхности полистрола проводили препаратами человеческой плазмы крови (10%), бычьего сывороточного альбумина (БСА, 5 мг/мл, «Sigma», США), фибронектина (Фн, 25 мкг/мл, «Sigma», США), варнерина (32 мкг/мл) или хоминина (32 мкг/мл) в течение 60 мин при 37°С. Низкомолекулярные катионные пептиды варнерин и хоминин были выделены из сред культивирования бактерий S. warneri KL-1 (Коробов и др., 2010) и S. hominis KLP-1 (Патент РФ № 2528055). В качестве контрольных использовали поверхности, предобработанные

0,9% раствором NaCl. После аспирации жидких сред чашки однократно промывали 2 мл ФБ (10 мМ, pH 7,2) и использовали в экспериментах.

Исследование рельефа поверхностей полистирола до и после их обработки препаратами плазмы крови, БСА и Фн проводили на атомно-силовом микроскопе «Dimension Icón» («Veeco», США) в полуконтактном режиме с использованием кремниевых зондов NSG01 (10 им, 7 Н/м, «NT-MDT», Россия) с частотой 2 кГц.

Измерения краевого угла смачивання поверхностей полистирола после их обработки белковыми компонентами крови проводили по модифицированному методу сидячей капли (Yuan and Lee, 2013).

Фильтраты сред на ранних этапах образования биопленок получали после инкубации отмытых бактерий S. epidermidis (107 КОЕ/мл) в ФБ на поверхностях полистирола в статических условиях при 37СС в течение 0, 30, 60 мин. По завершении инкубации жидкую часть собирали аспирацией, освобождали от клеток с помощью центрифугирования (12000xg, 5 мин, 4 °С) и фильтрования (0,20 мкм, «Millipore», Германия). Для масс-спектрометрического анализа методом MALDI-TOF бесклеточные фильтраты концентрировали на установке Concentator 5301 («Eppendorf», Германия), а затем высушенные осадки растворяли в дистиллированной воде. Оценку действия протеолитических ферментов на бесклеточные фильтраты адгезионных сред проводили путем их обработки (37°С, 2 ч) растворами трипсина (100 мкг/мл, «Sigma», США) и протеиназы К (100 мкг/мл, «Sigma», США) с последующим отделением ферментов с помощью мембранной ультрафильтрации (10 кДа, «Sartorius», Германия).

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью программного обеспечения «Prism 6» («GraphPad Software Inc.», США) с использованием однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA). Все эксперименты проводили в трех-пятикратной повторное™. Достоверность полученных результатов оценивали при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Гндрофобность поверхности бактерий S. epidermidis и их способность к продукции PIA. Установлено, что все использованные в работе штаммы бактерий S. epidermidis характеризовались близкой гидрофобностью в пределах 66-78%, а при росте на агаре с Конго красным колонии всех исследованных штаммов обладали красной окраской, свидетельствующей об отсутствии продукции межклеточного адгезина PIA (Freeman et al., 1989).

Влияние физико-химических условий на адгезию бактерий S. epidermidis. Известно, что гидродинамические условия культивирования оказывают значительное влияние на первые этапы адгезии бактериальных клеток (An and Friedman, 2000). Результаты наших исследований влияния гидродинамических параметров культивирования на адгезию бактерий S. epidermidis 33, полученных в разные периоды развития планктонной популяции, показали, что в первые 30 мин инкубации приложение силы сдвига в 10,7 дин/см2 снижало адгезию клеток примерно в 2,5 раза вне зависимости от физиологического состояния бактерий (Рис. 1). В то же время, различие в углах наклона кривых свидетельствует об отличиях в темпах прироста сорбированных клеток разных фаз развития бактериальной популяции как при перемешивании, так и в статических условиях.

30 60 90 Время, мин

В статических условиях

Бактерии

стационарной

фазы

30 60 90 Время, мин

120

При сдвигающем усилии 10,7 дин/см

Рисунок 1. Динамика сорбции бактерий 5. ер'и1еттк1'к 33 логарифмической и стационарной фаз роста в разных гидродинамических условиях.

Изучение влияния температуры окружающей среды на процессы сорбции бактерий на поверхности полистирола показало, что данный фактор оказывает практически одинаковый эффект на адгезию всех исследованных штаммов 5. ер'и1егт'иИз (Рис. 2). При сравнении численности сорбированных бактерий в среде 1.В и 0,9% растворе ЫаС1 при разных температурных режимах было обнаружено стимулирующее действие высоких температур в обоих вариантах (Рис. 2). Однако, в богатой питательной среде этот эффект проявлялся в значительно большей степени. При низкой температуре (3°С) адгезия значительно снижалась по сравнению с контролем (37°С), достигая одинакового уровня в обеих исследованных средах.

■2 150-

о

0) I125'

5 1100-

о со 1- ф 75-

о о> ..

ф с; 50-

У О

С с 25-

О

0-

Среда 1-В

7 14 21 28 35 42 Температура, "С

"2 о н 0)

о ш

I-о

О) 3"

е; о

150

1100175 0)

с; 50 Н о

= 254

Изотонический раствор №С1

7 14 21 28 35 42 Температура, °С

Бер/бегт/сИз 33

Э. ерйегтйй 12228 -О- З.ерйети'й'з 29887

Рисунок 2. Адгезия бактерий 5. ер'нЫгткГк на поверхности полистирола при разных температурах в среде ЬВ и изотоническом растворе №С1.

* - различия статистически значимы при сравнении с данными при 37СС (р<0,05)

Установлено, что изменение рН среды от кислых (рН 4) до слабощелочных (рН 8) значений не оказывало какого-либо значительного влияния на сорбцию бактерий 5. ер1с1егт1сИ.ч 33 стационарной фазы роста (Рис. 3). В то же время для бактерий лог-фазы была характерна: тенденция к снижению адгезии в слабокислой зоне, достигавшая статистически значимого отличия при рН 4, и некоторое увеличение числа сорбированных клеток в слабощелочной зоне (Рис. 3). Полученные результаты

согласуются с данными о том, что при кислых значениях рН (3-6) адгезия бактерий S. epidermidis, в основном, ниже, чем в нейтральной среде при рН 7 (Dunne Jr. and Burd, 1992; Zmantar et al., 2010).

Рисунок 3. Влияние кислотности среды LB на адгезию бактерий S. epidermidis 33 логарифмической и стационарной фаз роста

бактериальной популяции на поверхности полистирола. * - различия статистически значимы при сравнении с данными при рН 7,0 (р<0,05).

Оценка влияния осмотического давления среды на способность бактерий S. epidermidis 33 сорбироваться на гидрофобных полистироловых и гидрофильных стеклянных поверхностях показала, что в контрольных экспериментах (среда, не содержащая NaCl) численность бактерий, адгезированных на разных типах поверхностей, отличается практически в два раза (Рис. 4). Это согласуется с данными о том, что адгезия бактерий S. epidermidis на поверхностях гидрофобных материалов выше, чем на гидрофильной поверхности стекла (Cerca et al., 2005b). Однако, с повышением концентрации соли в среде инкубации адгезия на стекле и полистироле снижалась, а при концентрациях 1,0-2,0 М NaCl разница в количестве сорбированных клеток на разных типах поверхностей нивелировалась. Известно, что стафилококки сохраняют жизнеспособность в высокомолярных растворах NaCl (Хоулт и др., 1997). Действительно, количество живых клеток в среде в течение 30 мин оставалось постоянным. Выявленное ингибирующее действие высоких концентраций ионов Na+ на адгезию может быть связано с их способностью неспецифически связываться с отрицательно-заряженными группами, например, тейхоевых и тейхоуроновых кислот, а также пептидогликана на поверхности бактериальных клеточных стенок (Потехина, 2006). Вследствие этого, отрицательный поверхностный заряд бактериальных клеток снижается, что, в свою очередь, приводит к изменению их сорбционных характеристик.

80-1

ñ 40

I 20

с; о sé

-О- Бактерии лог-фазы

Бактерии стационарной фазы

6 РН

80-1

60-

40-

20-

10» т; §§

И°7 2 *

1 8 * н

-Г" 0.0

10»

10s

* ***

m *

s 3

а О-

ю4

0.5 1.0 1.5 2.0 Концентрация №С1, М

Адгезия на полистироле

Адгезия на стекле

Количество живых клеток, КОЕ/мл

Рисунок 4. Влияние осмотической силы раствора на адгезию бактерии 5. ер'икгт'иГп 33 к стеклу и полистиролу.

* - различия статистически

значимы при сравнении с данными на стекле (р<0,05).

Таким образом, полученные в наших исследованиях данные свидетельствуют о том, что изменение физико-химических условий среды - сдвигающих усилий, температуры и кислотности может приводить к ослаблению адгезии бактерий 5. epidermidis к поверхности полистирола. Этому способствует также повышение осмолярности среды, причем при значительном возрастании ионной силы раствора (1,0-2,0 М NaCl) разница в количестве сорбированных клеток на разных типах поверхностей практически нивелируется.

Влияние соединений, меняющих свойства бактериальной поверхности, на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis. Учитывая данные о наличии в биопленках стафилококков белковых компонентов (Götz, 2002), была проведена экспериментальная оценка влияния на адгезию и рост биопленок этих бактерий ионов биологически активных металлов, определяющих активность внеклеточных протеаз и пептидаз (Mikhailova et al., 2005).

Внесение в среду культивирования ионов кальция (2,5 мМ) снижало количество сорбирующихся бактерий и интенсивность формирования биопленок S. epidermidis 33 (Рис. 5). Вместе с тем, адгезия бактерий штаммов 12228 и 29887 в присутствии ионов Са2+ практически не менялась, однако, интенсивность формирования пленок бактериями S. epidermidis 29887 в этих условиях снижалась практически в 2 раза.

Обнаружено, что ингибирующим эффектом как на адгезию, так и образование биопленок для всех исследованных штаммов S. epidermidis обладали и ионы цинка (2,5 мМ). Наиболее значительно влияние этих катионов проявлялось на первых этапах образования биопленок, приводя к уменьшению числа сорбированных клеток на 85-97 %, при этом, образование биопленок снижалось в 1,5-2 раза (Рис. 5).

■а

о

о ш ь о

V У

5

с.

6

150-!

К

|юоН

СО ф

§

50-

Адгезия

d

h

Образование биопленок

1-В |_В+ Са2* |_в+гп2* 1_В 1_В+ Са2* ¡.В+2п2*

О S.epidermic^is 33 S.epidermidis 12228 □ S.epidermidis 29887

Рисунок 5. Влияние ионов кальция (2,5 мМ) и цинка (2,5 мМ) в среде ЬВ на адгезию и образование биопленок бактериями 5. epidermidis.

* - различия статистически значимы при сравнении с контролем (ЬВ) (р<0,05).

Более детальное изучение влияния двухвалентных катионов металлов на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis 33 показало, что адгезия бактериальных клеток в значительной мере подавлялась всеми исследованными катионами (Рис. 6). При этом необходимо отметить, что внесение в среду ионов Са2+ и Мп2+ до 0,5 мМ приводило к небольшому повышению образования биопленок (Рис. 6 А, Г). Однако, дальнейшее увеличение содержания этих ионов в среде ингибировало этот процесс. Наряду с этим, способность бактерий формировать биопленки повышалась примерно в 2 раза при добавлении в среду ионов М§2+ (Рис. 6Б). В то же время, присутствие в среде ионов во всем диапазоне исследованных концентраций ингибировало образование биопленок (Рис. 6В).

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Концентрация Са2*, гпМ

•а о

80 60 4020-

0.4 0.3

О

I-0.2 Р

■0.1

0.0

0.0

2.5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Концентрация Mg2+, тМ

0.5 1.0 1.5 2.0 Концентрация Zn2+, mM

Адгезия, количество клеток/поле зрения

0.5 1.0 1.5 2.0 Концентрация Mn2+, тМ

Биопленка, OD570

Рисунок 6. Влияние содержания в среде ЬВ ионов металлов Са2+ (А), (Б), гп2+ (В), Мп2+ (Г) на адгезию и образование биопленок бактериями S. ер 'и1егт1(Иъ 33.

* - различия статистически значимы при сравнении с данными при отсутствии катионов в среде (р<0,05).

Известно, что ионы кальция и марганца способны ингибировать адгезию к полистиролу, межклеточную агрегацию и образование Вар-зависимых биопленок бактериями S. aureus (Arrizubieta et at, 2004). В этой связи, можно предполагать, что подобный эффект характерен и для бактерий S. epidermidis, обладающих PIA-отрицательным фенотипом. Кроме того, избыток ионов цинка способен оказывать влияние на уровень гидрофобности бактерий S. epidermidis, связываясь с белками клеточной стенки Аар и SasG, имеющими Zn-связывающие домены (Conrady et al., 2008). Одновременно с этим известно, что экзополисахариды и липотейхоевые кислоты, входящие в состав клеточной стенки грамположительных бактерий, способны связывать ионы кальция (Josefsson et al., 1998; Потехина, 2006). По-видимому, такое неспецифическое связывание ионов металлов с поверхностными структурами бактериальных клеток может приводить к значительным изменениям их электростатических свойств.

Действительно, результаты исследований влияния двухвалентных катионов на дзета-потенциал клеток S. epidermidis 33 подтвердили их способность оказывать существенное влияние на электрический заряд бактериальных клеток (Табл. 1). Максимальное действие на величину дзета-потенциала бактерий оказывали ионы магния, снижая его практически на 30%. Менее выраженными эффектами обладали ионы кальция и цинка (20 и 18%, соответственно), а наименьшим - ионы марганца, вызывавшие изменение дзета-потенциала лишь на 7%.

Таблица 1. Дзета-потенциал клеток 5. ерй1егт1(1Ь 33 в среде ЬВ, содержащей ноны двухвалентных металлов. ____

Среда Контроль (LB без КС1) Са2+ (2,5 мМ) Mg2+ (2,5 мМ) Zn2+ (2,5 мМ) Мп2+ (2,5 мМ)

Дзета-потенциал, мВ -21,0±0,4 -16,7±0,7* -14,5±1,0* -17,3±0,6* -19,5±0,8*

* - различия статистически значимы при сравнении с контролем (р<0,05)

Таким образом, ионы двухвалентных металлов оказывают выраженное влияние на адгезию бактерий S. epidermidis, по-видимому, двумя различными путями -связыванием с карбоксильными группами белков и взаимодействием с отрицательно заряженными группировками различных поверхностных структур бактериальных клеток, изменяя их дзета-потенциал.

Изучение действия соединений, нарушающих энергетические функции бактериальных мембран, выявило, что введение в инкубационную среду нигерицина (Nig), нивелирующего рН-компоненту мембранного потенциала, не оказывало существенного влияния на адгезию бактерий S. epidermidis и образование ими биопленок (Рис. 7). В то же время, в присутствии валиномицина (Val), рассеивающего электрическую составляющую потенциала (Vinnikov el al., 1989), количество сорбированных на полистироле бактерий S. epidermidis 12228, атак же интенсивность образования ими и бактериями штамма S. epidermidis 29887 биопленок существенно снижались. Аналогичное влияние на формирование биопленок этих штаммов отмечалось и в присутствии протонофора карбонил-цианид-ш-хлорфенилгидразона (СССР). Полученные результаты свидетельствуют о том, что наибольший вклад в адгезию и формирование биопленок бактерий S. epidermidis, по-видимому, вносит электрическая составляющая мембранного потенциала, в то время как изменение другой компоненты потенциала - ДрН - практически не оказывает влияния на эти процессы.

этанол Val Nig СССР этанол Val Nig СССР

О S.epidermiids 33 ЕЭ S.epidermidis 12228 □ S.epidermidis 29887

Рисунок 7. Действие мембранотропных соединений (10"6 М) на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis в среде LB.

* - различия статистически значимы при сравнении с данными в LB + спирт (р<0,05).

Известно, что различные гидролитические ферменты, а также соединения, окисляющие а-гликольные группировки в углеводах, способны оказывать существенное влияние на процессы колонизации бактериями абиотических поверхностей (Hussain et al., 1997; Izano et al„ 2008; Rohde et al„ 2005).

Действительно, внесение в инкубационные среды одновременно с бактериями ферментов, гидролизирующих белки (трипсин), нуклеиновые кислоты (ДНКаза и РНКаза), клеточные стенки бактерий (лизоцим), а также периодата натрия, окисляющего а-гликольные группировки соединений, оказывало значительное влияние на адгезию и образование биопленок 5. epid.ermid.is. Как представлено на Рис. 8, лизоцим, трипсин и периодат натрия значительно ингибировали как процессы адгезии, так и формирования биопленок бактериями всех исследованных в работе штаммов.

S. epidermidis 33

S. epidermidis 12228

S. epidermidis 29887

50 100 150 % от контроля

50 100 150

% от контроля

□ Адгезия

50 100 150 200

% от контроля

□ Формирование биопленок

Рисунок 8. Действие ферментов, препаратов ДНК и периодата натрия на адгезию и образование биопленок бактерий S. epidermidis.

* - различия статистически значимы при сравнении с контролем (р<0,05).

Поскольку внесение в среду инкубации трипсина не приводило к бактерицидному действию на клетки тестированных штаммов, можно полагать, что его присутствие в среде способствует гидролизу определенных белков, необходимых для колонизации поверхности и образования биопленок. В то же время, эффекты лизоцима и периодата натрия, скорее всего, связаны с расщеплением пептидогликана и его углеводных компонентов.

Небольшие отличия выявлялись в действии РНКазы. Так, присутствие в среде этого фермента приводило к повышению уровня сорбции бактерии штамма S. epidermidis 12228. В то же время, наличие этой нуклеазы в питательной среде угнетало развитие биопленок бактерий S. epidermidis 29887.

Внесение ДНКазы в среду формирования биопленок ингибировало процессы их образования, возможно, за счет снижения интенсивности кислотно-основных взаимодействий как между клетками и поверхностью, так и непосредственно между бактериальными клетками (Das et al., 2010; Qin et al., 2007b). Исключение составлял штамм S. epidermidis 29887, образующий биопленки в присутствие этого фермента практически на уровне контроля. Однако, введение внеклеточной гетерологичной ДНК (ДНК КРС) не оказывало значительного эффекта на процессы адгезии и формирования биопленок для всех изученных штаммов.

Более подробное изучение влияния различных видов полной геномной ДНК, выделенной из бактерий тестируемого штамма стафилококков, а так же из бактерий Р. acnes и селезенки крупного рогатого скота (КРС), на адгезию бактерий S. epidermidis 33 показало, что внесение в среду инкубации аутологичной ДНК приводило к увеличению числа сорбированных клеток в 1,5 раза (Рис. 9). Присутствие в среде чужеродной ДНК, как бактериального, так и животного происхождения, не сказывалось на количестве связавшихся с поверхностью полистирола бактерий. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что действие экзДНК на сорбцию стафилококков, по-видимому, видоспецифично и определяется физико-химическими свойствами конкретных ДНК.

150-

200

. к к 5 s о г о. ш н 8-5 100+

§S

50-

I

Ï

-r^-l—

Контроль ДНК ДНК ДНК

S. epider- Р. acnes КРС midis

Рисунок 9. Действие экзДНК на адгезию бактерий 5. ер 'и1еттк1^ 33.

* - различия статистически значимы при сравнении с контролем (р<0,05).

Специальные исследования были посвящены изучению сорбционных характеристик бактерий S. epidermidis 33 при наличии в среде инкубации поверхностно-активных соединений. Обнаружено, что додецилсульфат натрия (SDS) и тритон Х-100 в концентрации 0,1хМПК вызывали снижение числа прикрепившихся к полистиролу клеток на 50-75 % (Рис. 10). При этом SDS оказывал практически одинаковое действие, как в воде, так и в среде LB, тогда как внесение тритона Х-100 и цетавлона в среду LB оказывало на адгезию бактерий меньшее действие по сравнению с проявлением активности этих детергентов в водных растворах. Ингибирующее действие этих соединений на адгезию, по-видимому, связано с их способностью солюбилизировать белковые компоненты поверхностей клеточных стенок сорбирующихся бактерий (Paul and Jeffrey, 1985).

О

80-!

60-

s

с; о

S" 40-1 о> о 20-

□ Вода Ш LB - lb

й- rfl il

КонтрольТритон SDS Цетавлон Х-100

Рисунок 10. Сравнение действия детергентов на адгезию бактерий 5. epidermidis 33 в воде и среде ЬВ.

* - различия статистически

значимы при сравнении с контролем (р<0,05).

Таким образом, модификация поверхностей бактериальных клеток обработкой соединениями, оказывающими влияние на локализованные на внешней поверхности углеводные или белковые молекулы, приводит к изменению сорбционных свойств бактерий.

Действие антибиотических пептидных соединений па адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что некоторые катионные пептиды являются перспективной альтернативой современным антибиотикам (Vaara, 2009). Показано, что один из дефенсинов человека пептид LL-37 обладает антимикробной активностью, а так же подавляет образование биопленок S. aureus (Dean et al., 2011). Аналогичными свойствами в отношении бактерий S. epidermidis обладает выделенный из гепатоцитов человека пептид hep20 (Brancatisano et al., 2014).

Как показали наши исследования, низкомолекулярный катионный пептид варнерин в концентрациях 0,1—ЮхМПК проявлял выраженное ингибирующее действие на адгезию бактерий исследованных штаммов на поверхности полистирола, в том числе бактерий штамма S. epidermidis АТСС 29887, обладающих устойчивостью к метициллину (Рис. 11).

-О- Численность сорбированных клеток -■• Численность живых клеток

Рисунок 11. Динамика численности сорбированных на полистироле и живых планктонных клеток бактерий 5. epidermid¡s при возрастании концентрации варнернна в среде при инкубации в течение 30 мин.

* - различия статистически значимы при сравнении с данными при ОхМПК (р<0,05).

Специальными экспериментами проведен сравнительный анализ действия антибактериальных пептидов стафилококков, варнерина и хоминина, на адгезию живых и убитых нагреванием бактерий epidermidis 33 к различным поверхностям (Рис. 12). В контрольных экспериментах бактерии инкубировали в изотоническом растворе КаС1. В экспериментах с живыми бактериями 5. epidermidis 33 введение в среды обоих пептидов (0,5 мкг/мл) приводило к снижению числа сорбированных клеток, как на гидрофобной поверхности полистирола, так и на гидрофильной поверхности стекла практически в 2 раза. При этом, присутствие в среде как варнерина, так и хоминина не оказывало влияния на адгезию бактерий после их термической обработки при 100 °С.

100-1

о

1- О) к 80-

5 s i

о m 1- о а п 60-

о ф 40-

а> q

з- о

s с; с 20-

о

■¡с 0-

Полистирол

150-1

* хЮО-

i

о а

п ш

50-

о с

Стекло

Контроль

О

W

Живые

Контроль W H

^ Клетки после кипячения

Рисунок 12. Действие катионных пептидов варнерина (W) и хоминина (Н) на адгезию живых и убитых кипячением бактерий S. epidermidis 33 на поверхностях полистирола и стекла.

* - различия статистически значимы при сравнении с контролем (р<0,05).

Анализ литературы свидетельствует о том, что особое внимание исследователей привлекает поиск путей подавления бактериального прикрепления и колонизации имплантатов за счет покрытия их поверхностей антимикробными пептидами (Costa et al, 2011). Действительно, в наших экспериментах предобработка поверхностей полистирола растворами обоих пептидов в течение 60 мин приводила к значительному снижению количества адгезированных бактерий (Рис. 13). Следует отметить увеличение антиадгезионной активности сорбированной формы пептидов по сравнению с растворимой, которое так же наблюдалось другими исследователями (Costa et al., 2011). Возможно, это связано с непосредственным концентрированием антибактериальных пептидов на границе раздела фаз, когда их действие особенно заметно.

50-|

к 40-х

1 30

ш 20-с,

с о

SÉ

Û

w

СИ

а

H

Контроль

АМП в среде

Поверхности, предобработанные АМП

Рисунок 13. Влияние растворенных и сорбированных на поверхности полистирола варнерина (\У) и хоминина (Н) на адгезию бактерий epidermidis 33 к полистиролу.

* - различия статистически значимы при сравнении с контролем (р<0,05).

Особый интерес представляло изучение продолжительности проявления ингибирующего эффекта обоих пептидов на развитие биопленок бактерий 5. epidernudis после удаления этих соединений из среды инкубации. Сорбцию бактерий к поверхности полистирола проводили в течение 30 мин в присутствии 1хМПК варнерина или хоминина, после этого пептиды и несвязавшиеся бактерии удаляли промыванием ФБ, а затем вносили питательную среду ЬВ для последующего роста бактерий и формирования биопленок. Полученными данными установлено, что продолжительность ингибирующего эффекта катионных пептидов отличалась для бактерий разных штаммов 5. epidermidis и составляла от 2 до 5,5 ч (Рис. 14).

Э. ерШегтМь 33

Э. ерИегт№в 12228

Контроль

Время, ч Варнерин

Б. ер/аГегт/Уга 29887

о 2

Время, -о- Хоминин

Рисунок 14. Продолжительность ингибирующего действия варнерина и хоминина на образование биопленок бактериями 5. ер1(1егти/м после адгезии (30 мин) в присутствии 1хМПК катионных пептидов.

* - различия статистически значимы при сравнении с контролем (р<0,05).

Максимальная чувствительность процесса формирования биопленок к обоим пептидам была обнаружена у бактерий 51. ер1с1егт1сИ5 33. Так, после удаления из среды катионных пептидов, количество связанных с поверхностью полистирола бактерий 5. ер1с1егт1сИя 33, «стрессированных» варнерином или хоминином в течение 30 мин, было заметно меньше контрольных на протяжении 5,5 ч. Для бактерий 5. ер1с1егт1сИ5 12228 этот период снижался до 4 ч, а наименьший эффект обоих пептидов был выявлен в отношении бактерий 51. ер1с1егт1сИ5 29887, для которых торможение процесса формирования биопленок проявлялось только в течение 2 ч после удаления катионных пептидов.

Изучение адгезии бактерий 5. ер1йетт1(1к в присутствии компонентов крови.

Известно, что после контакта с кровью поверхность полимеров практически мгновенно покрывается белками плазмы с достижением полного насыщения в течение 15-60 мин (Сойопаго е/ а1., 1981; 1$1%иго е/ а!., 2005).

На основании данных об адгезии бактерий 5. ер1с1егтШ$ на поверхностях полистирола после предобработки различными белками плазмы крови (Рис. 15) и результатов изучения гидрофобности полученных поверхностей (Табл. 2) была выявлена связь между ослаблением адгезии всех исследованных штаммов ер1с{егт1Ш$ и снижением контактного угла смачивания в случаях преадсорбции альбумина и плазмы крови на поверхности полистирола.

Таблица 2. Физико-химическая характеристика поверхности полистирола после предобработки белковыми компонентами крови в течение 60 мин.

Компонент крови Средняя шероховатость, Яа. нм Средняя разница в высоте, Яг, нм Адгезия к кантилеверу, пК Контактный угол смачивания. °

Без обработки 2,9±0,4 2.4±3,5 0,47±0,02 78±2

Плазма 4,9±1,5* 3.4±3.8 0.96±0.02* 18±2*

БСА 2,6±0,5 2,1 ±0.4 0,34±0,002* 21±3*

Фн 3,6±0,3 2,9±0.4 0.64±0,002* 73±4

* - различия статистически значимы при сравнении с данными «без обработки» (р<0,05)

50-1

О 40-

b о S I ш а 30-

о ф 20-

У

с

10-

0-

Предобработанные поверхности

1*1 J |-,1й1*1

Контроль Плазма

БСА

и Ф 20-

m пт

В растворах, содержащих белки

Jill

ÜL

Контроль Плазма

БСА

О S. epidermidis 33

Ш S.epidermidis 12228 □ S. epidermidis 29887

Рисунок 15. Влияние сорбированных на поверхности полистирола и находящихся в растворе компонентов крови на адгезию бактерий Я. ер'и1егт'иИ\ к полистиролу.

* - различия статистически значимы при сравнении с контролем (р<0,05).

В то же время нами показано, что предобработка поверхности полистирола Фн могла оказывать как стимулирующее действие на сорбцию бактериальных клеток (S. epidermidis 12228 и 29887), так и не проявлять какого-либо видимого эффекта (S. epidermidis 33) (Рис. 15). По-видимому, это не связано с изменением гидрофобности поверхности полистирола, так как иммобилизация Фн не изменяла контактного угла смачивания (Табл. 2), или различием гидрофобных характеристик исследованных штаммов S. epidermidis, поскольку они все обладали практически одинаковым уровнем гидрофобности. Скорее всего, выявленная гетерогенность сорбционных характеристик связана с уровнем специфичности взаимодействия между бактериальными клетками отдельных штаммов и Фн. Действительно, наличие Фн-связывающего белка Embp у нескольких штаммов 5. epidermidis, включая S. epidermidis АТСС 12228, было подтверждено с помощью вестерн-блота экстрактов их клеточных стенок (Linnes et al., 2013). Таким образом, повышение адгезии бактерий 5. epidermidis 12228 и S. epidermidis 29887 к поверхностям полистирола с адсорбированным Фн позволяет предполагать наличие на поверхностях бактериальных клеток данных штаммов белков, подобных Embp, и отсутствие этого белка на поверхности бактерий S. epidermidis 33.

Одновременно с этим, анализ результатов АСМ-исследования рельефа поверхностей полистирола, предобработанных различными белками плазмы крови, (Табл. 2, Рис. 16) и данных об уровне сорбции бактерий S. epidermidis на полученных поверхностях (Рис. 15) показал, что более гладкая (среднее Ra=2,9 нм) необработанная поверхность полистирола характеризуется большей адгезией бактерий по сравнению с таковой после обработки препаратами плазмы (среднее Ra=4,9 нм). Интересно, что поверхности полистирола после обработки альбумином (Ra=2,6±0,5 нм) и фибронектином (Ra=3,6±0,3 нм) обладали близкой топологией с необработанной поверхностью (Ra=2,9±0,4 нм), но различались по способности сорбировать бактерии S. epidermidis. Вероятнее всего, это связано с тем, что шероховатость поверхности ниже пороговой величины (Ra=10 нм) оказывает незначительное влияние на адгезию бактерий S. epidermidis (Shida et al., 2013).

Рисунок 16. Рельеф поверхностей полистирола после предобработки белковыми компонентами крови в течение 60 мин (ACM Dimension Icon, «Veeco», CILIA)

а - без обработки; b- плазма крови человека, 10%; с - БСА. 0.5%; d-Фн, 25 мкг/мл.

Изучение особенностей регуляции процессов адгезии бактерий S. epidermidis

В связи с полученными нами (Рис. 4) и другими исследователями (Cerca et al., 2005b) данными о высокой адгезионной активности бактерий на гидрофобных поверхностях, в специальных исследованиях было проведено изучение характера изменения состава инкубационной среды при сорбции бактерий S. epidermidis на поверхности полистирола.

Согласно данным, представленным на Рис. 17. фильтраты среды инкубации (0,22 мкм), полученные после 60 мин контакта бактерий S. epidermidis 33 с поверхностью полистирола в ФБ. обладали стимулирующим эффектом на адгезию «свежих» бактериальных клеток этого же штамма. Обработка таких фильтратов протеолитическими ферментами (трипсином или протеиназой К) приводила к потере их стимулирующего влияния на адгезию бактериальных клеток, одновременно выявляя пептидную природу этих соединений.

Рисунок 17. Адгезия бактерий | t 5. epidermidis 33 на поверхности

полистирола в фильтратах, полученных после адгезии бактерий того же штамма в ФБ на поверхности полистирола в течение 30 мин и 60 мин и обработанных трипсином и протеиназой К.

* - различия статистически

значимы при сравнении с контролем (р<0,05)

Í

Í

гЬ

i

Контроль Фильтрат 30 мин

I_

Фильтрат 60 мин

_I

Фильтрат Фильтрат 60 мин + 60 мин + трипсин протеиназа К

без обработки

Масс-спектрометрический анализ методом MALDI-TOF показал, что взаимодействие бактерий S. epidermidis 33 с поверхностью полистирола в течение 30 и 60 мин приводит к выделению в среду множества низкомолекулярных соединений с мол. массами от 264 до 684 Да (Рис. 18). В фильтратах сред после 60 мин контакта бактерий с поверхностью количество этих соединений возрастало на порядок по сравнению с фильтратами после 30 мин контакта и, кроме того, обнаруживались три новых соединения с мол. массами 552, 574 и 596 Да. Появление этих соединений по времени совпадает с периодом увеличением числа связанных с поверхностью полистирола бактериальных клеток (Рис. 17). Это дает основание предполагать возможное наличие у данных соединений функций «агентов кворума». Обнаруженная чувствительность данных соединений к протеазам согласуется с известными данными о том, что регуляторными молекулами в системах «quorum sensing» у бактерий рода Staphylococcus выступают короткие пептиды, состоящие из 8 или 12 аминокислот (Olson et ai, 2014).

Рисунок 18. Масс-спектры бесклеточных фильтратов, полученных после адгезии бактерий ер'и1епп'кГ^ 33 в ФБ на поверхностях полистирола:

1 — фильтрат после 30 мин; 2 — фильтрат после 60 мин.

Таким образом, проведенные нами исследования процессов адгезии бактерий S. epidermidis свидетельствуют о возможности функционирования ауторегуляции процесса сорбции клеток при освоении бактериальной популяцией свободных поверхностей на границах раздела фаз. Кроме того, полученные данные позволяют рассматривать в качестве важных участников этих событий низкомолекулярные соединения, которые, по данным масс-спектрометрического анализа обладают мол. массой 550 - 600 Да и, по-видимому, имеют пептидную природу.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что повышение сдвигающих усилий и осмотического давления среды, понижение её температуры и кислотности сопровождаются снижением адгезии бактерий исследованных штаммов .S'. epidermidis к поверхностям стекла и полистирола.

2. Выявлено, что увеличение концентрации ионов кальция, магния, цинка и марганца в среде инкубации приводит к ингибированию процессов сорбции и формирования биопленок бактерий S. epidermidis на поверхностях полистирола, по-видимому, вследствие изменения дзета-потенциала бактериальных клеток.

3. Детергенты и гидролитические ферменты, изменяющие поверхностные характеристики бактериальных клеток, снижают адгезию S. epidermidis к гидрофобной поверхности полистирола.

4. Присутствие в среде аутологичной ДНК оказывает стимулирующий эффект на сорбцию бактерий S. epidermidis, в то время как наличие чужеродной ДНК как бактериального, так и животного происхождения, не вызывает каких-либо значительных изменений интенсивности этого процесса.

5. Установлено, что низкомолекулярные катионные пептиды семейства лантибиотиков варнерин и хоминин снижают адгезию и интенсивность образования биопленок бактерий S. epidermidis, в том числе, обладающих устойчивостью к метициллину, как на гидрофобной, так и на гидрофильной поверхностях.

6. Обработка поверхности полистирола сывороточным альбумином или плазмой крови, вызывающая снижение её гидрофобности, подавляет адгезию бактерий S. epidermidis, тогда так обработка поверхности фибронектином повышает интенсивность этого процесса, вероятно, за счет специфических взаимодействий этого белка с поверхностными структурами бактериальных клеток.

7. Обнаружено, что адгезия бактерий S. epidermidis 33 на поверхности полистирола сопровождается выделением в среду низкомолекулярных соединений, по-видимому, пептидной природы, стимулирующих сорбцию бактерий на начальных этапах освоения ими поверхностей, возможно, в качестве факторов кворума.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Полюдова, Т.В. Влияние факторов внешней среды на начальные этапы формирования биопленок Staphylococcus epidermidis 33 / Т.В. Полюдова, Л.М. Лемкина, Д.В. Ерошенко, В.П. Коробов // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 4/1 (38). - С. 46-48.

2. Ерошенко, Д.В. Влияние ионов двухвалентных металлов на адгезию и образование биопленок бактериями Staphylococcus epidermidis / Д.В. Ерошенко, В.П. Коробов//Фундаментальные исследования.-2014. - № 12(8).-С. 1663-1667.

3. Eroshenko D.V. The role of plasma, albumin, and fibronectin in Staphylococcus epidermidis adhesion to polystyrene surface / D.V. Eroshenko, l.A. Morozov, V.P. Korobov // Current Microbiology. - 2015. - doi:10.1007/s00284-015-0796-8

4. Ерошенко, Д.В. Сравнительный анализ формирования и разрушения биопленок PIA-отрицательных бактерий Staphylococcus epidermidis под действием гидролитических факторов / Д.В. Ерошенко, В.П. Коробов // Вестник Томского государственного университета. Биология. - 2015. - № 1 (29). - С. 28-36

Публикации в других журналах и сборниках

1. Ерошенко, Д.В. Адгезия бактерий Staphylococcus epidermidis 33 при действии некоторых физико-химических факторов среды/ Д.В. Ерошенко, Л.М. Лемкина, В.П. Коробов // Вестник Пермского университета. Серия Биология. - 2012. - Вып. 1. - С. 2933.

2. Ерошенко, Д.В. Влияние температуры на адгезию клеток Staphylococcus epidermidis / Д.В. Ерошенко, Л.М. Лемкина, В.П. Коробов // Тезисы докладов 16-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино. - 2012. - С. 18-19.

3. Ерошенко, Д.В. Адгезия бактерий Staphylococcus epidermidis при нарушении энергетических функций плазматических мембран / Д.В. Ерошенко, Л.М. Лемкина, В.П. Коробов // Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». - Саратов. - 2012. -С. 68.

4. Ерошенко, Д.В. Влияние ионов магния, кальция и ЭДТА на адгезию Staphylococcus epidermidis к полистиролу in vitro / Д.В. Ерошенко, Л.М. Лемкина, В.П. Коробов // Тезисы докладов VIII Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии»,- Москва. - 2012. - С. 1718.

5. Korobov, V.P. Disruption of cytoplamic membrane energization in Staphylococcus epidermidis affects cell adhesion to polystyrene surface / V.P. Korobov, D.V. Eroshenko, L.M. Lemkina, T.V. Poludova, L B. Filatova // Abstracts of the International conference «Biofilms IV». - Paris, France. - 2012. - P. 70.

6. Ерошенко, Д.В. Действие этанола на адгезивные свойства бактерий Staphylococcus epidermidis 33 / Д.В. Ерошенко, Л.М. Лемкина, В.П. Коробов // Тезисы докладов 17-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино. - 2013. - С. 16.

7. Eroshenko, D.V. Lysozyme and proteases' effect on Staphylococcus epidermidis adhesion / D.V. Eroshenko, L.M. Lemkina, V.P. Korobov // Abstracts of the 5th Congress of European Microbiologists «FEMS 2013». - Leipzig, Germany. - 2013. - P. 79.

8. Ерошенко, Д.В. Влияние двухвалентных ионов цинка и марганца на адгезию бактерий Staphylococcus epidermidis / Д.В. Ерошенко, Л.М. Лемкина, В.П. Коробов // Тезисы докладов VI Всероссийского с международным участием Конгресса молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013». - Иркутск. - 2013. - С. 72-74.

9. Ерошенко, Д.В. Эффект экзогенной ДНК на адгезию бактерий Staphylococcus epidermidis / Д.В. Ерошенко, Л.М. Лемкина, В.П. Коробов // Тезисы докладов 18-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино. - 2014. - С. 203-204.

10. Eroshenko, D.V. The effect of low molecular weight cationic peptides on Staphylococcus epidermidis adhesion / D.V. Eroshenko, L.M, Lemkina, I.A. Morozov, V.P. Korobov // Abstracts of the International conference «Biofilms VI». - Vienna, Austria. -2014. - P. 45.

11. Eroshenko, D.V. Post-antibacterial effect of two cationic peptides on staphylococcal biofilm / D.V. Eroshenko, V.P. Korobov // Abstracts of the 111 International Conference on Antimicrobial Resistance «ICAR-2014». - Madrid, Spain. - 2014. - P. 232.

12. Ерошенко, Д.В. Активация сорбции бактерий Staphylococcus epidermidis аутогенными низкомолекулярными факторами/Д.В. Ерошенко, К.С. Лауринявичус, В.П. Коробов // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». -Москва.-2014.-С. 89.

ЕРОШЕНКО Дарья Владимировна

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ПЕРВЫЕ ЭТАПЫ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЯМИ STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS

03.02.03 Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать . Формат 60x90/16.

Усл.печ.л. 1. Тираж 120 экз. Заказ Набор компьютерный

Отпечатано в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13