Получение мутантов Burkholderia cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo

Андреев, Александр Львович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение мутантов Burkholderia cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение мутантов Burkholderia cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo"

Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф

РАМН

На правах рукописи

Андреев Александр Львович

Получение мутантов Burkholderia cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo

03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

. Гамалеи

UU3476BOY

Москва 2009

003476807

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских наук, Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН

Научный руководитель:

д.б.н, проф. Юлия Михайловна Романова.

Официальные оппоненты:

д.м.н, проф. Бондаренко Виктор Михайлович

д.б.н, проф. Хмель Инесса Александровна

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт

трансплантологии и искусственных органов Росздрава.

Защита диссертации состоится « ¿тч» октября 2009 г. в 11 час. на заседании Диссертационного Совета Д 001.007.01 при НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (12309 г. Москва, ул. Гамалеи, 18)

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Автореферат разослан « / » сентября 2009 года.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета д.м.н, проф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Исследования последнего десятилетия показали, что более 99 % бактерий существуют в природной среде и в организмах хозяев в виде сложно организованных сообществ - биопленок. Такой образ жизни является основной стратегией их выживания. Биопленки могут быть сформированы популяциями как одного вида бактерий, так и сообществом многих видов микробов. Современные микроскопические методы показали, что биопленки имеют сложную архитектуру: бактерии в биопленке заключены в экзополимерный матрикс, который содержит каналы, наполненные жидкостью, через которые происходит приток питательных веществ и кислорода и выведение продуктов метаболизма. Главным компонентом матрикса являются экзополисахариды, в его состав также входят белки, нуклеиновые кислоты и другие вещества [Ильина Т.С., Романова Ю.М., с соавт., 2004].

Изучение биопленок вызывает огромный интерес исследователей в последние годы в силу того, что этот способ существования бактерий создает большие проблемы в медицинской практике: установлено, что многие хронические инфекции, возникновение которых связано с использованием медицинского имплантированного оборудования - линз, катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, - обусловлены способностью бактерий расти в виде биопленок на поверхностях этих устройств. Причем, будучи организованными в биопленочные сообщества, бактерии проявляют большую устойчивость к действию антибактериальных препаратов, в том числе антибиотиков, факторов иммунной защиты организма и неблагоприятных факторов среды [Ооп1ап 11.М., Соз1егк>п 1.\У., 2002].

Объект нашего исследования - бактерии ВигМгоМепа сепосераЫа -являются одним из возбудителей, вызывающих тяжелые легочные инфекции у иммунодефицитных пациентов и у больных с наследственным заболеванием -кистозным фиброзом легких (КФ). Интенсивные исследования этого возбудителя в последнее время позволили определить у него следующие

факторы патогенности: кабельные пили, сидерофоры, липазы, гемолизины, экзополисахариды (EPS), биопленки [Sajjan U.S., Sun L., v et al., 1995; Visser M.B., Majumdar S., et al., 2004; Kooi C., Subsin В., et al., 2006; Hutchison M.L., Poxton I.R., et al., 1998; Cunha M.V., Sousa S.A., et al., 2004]. Вклад каждого из этих факторов в общую патогенность Burkholderia sp. все еще недостаточно определен. Поскольку тяжелые хронические легочные патологии, вызываемые В. cenocepacia у обширной группы иммунодефицитных людей, обусловлены способностью возбудителя формировать биопленки и поскольку проблема лечения этой инфекции остается актуальной и в нашей стране, и за рубежом, изучение процесса образования биопленок и его генетического контроля как основа для разработки способов борьбы с ними является одной из актуальных проблем современной инфектологии. Изучение механизмов образования биопленок этими бактериями должно внести существенный вклад в поиск мер профилактики и защиты против патогенов путем создания нового класса антимикробных препаратов, способных ингибировать патогенные свойства бактерий или препятствовать процессу образования биопленок.

Одним из подходов к изучению процесса образования биопленок является получение мутантов, влияющих на этот процесс, и их комплексное изучение.

Цель работы: получение мутантов бактерий В. cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo.

В соответствии с поставленной целью в процессе выполнения диссертационной работы предстояло решить следующие задачи:

1. изучение способности бактерий В. cenocepacia формировать биопленки и отработка методик качественной и количественной оценки этого процесса;

2. получение мутантов В. cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок методом инсерционного мутагенеза;

3. сравнительная электронно-микроскопическая характеристика полученных мутантов.

4. клонирование фрагментов мутантных генов, содержащих инсерцию пласпозона;

5. секвенирование клонированных фрагментов и идентификация мутантных генов с помощью баз данных; протеомный анализ;

6. изучение in vivo динамики инфекционного процесса, вызываемого полученными мутантными штаммами на биологической модели заражения лабораторных животных.

Научная новизна.

На основе комплексного подхода при исследовании процесса формирования биопленок бактериями В. cenocepacia выявлены три гена, принимающие участие в генетическом контроле процесса образования биопленок: ompR и tetR, кодирующие глобальные регуляторы транскрипции, и ген cydB, кодирующий субъединицу I цитохром bd убихинол оксидазы. Впервые показано участие этих генов в генетическом контроле процесса образования биопленок у В. cenocepacia.

Впервые при использовании протеомного анализа показана дифференциальная экспрессия белка шаперона GroEL у штаммов с различной способностью к образованию биопленки. Это дает возможность предполагать роль этого белка в генетическом контроле процесса формирования биопленок бактериями В. cenocepacia.

Выявлена наиболее чувствительная к инфекции В. cenocepacia линия мышей I/St, позволяющая проводить сравнительные исследования динамики инфекционного процесса, вызываемого различными штаммами этого возбудителя. С использованием этой линии мышей впервые экспериментально показана зависимость более длительной персистенции бактерий В. cenocepacia в органах зараженных животных in vivo от способности возбудителя к формированию биопленок, определяемой in vitro.

Впервые при проведении патоморфологических исследований легких мышей, инфицированных штаммом с повышенной способностью к образованию биопленки, на поверхности альвеол наблюдали окрашенную эозином биопленку. Впервые в биологической модели показано, что способность к образованию биопленок у бактерий В. cenocepacia обусловливает воспалительный процесс в легких, длительную персистенцию возбудителя в организме экспериментальных животных, что может приводить к гибели мышей.

Практическая значимость.

Получена коллекция штаммов В. cenocepacia с различной способностью к образованию биопленок, которые хранятся в лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Определен комплекс методов и подходов для характеристики полученных мутантов in vivo и in vitro, что позволит оценивать степень влияния различных лекарственных средств на способность образовывать биопленки различными видами бактерий.

Положения, выносимые на защиту.

1. Процесс образования биопленок патогенными бактериями подвержен сложному генетическому контролю. Методом инсерционного мутагенеза получены мутанты В. cenocepacia как с пониженной, так и с повышенной способностью к образованию биопленок. 3 мутантных гена идентифицированы и впервые показано участие генов, ompR и tetR, кодирующих глобальные транскрипционные регуляторы OmpR и TetR, соответственно и гена cydB, кодирующего важный дыхательный фермент бактерий, цитохром bd убихинол оксидазу, в регуляции процесса формирования биопленок бактериями В. cenocepacia. Показана дифференциальная экспрессия гена groE в штаммах с мутациями cydE и отрК, что предполагает роль белка GroEL в процессе формирования биопленок бактериями В. cenocepacia.

2. На биологической модели заражения мышей наиболее чувствительной к инфекции В. cenocepacia линии мышей I/St in vivo показано, что повышенная

способность к формированию биопленок у мутантного штамма суйК, приводит к более длительной персистенции бактерий в органах зараженных животных и вызывает воспалительный процесс в легких.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на международной конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», Пущино, 2006; 16-ом Международном Конгрессе по Клинической Микробиологии и Инфекционным Заболеваниям (Ницца 2006); 12-ом Международном симпозиуме по Микробной Экологии (1БМЕ-12, Керне, Австралия 2008).

Апробация диссертации состоялась на конференции отдела Генетики и Молекулярной биологии бактерий 2 апреля 2009 года.

Публикации.

По результатам исследований опубликовано 8 научных работ, 5 из которых в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из «Введения», шести глав «Обзора литературы», описания «Материалов и Методов», шести глав «Собственных исследований», «Обсуждения», «Выводов» и «Списка литературы» (15 отечественных и 168 зарубежных источников). Работа изложена на 115 страницах, иллюстрирована 8 таблицами, 15 рисунками.

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов. Электронно-микроскопические исследования выполнялись совместно с сотрудниками лаборатории анатомии микроорганизмов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (рук. лаб. д.м.н. Диденко Л.В) и с.н.с. НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова к.б.н. Галкиной С.И. Определение нуклеотидных последовательностей мутантных генов было выполнено в центре коллективного пользования «Геном» в институте

молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Протеомный анализ мутантных штаммов был проведен в НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН.

Исследования поддерживались Российским Фондом Фундаментальных Исследований, грант № 05-04-49379.

Штаммы бактерий, плазмиды и условия выращивания бактериальных культур.

В экспериментах использовали: штамм В. cenocepacia 370, геномовара IIIA (клинический изолят, выделенный от больного в госпитале им. H.H. Бурденко); штаммы Е. coli CCI 18 (к pir), несущий пласпозон (плазмида/транспозон) pTnMod-RKm и Е. coli S17-1 (к pir) (получены от д.б.н., проф. И.А. Хмель (Институт молекулярной генетики)).

Бактериальные культуры выращивали в жидкой или на агаризованной среде Luria-Bertani (LB-arap) фирмы «DIFCO», США, при 28-30°С для В. cenocepacia и при 37°С для Е. coli. При культивировании мутантов в среды выращивания добавляли антибиотики канамицин и гентамицин в конечных концентрациях 100 мкг/мл и 10 мкг/мл, соответственно. Для проверки физиологических свойств бактерий использовали специальную среду BCSA, а также кровяной агар с добавлением эритроцитарной массы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение мутантов с нарушенной способностью к образованию

биопленок.

Для выявления генов, участвующих в генетическом контроле процесса образования биопленок, был применен подход, используемый для изучения генетического контроля любого процесса - получение мутантов с нарушением данного процесса.

Для получения мутантов был применен метод ненаправленного

инсерционного мутагенеза, позволяющий получать большое количество

мутантных клонов за счет интеграции в геном реципиентного штамма мигрирующего генетического элемента - пласпозона pTnMod-RRm.

Пласпозон pTnMot/-RKm - это плазмида, в состав которой, кроме транспозона с инвертированными повторами (IR), гена устойчивости к антибиотику канамицину (Km), входит orí репликации и участки с множественными сайтами рестрикции. Пласпозон способен полностью встраиваться в любое место хромосомы, приводя к инсерционной мутации. В дальнейшем пласпозон можно вырезать по сайтам рестрикции с фрагментом хромосомы хозяина, лигировать сам на себя и клонировать в Е. coli. При этом в Е. coli он будет существовать в виде самореплицирующейся плазмиды. Схема строения пласпозона приведена на рис. 1.

Рис. 1 Схема строение пласпозона pTnMod-RKm (идентификационный номер в базе данных Gene Bank - AF061930)

В качестве исходного штамма для мутагенеза был выбран выделенный у иммунодефицитного больного изолят В. cenocepacia - штамм 370, поскольку он является типичным представителем своего вида, обладает выраженной гемолитической, хитинолитической и протеолитической активностями, обладает системой QS, способен к образованию биопленок и чувствителен к антибиотику канамицину, что необходимо для селекции мутантов.

После конъюгационного скрещивания реципиентного штамма 370 с донорным штаммом Е. coli CCI 18, несущим пласпозон pTnM>û?-RKm, было отобрано более 1000 инсерционных клонов с внедренным в геном пласпозоном.

Анализ процесса формирования биопленок мутантами.

Все полученные иясерционные мутанты проверяли на способность бактерий к формированию биопленок. Для этого, сначала проводили визуальный скрининг штаммов на способность к образованию биопленок в микротитровальных планшетах. Мутанты в течение двух суток выращивали в лунках микротитровальных планшетов, затем отмывали планктонные клетки от клеток, прикрепившихся к поверхности лунок, и окрашивали образованные биопленки красителем кристалл виолетом, затем визуально оценивали образовавшееся кольцо биопленки на боковой поверхности лунки.

На рис. 2 в виде синих колец видны окрашенные кристалл виолетом биопленки различных клонов В. cenocepacia, образованные в лунках полистиролового 96-луночного планшета. Мутант с повышенной способностью образовывать биопленку отличается от контрольного штамма 370 более яркоокрашенными «кольцами», а мутант, характеризующийся отсутствием способности образовывать биопленку, менее интенсивно окрашен, в сравнении с контрольным штаммом.

йяеерциоиный огон -

суперпродудеш-

ояссшенкн

Рис. 2 Биопленки, продуцируемые различными штаммами ЪигкЬоЫепа сепосерасга в лунках микротитровальных планшетов (визуальный анализ).

Фан (К-)

ИнссршгонЕый югон -не образует

В. cenoct>[iacia шгазш 370 (КН)

В результате визуального скрининга мы отобрали 36 клонов, которые при повторных опытах постоянно значительно лучше или хуже родительского штамма образовывали биопленки.

Далее мы провели количественный анализ способности образования биопленок отобранными мутантами. Для этого краситель экстрагировали из сформированных биопленок спиртом, и интенсивность окрашивания оценивали в спектрофотометре.

На рис. 3, 4 представлены результаты количественной оценки способности к образованию биопленок разными мутантными клонами по сравнению с исходным штаммом В. сепосераЫа.

инсерционные клоны

1 2 3

штаммы В. сепосерааа

а инокуляция культуры

□ планктонные клетки через 1 сутки

О планктонные клетки через 2 суток

шбиопленка

Рис. 3,4 Количественный (спектрофотометрический) анализ способности полученных инсерционных клонов формировать биопленки в 96-луночных пластиковых планшетах(З). То же для отобранных 3-х мутантов (4). По оси абсцисс светлые столбики - оптическая плотность культуры планктонных клеток после 12-часового роста, темные - оптическая плотность окрашенного спирта после обработки биопленок, по оси ординат - оптическая плотность при длине волны 540 нм (СЮ 540).

В итоге для дальнейшего анализа мы отобрали 3 наиболее фенотипически стабильных мутанта - один не образующий биопленки и два со значительно повышенной способностью к ее образованию (рис. 4).

Сравнительное морфологическое изучение мутантных штаммов.

С помощью ультратонких срезов и негативного контрастирования совместно с лабораторией анатомии микроорганизмов было показано, что клетки в биопленках, в отличие от планктонных клеток, имеют гетерогенную структуру, что свидетельствует об их различном физиологическом состоянии (рис. 5 а).

Рис. 5 Ультратонкие срезы биопленки, образованной на полистироле а - Клетки 1 (=>) и второго (Т ) типов Ув. 5 ООО; б - Клетки, упакованные в чехол (t) Ув. 5 400; в - Мембранные структуры (Т) - компонент биопленки Ув. 4 800.

У штаммов, способных образовывать биопленки, клетки лежат в волокнистой ячеистой структуре (рис. 5 б, в), образующей капсулы и чехлы, отсутствующие у мутанта, неспособного образовывать биопленки.

Общий вид биопленки, образуемой родительским штаммом 370, был получен методом сканирующей электронной микроскопии. Хорошо видна типичная структура биопленки, покрытой плотным матриксом (рис. 6 а). На рис. 6 б видны грибовидные образования, типичные для структуры биопленки.

Рис. 6 Фотографии биопленки, полученной в сканирующем электронном микроскопе.

Таким образом, использование различных микроскопических техник позволило нам визуально оценить структурную организацию биопленок, образованную исследуемыми нами мутантными штаммами.

Идентификация генов, принимающих участие в образовании биопленок.

Следующим этапом работы необходимо было идентифицировать гены, мутации в которых привели к нарушению процесса образования биопленок.

Для этого была осуществлена следующая последовательность экспериментов:

1. клонирование фрагментов мутантных генов, граничащих с внедренным пласпозоном pTnMrá-RKm, при использовании маркера пласпозона канамицинрезистентности в качестве селективного при отборе клонов с инсерцией пласпозона в ген.

2. определение нуклеотидной последовательности фрагментов мутантных генов и их идентификация после сравнения с базами данных Gene Bank.

Оказалось, что последовательность ДНК, определенная для мутанта, характеризующегося отсутствием способности формировать биопленки, на 94 % совпадает с последовательностью гена ompR, являющегося глобальным транскрипционным регулятором. Последовательность другого мутантного гена, который характеризовался увеличенной по сравнению с контролем

способностью формировать биопленку, на 95% гомологична участку гена tetR, продукт которого также представляет собой белок, являющийся членом семейства транскрипционных регуляторов TetR. Последовательность еще одного из полученных мутантных генов, также характеризующегося значительным увеличением способности формировать биопленки, на 97 % совпадает с последовательностью гена cydB, кодирующего субъединицу I цитохром bd убихинол оксидазы.

Из табл. 1 видно, что мутант отрК, статистически достоверно, почти в 5 раз менее интенсивно образует биопленку, а у мутантов tetR' и cydB' эта способность увеличена более чем в 1,5 раза. Все три идентифицированные последовательности зарегистрированы в базе Gene Bank и имеют соответствующие номера.

Таблица 1.

Идентифицированные мутантные гены В. cenocepacia.

Идентифицированные мутантные гевы Функция идентифицированного гена Отношения интенсивности формирования биопленок (мутант/дикий тип) Зарегистрированные последовательности в базе данных Gene Bank

ompR Глобальный транскрипционный регулятор OmpR 0Д7±0,06 EF446373

tetR Транскрипционный регулятор (репрессор) семейства TetR 1,56±0,22 EU078682

cydB Субъединица I цитохром bd убихинол оксидазы 1,64±0,11 EU046374

Известно, что процесс образования биопленок у бактерий контролируется регуляторной системой Quorum sensing (QS). Как было показано в лаборатории, у полученных нами мутантов система QS не нарушена. Два из идентифицированных нами гена оказались известными генами глобальных регуляторов транскрипции, которые регулируют работу множества разных генов. Такой сложный физиологический процесс, как образование биопленки,

конечно, должен регулироваться и другими системами глобальной регуляции, кроме QS. Так, для Е. coli показано, что только на ранней стадии образования биопленки участвуют три глобальных регулятора, одним из которых является OmpR. Глобальные регуляторы семейства TetR также определяют работу некоторых генов, важных для образования биопленок у некоторых видов бактерий. Для В. cenocepacia участие этих регуляторных генов, а также гена cydB, не являющегося геном системы глобальной регуляции, ранее показано не было.

Протеомный анализ штамма 370 и мутантов отрК и cydK.

Для того чтобы определить, синтез каких белков нарушается из-за мутаций в генах глобальных регуляторов, нами был проведен протеомный анализ двух мутантных штаммов отрК и cytK с помощью сотрудников группы протеомного анализа ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН.

Оказалось, что у мутанта отрК, характеризующегося потерей способности к образованию биопленок, супрессирован синтез ряда белков (табл. 2). У штамма с мутацией в гене cydff, не являющемся глобальным регулятором, была обнаружена суперэкспрессия единственного белка - шаперона GroEL (табл. 2).

Таблица 2.

Идентифицированные белки мутантных штаммов В. cenocepacia с измененным

уровнем экспрессии

ompR' Репрессированные белки: шаперон GroEL (groE); фосфоманномутаза РММ (algC); аланин-радемаза (dadB); рибосомальный белок S2; белок биосинтеза убихинона COQ7-подобный; 2,3,4,5-тетрагидропиридин-2-карбоксилат N-сукцинилтрансфераза; 5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеин S-метилтрансфераза; фосфопируват гидратаза; фактор элонгации Tu (EF-Tu) (tuf); Т-белок, компонент системы расщепления глицина

cydE Сверхэкспрессированные белкп: шаперон GroEL (groE)

Таким образом, в результате протеомиого анализа выяснилось, что у мутанта отрК, характеризующегося отсутствием способности к образованию биопленки синтез белка GroEL репрессирован, а у мутанта cydB~, с повышенной способностью к образованию биопленок единственным отличием от родительского штамма является сверхэкспрессия этого белка. Это дало нам основание предположить важную роль этого белка в процессе формирования биопленок у В. cenocepacia. GroEL-подобные белки являются молекулярными шаперонами. Шапероны - высоко консервативные белки, которые играют важную роль в физиологии различных клеток. Одни шапероны могут помогать транспортировать белки через мембраны и способствовать фолдингу белков, в то время как другие могут играть ключевую роль в сборке компонентов клеточной поверхности, таких как фимбрии. Фимбриальные структуры участвуют в бактериальном патогенезе, способствуя прикреплению к ткани хозяина. Повышенная адгезивная способность мутанта за счет повышенной экспрессии гена groE может способствовать и процессу формирования биопленок у В. cenocepacia.

Для некоторых белков, синтез которых репрессирован в клетках мутанта отрК, можно предположить роль в процессе формирования биопленок. Так, фермент фосфоманномутаза (РММ) участвует в синтезе альгината, структурного компонента биопленки у Pseudomonas aeruginosa. Фактор элонгации EF-Tu, помимо основной своей функции - элонгации полипептидной цепи, у разных видов лактобактерий является адгезином, определяющим прикрепление и колонизацию бактериальными клетками слизи и клеток слизистой оболочки кишечника, а у Mycoplasma pneumoniae связывает бактериальные клетки с фибронектином, компонентом межклеточного матрикса. Вполне возможно участие EF-Tu на начальных этапах адсорбции клеток на поверхности для образования биопленок.

Сравнительная характеристика инфекционного процесса, вызванного мутантными штаммами В. cenocepacia.

Поскольку образование биопленки было показано при легочных заболеваниях людей, вызванных В. cenocepacia, изучение инфекционного процесса в биологических моделях является одной из важнейших сторон комплексной характеристики мутантов.

Тем не менее, адекватной биологической модели для В. cenocepacia нет, так как лабораторные животные не погибают, и, практически, не болеют при заражении их штаммами буркхолдерий. Методом трансгенного мутагенеза получена и описана линия мышей с нокаутированным геном трансмембранного регулятора КФ (мыши Cftr~'~). К сожалению, в наших питомниках такой линии мышей нет. Альтернативой является метод получения иммунодефицитных животных. Однако сложность и длительность их подготовки значительно затрудняет использование их для объемных экспериментов. Поэтому мы попытались найти линию мышей, которая была бы наиболее чувствительна к исследуемому нами возбудителю и на которой мы могли бы продемонстрировать различия в течение инфекционного процесса, вызванного мутантами. Для этого мы провели эксперименты по внутрибрюшинному заражению мышей четырех известных линий, две из которых - BLACK, BALB/c, характеризуются наличием мутации NRAMP, приводящей к повышенной чувствительности к некоторым инфекциям, и две другие линии - I/St и A/Sn, полученные в лаб. проф. Апта A.C. в Центральном Институте Туберкулеза и характеризующиеся различной чувствительностью к туберкулезу и некоторым другим инфекциям. В качестве критериев оценки чувствительности сравниваемых линий к инфекции буркхолдериями нами были выбраны показатели высеваемости бактерий из органов животных и отношение массы легкого к массе тела инфицированного животного (табл. 3, рис 7).

Таблица 3.

Динамика высеваемости бактерий из селезенок и легких различных штаммов (BLACK, BALB/c, I/St, I/Sn) после впутрибрюшинной инокуляции животных 0,5 мл дозой 3107 КОЕ/мышь В. cenocepacia 370.

линия мышей Высеваемость бактерий из органов Отношение массы легких к массе тела мышей тлепс./ттела (Р < 0,05)

2 день 5 день

селезенка селезенка легкие

BLACK 3 104 4102 5102 0,009

BALB/c 2104 5101 ПО3 0,01

I/St 7,5104 1,6-102 710J 0,008

A/Sn 1,5104 ПО1 2Ю1 0,007

80000

| 60000

I 40000

^ 20000

В BLACK ■ BALB/C

□ I/St

□ A/Sn

2дня, селезенка

5дней,селезенка 5дней,легкие

Рис. 7 Динамика высеваемости бактерий из селезенок и легких мышей различных линий (BLACK, BALB/c, I/St, I/Sn) после внутрибрюшинной инокуляции животных дозой 3107 КОЕ/мышь В. cenocepacia 370.

Результаты эксперимента показали, что по критерию отношения массы легких к массе тела между линиями разницы практически не было, а по критериям высеваемости бактерий из органов, наиболее чувствительной из четырех проверенных оказалась линия мышей I/St. Чувствительность заключалась в том, что бактерии в большем количестве высевались из органов мышей этой линии по сравнению с другими линиями (табл. 3, рис. 7). Линию мышей I/St мы и использовали в дальнейших сравнительных экспериментах.

Далее мы определяли сроки персистенции бактерий мутантных штаммов в легких и селезенках мышей линии I/St при дозе заражения 2,5 107 КОЕ/мышь. Оказалось, что, несмотря на внутрибрюшинный способ заражения, легкие, а не селезенка являются предпочтительным местом локализации бактерий, и все проверенные нами штаммы сохранялись в органах мышей в течение 10 дней. Клетки штаммов, лучше образующих биопленки, сохранялись в организме в

заметно большем количестве, чем клетки родительского штамма или штамма со сниженной способностью образовывать биопленки (табл. 4).

Таблица 4.

Динамика высеваемости бактерий из легких и селезенок мышей линии I/St при внутрибрюшинном заражении культурами мутантных штаммов В. cenocepacia.

Штамм Высеваемость бактерий из органов (КОЕ/мышь)

3-й день 10-й день

селезенка легкие селезенка легкие

370 1,910J 2,510J 4 210'

ompR' 1,210J 1,410' 0 210'

cydB' 310J 3,41 (У 14 7102

tetR' 2,5 10J 3,8103 20 8102

Внутрибрюшинное заражение животных позволяет полностью ввести рассчитанную дозу животному и проследить дальнейшее развитие бактерий в организме, однако для возбудителей инфекций, развивающихся в дыхательных путях, более естественным является интраназальный способ заражения. Для сравнения культур мутантного штамма отрК, не образующего биопленки, и мутантного штамма cydB\ ярко выраженного суперпродуцента биопленок взрослым особям (20-24г) линии I/St интраназально вводили культуры бактерий в дозе 2107 КОЕ/мышь. Учет высеваемости контролировали в течение 25 суток после инфицирования (табл. 5, рис. 8).

Таблица 5.

Динамика высеваемости бактерий нз легких и селезенок мышей линии I/St после интраназального заражения их мутантными штаммами В. cenocepacia.

Штамм

Время после заражения от pR' I cydB'

легкие селезенка легкие селезенка

1 час 2105 0 4105 0

1 день 310J 10 7,510J 1,610'

5 день ПО4 510' 510" 610'

15 день 4 10' 2 4102 2101

25 день 1,1Ю2 0 3,4102 210'

15день 25день

высвваемость бактерий из легких

Рис. 8 Динамика высеваемости бактерий из легких и селезенок мышей линии I/St после интраназального заражения их мугантными штаммами В. cenocepacia.

Результаты, представленные в табл. 5 и на рис. 8 показывают, что бактерии сохраняются и обнаруживаются не только в легких, но и в селезенках j мышей. При этом количество клеток штамма cydB', высевающихся из органов зараженных животных, на всех сроках наблюдения в 2-10 раз больше J количества высевающихся клеток мутанта отрК, не образующего биопленки. Кроме того, клетки штамма отрК полностью выводятся из селезенки к концу срока наблюдения. В повторных и более длительных по срокам наблюдения экспериментах нами были подтверждены полученные закономерности.

Несмотря на использование высоких доз при внутрибрюшинном способе заражения (до 1'109 КОЕ/мышь) нам не удалось вызвать развитие острой инфекции у взрослых мышей (20-24 г) ни одной линии. Единичная гибель наблюдалась у мышей лишь при заражении штаммами с повышенной способностью к образованию биопленок. При определении LD50 условно патогенных бактерий часто используют молодых незрелых животных. Поэтому, мы также попробовали определить LD50 при внутрибрюшинном заражении ювенильных мышей (10-12 г.) линии I/St. Была показана 100% гибель животных в течение первых суток при внутрибрюшинном заражении штаммом cydB' в дозе 5108 КОЕ/мышь. Заражение родительским штаммом даже в дозе 1109 КОЕ/мышь вызывало лишь 20 % гибель в течение 10 дней, а у выживших животных признаки заболевания исчезали (табл. 6). Таким образом, при использовании молодых животных выбранной нами линии I/St

экспериментально была показана 100 % гибель животных при заражении их клетками мутанта с повышенной способностью к образованию биопленки.

Таблица 6,

Летальность ювенильных мышей линий I/St при внутрибрюшиниом заражении штаммами 370 и cydB '.

Штамм 370 Штамм cydB

Дозы заражения (КОЕ/мышь) НО8 5108 НО9 1 10s 5108 110'

Летальность (%) 0 20% 20% 0 100% 100%

Патоморфологические исследования легких инфицированных мышей.

Для определения причин гибели мышей совместно с сотрудниками лаборатории электронной микроскопии было проведено патоморфологическое исследование легких зараженных животных. Сегменты выделенных легких окрашивали гематоксилином и эозином. Было показано, что в легких зараженных мышей происходят воспалительные процессы, инфильтрация альвеол и стромы легкого лейкоцитами, выход лейкоцитов из сосудов и скопление их вокруг бронхиол (рис. 9, 10 и 11).

Рис. 9 Окрашенный участок легкого нормальной мыши, после инокуляции PBS. а) Хорошо аэрированная легочная ткань, просветы внутрилегочных бронхов и бронхиол расправленные и свободные. Ув. 100 X; б) Легочная паренхима. Хорошо видны четкие межальвеолярные границы. Ув. 200 X.

Рис. 10 Окрашенный участок легкого мышей линии I/St. после заражения штаммом 370. а) Четко видно хорошо аэрированные (справа) и плохо аэрированные (слева) части легкого. Ув. 32 X; б) Альвеолы разглажены, капилляры более расширены. Это показатель сурфактантной патологии; в) Наблюдается выход лейкоци юь из сосудов и их аккумуляция вокруг бронхиол (стрелки). Ув. 32 X.

Кроме того, впервые на поверхности альвеол легких мышей была обнаружена окрашенная эозином пленка. Вероятно, это бактериальная биопленка, образованная возбудителем В. сепосерас1а (рис. 11 в).

Рис. 11 Окрашенный участок легкого мышей линии I/St, после заражения штаммом cydR.

а) Вид альвеол и стромы, инфильтрованной лейкоцитами. У в. 100 X,

б) Выход лимфоцитов из вен. Ув. 400 X,

в) Видна окрашенная эозином пленка неизвестного происхождения, возможно биопленки (стрелка). У в. 1000Х

г) Воспалительная инфильтрация лейкоцитов и их скопление вокруг бронхов, что свидетельствует о воспалительной реакции; видны макрофаги. У в. 1000 X.

выводы

1. Методом инсерционного мутагенеза получено более 1000 инсерционных клонов Burkholderia cenocepacia со случайным внедрением пласпозона pTnMod-RKm в хромосому. Тотальная проверка инсерционных клонов позволила выделить 36 мутантов с измененной способностью к формированию биопленки и у 3-х мутантов идентифицировать мутантные гены.

2. Клонирование фрагментов мутантных генов, содержащих инсерцию пласпозона, и секвенирование клонированных фрагментов, позволило впервые идентифицировать три гена ompR, cydB и tetR, участвующих в регуляции процесса образования биопленок у В. cenocepacia.

3. С помощью протеомного анализа показана дифференциальная экспрессия гена groE в штаммах с мутациями cydR и отрК, что предполагает роль белка GroEL в процессе формирования биопленок бактериями В. cenocepacia.

4. Трансмиссионный электронно-микроскопический анализ позволил выявить ультраструктурные особенности строения организации биопленок, образуемых родительским и мутантными штаммами В. cenocepacia.

5. Выявлена наиболее чувствительная к инфекции В. cenocepacia линия мышей, позволяющая проводить сравнительные исследования динамики инфекционного процесса, вызываемого различными штаммами В. cenocepacia.

6. Экспериментально in vivo показана более длительная персистенция в органах зараженных животных мутанта cydK с повышенной способностью к образованию биопленок по сравнению с исходным штаммом и другими мутантными штаммами.

7. Патоморфологические исследования показали, что в легких мышей, зараженных бактериями мутанта cydBí с повышенной способностью к формированию биопленок, происходят воспалительные процессы, проявляющиеся в инфильтрации альвеол и стромы легкого лейкоцитами и их скопление вокруг бронхов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Смирнова Т.А., Андреев АЛ., Гтцбург АЛ. Способность к формированию биопленок у различных штаммов Salmonella typhimurium. // Микробиология. - 2006. - № 4. - С. 38-42.

2. Романова Ю.М., Смирнова Т.А., Андреев АЛ., Ильина Т.С., ДиденкоЛ.В. Образование биопленок - пример «социального» поведения бактерий. //Микробиология. - 2006. Т. 75. № 4. - С. 1-6.

3. Смирнова ТА., Диденко Л.В., Андреев АЛ., Алексеева Н.В., Степанова Т.В., Романова ЮМ Электронно-микроскопическое изучение биопленок, образуемых бактериями Burkholderia cepacia // Микробиология. - 2008. Т. 77. № 1. - С. 1-8.

4. Каминская А.А., Пушкарева В.И., Ермолаева С.А., Степанова Т.В., Алексеева Н.В., Андреев АЛ. Роль ассоциации простейших Tetrahimena periformis и бактерий Burkholderia cepacia в формировании биопленок. // Успехи соврем, биологии. - 2007. Т. 127. №1.- С. 44-49.

5. Romanova YilM., Alekseeva N. V., Smirnova T.A., Andreev AL, Didenko L. V., Gintsburg A.L. «Biofilm production by different strains of Salmonella typhimurium: genetics, morphology and role of surface and nutrient content of medium»// 16й1 European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Nice. France. - 2006.

6. Romcmova J.M., Alekseeva N.V., Smirnova T.A., Andreev AL, DidenkoL.V. «Biofilm production by different strains of Salmonella typhimurium: genetics and morphology». // 11th International symposium on Microbial Ecology - ISME-11. Vienna. Austria. - 2006.

7. Romanova YuM, Goryachev S.N., Alexeeva N. V., Stepanova Т. V., Andreev AL, Gintsburg AL. «The Genetic Control of Biofilm Formation by Burkholderia cenocepacia» // 12th International Symposium on Microbial Ecology - ISME-12. Cairns. Australia. -2008.-P.740.

8. Романова Ю.М., Степанова Т.В., Нестеренко Л.Н., БалунецД.В., Андреев АЛ. Персистенция бактерий Burkholderia cenocepacia in vivo в зависимости от их способности к образованию биопленок. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. №4. - С. 29-33.

Заказ №585. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Андреев, Александр Львович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Биопленки: феномен, история вопроса.

Глава 2. Методы исследования биопленок.

2. I. Микроскопические методы.

2. 2. Генетические методы.

Глава 3. Характеристика бактерий рода Burkholderia.

Глава 4. Генетический контроль процесса образования биопленок

4. 1. Роль регуляторной системы «quorum sensing» в образовании биопленок

4. 2. Стадии процесса образования биопленок и их генетический контроль

Глава 5. Роль клеточных структур в формировании биопленок.

Глава 6. Значение биопленок в патогенезе хронической инфекции

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 7. Материалы и методы.

7. 2. Световая микроскопия.

7. 3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

7. 4. Инсерционный мутагенез.

7. 5. Анализ формирования биопленок.

7. 6. Выделение ДНК, клонирование.

7. 7. Протеомный анализ.

7.8. Трансмиссионная электронная микроскопия.

7. 9. Заражение лабораторных животных.

7. 10. Статистическая обработка результатов.

Глава 8. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

8. 1. Получение мутантов с нарушенной способностью к образованию биопленок.

8. 2. Идентификация генов, принимающих участие в образовании биопленок.

8. 3. Протеомный анализ штамма 370 и полученных мутантов.

8. 4. Сравнительное морфологическое изучение мутантных штаммов.

8. 5. Сравнительная характеристика инфекционного процесса, вызванного мутантными штаммами В. cenocepacia.

8. 6. Патоморфологические исследования. легких инфицированных мышей.

Глава 9. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение мутантов Burkholderia cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo"

Исследования последнего десятилетия показали, что более 99 % бактерий существуют в природной среде и в организмах хозяев в виде сложно организованных сообществ — биопленок. Такой образ жизни является основной стратегией их выживания. Биопленки могут быть сформированы популяциями как одного вида бактерий, так и сообществом многих видов микробов. Современные микроскопические методы показали, что биопленки имеют сложную архитектуру: бактерии в биопленке заключены в экзополимерный матрикс, который содержит каналы, наполненные жидкостью, через которые происходит приток питательных веществ и кислорода и выведение продуктов метаболизма. Главным компонентом матрикса являются экзополисахариды, в его состав также входят белки, нуклеиновые кислоты и другие вещества [Ильина Т.С., Романова Ю.М., с соавт., 2004].

Изучение биопленок вызывает огромный интерес исследователей в последние годы в силу того, что этот способ существования бактерий создает большие проблемы в медицинской практике: установлено, что многие хронические инфекции, возникновение которых связано с использованием медицинского имплантированного оборудования — линз, катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, - обусловлены способностью бактерий расти в виде биопленок на поверхностях этих устройств. Причем, будучи организованными в биопленочные сообщества, бактерии проявляют большую устойчивость к действию антибактериальных препаратов, в том числе антибиотиков, факторов иммунной защиты организма и неблагоприятных факторов среды [Donlan R.M., Costerton J.W., 2002].

Объект нашего исследования - бактерии Burkholderia cenocepacia являются одним из возбудителей, вызывающих тяжелые легочные инфекции у иммунодефицитных пациентов и у больных с наследственным заболеванием -кистозным фиброзом легких (КФ). Интенсивные исследования этого возбудителя в последнее время позволили определить у него следующие 4 факторы патогенности: кабельные пили, сидерофоры, липазы, гемолизины, экзополисахариды (EPS), биопленки [Sajjan U.S., Sun L., v et al., 1995; Visser M.B., Majumdar S., et al., 2004; Kooi C., Subsin В., et al., 2006; Hutchison M.L., Poxton I.R., et al., 1998; Cunha M.V., Sousa S.A., et al., 2004]. Вклад каждого из этих факторов в общую патогенность Burkholderia sp. все еще недостаточно определен. Поскольку тяжелые хронические легочные патологии, вызываемые В. cenocepacia у обширной группы людей, обусловлены способностью возбудителя формировать биопленки и поскольку проблема лечения этой инфекции остается актуальной и в нашей стране, и за рубежом, изучение процесса образования биопленок и его генетического контроля как основа для разработки способов борьбы с ними является одной из актуальных проблем современной инфектологии. Изучение механизмов образования биопленок этими бактериями должно внести существенный вклад в поиск мер профилактики и защиты против патогенов путем создания нового класса антимикробных препаратов, способных ингибировать патогенные свойства бактерий или препятствовать процессу образования биопленок.

Одним из подходов к изучению процесса образования биопленок является получение мутантов, влияющих на этот процесс и их комплексное изучение.

Целью настоящей работы являлось получение мутантов бактерий Burkholderia cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo.

Задачи исследования:

1) изучение способности бактерий В. cenocepacia формировать биопленки и отработка методик качественной и количественной оценки этого процесса;

2) получение мутантов В. cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок методом инсерционного мутагенеза;

3) сравнительная электронно-микроскопическая характеристика полученных мутантов;

4) клонирование фрагментов мутантных генов, содержащих инсерцию пласпозона;

5) секвенирование клонированных фрагментов и идентификация мутантных генов с помощью баз данных; протеомный анализ;

6) изучение in vivo динамики инфекционного процесса, вызываемого полученными мутантными штаммами на биологической модели заражения лабораторных животных.

В работе использовали традиционные микробиологические методы выращивания культур и экспериментального заражения лабораторных животных, современные молекулярно-генетические методы — полимеразную цепную реакцию (ПЦР), клонирование и секвенирование генов, сравнительный протеомный анализ исходных и полученных мутантных штаммов и электронно-микроскопическую технику.

Для количественной оценки образуемых клетками разных штаммов биопленок В. cenocepacia применяли метод спектрофотометрической оценки степени созревания биопленок в 96-луночном планшете при окрашивании специфическими красителями.

Для получения мутантов В. cenocepacia с нарушенной способностью к образованию биопленок применяли метод инсерционного мутагенеза с помощью рекомбинантной структуры из плазмиды и транспозона, получившей название пласпозона рТпМэс/-ККш.

Идентификацию полученных мутаций проводили после клонирования фрагментов мутантных генов по маркеру пласпозона, секвенирования клонированных фрагментов и сравнения полученных сиквенсов с имеющимися в базах данных нуклеотидными последовательностями геномов.

Для характеристики полученных мутантов использовали метод протеомного анализа синтезируемых ими белков.

Морфологические отличия планктонных клеток и клеток в составе биопленки, а также патоморфологические изменения в легких инфицированных животных исследовали в световом, флуоресцентном и трансмиссионном, электронном микроскопах.

Научная новизна

На основе комплексного подхода при исследовании процесса формирования биопленок бактериями В. cenocepacia нами были выявлены три гена, принимающие участие в генетическом контроле процесса образования биопленок: ompR и tetR, кодирующие глобальные регуляторы транскрипции, и ген cydB, кодирующий субъединицу I цитохром bd убихинол оксидазы. Впервые для В. cenocepacia показано участие этих генов в генетическом контроле процесса образования биопленок.

Впервые, при использовании протеомного анализа, показана дифференциальная экспрессия белка шаперона GroEL у штаммов с различной способностью к образованию биопленки. Это дает возможность предполагать роль этого белка в генетическом контроле процесса формирования биопленок бактериями В. cenocepacia.

Выявлена наиболее чувствительная к инфекции Bl cenocepacia линия мышей I/St, позволяющая, проводить сравнительные исследования динамики инфекционного процесса, вызываемого различными штаммами этого возбудителя. С использованием этой линии мышей впервые экспериментально показана зависимость более длительной персистенции бактерий В. cenocepacia в органах зараженных животных in vivo от способности возбудителя к формированию биопленок, определяемой in vitro.

Впервые при проведении гистопатологических исследований легких мышей, инфицированных штаммом с повышенной способностью к образованию биопленки, на поверхности альвеол наблюдали окрашенную эозином биопленку. Полученные результаты подтверждают, что способность к образованию биопленок у бактерий В. cenocepacia обусловливает воспалительный процесс в легких, длительную персистенцию возбудителя в организме экспериментальных животных, и даже приводит к гибели мышей.

Практическая значимость

Медицинская микробиология и клиническая фармакология, к сожалению, только начинают подбираться к разработке современных медикаментозных препаратов с целью их воздействия на биопленки. Однако, в бактериологических лабораториях развитых стран уже начинают оценивать антисептики и антибиотики по эффективности их действия не только на изолированные микроорганизмы, но и на бактерии, находящиеся в составе биопленок. Несмотря на то, что представленная работа носит фундаментальный характер, ее практическая значимость состоит в получении коллекции штаммов В. cenocepacia с различной способностью к образованию биопленок, в применении комплекса методов и подходов для характеристики полученных мутантов in vivo и in vitro, что позволит оценивать степень влияния различных лекарственных средств на этот процесс и на способность образовывать биопленки различными видами бактерий.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Биопленки: феномен, история вопроса

Долгое время господствовало общепринятое представление, ' что в природных условиях бактерии живут в виде свободноплавающих (планктонных) клеток, например в поверхностных слоях морских или речных вод, хотя тот факт, что бактерии способны образовывать сложные бактериальные сообщества, микробиологам был известен еще со времен А. Левенгука [Ильина, Романова, Гинцбург, 2004].

То, что более 99 % известных бактериальных популяций существуют в природных экосистемах в виде специфически организованных, прикрепленных к различным субстратам сообществ - биопленок, стало ясно благодаря исследованиям последнего десятилетия, которые показали: планктонная, или свободноплавающая, микробиологическая фаза является, прежде всего, стадией 8 перемещения с одной поверхности на другую. Способность к образованию биопленок в последние годы была обнаружена более чем у 50 видов бактерий [Веселова, 2008].

Прогрессу в понимании феномена биопленок способствовало совершенствование техники микроскопирования и особенно применение конфокального сканирующего лазерного микроскопа (KCJIM), позволившее изучать микроструктуру живых биопленок [Costerton, Geesy et al., 1987; Donlan, 2002].

Биопленки — это высокоорганизованные бактериальные сообщества, образованные бактериями одного или нескольких видов и состоящие как из активно функционирующих клеток [Costerton, Lewandowsky et al., 1995; Donlan, Costerton, 2002.], так и из покоящихся, или некультивируемых, форм [Stoodley et al., 2002], заключенных в экзополимерный матрикс [Costerton, Geesy et al., 1987].

Ряд авторов [Costerton, Geesy et al., 1987; Davey, O'Tool, 2000; Shapiro, 1998] считают образование биопленок морфологической дифференциацией в ответ на воздействие факторов внешней среды, таких как изменение температуры, рН среды, осмолярность, что сопровождается изменением метаболизма, гидродинамики, коммуникативных связей и т.д.

Сложная архитектура биопленок обеспечивает возможность метаболической кооперации клеток внутри пространственно хорошо организованных систем, создает условия, благоприятствующие-установлению симбиотических взаимоотношений между бактериями разных видов и защите от воздействия внешней среды. Биопленки пронизывает сеть водных каналов, обеспечивающих доставку питательных веществ членам сообщества и удаляющих продукты метаболизма.

Образование биопленок является сложным многошаговым и строго регулируемым биологическим процессом. Индивидуальные члены сообщества имеют «специфические обязанности», которые, комбинируясь с другими, усиливают жизнеспособность всего консорциума, что подтверждается экспрессией в разных клетках одной биопленки разных генов и синтезом белков различного назначения. Эти факты, а также объединение клеток бактерий в биопленке сложными межклеточными связями позволяет рассматривать биопленку в качестве функционального аналога многоклеточного организма [Shapiro, 1998].

Господство биопленок было установлено, за небольшими исключениями, во всех природных экосистемах. Они образуются на поверхностях различного происхождения (биотических и абиотических) как в природе, так и в организмах различных хозяев, причем предпочтительно на инертных поверхностях или на мертвых тканях. Такой способ существования бактерий создает большие проблемы в промышленности (коррозия), а также в медицине, поскольку бактерии образуют биопленки на медицинских инструментах, имплантируемом оборудовании (линзы, катетеры, в том числе сердечные, внутривенные и мочевыводящие, а также протезы, искусственные клапаны сердца и т.д.) и фрагментах мертвой ткани, таких как омертвевшая часть кости. Они могут также формироваться на живых тканях, как в случае эндокардитов у пациентов, подвергавшихся хирургическим операциям на сердце, а также в легких у больных кистозным фиброзом (КФ).

Считается, что около 60 % внутрибольничных инфекций обусловлены биопленками [Романова, Смирнова с соавт., 2006].

Благодаря KCJIM можно наблюдать за самим развитием биопленочных сообществ. Так, первичное прикрепление планктонных бактерий, при котором существенная роль отводится флагеллам и пилям, наблюдается как обратимый процесс - некоторые клетки .способны открепляться. Следующая стадия развития биопленок - созревание, при котором клетки теряют подвижность, прикрепление становится необратимым, нарастает пленочная биомасса, формируются трехмерные грибовидные или колоннообразные структуры. Третий период - процесс дисперсии бактерий из внутренних участков биопленки в окружающую среду: бактерии приобретают подвижность, выплывают через открытые каналы [Ильина, Романова, Гинцбург, 2004].

В процессе образования биопленок микроколонии развиваются в макроколонии, а затем в зрелую биопленку, что обеспечивается продукцией экзополисахаридов (EPS). Экзополисахариды биопленки формируют барьер между клетками и внешней, окружающей их средой и обеспечивают защиту бактерий от различных стрессовых ситуаций (УФ-облучение, высыхание, воздействие антибактериальных препаратов). Одним из основных структурных компонентов биопленок является матрикс - полимерное вещество, состоящее из смеси экзополисахаридов, белков, гликопротеинов, гликолипидов и, в некоторых случаях, нуклеиновых кислот. Матрикс представляет собой некую сеть, которая удерживает клетки биопленки вместе, обеспечивая механическую стабильность в поддержании пространственного расположения микроконсорциума в течение долгого периода. J.W. Costerton с соавт. [Costerton, Geesey et al., 1978] еще в 1978 году заметили, что сообщество прикрепленных бактерий в водной среде заключено в полисахаридный матрикс. Его механическая стабильность обеспечивается гидрофобными взаимодействиями, связыванием мультивалентных катионов и «запутанностью» биополимеров. Матрикс взаимодействует с окружающей средой, например, прикрепляет биопленку к различным поверхностям, позволяет «захватывать» растворенные вещества и частички различных субстанций из окружающей среды, обеспечивая, таким образом, питательными веществами биопленочные организмы.

На сегодняшний день известно, что у различных видов бактерий состав матрикса различается. Показано, что основным компонентом матрикса биопленок, образуемых S. typhimurhim, является целлюлоза, у P. aeruginosa таким веществом является альгинат (полианионный полисахарид), а у В. cepacia — экзополисахарид, получивший наименование по видовому названию бактерий «сепациан» [Cunha, Sousa et al., 2004].

В состав матрикса биопленок, как было сказано выше, входят также нуклеиновые кислоты, так называемая экстраклеточная ДНК (эДНК). Как правило, нуклеиновые кислоты локализованы внутри живых клеток и выполняют основную функцию, хранение и передачу генетической информации, а эДНК, главным образом, рассматривалась как результат лизиса клеток. Однако U. Bockelmann с соавт. [Uta Bockelmann et al., 2006] показали, что эДНК бактерий формирует некую пространственную структуру. На примере водных бактерий {Aquatic bacteria) штамма F8 было показано, что эДНК образует стабильную сеть филаментов. При сравнении последовательностей эДНК и геномной ДНК этих бактерий обнаружилось как их большое сходство, так и некоторые различия. Известно также, что некоторые (но не все) бактерии способны продуцировать большое количество эДНК. Показано, что ее образование может происходить как при росте биопленок, образованных бактериями одного вида, так и при формировании биопленок, образованных несколькими видами бактерий. Предполагается также роль эДНК в обмене генетической информацией в результате естественной трансформации, а также использовании ее клетками в качестве источника питания при голодании [Steinberg R.E. et al., 2005]. Несмотря на то, что остается еще много вопросов, касающихся источников появления и функций эДНК, ее роль при формировании биопленок несомненна.

Сложная архитектура биопленок обеспечивает возможность метаболической кооперации клеток и создает условия для установления симбиотических взаимоотношений в одной биопленке между бактериями разных видов [Costerton, Lewandowsky, 1995]. В большинстве природных и индустриальных сред биопленки представляют собой комплекс сообществ, состоящих более чем из одного микробного вида. Биопленки, состоящие из нескольких видов, часто толще и стабильнее, чем моновидовые, что может усиливать и без того их чрезвычайную устойчивость к антимикробным агентам [Al-Bakri, Gilbert et al., 2004]. При этом между отдельными клетками бактерий, принадлежащих к одному и тому же виду, а также разным видам, родам и даже семействам, осуществляется передача информации с помощью определенного рода сигнальных молекул, которые можно считать «словами» в своеобразном языке бактерий. В подобном поведении проявляются черты сходства бактерий с многоклеточными организмами: бактерии используют преимущества «социального поведения». Передача информации способствует быстрой адаптации популяции бактерий к меняющимся условиям и их выживанию в природной среде [Miller, Bassler, 2001; Завильгельский, Манухов, 2001; Taga, Bassler, 2003; Гинцбург, Ильина, Романова, 2003; Waters, Bassler, 2005].

Глава 2. Методы исследования биопленок

2.1. Микроскопические методы

Как было сказано выше, J.W. Costerton с соавт. еще в 1987 году определили, что биопленки состоят из отдельных клеток и микроколоний, заключенных в экзополимерный матрикс, и до 1990 года биопленки воспринимались как некие неструктурированные наросты. Такое представление основывалось на результатах изучения биопленок при электронном и световом микроскопировании. Первые исследования биопленок были выполнены с помощью сканирующего электронного микроскопа, причем подготовка препаратов, основанная на использовании дегидратантов, приводила к разрушению образцов перед анализом и к артефактам: внеклеточные полимерные субстанции, состоящие на 95 процентов из воды, выглядели как волокна, а не как плотный желеобразный матрикс, окружающий клетки [Donlan, Costerton, 2002]. Световое микроскопирование дает искажения из-за внефокусных эффектов.

Попытки изучать биопленки с помощью трансмиссионной электронной микроскопии были неудачны, поскольку сама технология подготовки образцов приводила к их обезвоживанию и разрушению. Применение же трансмиссионного микроскопического анализа с использованием специальных полисахаридных красителей типа «рутения красного» позволило прояснить природу внеклеточных волокон в биопленке и их ассоциации с клетками [Donlan, Costerton, 2002].

Для изучения живых клеток и наблюдения их в процессе движения, в том числе при образовании биопленок, применяются фазово-контрастный и интерференционный микроскопы. Фазово-контрастная микроскопия служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. В интерференционной микроскопии используется эффект интерференции, возникающий при комбинации двух наборов волн, который создает изображение микроструктур. При фазово-контрастной и интерференционной микроскопии регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микрокиносъемки.

Конфокальный сканирующий лазерный микроскоп (KCJIM), изобретенный еще в 50-х годах XX века, сначала не применялся для изучения бактерий. По мере накопления данных о распространенности и роли биопленок в природных процессах, в медицине и промышленности выявилась необходимость поиска новых методов их исследования. С помощью КСЛМ стало возможным проводить непосредственное наблюдение за живыми биопленками. Сочетание КСЛМ и эпифлуоресцентной микроскопии за счет комбинации красителей и специально разработанных компьютерных программ позволяло выявлять общее число клеток и процентный состав клеток в биопленке [Dennis, Zylstra, 1998].

Для наблюдения за процессом формирования биопленок с использованием КСЛМ конструируют так называемые проточные камеры -непрерывно-проточные системы из тефлона, металла либо пластика, сквозь которые непрекращающимся потоком пропускают питательную среду. Камеры снабжены визуализационными отверстиями, позволяющими осуществлять непосредственное наблюдение за процессом образования и развития биопленки без ее разрушения. Такие камеры чаще всего бывают однопроточными - для того чтобы свежая среда, поступающая в систему, проходила сквозь клетки и накапливалась в них, но не рециркулировала.

Описываемые камеры использовались для исследования биопленок в различных гидродинамических состояниях, при которых питательную среду пропускали в виде либо ламинарного, либо турбулентного течения. Структура биопленок изменяется в ответ на различные проточные состояния биопленок, выращенных под ламинарным потоком; биопленки представляют собой нечто вроде обрывков, состоящих из неровных овальных клеточных агрегатов, разделенных пустотами; биопленки, выращенные в турбулентном потоке, также представляли собой участки, похожие на лохмотья, но вытянутые наподобие ленты, которая колеблется в толще текущей (вращающейся) жидкости. Исследования показали, что биопленка полиморфна и структурно адаптирована к изменяющемуся количеству питательных веществ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Андреев, Александр Львович

выводы

2. Клонирование фрагментов мутантных генов, содержащих инсерцию пласпозона, и секвенирование клонированных фрагментов, позволило впервые идентифицировать три гена ompR, cydB и tetR, участвующих в генетическом контроле процесса образования биопленок у В. cenocepacia.

3. С помощью протеомного анализа показана дифференциальная экспрессия гена groE в штаммах с мутациями cydB' и ompR", что предполагает роль белка GroEL в процессе формирования биопленок бактериями В. cenocepacia.

6. Экспериментально in vivo показана более длительная персистенция в органах зараженных животных мутанта cydB' с повышенной способностью к образованию биопленок по сравнению с исходным штаммом и другими мутантными штаммами.

7. Патоморфологические исследования показали, что в легких мышей, зараженных бактериями мутанта cydB' с повышенной способностью к формированию биопленок, происходят воспалительные процессы, проявляющиеся в инфильтрации альвеол и стромы легкого лейкоцитами и их скопление вокруг бронхов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Многолетние исследования российских и зарубежных ученых в области образования биопленок патогенными бактериями, в том числе бактериями, имеющими большое медицинское значение - ответственными за развитие легочных и других хронических инфекций Е. coli, P. aeruginosa, В. cenocepacia, показали, насколько сложным и строго регулируемым является этот биологический процесс.

Авторами описываются стадии развития биопленочных сообществ, приводятся многочисленные данные о структурной организации биопленок, об экспрессии генов бактерий на разных стадиях развития биопленок и о ее регуляции, описываются соответствующие методы исследования -микроскопические и генетические, выясняется значение биопленок в патогенезе хронических инфекций, указываются различные причины устойчивости биопленок к проникновению антимикробных агентов, обсуждается значимость исследований в этой области для медицины, в частности для поиска мер профилактики и защиты против патогенных бактерий, для создания нового класса антимикробных препаратов.

Приведенный выше обзор научной литературы последнего десятилетия свидетельствует о том, что достигнут немалый прогресс в области изучения генетического контроля процесса образования биопленок у В. cenocepacia, являющегося среди представителей рода Burkholderia наиболее интересным, с необычным строением генома микроорганизмом, значимость которого как возбудителя инфекционных заболеваний еще не до конца распознана. В частности, показана роль сигнальной генетической системы «quorum sensing», описаны механизмы генетического контроля каждой из стадий процесса образования биопленок, а также раскрыта роль экзополисахаридного матрикса и различных клеточных структур - флагелл, пилей, курли, а также фимбрий и некоторых других адгезиноспособных структур клеток на разных стадиях биопленкообразования, в том числе во время начального прикрепления к субстрату планктонных бактерий.

Тем не менее исследование самого феномена образования биопленок патогенными бактериями разных видов и генетического контроля этого процесса продолжается и в России и за рубежом; это свидетельствует о важности и актуальности исследований одного из механизмов, ответственного за хроническое течение инфекционного процесса, с целью создания базы для разработки подходов к поиску новых средств борьбы с хроническими инфекциями.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 7. Материалы и методы

7.1. Штаммы бактерий, плазмиды и условия выращивания бактериальных культур

Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе, представлены в табл. 2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Андреев, Александр Львович, Москва

1. Велик А.С., Тарасова Н.Н., Хмель И.А. Регуляция формирования биопленок у Escherichia coli: влияние мутаций в генах hns, stpA, lon, rpoN 3. 1. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2008; № 4.

2. Веселова М.А. Изучение Quorum sensing систем регуляции у Pseudomonas chiororaphis и Burkholderia cepacia. // Автореф. дисс. к.б.н. М., -2008.

3. Гинцбург А.Л., Ильина Т.С., Романова Ю.М. -2003. "Quorum sensing" или социальное поведение бактерий. // Ж. микроб., эпидемиол., иммунобиол. №5, -С. 86-93.

4. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. "Quorum sensing", или как бактерии "разговаривают" друг с другом. // Молекуляр. Биология. -2001. Т. 35. № 2. -С. 268-277.

5. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития. // Генетика. -2004. Т. 40. № 11. -С. 1445-1456.

6. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Системы коммуникаций у бактерий и их роль в патогенности. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология : научно-теоретический журнал. -2006. № 3. -С. 22-29.

7. Лакин Г.Ф. Биометрия. // М: Высш. шк., -1990. -С. 1-352.

8. Малеев Г.В., Гинцбург А.Л. Методы флюоресцентной детекции и их применение в микробиологии. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2004. № 3. -С. 30-40.

9. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. // -2004. Том 1. Москва. Наука.

10. Романова Ю.М., Смирнова Т.А., Андреев А.Л. и др. Образование биопленок — пример «социального» поведения бактерий. // Микробиология. -2006. Том 75. № 4. -С 1-6.

11. Сукачев B.H. Основы теории биоценологии. // M., -1947. -С. 283.

12. Шагинян И.А., Чернуха М.Ю. // Молекул. Генетика. -2003. № 2. -С. 3-10.

13. Шагинян И.А., Хмель И.А., Романова Ю.М. и др. Клинические штаммы комплекса Burkholderia cepacia: характеристика и выявление компонентов регуляторной системы Quorum sensing. // Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. -2003. №4. -С. 15-20.

14. Alisson D.G. The biofilm matrix. // Biofouling. 2003.V. 19: P. 139-150.

15. Aim R.A., and Mattick J.S. Genes involved in the biogenesis and function of type-4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa. II Gene. -1997.V. 192: -P. 89-98.

16. Al-Bakri A.G., Gilbert P. and Allison D.G. Immigration and emigration of Burkholderia cepacia and Pseudomonas aeruginosa between and within mixed biofilm communities. // Journal of Applied Microbiology. -2004. V. 96. -P. 455-463.

17. Bakker D., Willemsen P.T., Simons L.H., van Zijderveld F.G. & de Graaf F.K. Characterization of the antigenic and adhesive properties of FaeG, the major subunit of K88 fimbriae. // Mol. Microbiol. -1992. V. 6: -P. 247-255.

18. Bernier S.P., and Sokol P.A. Use of supression-subsractive hybridization to identify genes in the Burkholderia cepacia compex that are unique to Burkholderia cenocepacia. II J. Bacteriol. -2005. V. 187: -P. 5278-5291.

19. Bentzmann de S., Aurouze M., Ball G., and Filloux A. FppA, a Novel Pseudomonas aeruginosa Prepilin Peptidase Involved in Assembly of Type IVb Pili. // J. Bacteriol. -2006. V. 188: -P. 4851 4860.

20. Ben Nasr A., Olsen A. et al. Assembly of human contact phase proteins and release of bradykinin at the surface of curli-expressing Escherichia coli. // Mol Microbiol. -1996. V. 20(5): -P. 927-35.

21. Belas R., Schneider R., and Melch M. Characterization of Proteus mirabilis Precocious Swarming Mutants: Identification of rsbA, Encoding a Regulator of Swarming Behavior. // J. Bacteriol. -1998. V. 180: -P. 6126 6139.

22. Bieber D., Ramer S.W. et al. Type IV Pili, Transient Bacterial Aggregates, and Virulence of Enteropathogenic Escherichia coli. // Science. -1998. V. 280: -P. 2114.

23. Burkholder W.H. Sour skin, a bacterial rot of onion bulbs. // Phitopathology. -1950. V. 40: -P. 115-117.

24. Buell C.R., and Anderson A.J. Genetic analysis of the aggA locus involved in agglutination and adherence of Pseudomonas putida, a beneficial fluorescent pseudomonad. //Mol. Plant Microbol Interact. -1992. V. 5: -P. 154-162.

25. Bockelmann U, Janke A, Kuhn R. et al. Bacterial extracellular DNA forming a defined network-like structure. // FEMS Microbiology Letters. -2006. V. 262. -P. 31-38.

26. Caiazza N.C., Merritt J.H. et al. Inverse Regulation of Biofilm Formation and Swarming Motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. // J. Bacteriol. -2007. V. 189: -P. 3603 -3612.

27. Characklis W.G., and Marshall K.C. Biofilms: a basis for an interdisciplinaly approach,. In Charaklis W.G. and Marshall K.C. (ed.) Biofilms. John Wiley & Sons. -1990. -P. 3-5.

28. Chater K.F. Genetics of differentiation in Streptomyces. // Annu. Rev. Microbiol. -1993. V. 47: -P. 685-713.

29. Cheng H., Lessie T. Multiple replicons constituting the genome of Pseudomonas cepacia 17616. //J. Bacteriol. -1994. № 176. -P. 4034-4042.

30. Costerton J.W., Cheng K.-J., Geesey G.G., Ladd T.I., Nickel J.C., Dasgupta M., and Marrie T.J. Bacterial biofilms in nature and disease. // Annu. Rev. Microbiol. -1987. V. 41: -P. 435-464.

31. Collins F.S. Cystic fibrosis: molecular biology and therapeutic implications. // Science. -1992. V. 256: -P. 774 779.

32. Costerton J.W., Geesey G.G., and Cheng G.K. How bacteria stick. // Sci. Am. -1978. V. 238:-P. 86-95.

33. Costerton J.W., Cheng K.-J., Geesey G.G., Ladd T.I., Nickel J.C., Dasgupta M., and Marrie T.J. Bacterial biofilms in nature and disease. // Annu. Rev. Microbiol. -1987. V. 41: -P. 435-464.

34. Corbett C.R., Burtnick M.N., Kooi C., Woods D.E., and Sokol P.A. An extracellular zinc metalloprotease gene of Burkholderia cepacia. II Microbiology. -2003. V. 149: -P. 2263-2271.

35. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., and Lappin-Scott H.M. Microbial biofilms. // Annu. Rev. Microbiol. -1995. V. 49: -P. 711745.

36. Collinson S.K., Emody L. et al. Purification and characterization of thin, aggregative fimbriae from Salmonella enteritidis. // J. Bacteriol. -1991. V. 173: -P. 4773 -4781.

37. Crosa J.H. Genetics and molecular biology of siderophore-mediated iron transport in bacteria. // Microbiol. Rev. -1989. V. 53: -P. 517-530.

38. Cox C.D., and Graham R. Isolation of an iron-binding compound from Pseudomonas aeruginosa. II J. Bacteriol. -1979. V. 137: -P. 357-364.

39. Davies D.G., Geesey G.G. Regulation of the alginat biosynthesis gene algC in Pseudomonas aeruginosa during biofilm development in continuous culture. // Appl. Environ. Microbiol. -1995. V. 61: -P. 860-867.

40. Davies D.G., Parsek M.R., Pearson J.P., Iglewski B.H., Costerton J.W., and Greenberg E.P. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. // Science. -1998. V. 280: -P. 295-298.

41. Davey M.E., O'Tool G.A. Microbiol Biofilms: from ecology to molecular genetics. // Microbiol, and Molecular Biol. Rew. -2000. V. 4. -P. 847-864.

42. Danese N., Pratt L.A., Dove S., and Kolter R. The outer-membrane protein, Ag43, mediates cell-to-cell interactions in of E. coli biofilms. // Mol. Microbiol. -2000. V. 37: -P. 424-432.

43. Davies D.G., and Geesey G.G. Regulation of the alginate biosynthesis gene algC in Pseudomonas aeruginosa during biofilm development in continuous culture. // Appl. Environ. Microbiol. -1995. V. 61: -P. 860-867.

44. Darling P., Chan M., Cox A. D., and Sokol P.A. Siderophore production by cystic fibrosis isolates of Burkholderia cepacia. II Infect. Immun. -1998. V. 66: -P. 874-877.

45. Dennis J.J. and Zylstra G.J. Plasposons: Modular Self-Cloning Minitransposon Derivatives for Rapid Genetic Analysis of Gram-Negative Bacterial Genomes. // Appl. Envir. Microbiol. -1998. V. 64: -P. 2710 2715.

46. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. // Clinical Microbiology, -2002, -P. 167-193.

47. Donlan R.M. Biofilms: microbial life on surfaces. // Emerg. Infect. Disease. -2002. V. 8. -P. 881-890.

48. Duan K., Dammel C. et al. Modulation of Pseudomonas aeruginosa gene expression by host microflora through interspecies communication. // Mol Microbiol. -2003. V. 50(5): -P. 1477-91.

49. Dworkin M. Recent advances in the social and developmental biology of the myxobacteria. //Microbiol. Rev. -1996. V. 60: -P. 70-102.

50. Eberhard A. Inhibition and activation of bacterial luciferase synthesis. // J. Bacteriol. -1972. V. 109: -P. 1101-1105.

51. Elsen S., Swem L.R., Danielle L. Swem and Bauer C.E. RegB/RegA, a Highly Conserved Redox-Responding Global Two-Component Regulatory System. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2004. V. 68: -P. 263 279.

52. Egan S.M. Growing repertoire of AraC/XylS activators. // J. Bacteriol. -2002. V. 184: -P. 5529-5532.

53. Engebrecht J., Nealson K., and Silverman M. Bacterial bioluminescence: Isolation and genetic analysis of functions from Vibrio fischeri. // Cell. -1983. V. 32:-P.773-781.

54. Erickson D.L., Endersby R., Kirkham A. et al. Pseudomonas aeruginosa quorum sensing system may control virulence factor expression in the lungs of patients with cystic fibrosis. // Infect. Immun. -2002. V. 70: -P. 1783-1790.

55. Finlay B.B. and Falkow S. Common themes in microbial pathogenicity revisited. //Microbiol. Mol. Biol. Rev. -1997. V. 61: -P. 136 169.

56. Finelli A., Gallant C.V., Jarvi K., and Burrows L.L. Use of In-Biofilm Expression Technology To Identify Genes Involved in Pseudomonas aeruginosa Biofilm Development. // J. Bacteriol. -2003. V. 185: -P. 2700 -2710.

57. Francez-Charlot A, Laugel B. et al. RcsCDB His-Asp phosphorelay system negatively regulates the flhDC operon in Escherichia coli. // Mol Microbiol. -2003 V. 49(3): -P. 823-32.

58. Friedman L. and Kolter R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. // Mol Microbiol. -2004. V. 51(3): -P. 675-90.

59. Fuqua W.C., Greenberg E.P. Listening in on bacteria: acyl-gomoserin lacton signaling. //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. -2002. V. 3. -P. 685-695.

60. Fuqua W.C., Winnas S.C., Greenberg E.P. Quorum sensing in bacteria: the luxR/luxI family of cell density rensponsive transcriptional regulation. // J. Bacteriol. -1994. V. 176: -P. 269-275.

61. Fuqua W.C., Parsec M.R., Greenberg E.P. Regulation of gene expression by cell-to cell communication: acyl-gomoserin lacton quorum sensing. // Annu. Rev. Gen. -2001. V. 35. -P. 439-468.

62. Gambello M.J. and Iglewski B.H. Cloning and characterisation of the Pseudomonas aeruginosa lasR gene, a transcriptional activator of elastase expression. // J. Bacteriol. -1991.V. 173: -P. 3000-3009.

63. Genevaux P., Muller S. and Bauda P. A rapid screening procedure to identify mini-TnlO insertion mutants of Escherichia coli K-12 with altered adhesion propertiese. // FEMS Microbiol. Lett. -1996. V. 142: -P. 27-30.

64. Genevaux P., Bauda P., DuBow M.S., and Oudega B. Identification of TnlO insertions in rfaG, rfaP, and galU genes involved in lipopolisaccharide core biosynthesis that affect Escherichia coli adhesion. // Arch. Microbiol. -1999. V. 172: -Pp. 1-8.

65. Gillian S.H. et al. New rules on medicines. // Vet Rec. -1995. V. 136: -P. 203.

66. Govan J.R.W., Vandamme P. Agricultural and medical microbiology: a time for bridging gaps. // Microbiol. -1998. V. 144: -P. 2373-2375. '

67. Govan J.R.W., and Deretic V. Microbiol pathogenesis in cystic fibrosis:mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. // Microbiol.j

68. Rev. -1996. V. 60: -P. 539-574.

69. Granato D., Bergonzelli G.E., Pridmore R.D. // Infect, and Immun. -2004. V. 72. №4. -P. 2160-2169.

70. Guerinot M.L. Microbial iron transport. -1994. // Annu. Rev. Microbiol. V. 48: -P. 743-772.

71. Hatchison M.L., Poxton I.R., and Govan J.R. Burkholderia cepacia produces a hemolysin that is capable of inducing apoptosis and degranulation of mammalian phagocytes. -1998. // Infect. Immune. V. 66: -P. 2033-2039.

72. Hales B.A., Morgan J.A., Hart C.A., and Winstanley C. Variation in flagellin genes and proteins of. -1998. // J. Bacteriol. V. 180: -P. 1110-1118.

73. Heilmann C., Gerke C., Perdreau-Remington F., and Gotz F. -1996. Characterization of Tn917 insertion mutants of Staphylococcus epidermidis affected in biofilm formation. // Infect Immun. V. 64: -P. 277-282.

74. Holmes A., Govan J., Goldstein R. Agricultural use of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia: a threat to human haelth. // Emerg. Infect. Disease. -1998. V. 4. -P. 221-227.

75. Huber В., Riedel K., Hentzer M. et al., The сер quorum-sensing system of Burkholderia cepacia Hill controls biofilm formation and swarming motility. //Microbiology. -2001. V. 147: -P. 2517 2528.

76. Hultgren S.J. and Normark S. Biogenesis of the bacterial pilus. // Curr Opin Genet Dev.-1991. V. 1(3): -P. 313-318.

77. Isles A. Maclusky I. Corey M. et al. Pseudomonas cepacia infection in cystic fibrosis: an emerging problem. // J. Pediatr. -1984. V. 104(2): -P. 206-10.

78. Jacobs A.A., Simons B.H. & de Graaf F.K. The role of lysine-132 and arginine-136 in the receptor-binding domain of the K99 fibrillar subunit. // EMBO J. -1987. V. 6: -P. 1805-1808.

79. Jungblut P.R., Bumann D., Haas G. et al. Comparative proteome analysis of Helicobacter pylori. // Mol Microbiol. -2000. V. 36(3): -P. 710-252.

80. Kaiser D., and Losick R. How and why bacteria talk to each other. // Cell. -1993.V. 73:-P.873-885.

81. Kachlany S.C., Planet P.J. et al. flp-1, the first representative of a new pilin gene subfamily, is required for non-specific adherence of Actinobacillus actinomycetemcomitans. //Mol Microbiol. -2001. V. 40(3): -P. 542-54.

82. Kempner E.S. and Hanson F.E. Aspects of light production by Photobacterium fischeri. //J. Bacteriol. -1968. V. 95: -P. 975-979.

83. Kievit De T.R. and Iglewski B.H. Bacterial Quorum Sensing in Pathogenic Relationships. // Infection and Immunity. -2000. V. 68. -P. 4839-4849.

84. Klausen M., Heydorn A., Ragas P. et al. Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa wild type, flagella and type IV pili mutants. // Mol Microbiol. -2003. V. 48(6): -P. 1511-24.

85. Kooi C., Subsin В., Chen R., Pohorelic В., and Sokol P.A. Burkholderia cenocepacia ZmpB Is a Broad-Specificity Zinc Metalloprotease Involved in Virulence. //Journal of Bacteriology. -2005. V. 187. №. 15. -P. 5278-5291.

86. Kothe M., Antl M., Huber В., Stoecker K., Ebrecht D., Steinmetz I., and Eberl L. Killing of Caenorhabditis elegans by Burkholderia cenocepacia iscontrolled by the сер quorum-sensing system. // Cell. Microbiol. -2003. V. 5: -P. 343-351.

87. Krogfelt K.A. Bacterial adhesion: genetics, biogenesis, and role in pathogenesis of fimbrial adhesins of Escherichia coli. II Rev Infect Dis. -1991. V. 13:-P. 721-735.

88. Krogfelt K.A., Bergmans H., and Klemm P. Direct evidence that the FimH protein is the mannose-specific adhesin of Escherichia coli type 1 fimbriae. // Infect. Immun. -1990. V. 58: -P. 1995 1998.

89. Lefebre M.D. and Valvano M.A. Construction and Evaluation of Plasmid Vectors Optimized for Constitutive and Regulated Gene Expression in Burkholderia cepacia Complex Isolates. // Appl. Envir. Microbiol. -2002. V. 68: -P. 5956 5964.

90. Lennin E. and DeCicco B. Plasmid of P. cepacia strains of diverse origins. // Appl. Environ. Microbiol. -1991. V. 57. -P. 2345-2350.

91. Lewenza S., Conway В., Greenberg E.P., Sokol P.A., Quorum sensing in Burkholderia cepacia: identification of the LuxRI homologs CepRI. // J. Bacteriol. -1999.V. 181: -P. 748-756.

92. Lewenza S., Sokol P.A. Regulation of ornibactin biosynthesis and N-acyl-l-homoserine lactone production by CepR in Burkholderia cepacia. J. Bacteriol. -200l.V. 183: -P. 2212-2218.

93. LiPuma J.J., Mahenthiralingam E. Commercial use of Burkholderia cepacia. //Emerg. Infect. -1999. V. 5. -P. 305-306.

94. Losick R., Youngman P., and Piggot P.J. Genetics of endospore formation in Bacillus subtilis. //Annu. Rev. Genet. -1986. V. 20: -P. 625-669.

95. Lundberg J.O., Weitzberg E., Cole J.A., and Benjamin N. Nitrate, bacteria and human health. //Nat Rev Microbiol. -2004. V. 2(7): -P. 593-602.

96. Lutter E., Lewenza S., Dennis J.J. et al. Distribution of quorum sensing genes in the Burkholderia cepacia complex. // Infect. Immun. -2001. V. 69: -P. 4661-4666.

97. Marshall K.C. Interfaces in microbial ecology. // Harvard University Press, Cambridge, Mass. -1976. V. 15: -P. 44-47.

98. Makin S.A., and Beveridge T.J. The influence of A-band and B-band lipopolisaccharide on the surface characteristics and adhesion of Pseudomonas aeruginosa to surfaces. // Microbiology. -1996. V. 142: -P. 299-307.

99. Mary E.D., and O'Tool G.A. Microbial biofilms: from Ecology to Molecular Genetics. // Microbiology and Molecular biology reviews. -2000. V. 64. -P. 847-867.

100. Marklund B.I., Tennent J.M., Garcia E. et al. Horizontal gene transfer of the Escherichia coli pap and prs pili operons as a mechanism for the development of tissue-specific adhesive properties. // Mol Microbiol. -1992. V. 6 (16): -P. 2225-2242.

101. Meitsner T.A., and Morse S.A. The role of iron-binding proteins in the survival of pathogenic bacteria. // Annu. Rev. Nutr. -1994. V. 14: -P. 471-493.

102. Meyer J.M., Hohnadel D., and Halle F. Cepabactin from Pseudomonas cepacia, a new type of siderophore. // J. Gen. Microbiol. -1989. V. 135: -P. 1479-1487.

103. Meyer J.M., Van V.T., Stintzi A., Berge O., and Winkelmann G. Ornibactin production and transport properties in strains of Burkholderiavietnamiensis and Burkholderia cepacia (formerly Pseudomonas cepacia). // Biometals. -1995. V. 8: -P. 309-317.

104. Meyer J.M., Azelvandre P., and Georges C. Iron metabolism in Pseudomonas fluorescens CHAO. // Biofactors. -1992. V. 4: -P. 23-27.

105. Miller M.B. and Bassler B.L. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev // Microbiol. -2001. V. 55: -P. 165-99.

106. Nealson K.H., Piatt T. and Hastings J.W. Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescence system. // J. Bacteriol. -1970. V. 104: -P. 313-322.

107. Neilands J.B. Siderophores: structure and function of microbial iron transport compounds. // J. Biol. Chem. -1995. V. 270: -P. 26723-26726.

108. Nyvad В., and Kilian M. Comparision of the initial streptococcal microflora an dental enamel in cariese-active and in caries-inactive individuals. // Caries Res. -1990. V. 24: -P. 267-272.

109. Nzula S., Vandamme P. & Govan J.R.W. Influence of taxonomic status on the in vitro antimicrobial susceptibility of the Burkholderia cepacia complex. // J. Antimicrobe Chemother. -2002. V. 50: -P. 265-269.

110. Olsen A., Jonsson A., and Normark S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. // Nature. -1989. V. 338 (6217): -P. 652-655.

111. O'Toole GA., and Kolter R. The initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis. // Mol. Microbiol. -1998. V. 30: -P. 295-304.

112. O'Toole G.A. To Build a biofilm. // J. of Bacteriology. -2003. V. 185: -P. 2687-2689.

113. O'Toole G.A., and Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. // Mol. Microbiol. -1998. V. 30 (2): -P. 295-304.

114. O'Toole G.A., Gibbs К.A. et al. The Global Carbon Metabolism Regulator Crc Is a Component of a Signal Transduction Pathway Required for Biofilm Development by Pseudomonas aeruginosa^ // J. Bacteriol. -2000. V. 182: -P. 425-431.

115. Parkins M.D., Ceri H., and Storey D.G. Pseudomonas aeruginosa GacA, a factor in multihost virulence, is also essential for biofilm formation. // Mol. Microbiol. -2001. V. 40: -P. 1215-1226.

116. Parsek M.R. and Greenberg E.P. Quorum sensing signals in development of Pseudomonas aeruginosa biofilms. // Methods Enzymol, Jan -1999; V. 310: -P. 43-55.

117. Pesci E.C., Milbank J.B., Pearson J.P. Quinoline signaling in the cell-to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1999. V. 96: -P. 11229-11234.

118. Pier G. Pseudomonas aeruginosa: a key problem in cystic fibrosis. // ASM News. -1998. V. 64: -P. 339-347.

119. Pratt L.A., Kolter R. Genetic analisys of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili. Mol. Microbiol. -1998. V. 30: -P. 285-294.

120. Prigent-Combaret C., Vidal O. Dorel C., and Lejune P. Abiotic surface sensing and biofilm dependent regulation of gene expression in Eschericia coli. -1999. // J. Bacteriol. V. 181: -P. 5993-6002.

121. Prince A. -1992. Adhesins and receptors of associated with infection of the respiratory tract. // Microb. Pathog. V. 13: -P. 251-260.

122. Priifi B.M., Besemann C. et al. A Complex Transcription Network Controls the Early Stages of Biofilm Development by Escherichia coli. // J. Bacteriol., Jun -2006; V. 188: -P. 3731 3739.

123. Prigent-Combaret C., Brombacher E. et al. Complex Regulatory Network Controls Initial Adhesion and Biofilm Formation in Escherichia coli via Regulation of the csgD Gene. // Journal of Bacteriology, Dec. -2001, -P. 7213-7223.

124. Ramos J.L., Marti'nez-Bueno M. et al. The TetR Family of Transcriptional Repressors. // Microbiology and molecular biology reviews, June -2005,-P. 326-356.

125. Ren D, Bedzyk L.A., Thomas S.M., Ye R.W., Wood Т.К. Gene expression in Escherichia coli biofilms. // Appl Microbiol Biotechnol. -2004. Jan 16. V. 64(4): -P. 515-524.

126. Richardson J., Stead D.E., and Coutts R.H. Incidence of the cblA major subunit pilin gene amongst Burkholderia species. // FEMS Microbiol Lett, Mar -2001; V. 196(1):-P. 61-66.

127. Rodney M., Donlan and J. William Costerton. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. // Clinical Microbiology Reviews. Apr -2002. -P. 167-193.

128. Ryley H.C. et al. Characterisation of Burkholderia cepacia from cystic fibrosis patients living in Wales by PCR ribotyping. // J. Med. Microbiol. -1995.V. 43: p. 436-441.

129. Sajjan U.S., Sun L., Goldstein R., Forstner J. F. // J. Bacteriol. 1995. V. 177: -P. 1030-1036.

130. Saiman L., Ishimoto K., Lory S., and Prince A. The effects of piliation and exoproduct expression on the adherence of Pseudomonas aeruginosa to respiratory epithelial monolayers. -1990. // J. Infect. Dis. V. 161: -P. 541-548.

131. Sajjan U.S., & Forstner J.F. Role of a 22-kilidalton pilin protein in binding of Pseudomonas cepacia to buccal epithelial cells. -1993. // Infect Immun. V. 61:-P. 3157-3163.

132. Sajjan U.S., Sylvester F.A., Forstner J. Cable-piliated Burkholderia cepacia bind to cytokeratin 13 of epithelial cells. -2000. // Infect Immun. V. 68: -P. 1787-1795.

133. Sajjan U., Liu L. et al. Lack of cable pili expression by cblA-containing Burkholderia cepacia complex. // Microbiology, Nov -2002; V. 148: -P. 3477 -3484.

134. Sajjan U. and Forstner J.F. Identification of the mucin-binding adhesin of Pseudomonas cepacia isolated from patients with cystic fibrosis. // Infect. Immun., Apr -1992; V. 60: -P. 1434 1440.

135. Sajjan U., Xie H. et al. Identification and molecular analysis of cable pilus biosynthesis genes in Burkholderia cepacia. // Microbiology, Apr -2003; V. 149: -P. 961 -971.

136. Sakellaris H., Munson G.P. & Scott J.R. A conserved residue in the tip proteins of CS1 and CFA/I pili of enterotoxigenic Escherichia coli that is essential for adherence. -1999. I I Proc Natl Acad Sci USA. V. 96: -P. 1282812832.

137. Sakellaris H., & Scott J.R. New tools in an old trade: CS1 pilus morphogenesis. -1998. // Mol Microbiol. V. 30: -P. 681-687.

138. Sauer K., Camper A.K. et al. Pseudomonas aeruginosa displais multiple phenotypes during development as a biofilm. // J. Bacteriol. -2002. V. 184: -P. 1140-1154.

139. Sauer K., Cullen M.C., et al. Characterization of Nutrient-Induced Dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAOl Biofilm. // J. Bacteriol., Nov -2004; V. 186: -P. 7312 7326.

140. Scordilis G.E., H.Ree, T.G. Lessie Identification of transposable elements which activate gene expression in Pseudomonas cepacia. // J. Bacteriol. -1987. V. 169: -P. 8-13.

141. Sherry L. Kuchma, John P., Connoly, and O'Tool G.A. A Three-Component Regulatory System Regulates Biofilm Maturation and Type III Secretion in Pseudomonas aeruginosa. I I Journal of Bacteriology. Feb. -2005. -P. 1441-1454.

142. Shapiro J.A. Bacterial as multicellular organism. // Sci. Am. -1998. V. 256: -P. 82-89.

143. Shapiro J.A. Thinking about bacterial populations as multicellular organism. // Ann. Rev. Microbiol. -1998. V. 52: -P. 81-104.

144. Simpson D.A., Ramphal R., and Lory S. Characterization of Pseudomonas aeruginosa fliO, a gene involved in flagellar biosynthesis and adherence. -1995. // Infect. Immun. V. 63: -P. 2950-2957.

145. Slauch J.M., Mahan M.J., and Mekalanos J.J. In vivo expression technology for selection of bacterial genes specifically induced in host tissues. //MethodsEnzymol, Jan -1994; V. 235: -P. 481-92.

146. Smith R.S., Harris S.G., Phillips R., Iglewski B. The Pseudomonas aeruginosa quorum sensing molecule N-(3-oxododecanoil) homoserine lacton contributes to virulence and induce inflammation in vivo. // J. Bacteriol. -2002, V. 184: -P. 1132-1139.

147. Sokol P.A., Sajjan U., Visser M.B., Gingues S., Forstner J., and Kooi C. The CepIR quorum-sensing system contributes to the virulence of Burkholderia cenocepacia respiratory infections. -2003. I I Microbiology. V. 149: -P. 3649-3658.

148. Sokol P.A., Lewis C.J., and Dennis J.J. Isolation of a novel siderophore from Pseudomonas cepacia. -1992. // J. Med. Microbiol. V. 36: -P. 184-189.

149. Soto G.E. and Hultgren S.J. Bacterial Adhesins: Common Themes and Variations in Architecture and Assembly. // J. Bacteriol., Feb -1999; V. 181: -P. 1059 1071.

150. Sousa S.A., Ulrich M., Bragonzi A. et al. Virulence of Burkholderia cepacia complex strains in gp91phox-/- mice. // Cell Microbiol, December 1, -2007; V. 9(12): c. 2817-25.

151. Stoodley P., Sauer K. et al. Biofilms as complex differentiated communities. // Ann. Rev. Microbiol. -2002. V. 56: -P. 187-209.

152. Stephan H., Freund S., Beck W., Jung G., Meyer J.M., and Winkelmann G. Ornibactins a new family of siderophores from Pseudomonas. -1993. // Biometals. V. 6: P. 93-100.

153. Steinberger R.E, Holden P.A. Extracellular DNA in single- and multiple-species unsaturated biofilms. // Appl Environ Microbiol. 2005. V. 71(9): -P. 5404-10.

154. Stevenson M.M., Kondratieva Т.К., Apt A.S., Tam M.F., and Skamene E. In vitro and in vivo T cell responses in mice during bronchopulmonary infection with mucoid Pseudomonas aeruginosa. // Clin Exp Immunol, January 1,-1995; V. 99(1): -P. 98-105

155. Sun L., Jiang R.Z., Steinbach S. & 7 other authors. The emergence of a highly transmissible lineage of cbl+ Pseudomonas (Burkholderia) cepacia causing CF centre epidemics in North America and Britain. -1995. // Nat Med. V. 1: -P. 661-666.

156. Su S., Stephens B.B., Alexandre G. et al. Lon protease of the -proteobacterium Agrobacterium tumefaciens is required for normal growth, cellular morphology and full virulence. // Microbiology, Apr -2006; V. 152: -P. 1197- 1207.

157. Taga M.E. and Bassler B.L. Chemical communication among bacteria. // Proc. Natl. Acad. Sci. -2003. V. 100: -P. 14549 14554.

158. Taga M.E., Semmelhack J.L., Bassler B.L., The luxS-dependent autoinducer AI-2 controls the expression of an ABC transport that functions in AI-2 uptake in Salmohella typhimurium. // Mol. Microbiol. -2001. V. 42: -P. 777-793.

159. Teresa A. Urban, Adam Griffith, Anastasia M. Torok, Mark E. Smolhin, Jane L. Burns, and Joanna B. Goldberg. Contribution of Burkholderia cenocepacia Fagella to Infectivity and Inflammation. -2004. // Infection and Immunity. -P. 5126-5134.

160. Tennent J.M., and Mattick J.S. Type 4 fimbriae, In P. Klemm (ed.), Fimbriae: adhesion, genetics, biogenesis, and vaccines. // Ann Arbor, Mich. CRC Press, -1994. -P. 127-146.

161. Tomlin K.L., Clark S.R., and Ceri H. Green and red fluorescent protein vectors for use in biofilm studies of the intrinsically resistant Burkholderia cepacia complex. // J. Microbiol Methods, Apr -2004; V. 57(1): -P. 95-106.

162. Tomich M. and Mohr C.D. Adherence and autoaggregation phenotypes of a Burkholderia cenocepacia cable pilus mutant. // FEMS Microbiol Lett, Nov -2003; V. 228(2): -P. 287-97.

163. Tsilibaris V., Maenhaut-Michel G., and Van Melderen L. Biological roles of the Lon ATP-dependent protease. // Res Microbiol, Oct -2006; V. 157(8):-P. 701-13.

164. Vasil M.L., Kreig D.P., Kuhns J.S. et al. Infect. -1990. // And Immun. V. 58: -P. 4020-4029.

165. Vasseur P., Vallet-Gely I. et al. The pel genes of the Pseudomonas aeruginosa РАК strain are involved at early and late stages of biofilm formation. // Microbiology, Mar -2005; V. 151: -P. 985 997.

166. Visser M.B., Majumdar S., Hani E., and Sokol P.A. Importance of the Ornibactin and Pyochelin Siderophore Transport Systems in Burkholderia cenocepacia Lung. // Infections Infect. Immun., May -2004; 72: -P. 2850 -2857.

167. Vidal О., Longin R. et al. Isolation of an Escherichia coli K-12 Mutant Strain Able To Form Biofilms on Inert Surfaces: Involvement of a New ompR Allele That Increases Curli Expression. // J. Bacteriol., May -1998; V. 180: -P. 2442 2449.

168. Waters C.M. and Bassler B.L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu Rev Cell Dev Biol. -2005; V. 21: -P. 319-46.

169. Wall D., and Kaiser D. Type IV pili and cell motility. // Mol. Microbiol. 1999. V. 32: p. 1-10.

170. Whitchurch C.B., and Mattick J.S. Characterization of a gene, pilU, required for twitching motility but not phage sensitivity in Pseudomonas aeruginosa. 1994.//Mol. Microbiol. V. 13: p. 1079-1091.

171. Whitchurch C.B., Hobbs M., Livingstone S.P., Krishnapillai V., and Mattick J.S. Characterization of Pseudomonas aeruginosa twitching motility gene and evidence for a specialised protein export sysrem in eubacteria. -1991. //Gene. V. 101:-P. 33-44.

172. Zhu J., Miller M.B., Vance R.E. et al. Quorum sensing regulation control virulence gene expression in Vibrio cholerae. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2002. V. 99:-P. 3129-3134.

173. Zielinski N.A., Chakrabarty A.M. and Alan Berry. Characterization and regulation of the Pseudomonas aeruginosa algC gene encoding phosphomannomutase. // The journal of biological chemistry. -1991. V. 266. № 15: -P. 9754-9763.

Информация о работе

Андреев, Александр Львович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Получение мутантов Burkholderia cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы