Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биопленок с антибиотиками

Тец, Георгий Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биопленок с антибиотиками
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биопленок с антибиотиками"

□ОЗОВ2Э48

На правах рукописи

Тец

Георгий Викторович

РОЛЬ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК ИЛИПИДОВ МАТРИКСА ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ БАКТЕРИЙ БИОПЛЕНОК С АНТИБИОТИКАМИ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2007

003062348

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Аркадьева Галина Евгеньевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Кветная Ася Степановна

доктор медицинских наук,

профессор Афиногенов Геннадий Евгеньевич

Ведущее учреждение: ГОУДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится 22 мая 2007 г. в «_» часов на заседании

диссертационного Совета Д.208.086.03. при ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И. И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д. 47).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И. И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Автореферат разослан «_» апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

А.Г. Бойцов

Актуальность темы. Последнее десятилетие ознаменовалось формированием новых представлений об организации жизни бактерий, особенностей их существования во внешней среде и организме человека. Основные открытия в этой области связаны с изучением бактериальных биопленок (Тец В. В., 1998; Ашапо А. et al., 1999; Costerton J. W. et al., 1999; Watnic P. et al., 2002). Накопившиеся данные свидетельствуют об особенностях свойств бактерий, находящихся в составе сообществ, наиболее актуальным из которых для практической медицины следует считать повышенную выживаемость микроорганизмов в биопленках (Anderl J. N. et al., 2000; Lewis К., 2001). Бактерии в составе сообществ выживают в присутствии антибиотиков, взятых в количествах, значительно превосходящих минимальную подавляющую концентрацию. Возможно, антибиотики вообще не могут полностью уничтожить бактерии биопленок, поскольку в последних обнаружены клетки, находящиеся в силу дифференцировки в состоянии полной устойчивости практически ко всем известным препаратам (Keren I. et al., 2004; Harrison J.J. et al., 2005; Lewis К., 2005). Несмотря на свою актуальность, биопленки остаются во многом слабо щученными. Очень мало известно о структуре, составе и функциях компонентов внеклеточного матрикса бактериальных сообществ. Среди различных молекул, обнаруженных в составе матрикса, особое внимание привлекают липиды и внеклеточная ДНК. Ли-пиды входят в состав поверхностной оболочки, отграничивающей сообщество от внешней среды, формируя мембраноподобную структуру (Tetz V.V. et al., 1993; Zhou L. et al., 1998). Такая оболочка, предположительно, может служить преградой на пути антибиотиков в биопленку (Тец В. В., 1997). Большое внимание исследователей в последние годы привлекает ДНК, которую можно обнаружить за пределами клеток эукариот (Anker Р., Stoun М., 2000; Bergsmedh А. et al., 2002; Anker Р. et al., 2004). Внеклеточная ДНК бактерий остается мало изученной. Почти ничего не известно о её путях распространения и функциях. На сегодня, практически нет данных о путях экспорта ДНК в межклеточный матрикс микробных биопленок. Вместе с тем, внеклеточная ДНК в биопленках представляет особый интерес для понимания механизмов и путей горизонтального переноса генов между различными микроорганизмами. Можно предполагать, что исследование внеклеточной ДНК биопленок поможет в понимании особенностей их развития и изменчивости признаков, а также эффективности перераспределения генов, в особенности, контролирующих антибиотико-устойчивость и патогенность. Возможно, внеклеточная ДНК станет новой мишенью для воздействия на микроорганизмы.

Цель исследования - изучить состав фосфолипидов и содержание внеклеточной ДНК бактериальных биопленок, оценить возможность повышения эффективности антибиотикотерапии за счет воздействия на компоненты матрикса микробных сообществ.

Задачи исследования

1. Изучить состав фосфолипидов матрикса и поверхностной оболочки биопленок неродственных представителей грамположительных и грам-отрицательных бактерий.

2. Произвести поиск и охарактеризовать внеклеточную ДНК в мат-риксе биопленок неродственных бактерий на различных стадиях развития сообщества.

3. Оценить связь матриксной ДНК и изучить возможность воздействовать на неё с целью изменения свойств биопленки.

4. Изучить влияние ДНКазы на активность передачи генов, интенсивность формирования и сохранение признака антибиотикоустойчивости в биопленках.

5. Проверить эффективность воздействия на бактерии биопленок антибиотиков, способных преодолевать мембрану клеток эукариот.

6. Оценить эффективность совместного действия ДНКазы и антибиотиков на биопленки разного возраста неродственных грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное изучение состава внеклеточных фосфолипидов матрикса и поверхностной оболочки различных неродственных моно- и смешанных микробных сообществ. Выполнен поиск и идентификация внеклеточной ДНК микробных биопленок. Установлено, что в составе поверхностной оболочки биопленок и внеклеточном матриксе фосфолипиды по качественному составу аналогичны мембранным, но количественно в них преобладают стабильные фракции. Показано, что в матриксе различных, неродственных микроорганизмов присутствует внеклеточная ДНК, которая содержит гены бактериальной хромосомы и плазмид. Доказано, что антибиотики, способные проникать через мембрану клеток, действуют на бактерии, находящиеся в биопленках. Впервые установлено, что разрушение внеклеточной ДНК приводит к невосстановимым изменениям различных свойств биопленок неродственных бактерий, сопровождающимся снижением числа антибиотикоустойчивых клеток. Впервые доказана возможность усиления действия на биопленки неродственных микробов различных антибиотиков за счет воздействия на

компонент матрикса - внеклеточную ДНК. Предложены новые способы борьбы с инфекционными заболеваниями (патенты РФ № 2267329, № 2269358, №2269359).

Практическая ценность работы

На основании полученных данных стало возможным использовать новые критерии выбора антибиотиков для действия на бактерии, основанные на способности препарата проникать через липидную оболочку биопленок, что позволяет повысить эффективность антибиотикотерапии и уменьшить число осложнений.

Использование ДНКазы для воздействия на бактериальные биопленки позволяет уменьшить их биомассу, а также интенсивность образования и сохранения антибиотикоустойчивых клонов.

Выявлена новая мишень - внеклеточная ДНК матрикса биопленок для воздействия на бактерии с целью повышения эффективности антибиотикотерапии. Использование ДНК матрикса, как дополнительной мишени при терапии, позволяет повысить эффективность действия различных антибиотиков на неродственные микробы, находящиеся в биопленках, снизить вероятность возникновения, распространения и сохранения устойчивости к лечебному агенту, сократить общую продолжительность терапии, уменьшить сроки пребывания больных в стационаре и снизить частоту рецидивов заболевания.

Разработаны и внедрены в клиническую практику новые эффективные схемы антимикробной терапии, включающие воздействие на внеклеточную ДНК фермента ДНКазы у больных с абсцессами и флегмонами челюстно-лицевой локализации.

Внедрение в практику

Разработаны и внедрены в клиническую практику кафедры хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Санкт-Петербургского государственного университета им. акад. И. П. Павлова новые эффективные схемы антимикробной терапии, включающие воздействие на внеклеточную ДНК матрикса ДНКазой у больных с абсцессами и флегмонами челюстно-лицевой локализации.

Получены патенты РФ: Способ лечения заболеваний, сопровождающихся изменениями качественного и/или количественного состава внеклеточной ДНК крови /В. В. Тец, Г. В. Тец, Д. Д. Генкин // Патент РФ № 2267329 от 10 января 2006; Способ лечения генерализованных инфекций, вызываемых бактериями, или заболеваний, вызываемых грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболева-

ний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, обусловленных мутациями генов соматических клеток /В. В. Тец, Г. В. Тец, Д. Д. Генкин // Патент РФ № 2269358 от 10 февраля 2006; Способ профилактики развития онкологических заболеваний, или инфекций, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, развивающихся вследствие мутации генов соматических клеток /В.В. Тец, Г.В. Тец, Д.Д. Генкин // Патент РФ № 2269359 от 10 февраля 2006.

Материалы диссертации внедрены в лекционные курсы по общей и частной медицинской микробиологии для студентов и врачей в Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. акад. И. П. Павлова.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Наличие фосфолипидов в поверхностной оболочке и матриксе бактериальных биопленок позволяет использовать новые принципы в выборе антибиотиков, активных против микробов, находящихся в составе сообществ.

2. Добавление ДНКазы на разных стадиях существования бактериальных биопленок ведет к нарушению их образования, уменьшению биомассы, снижению эффективности формирования и сохранению антибиотико-устойчивых клонов.

3. Совместное применение ДНКазы и антибиотиков ведет к усилению антибактериального эффекта при действии на биопленки неродственных бактерий разного возраста.

Апробация результатов исследования

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях симпозиумах и съездах:

Международная конференция «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины» Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова (2006 г.).

Научно-практическая конференция «Санкт-Петербургский научно-технический потенциал в решении проблем лабораторной медицины - Сделано в Санкт-Петербурге» (2007).

1st European Congress of Microbiology, 2003. Ljubljana, Slovenia.

43rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC) September 14-17,2003. Chicago, II, USA.

Fourth International Conference on Circulating Nucleic Acids in Plasma / Serum (CNAPS-IV)) (London, 2006).

Диссертация апробирована на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии/НИЦ отдела молекулярной биологии и генетики и на проблемной комиссии «микробиология и иммунология» СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (2007).

Личный вклад автора

Личное участие автора осуществлялось на всех этапах работы. Автор участвовал в определении идеи исследования. Лично автором выполнены микробиологические и молекулярно-генетические исследования, разработаны методы идентификации внеклеточной ДНК матрикса и созданы оригинальные праймеры. Произведены статистическая обработка результатов и анализ полученных данных.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 4 статьи в ведущих рецензируемых изданиях РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация представлена в одном томе, состоит из введения, 3 глав, содержащих: обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований; заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 50 таблиц и 16 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили стандартные штаммы грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий, полученные из международных коллекций и выделенные у больных в клиниках урологии, акушерства и гинекологии, госпитальной терапии, хирургической стоматологии и че-люстно-лицевой хирургии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова: Acinetobacter baumanii VT54; Enterobacter spp. VT1620; Enterobacter VT955; Escherichia coli ATCC 25922; E. coli K-12; E. coli XL-1 blue AmpR (плазмидная устойчивость к ампициллину и тетрациклину, плазмида pNF-kB-Luc); Е. coli G-1 KmR; Haemophilus influenzae VT450-2006; Klebsiella pneumoniae КП367; Pseudomonas aeruginosa VT592; Staphylococcus aureus ATCC 29213; S.aureus ATCC 25923; S..aureus VT209; S. aureus VT38, S. epidermidis VT43; S. epidermidis VT82; S.epidermidis VT710; S.pyogenes VT59.

Питательные среды. Мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), минимальная синтетическая среда М9, бульон Мюллер-Хинтон (bioMerieux), агар Мюллер-Хинтон (bioMerieux), Шедлер агар (bioMerieux) и трипказосоевый агар (bioMerieux), среда LB (Sigma).

Антибиотики и ферменты. В работе использованы различные природные и синтетические антибиотики: азитромицин (Отечественные Лекарства, Россия), ампициллин (Hemofarm DD, Югославия), гентамицин (Lederle, США), канамицин (ICN, США) левофлоксацин (Отечественные Лекарства, Россия), линкомицин (ICN, США), цефотаксим (Lek DD, Словения), ципрофлоксацин (Bayer, Германия), рифампицин (ICN, США), тетрациклин (BioMerieux, Франция). Дезоксирибонуклеаза I - ДНКаза I (ООО «Самсон», Россия), папаин (Loba Chemie), протеиназа К (Sigma, США), лизоцим (Serva, Германия). Жизнеспособность бактерий оценивали, определяя число колониеобразующих единиц (КОЕ) методом серийных разведений. Для этого готовили последовательные десятикратные разведения в физиологическом растворе и по 0,1 мл высевали на агаризованную среду, после чего инкубировали 24 часа при Т= 37 °С и подсчитывали количество выросших колоний.

Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотиков определяли на жидкой и плотной питательной средах, используя метод серийных разведений. Метод основан на последовательных двукратных разведениях антибиотика. Бактериальную суспензию вносили в количестве, соответствующем стандарту мутности 0,5 по McFarland, и инкубировали при Т= 37 °С. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), при которой бактериальный рост визуально не определялся, принимали за МПК.

Получение биопленок. Во флаконах на дно помещали покровное стекло размером 1,5 см на 0,5 см, затем вносили 0,4 мл бульонной культуры (5x108 КОЕ), инкубировали 3 часа при Т= 37 °С и после этого добавляли свежую среду до 2,0 мл. Флаконы выдерживали требуемое время при Т = 37 °С. Образование биопленки оценивали микроскопически, для чего покровные стекла извлекали из флаконов, отмывали фосфатным буфером, фиксировали 96° этиловым спиртом и окрашивали раствором генциан-виолета. В чашках Петри (D = 40 мм) вносили по 0,8 мл бактерий в конечной концентрации (5х108 КОЕ), инкубировали 3 часа при Т = 37 °С и после этого добавляли по 2 мл свежей среды. Чашки выдерживали 24 часа при Т = 37 °С. В пластиковых планшетах (96-луночные планшеты Sarstedt, Германия) в лунки вносили по 0,1 мл бульонной культуры бакте-

рий (5хЮ7КОЕ), выращивали в течение 24 часов при Т= 37 °С. Для оценки состояния биопленок удаляли содержимое лунок, промывали трехкратно фосфатным буфером, высушивали, окрашивали раствором генцианвио-лета (50 мкл/лунку) в течение 10 минут, промывали фосфатным буфером, затем добавляли 96° этиловый спирт (200 мкл/лунку) и учитывали результаты на ридере (Stat-Fax-2100) при длине волны 560 нм.

Получения внеклеточного матрикса. Бактериальные сообщества смывали или соскабливали с поверхности в минимальном объеме дистиллированной воды или изотонического раствора хлорида натрия. Полученную суспензию центрифугировали для разделения на фракции клеток и внеклеточного матрикса.

Выявление мутантов антибиотикоустойчивости. Исходную микробную взвесь высевали на агаризованную среду, содержащую рифампицин в концентрации 25 мкг/мл. Количество мутантов, давших рост на среде с антибиотиком, определяли через 72 часа инкубации при Т= 37 °С. Анти-биотикоустойчивыми считали клоны, которые росли после пересева на свежую среду содержащую рифампицин.

Выявление передачи генов антибиотикоустойчивости проводили при совместном культивировании Е. coli XLl-Blue KmR и Е. coli Gl AmpR на средах без антибиотика, содержащих раздельно канамицин или ампициллин а также канамицин с ампициллином. Учет опыта проводили через 24 или 48 часов.

Выделение нуклеиновых кислот из внеклеточного матрикса сообществ выполняли методами фенол - хлороформной и гуанидин-тиоционатной экстракции, а также при помощи стандартного набора для выделения ДНК «ДНК сорб-Б» (Маниатис Т. и др., 1994).

Электрофорез ДНК выполняли в 0,7-2,0% агарозном геле. В качестве буфера использовали 50 мМ трис-ацетатный буфер (0,04 М пятидесятикратного трис-ацетата, 0,002 М ЭДТА, вода остальное), pH 7,5. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием.

Определение количества и структуры ДНК. Содержание и структуру ДНК бактерий и матрикса определяли с использованием 4',6-диамидино-2-фенилиндола (ДАФИ) (фирма «Serva», Германия) в конечной концентрации 0,4 мкг/мл после лизиса образцов в условиях получения нуклеоида. Для изучения изменений структуры ДНК применяли двухпараметровый флуоресцентный анализ суперспиральной структуры полинуклеотида, включающий использование интеркалятора - этидий бромида («Sigma», США) и неинтеркалирующего ДНК-лиганда - ДАФИ, как описано ранее

(Иванов С.Д., и др. 1999). Целостность клеточных мембран оценивали по изменению их проницаемости, для чего определяли величину флуоресценции пробы после обработки клеток ДНК-специфичным флуорохромом. Все измерения проводили на флуоресцентном спектрофотометре «Model-850» (фирма Hitachi, Япония). Для ДАФИ устанавливали Хвозб = 350 нм, А,эм = 450 нм, для этидий бромида - Хвозб = 510 нм, Аэм = 590 нм.

Выявление генов 16S рибосомальной ДНК в межклеточном матриксе проводили по следующей паре олигонуклеотидных праймеров: 5'-ТСС-TACGGGGGCAGAGT-3' и 5'-GGАСТАССAGGGTATCTAATCCTGTT-3' с длиной ампликона равной 466 нуклеотидов (NCBI-BLAST). Синтез праймеров проведен в ООО «Синтол». Реакцию ставили в присутствии 0,2 % шМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов 2,5 mM MgCl2, 30 тМ Трис-HCl (pH 8,5 при +25 °С), 16 mM (NH4)2S04, 0,1 % Nonidet Р40 («Sigma»), по 0,5 мкл олигонуклеотидных праймеров и 2,5 Ед Dia Taq ДНК полимеразы (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребсоюза, Россия) на амплифи-каторе «Teche» (Англия). Условия проведения ПЦР: 95 °С 3 мин 30 с; затем 94°С 15 с, 58 °С 30 с; 72 °С 45 с - 37 циклов; затем 72 °С 7 минут 35 с. ПЦР фрагменты анализировали электрофорезом в 2 % агарозном геле окрашиванием бромистым этидием. С помощью маркера молекулярной массы (100 bp DNA Ladder BioLabs 500 мкг/мл) подтверждали соответствующие размеры интересующего фрагмента искомого ампликона. В качестве положительного контроля использовали 2,5 мкл бактериальной культуры E.coli АТСС 25922 в концентрации 105 клеток/мл (Harris К.А., Hartley J.C., 2003). Негативный контроль отражал наличие контаминации ПЦР реактивов бактериальной ДНК. Для этого, вместо опытных образцов, к ПЦР реактивам добавляли 2,5 мкл стерильной воды для инъекций (Мик-роген, Россия).

Изучение липидного состава бактериальных сообществ выполнено с использованием меченного фосфата - Na2H33P04 («Изотоп», Россия) общей активностью 30 мкКюри. поверхностную оболочку биопленки для её отделения от слоя бактериальных клеток фиксировали 15 мл 0,25 % раствора глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,2. Липид-ный состав определяли методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии на пластинах «Sorbfil» фирмы «Сорбполимер» (Россия) с размером зерен сорбента 8-12 мкм. Проводили двумерное разделение в следующих системах растворителей - 1-е направление: хлороформ-метанол-аммиак (70 : 30 : 2, об/об); 2-е направление: хлороформ-метанол-вода (65 : 25 : 4, об/об). Объемы липидных экстрактов препаратов клеток и биопле-

нок, наносимых на пластины, выравнивали по радиоактивности. Включение радиоактивной метки в фосфорсодержащие компоненты липидных экстрактов определяли авторадиографически наложением хроматограмм на пластины Biomax MR фирмы «Kodak» и экспонированием в течение 3—7 суток при комнатной температуре. Зоны меченых соединений выявляли по процедуре, специально разработанной этой фирмой для авторадиографических пленок. Изготовление сканограмм проводили после просмотра готовых пленок на приборе DeskScan II фирмы HP. Соотношение отдельных липидных компонентов в препаратах рассчитывали путем оценки радиоактивности отдельных пятен хроматограмм. С этой целью сорбент с соответствующих зон пластинок аккуратно выскребали и количественно переносили в виалы, содержащие 10 мл сцинтилляционной жидкости «Ecolite» фирмы ICN. Уровень радиоактивности проб измеряли на установке «БЭТА-2» (СССР). Изучение фосфолипидного состава выполнено совместно с Лабораторией биохимии и развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, за что автор выражает глубокую признательность руководителю, профессору В.H Коробову и сотрудникам.

Статистическая обработка выполнена с использованием методов вариационной статистики. Наряду со средним арифметическим значением (М), вычисляли величины среднеквадратичной ошибки (ст сигма), определяли доверительные границы выборочного параметра. При представлении количественных данных приводятся значения М+/- а. Достоверность различий оценивали, используя t - критерий Стьюдента при пороге доверительной вероятности 0,97 (Монцевичуте-Эрингене Е.В., 1964). Во всех таблицах суммированы данные трех и более независимых экспериментов. Для статистической обработки полученных результатов использовали пакет лицензированных прикладных программ «Stadia», версия 2; «Arcada», а также лицензированную программу для анализа данных биомедицинских исследований Primer for Biostatistics, Version 4.03 by Stanton A. Glantz 2000 r.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все использованные штаммы обладали культуральными и тинкто-риальными свойствами, характерными для данного вида микроорганизмов. При выращивании на плотных питательных средах бактерии образовывали колонии, колониеподобные сообщества, смешанные сообщества и биопленки.

Биопленки получали на дне лунок планшет, флаконов или поверхности стекол, помещенных на дно флаконов, чашках Петри. Биопленки изученных штаммов через 24 часа роста покрывали всю поверхность дна использованной посуды непрерывным «ковром», с зонами утолщения, образованными многослойными скоплениями клеток и участками, в которых при световой микроскопии бактерии не выявляются. При спектрофотометрическом изучении матрикса биопленок, отделенного от клеток центрифугированием, при разных длинах волн выявлены пики поглощения, характерные для белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот.

Липиды бактериальных биопленок. Согласно данным элекгронномикро-скопического анализа (Tetz V.V. et al., 1993; Zhou L. et al., 1998) поверхностная оболочка имеет компонент по строению сходный с мембраной. В результаты выполненного исследования установлено, что поверхностная оболочка биопленок и матрикс содержат фософолипиды. Фосфолипидный состав мембран использованных штаммов грамотрицательных и грамположительных бактерий различается. Качественный состав фосфолипидов клеточных мембран каждого штамма и матрикса образуемых ими биопленок совпадает, но различается количеством отдельных компонентов (табл. 1).

Таблица 1

Содержание фосфолипидов в экстрактах мембран бактериальных клеток и внеклеточного матрикса

Фракции фосфолипидов Содержание фосфолипидов (%)

Е coli S aureus E.coli+S aureus

К М К М К М

1.Фосфатидилглицерол -PG 10,0 13,4 71,6 32,2 14,0 3,2

2.Лизофосфатидилглицерол-LPG 1,4 - 5,6 0,7 0,8 0,5

З.Фосфатидил-этаноламин -PEA 80,3 70,4 2,7 0,9 65,8 62,6

4.Лизофосфатидил-этаноламин- LPEA 1,8 1,2 - - 0,5 0,8

5. Фосфатидная кислота -РА 0,1 0,9 - - <0,1 0,5

6. Кардиолипин -CL 4,6 12,2 7,7 65,5 11,9 31,0

7.Сумма лизофосфолипидов 4,3 1,2 17,4 1,3 3,5 1,3

Примечание: К - клетки; М - матрикс

В экстрактах липидов клеток и матрйкса, полученных из смешанной биопленки, образованной стафилококком и кишечной палочкой, обнаруживаются практически все основные компоненты фосфолипидов, характерные для каждого из составляющих газон видов бактерий. Обращает на себя внимание; что различия количеств фракций фофсолигшдов мембран и матрйкса в биопленках, образованных отдельными бактериями или их смесью, касаются, прежде всего, стабильных и нестабильных фракций. Так, мембраны всех бактерий по сравнению с матриксом содержат значительно больше нестабильных йизофосфолипвдов. В то же время, матрикс несет значительно больше сравнительно стабильного кардиолипина. Повышенное содержание кардиолипина в лип идах внеклеточного пространства биопленки, во-видимому, является важной предпосылкой Стихийного образования мембраны или мембран«подобной структуры повышенной прочности, которая может функционировать в качестве защитного барьера между сообществом бактериальных клеток и окружающим пространством.

Сравнение свойств внеклеточной ДНК, полученной из биопленок разного типа грамположительных н грамотрицательныX бактерий, показало, что во всех пробах матрйкса, присутствует внеклеточная ДНК с молекулярной массой, примерно. 30 кДа (рис. 1).

1. ДНК матрйкса бйоплекки Е. coli

2. к HINT III

3. Д!¡К матриксабиопленкиS. aureus

Рис. 1. Электрофоре грамм а внеклеточной ДНК матрйкса микробных сообществ 4 coli А ТС С 25922 и S. aureus 209.

Использованный метод электрофоретиче^кого разделения в агарозном геле с концентрациями от 0,5 до 2,0 % не показал различий в величине фрагментов ДНК матрйкса, полученной из различных сообществ неродст-

венных бактерий (S. aureus VT209, Е. coli АТСС 25922, Р aeruginosa VT592 , A. baumanii VT-54, S. pyogenes VT59.). Изучение внеклеточной ДНК, выделенной из смешанных микробных сообществ, образованных S. aureus VT209 и Е. coli АТСС 25922, при электрофорезе идет единым, не разделенным фронтом, не отличимым от фрагментов, обнаруженных в сообществах сформированных бактериями одного типа. При исследовании внутриклеточной ДНК бактерий установлено, что кроме хромосомной ДНК в клетках биопленок, полученных на плотной и в жидких питательных средах, у грамполо-жительных и грамотрицательных бактерий содержатся участки ДНК с молекулярной массой, примерно, 30 кДа. Полученные данные позволяют предположить, что фрагменты образуются внутри клеток.

Выявление генов хромосомной ДНК во внеклеточном матриксе биопленок выполнено с использованием разработанного нами праймера, (консервативный участок генома, кодирующий 16S рибосомальню РНК) выбранного в результате анализа сиквенированных геномов бактерий (NCBI BLAST http://l30.14.29.110/sutils/genom_table.cgi=microb). В результате проведенных исследований, во внеклеточном матриксе биопленок, сформированных E.coli АТСС 25922 и S. aureus VT-209, обнаружены фрагменты хромосомной ДНК

Оценка появления внеклеточной ДНК матрикса микробных сообществ на различных этапах роста показала, что изменение количества ДНК внутри бактерий и свободной во внеклеточном матриксе биопленок зависит от сроков роста сообщества и проницаемости мембран. Установлено, что по мере старения культуры (с 24 до 72 часов), не происходит значимого увеличения количества свободной ДНК в матриксе, в то время как содержание внутриклеточной ДНК снижается. Одновременно наблюдалось достоверное повышение проницаемости клеточных мембран после 72 ч роста по сравнению с 24- и 48-часовыми культурами бактерий. Опережение уменьшения количества внутриклеточной ДНК по отношению к нарушениям проницаемости мембран у эукариот указывает на апоптоз. Это свидетельствует в пользу того, что попадание ДНК во внеклеточный матрикс в стационарной стадии роста бактерий может быть связано с апоптозо-подобной гибелью клеток, существование которой описано в ряде работ (Yarmolinsky М.В., 1995; Hochman А., 1997; Lewis К., 2000; Sat В. et al., 2001).

Влияния экзогенных ДНКаз на внеклеточную ДНК бактериальных сообществ исследовано у большинства использованных штаммов. Фермент -ДНКаза I в разных количествах добавляли одновременно с засевом бактерий.

Установлено, что молекулярная масса ДНК, выделенной из биопленки, выращенной в присутствии ДНКазы, не отличалась от контрольной, однако ее количество было снижено. Полученные данные свидетельствуют, что во внеклеточном матриксе в присутствии ДНКазы происходит разрушение ДНК.

Формирование микробных сообществ в присутствии ДНКазы I и действие на уже образованные биопленки. Добавление ДНКазы в питательную среду одновременно с засевом бактерий для получения микробных сообществ у изученных штаммов неродственных грамположительных и грамотрицательных бактерий вызывало снижение оптической плотности биопленок. Использованные штаммы в присутствии ДНКазы образуют биопленки, по биомассе, определяемой на ридере, отличающиеся от обычных, полученных в тех же условиях, но без фермента. Одной из причин изменения свойств биопленки при добавлении ДНКазы, предположительно, могло быть образование токсических продуктов распада ДНК. Действие олиго-, моно- и динуклеотидов появляющиеся при добавлении ДНКазы, на бактериальные биопленки, оценивали, добавляя одновременно с засевом бактерий растворы, содержащие нуклеотиды в количестве 200 мкг/мл, 100 мкг/мл, 20 мкг/мл и 5 мкг/мл. Состояние биопленки определяли через 24 часа инкубации при 37°С. Оптическая плотность биопленок, выращенных при добавлении перевара ДНК в количестве от 5 до 200 мкг/мл, не отличалась от контрольных. Таким образом, полученные данные указывают, что изменения свойств биопленки при действии ДНКазы не связано непосредственно с токсичностью нуклеотидов, образуемых при распаде ДНК. Степень снижения оптической плотности биопленки, образованной в присутствии различных концентраций ДНКазы, имеет дозоза-висимый характер, что указывает на специфичность зарегистрированного эффекта (рис. 2).

В присутствии ДНКазы в биопленке зарегистрировано также снижение числа КОЕ. Вместе с тем, имеется несоответствие в степени снижения оптической плотности биопленки и уменьшения в ней числа КОЕ. Так, ДНКаза, добавленная в концентрации от 0,007 до 0,5 мкг/мл, вызывает уменьшение оптической плотности биопленки более чем на 20%, не приводя к изменениям числа КОЕ. Максимальное снижение числа КОЕ в биопленках у грамотрицательных и грамположительных бактерий было схожим и наблюдалось при концентрации ДНКазы 5 мкг/мл. Дальнейшее увеличение концентрации фермента не приводило к дополнительному, существенному уменьшению числа КОЕ, однако оптическая плотность биопленки продолжала снижаться. При действии на сформированные био-

пленки, ДНКаза также вызывает снижение их биомассы. Уменьшение оптической плотности 24-часовых сообществ грамотрицательных бактерий достигало 75% и зависело от концентрации фермента. При этом не наблюдалось значительной разницы между эффектами действия ДНКазы, добавленной в концентрациях от 5 мкг/мл, до 20 мкг/мл. Показано, что дозоза-висимость и усиление эффекта исчезают при увеличении концентрации выше определенного уровня. Предполагается, что лимитирующим фактором является проницаемость матрикса. При этом количество препарата, проникающего в биопленку, не нарастает параллельно увеличению его концентрации в окружающей среде.

Рис. 2. Угнетение формирования биопленки Е coli АТСС 25922 и S aureus 209.

Влияние ДНКазы на возникновение, сохранение и перераспределение признака антибиотикоустойчивости в биопленках. В присутствии ДНКазы, добавленной в количестве от 0,5 мкг/мл, наблюдается снижение частоты встречаемости в биопленках рифампицин устойчивых мутантов. Наименьшее число устойчивых клонов обнаружено при добавлении ДНКазы в количестве 5 мкг/мл. Влияния ДНКазы на передачу генов антибиотикоустойчивости в условиях планктонного роста и в биопленках изучали с использованием штаммов E.coli XL1 - Blue Kmr и E.coli Gl Ampr, имеющих плазмидную антибиотикоустойчивость к ампициллину или ка-намицину. Добавление ДНКазы в количестве 1 мкг/мл совместно с засевом бактерий при получении смешанного сообщества снижало число по-

являющихся антибиотикоустойчивых мутантов в 10 раз. Выживаемость антибиотикоустойчивого штамма E.coli XL-1 Blue при действии ДНКазы в условиях планктонного роста также снижалась, примерно, в 10 раз.

Действие на бактерии биопленок антибиотиков, способных проникать в клетки эукариот, было исследовано на примере левофлоксацина и азитр-омицина. Полученные результаты свидетельствуют, что данные антибиотики в количествах от 1 до 200 МПК, влияют на формирование, а также действуют на уже сформированные биопленки испытанных штаммов. Полного угнетения образования биопленок не происходит ни в одном случае. Для всех испытанных штаммов получены схожие по характеру результаты, пример которых по изучению азитромицина, приведен в табл. 2 и 3.

Таблица 2

Влияние азитромицина на сформированные биопленки S aureus VT209

Проба Характеристика биопленки

Биомасса биопленки в ЕД оптической плотности Биомасса биопленки в % по отношению к контролю

1* 2 3 1 2 3

Интактный контроль 1,980 2,110 2,270 100% 100% 100 %

Азитромицин 1 МПК 1,968 2,050 2,205 99,0% 97,0% 97,1%

Азитромицин 10МПК 1,666 1,840 1,950 84,0% 87,0% 85,9%

Азитромицин 100 МПК 1,074 1,320 1,470 66,2% 62,5% 64,7%

Примечание: *-№эксперимента.

ТаблицаЗ.

Влияние азитромицина на число КОЕ сформированных биопленок S aureus VT209

Проба Число КОЕ

Интактный контроль (3,0±0,1)109

Азитромицин 1 МПК (2,5±0,1)109

Азитромицин 10 МПК (9,0±0,1)108

Азитромицин 100 МПК (6,4±0,1)108

Примечание: * - среднее по результатам трех опытов

Таким образом, можно говорить, что левофлоксацин и азигромишш проникают через липидсодержащую поверхностную оболочку биопленок: различных неродственных грамположительных и грамотрицательных бактерий. При этом регистрируется снижение биомассы и числа жизнеспособных бактерий.

Совместное действие ДНКазы и антибиотиков было изучено с использованием препаратов вне зависимости от способности последних проникать в интактные биопленки использованных штаммов бактерий. При формировании биопленок антибиотики использовали а субингибирующих концентрациях (ниже МПК в 5-10 раз), которые, добавленные при засеве, снижают биомассу образовавшейся биопленки, в среднем, на 20-25 %. При совместном действии фермента и антибиотика зарегистрировало усиление угнетения формирования биопленок. Комплексы антибиотиков с ДНКазой снижали биомассу сообщества на 60-70%. Взаимное потенци-ирование действия нуклеазы и антибио г и кон обнаружено у всех испытанных комплексов (рис. 3).

Рис. 3. Совместное действие ДНКазы и антибиотиков на формирование биопленки S. aureus VT - 3ii,

Уровень снижения оптической плотности, и присутствии различных антибиотиков, мало различался у исследованных штаммов неродственных грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Антибиотики к 24 часовым биопленкам добавляли в количестве 100 мкг/мл. При этом препараты вызывали незначительное, на 15-20%, уменьшение их биомассы. "Уровень снижения оптической плотности, в присутствии различных антибиотиков, мало различался у исследованных штаммов неродственных грамположительных и грамотрицательных бактерий. Фермент - ДНКаза, добавленная к 24 часовым биопленкам различных бактерий, вызывает однотипный эффект (как это видно, например, на рис. 4), проявляющийся в снижении оптической плотности более чем на 40 %.

С': .#1К-Н1 &Рра2 - амгЛчггии.^нК-м

Рис, 4. Совместное действие ДНК-азы и антибиотиков на 24-часовуЮ биопленку Е.соЦ АТСС-25922.

Анализ выживаемости бактерий в присутствии ДНКазы и антибиотиков в 24 часовой биопленке показал, что среди препаратов (ампициллин, гентамицщ цинрофлоксацин. линкомицин, цефотаксим), взятых в концентрациях 100 мкг/мл только гентамицин снижал число КОЕ в 24 ч биопленке, Например, если в контроле число КОЕ Е.соП АТСС 25922 составляло (9,32+0,18)х103, то после воздействия гентамицин а - (2,29+0.13]х 10'\

Нуклеаза в количестве 5 мкг/мл не изменяла число КОЕ в 24-часовых биопленках испытанных штаммов грамотрицательных и грамположитель-ных бактерий. Установлено, что в присутствии ДНКазы и использованных антибиотиков регистрируется снижение числа КОЕ (табл. 4).

Поскольку сами по себе ферменты не влияли на жизнеспособность бактерий, выявленный феномен связан, скорее всего, с увеличением поступления антибиотиков внутрь биопленок.

Таблица 4

Выживаемость Е coli АТСС 25922 в 24-часовых биопленках в присутствии ДНК-азы и антибиотиков

Препарат Число КОЕ

Контроль (9,32±0,18)х 108

ДНК-аза (8,91±0,29) х 108

Ампициллин (5,36±0,17) х 108

Ампициллин + ДНК-аза (1,81±0,23) х 107

Ципрофлоксацин (6,25±0,18)х 108

Ципрофлоксацин +ДНК-аза (3,57±0,24) х 107

Гентамицин (2,29±0,13) х 106

Гентамицин+ ДНК-аза (1,43±0,16) х 105

Цефотаксим (6,42±0,18) х 108

Цефотаксим4 ДНКаза (5,94±0,29) х 107

Восстановление биопленки, после действия ДНКазы и антибиотиков имело индивидуальный характер. Через 168 часов после окончания действия ДНКазы биомасса бипленок не восстанавливалась и составляла у стафилококка 64,4 %, а кишечной палочки 38,6 % от контрольного уровня. По отношению к E.coli были испытаны левофлоксацин (3 МПК-10 мкг/мл) и гентамицин (100 мкг/мл), при этом через 7 суток не наблюдалось восстановление биомассы биопленки по отношению к контролю. Через 168 часов биопленки S. aureus после воздействия левофлоксацина и азитроми-цина частично восстановились, и их биомасса составила по отношению к контролю около 78% и 98% соответственно. Восстановление не отмечено после удаления гентамицина, когда биомасса биопленок после 7 суток роста составляла, примерно, 56% от контроля. Таким образом, установлено, что изменения биопленки, вызванные однократным добавлением ДНКазы, сохраняются на протяжении всего эксперимента у использованных штаммов грамотрицательных и грамположительных бактерий. После

применения антибиотиков снижается биомасса микробных сообществ всех испытанных бактерий, а их восстановление имеет индивидуальный характер, который зависит от природы препарата и микроба.

ВЫВОДЫ

1. Поверхностная оболочка и внеклеточный матрикс биопленок грам-положительных и грамотрицательных бактерий изученных штаммов содержат большое количество липидов, аналогичных таковым у мембран микроорганизмов сообщества, причем среди фосфолипидов в минимальном количестве обнаружены нестабильные фракции и максимально представлен стабильный кардиолипин.

2. Внеклеточный матрикс бактериальных биопленок неродственных микроорганизмов на всех исследованных сроках роста содержит фрагменты ДНК, несущие хромосомные гены, с молекулярной массой, равной приблизительно 30 кДА, которые играют важную роль в поддержании жизнедеятельности сообществ.

3. Действие ДНКазы на этапе формирования и на уже сформированные микробные сообществ, ведет к нарушению их образования, уменьшению биомассы и снижению числа колониеобразующих единиц.

4. Разрушение внеклеточной ДНК в присутствии ДНКазы в биопленках различных грамположительных и грамотрицательных бактерий ведет к нарушению передачи генетической информации между клетками, снижению числа образующихся рекомбинантов и мутантов антибиотико-устойчивости, а также уменьшению их выживаемости в сообществах.

5. Антибиотики, проникающие в биопленки, снижают биомассу сообщества преимущественно за счет уменьшения количества внеклеточного матрикса и, в меньшей степени, за счет числа жизнеспособных бактерий, дающих рост на плотной среде.

6. Матрикс микробных сообществ представляет собой новую мишень для действия лечебных препаратов, при этом применение ДНКазы увеличивает эффективность действия неродственных антибиотиков на бактерии в биопленках разного возраста.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выбор антибиотикотерапии с учетом способности препарата проникать в биопленки при условии необходимости преодоления липидного барьера.

2. Включение ДНКазы в сочетании с антибиотиками в схему лечения гнойно-воспалительных процессов для повышения эффективности терапии и профилактики возникновения и распространения антибиотико-устойчивости.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тец Г.В. Внеклеточная ДНК колониеподобных сообществ / Г В. Тец // Ученые Записки Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И П Павлова. - 2003. - Т. X, № 4. - С. 38-40.

2. Тец Г.В. Влияние условий культивирования на содержание ДНК бактерий и проницаемость их мембран / В.В Тец, С.Д. Иванов, Г.В. Тец, М.М. Писарева, В.А. Ямшанов // Вестник РАМН. - 2005. -№ 7. - С. 15-18.

3 Тец Г.В. Применение фермента дезоксирибонуклеаза у больных с абсцессами и флегмонами челюстно-лицевой области / М.М. Соловьев, В.В. Тец, А.П. Бобров, K.JI. Артеменко, И.Р. Мошкевич, Г.В. Тец // Стоматология. - 2006. - Т.85, №6. - С.40-46

4. Тец Г.В. Совместное действие антибиотиков и дезоксирибонуклеазы на бактерии / Г.В. Тец, К.Л. Артеменко // Антибиотики и химиотерапия - 2006. -Т.51, №6. -С.З--6.

5. Тец Г.В Совместное действие антибиотиков и дезоксирибо-нуклеазы. / Г.В. Тец, К.Л. Артеменко // Дезоксирибонуклеаза в терапии бактериальных и вирусных гепатитов / Под ред. В.В. Тец, Д.Д. Генкин. - СПб., 2006. - С.7-14.

6. Tetz G.V. Extracellular phospholipids of isolated bacterial com-munities / V.V. Tetz, P. Korobov, N.K. Artemenko, L.M. Lemkina, N.V. Panjkova, G V. Tetz // Biofilms - 2004. - № 1,-P. 149-155.

7. Способ лечения заболеваний, сопровождающихся изменениями качественного и/или количественного состава внеклеточной ДНК крови / В.В. Тец, Г.В. Тец, Д Д Генкин // Патент РФ № 2267329 от 10 января 2006

8. Способ лечения генерализованных инфекций, вызываемых бактериями, или заболеваний, вызываемых грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, обусловленных мутациями генов соматических клеток / В.В. Тец, Г.В. Тец, Д.Д. Генкин // Патент РФ № 2269358 от 10 февраля 2006.

9. Способ профилактики развития онкологических заболеваний, или инфекций, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, развивающихся вследствие мутации генов соматических клеток / В.В. Тец, Г.В. Тец, Д Д. Генкин // Патент РФ № 2269359 от 10 февраля 2006.

Лицензия ИД №00597 от 15.12.99 г. Подписано в печать 13.04.07. Усл. печ. л. 1,25. Формат 60x84 1/16. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 207 /07. 197022, Санкт-Петербург, улица Льва Толстого, 6-8 Издательство СПбГМУ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тец, Георгий Викторович

Список сокращений.

Введение.

Глава 1 Микробные сообщества. Обзор проблемы.

1.1 Микробные сообщества.

1.1.1 Биопленки.

1.1.2 Колонии.

1.1.3 Газон.

1.1.4 Колониеподобные сообщества.

1.1.5 Смешанные микробные сообщества.

1.1.6 Смешанный газон.

1.2 Регуляция свойств бактериальных биопленок.

1.3 Взаимодействие микробных сообществ с факторами окружающей среды.

1.4 Внеклеточная ДНК.

Глава 2 Материалы и методы.

2.1 Микроорганизмы.

2.2 Питательные среды.

2.3 Антибиотики.

2.4 Ферментные препараты.

2.5 Методы.

2.5.1 Получение моно-, ди-и олигонуклеотидов.

2.5.2 Определение жизнеспособности бактерий.

2.5.3 Определение минимальной подавляющей концентрации антибиотиков

2.5.4 Получение бактериальных биопленок в стеклянных флаконах.

2.5.5 Получение бактериальных биопленок в чашках

Петри.

2.5.6 Получение бактериальных биопленок в пластиковых планшетах.

2.5.7 Получение внеклеточного матрикса бактериальных сообществ.

2.5.8 Выявление мутантов устойчивых к антибиотикам.

2.5.9 Выявление передачи генов антибиотикоустойчивости.

2.5.10 Выживание антибиотикоустойчивых клонов в присутствии ДНКазы.

2.5.11 Методы выделения нуклеиновых кислот.

2.5.12 Электрофорез в агарозном геле.

2.5.13 Выделение ДНК из бактериальных клеток.

2.5.14 Извлечение ДНК из агарозного геля.

2.5.15 Измерение оптической плотности матрикса.

2.5.16 Оценка появления ДНК в матриксе и целостности клеточных мембран.

2.5.17 Электронная микроскопия.

2.5.18 Выявление генов кодирующих 16S рибосомальную

РНК в межклеточном матриксе.

2.5.19 Изучение липидного состава бактериальных сообществ.

2.5.20 Статистические методы.

Глава 3 Результаты собственных исследований.

3.1 Свойства использованных штаммов и характеристика биопленок.

3.2 Определение липидного состава матрикса микробных сообществ.

3.3 Выбор метода выделения внеклеточной ДНК из матрикса.

3.4 Сравнение внеклеточной ДНК, полученной из различных типов микробных сообществ.

3.5 Выявление фрагментов ДНК внутри бактерий биопленок.

3.6 Атомно-силовая микроскопия фрагментов ДНК бактериального матрикса.

3.7 Выявление признаков хромосомной ДНК во внеклеточном матриксе биопленок.

3.8 Оценка появления внеклеточной ДНК матрикса микробных сообществ на различных этапах роста.

3.9 Влияния экзогенных ДНКаз на внеклеточную ДНК бактериальных сообществ.

3.9.1 Влияния экзогенных ДНКаз на внеклеточную ДНК на стадии формирования биопленки.

3.9.2 Влияния олиго- моно- и динуклеотидов на формирование биопленки.

3.9.3 Формирование микробных сообществ в присутствии ДНКазы.

3.9.4 Оценка действия ДНКазы на сформированные бактериальные сообщества.

3.9.5 Оценка эффективности действия ДНКазы на различных этапах формирования биопленки.—

3.9.6 Оценка возможной роли внеклеточной ДНК в формировании и поддержании жизнедеятельности микробных сообществ.

3.9.7 Действие ДНКазы на образование отдельных компонентов бактериальной биопленки.

3.9.8 Влияние ДНКазы на частоту выявления в биопленках мутантов антибиотикоустойчивости.

3.9.9 Влияние ДНКазы на передачу между бактериями в биопленках генов устойчивости к антибиотикам.

3.9.10 Сохранение признака антибиотико-устойчивости при культивировании бактерий в присутствии ДНКазы.

3.10 Действие на бактерии биопленок антибиотиков, способных проникать в клетки эукариот.

3.10.1 Определение МПК азитромицина и левофлоксацина.

3.10.2 Влияние левофлоксацина и азитромицина на формирование биопленок.

3.10.3 Влияние левофлоксацина и азитромицина на сформированные биопленки.

3.11 Совместное действие ферментов и антибиотиков на бактерии.

3.11.1 Совместное действие на биопленки ДНКазы и антибиотиков.

3.11.2 Совместное действие антибиотиков и ферментов на бактерии в условиях планктонного роста.

3.11.3 Совместное действие антибиотиков и ферментов на бактерии при формировании биопленок.

3.11.4 Совместное действие антибиотиков и ДНКазы на бактерии сформированных биопленок.

3.11.5 Действие ДНКазы и антибиотиков на бактерии биопленок различного возраста.

3.11.6 Восстановление биопленки, после действия

ДНКазы и антибиотиков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биопленок с антибиотиками"

Актуальность темы Последнее десятилетие ознаменовалось формированием новых представлений об организации жизни бактерий, особенностей их существования во внешней среде и организме человека. Основные открытия в этой области связаны с изучением бактериальных биопленок (Тец В.В., 1998; Amano A. et al., 1999; Costerton J. W. et al., 1999; Watnic P., Kotler R., 2002). Накопившиеся данные свидетельствуют об особенностях свойств бактерий, находящихся в составе сообществ, наиболее актуальным из которых для практической медицины следует считать повышенную выживаемость микроорганизмов в биопленках (Anderl J.N. et al. 2000; Lewis К., 2001). Бактерии в составе сообществ выживают в присутствии антибиотиков, взятых в количествах, значительно превосходящих минимальную подавляющую концентрацию. Возможно, антибиотики, вообще, не могут полностью уничтожить бактерии биопленок, поскольку в последних обнаружены клетки, находящиеся в силу дифференцировки в состоянии полной устойчивости практически ко всем известным препаратам (Keren I. et al., 2004; Harrison J.J. et al., 2005; Lewis K., 2005). Несмотря на свою актуальность, биопленки остаются со многом слабо изученными. Очень мало известно о структуре, составе и функциях компонентов внеклеточного матрикса бактериальных сообществ. Среди различных молекул, обнаруженных в составе матрикса, особое внимание привлекают липиды и внеклеточная ДНК. Липиды входят в состав поверхностной оболочки, отграничивающей сообщество от внешней среды, формируя мембраноподобную структуру (Tetz V.V. et al., 1993; Zhou L. et al., 1998). Такая оболочка, предположительно, может служить преградой на пути антибиотиков в биопленку (Тец В.В., 1997). Большое внимание исследователей в последние годы привлекает ДНК, которую можно обнаружить за пределами клеток эукариот (Anker P., Stoun M., 2000; Bergsmedh A. et al., 2002 Anker P. et al., 2004). Внеклеточная ДНК бактерий остается практически неизученной. Почти ничего не известно о её путях распространения и функциях. На сегодня, практически нет данных о путях экспорта ДНК в межклеточный матрикс микробных биопленок. Вместе с тем, внеклеточная ДНК в биопленках представляет особый интерес для понимания механизмов и путей горизонтального переноса генов между различными микроорганизмами. Можно предполагать, что исследование внеклеточной ДНК биопленок поможет в понимании особенностей их развития и изменчивости признаков, а также эффективности перераспределения генов, в особенности контролирующих антибиотико-устойчивость и патогенность. Возможно, внеклеточная ДНК станет новой мишенью для воздействия на микроорганизмы.

Цель работы

Целью настоящей работы являлось изучение состава фосфолипидов и содержания внеклеточной ДНК бактериальных биопленок, а так же оценка возможности повышения эффективности антибиотикотерапии за счет воздействия на компоненты матрикса микробных сообществ. В процессе выполнения были поставлены следующие задачи:

1. Изучить состав фосфолипидов матрикса и поверхностной оболочки биопленок неродственных представителей грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий.

2. Произвести поиск и охарактеризовать внеклеточную ДНК в матриксе биопленок неродственных бактерий на различных стадиях развития сообщества.

4. Изучить влияние ДНКазы на активность передачи генов, интенсивность формирования и сохранение признака антибиотикоустойчиво-сти в биопленках.

6. Оценить эффективность совместного действия ДНКазы и антибиотиков на биопленки разного возраста неродственных грамположитель-ных и грамотрицательных бактерий.

Научная новизна работы Впервые проведено комплексное изучение состава внеклеточных фосфолипидов матрикса и поверхностной оболочки различных неродственных моно и смешанных микробных сообществ. Выполнен поиск и идентификация внеклеточной ДНК микробных биопленок. Установлено, что в составе поверхностной оболочки биопленок и внеклеточном матриксе фосфолипиды по качественному составу аналогичны мембранным, но количественно в них преобладают стабильные фракции. Показано, что в матриксе различных, неродственных микроорганизмов присутствует внеклеточная ДНК, которая содержит гены бактериальной хромосомы и плазмид. Доказано, что антибиотики, способные проникать через мембрану клеток, действуют на бактерии, находящиеся в биопленках.

Впервые установлено, что разрушение внеклеточной ДНК, приводит к невосстановимым изменениям различных свойств биопленок неродственных бактерий, сопровождающимся снижением числа антбиотико-устойчивых клеток.

Впервые доказана возможность усиления действия на биопленки неродственных микробов различных антибиотиков за счет воздействия на компонент матрикса - внеклеточную ДНК.

Предложены новые способы борьбы с инфекционными заболеваниями (патенты РФ № 2267329, № 2269358 № 2269359).

Теоретическое и практическое значение результатов исследования На основании полученных данных стало возможным использовать новые критерии выбора антибиотиков для действия на бактерии, основанные на способности препарата проникать через липидную оболочку биопленок, что позволяет повысить эффективность антибиотикотера-пии и уменьшить число осложнений.

Выявлена новая мишень — внеклеточная ДНК матрикса биопленок для воздействия на бактерии с целью повышения эффективности анти-биотикотерапии. Использование ДНК матрикса, как дополнительной мишени при терапии, позволяет повысить эффективность действия различных антибиотиков на неродственные микробы, находящиеся в биопленках, снизить вероятность возникновения, распространения и сохранения устойчивости к лечебному агенту, сократить общую продо-ложительность терапии, уменьшить сроки пребывания больных в стационаре и снизить частоту рецидивов заболевания.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Наличие фосфолипидов в поверхностной оболочке и матриксе бактериальных биопленок позволяет использовать новые принципы в выборе антибиотиков, активных против микробов, находящихся в составе сообществ.

Апробация результатов исследования Основные положения диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях симпозиумах и съездах:

Международная конференция «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины» Санкт-Петербургский Государственный Медицин-ский Университет им. акад. И.П. Павлова, 2006 г.

Научно-практическая конференция «Санкт-Петербургский научно-технический потенциал в решении проблем лабораторной медицины — Сделано в Санкт-Петербурге", 2007 г.

1st European Congress of Microbiology June 29 - July 3, 2003. Ljubljana, Slovenia.

43rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC) September 14-17, 2003. Chicago, II, USA.

Fourth International Conference on Circulating Nucleic Acids in Plasma/Serum (CNAPS-IV)) (London, 2006).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Тец, Георгий Викторович

выводы

1. Поверхностная оболочка и внеклеточный матрикс биопленок грамположительных и грамотрицательных бактерий изученных штаммов содержат большое количество липидов, аналогичных таковым у мембран микроорганизмов сообщества, причем среди фосфолипидов в минимальном количестве обнаружены нестабильные фракции и максимально представлен стабильный кар-диолипин.

2. Внеклеточный матрикс бактериальных биопленок неродственных микроорганизмов, на всех исследованных сроках роста содержит фрагменты ДНК, несущие хромосомные гены, с молекулярной массой, равной приблизительно 30 кДА, которые играют важную роль в поддержании жизнедеятельности сообществ.

3. Действие ДНКазы на этапе формирования и на уже сформированные микробные сообществ, ведет к нарушению их образования, уменьшению биомассы и снижению числа колониеобразую-щих единиц.

4. Разрушение внеклеточной ДНК в присутствии ДНКазы в биопленках различных грамположительных и грамотрицательных бактерий ведет к нарушению передачи генетической информации между клетками, снижению числа образующихся рекомбинантов и мутантов антибиотикоустойчивости, а также уменьшению их выживаемости в сообществах.

5. Антибиотики, проникающие в биопленки, снижают биомассу сообщества преимущественно за счет уменьшения количества внеклеточного матрикса и в меньшей степени за счет числа жизнеспособных бактерий, дающих рост на плотной среде.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена изучению свойств бактериальных биопленок, образованных различными, неродственными грамполо-жительными и грамотрицательными микроорганизмами, находящихся в биопленках. Основное внимание в работе было уделено изучению компонентов матрикса биопленок, которые кроме самих бактерий могли оказывать влияние на их взаимодействие сообщества с факторами внешней среды и влиять на выживаемость микроорганизмов в присутствии антибиотиков. Основное внимание в работе уделено исследованию внеклеточных липидов и ДНК матрикса.

В результате проведены исследований в поверхностной оболочке, отделяющей биопленки от внешней среды, и в межклеточном матриксе выявлено содержание большого количества липидов. Обнаруженные липиды по качественному составу аналогичны таковым у мембран бактерий, образовавших сообщество. Липиды матрикса отличаются от клеточных количеством определенных компонентов и, прежде всего, низким содержанием нестабильных фосфолипидов и повышенным стабильного кардиолипина. Сравнительно высокое содержание кардиоли-пина в матриксе внеклеточного пространства биопленки можно считать важной предпосылкой стихийного образования мембраноподобной структуры повышенной прочности, которая может функционировать в качестве защитного барьера между сообществом бактериальных клеток и окружающим пространством. Существование липидсодержащего барьера между внешней и внутренней средой биопленок позволило предположить, что антибиотики, хорошо проникающие через мембрану клеток эукариот, должны быть эффективны и по отношению к бактериям, расположенным внутри биопленок. Проведенные нами исследования подтвердили данное предположение и показали, что препараты левофлоксацин и азитромицин, хорошо преодолевающие барьер мембраны клетки человека, проникают в микробные биопленки и вызывают значительное снижение их биомассы и числа КОЕ.

Другим важным, малоизученным компонентом матрикса является свободная внеклеточная ДНК. Такая ДНК в ходе настоящего исследования обнаружена в матриксе биопленок, различного возраста у неродственных бактерий. Все фрагментов внеклеточной ДНК имеют приблизительно одинаковый размер и согласно результатам идентификации в ПЦР с помощью созданного нами праймера содержат хромосомные бактериальные гены. Для штаммов, несущих плазмиду, показано, что ДНК последней также может быть обнаружена в свободном состоянии в матриксе. После электрофореза ДНК, выделенной из матрикса у содержащего плазмиду штамма в агарозном геле, регистрировали две независимые полосы, одна из которых соответствовала плазмидной нуклеиновой кислоте. Определение функциональной активности внеклеточной ДНК матрикса было проведено в условиях воздействия на неё дезокси-рибонуклезы. Использованная нами ДНКаза была предварительно проверена на наличие собственного токсического действия на различные штаммы. В результате установлено, что ДНКаза не оказывает токсического действия на бактерии, растущие диффузно. В присутствии нук-леазы в биопленках зарегистрировано уменьшение количества внеклеточной ДНК. При действии ДНКазы выявлено частичное угнетение передачи плазмидных генов, контролирующих атибиотико-устойчивость. Кроме того, показано, что при действии ДНКазы в биопленке снижается частота выявления мутантов антибиотико-устойчивости и эффективность сохранения данного признака бактериями. Важным результатов действия ДНКазы оказалось также изменение морфологии биопленки и количеств а в ней внеклеточного матрикса. Фермент, добавленный в момент засева и на разных сроках существования сообщества, снижал количество внеклеточного матрикса, изменял морфологию биопленки, но мало влиял на число КОЕ. Эффект действия ДНКазы зависел от дозы препарата. В присутствии фермента в матриксе уменьшалось содержание ДНК и в меньшей степени белков и полисахаридов. Для оценки состояния биопленки, сформированной в присутствии ДНКазы или изменившейся при её воздействия на различных сроках роста мы оценили результаты воздействия различных антибиотиков, вне зависимости от их способности проникать в биопленки. Совместное применение ДНКазы и различных, неродственных антибиотиков привело к усилению их антимикробного действия. Таким образом, на бактериальные биопленки одновременно оказывалось комплексное воздействие, при котором сам антибиотик влиял на клетки, а ДНК на компоненты матрикса. Нуклеаза повышала эффективность действия антибиотиков в биопленках различного возраста в изученных штаммах грамположительных и грамотрицательных бактерий. Изменения биопленок, возникшие под воздействие ДНКазы, не восстанавливались и биомасса оставалась сниженной минимум на протяжении 7 суток. Для сравнения уменьшение биомассы биопленок стафилококка, возникшее под влиянием антибиотиков, добавленных при формировании сообщества, через 7 суток инкубации практически возвращалось к норме. Таким образом, проведенные исследования позволили показать происхождение и состав липидов матрикса, оценить роль внеклеточной ДНК бактериальных биопленок в распространении генетической информации и поддержании свойств сообщества. На основании полученной информации разработан принципиально новый универсальный способ повышения эффективности действия антибиотиков, основанный на использовании новой внеклеточной мишени — ДНК матрикса. Новизна подхода защищена 3 патентами РФ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тец, Георгий Викторович,

1. Ашкинази И.Я. Эритроциты и внутреннее тромбопластино-образование. Л.: Наука, 1977. - С.50-54.

2. Белобородова Н.В., Богданов М.Б., Черненькая Т.В. Алгоритмы антибиотикотерапии: Руководство для врачей. — М.: Медицина, 1999.- 144 с.

3. Бреслер С. Е., Молекулярная биология.- М.: Медицина, 1973.277 с.

4. Вольх М, Рансбергер К. Лечение ферментами / Пер. с англ. — М.: Мир, 1976. 240с.

5. Галебская Л.В., Немировский B.C. Ферменты и ферментные препараты. СПб.: Изд-во СПбГМУ, 2001.- 84 с.

6. Грузина В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий // Антибиотики и химиотерапия.- 2003.-№ 48.-С. 32-39.

7. Заславская Н.В., Тец В.В. Влияние времени преинкубации на значения МПК при определении чувствительности методом Е-тестов // Клинич. микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. -№ 2. - С. 20-21.

8. Заславская Н.В., Артеменко Н.К., Чижевская М.М. и др. Особенности выживаемости бактерий в микробных сообществах // Клинич. микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. -№ 2.-С. 19-20.

9. Иванов С.Д., Кованько Е.Г., Попович И.Г., Забежинский М.А. // Радиац. биология. Радиоэкология.-1999.-Т.39, № 4.-С.418-424.

10. Кнорринг Г.Ю., Ремизов А.П. К вопросу о возможностях потенцирования эффекта антибактериальных препаратов // Здравоохранение Урала. 2003. - №12. - С.5-8.

11. Кнорринг Г.Ю., Ремизов А.П. Системная энзимотерапия: новые возможности потенцирования эффекта антибактериаль-ных препаратов // Consilium provisorum. 2004. - Т.4, №2. - С.28-30.

12. Криг Н., Герхард Ф. Твердая культура. В кн. Методы общей бактериологии. М.: Мир.-1983, Т.1. С.356-363.

13. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Пер. с англ. М.: Мир, 1984.-231 с.

14. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976.- 436 с.

15. Медведева С.Е., Пузырь А.П., Могильная О.А. Цитоархитекто-ника бактериальных колоний Институт Биофизики, Препринт. 149, Красноярск, 1991. - 35 с.

16. Методы общей бактериологии // Под ред. Ф.Герхарда М., Мир, 1983.

17. Монцевичуте-Эрингене Е.В. Упрощенные математико-статестические методы в медицинской исследовательской работе // Патол.Физиол.Экспер.Тер.-1964.-С.71-78.

18. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / Под. ред. Страчунского J1.C. М., 2002. - 386 с.

19. Соловьев М.М., Тец В.В., Бобров А.П., Артеменко K.JL, Мош-кевич И.Р., Тец Г.В. Применение фермента дезокси-рибонуклеаза у больных с абсцессами и флегмонами челюстно-лицевой области // Стоматология.-2006.- Т.85, №6.- С.40-46.

20. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии.-СПб.: СПбГТУ. 1999.-521с.

21. Сингер М., Берг П. М.:Мир, 1998.-391с.

22. Тец Г.В. Внеклеточная ДНК колониеподобных сообществ // Ученые Записки Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова.- 2003.-Т. X, № 4.-С. 38-40.

23. Тец Г.В., Артеменко K.J1. Совместное действие антибиотиков и дезоксирибонуклеазы. // Дезоксирибонуклеаза в терапии бактериальных и вирусных гепатитов / Под ред. Тец В.В., Генкин Д.Д. СПб. - 2006. - С.7-14.

24. Тец Г.В., Артеменко K.JT. Совместное действие антибиотиков и дезоксирибонуклеазы на бактерии // Антибиотики и химиотерапия. 2006.- Т.51, №6.-С.З-6.

25. Тец В.И. Санитарная микробиология.- Л.:Медгиз,1953.-434с.

26. Тец В.В., Рыбальченко О.В., Савкова Г.А. Кооперация и специализация клеток в микробных колониях. / В кн. Острые кишечные инфекции.- Вып.12, Л.-1989.-С.54-62.

27. Тец В.В. Рыбальченко О.В, Савкова Г.А. Контакты между клетками в бактериальных колониях // Микробиология. 1990. -№9. С.7—13.

28. Тец В.В., Рыбальченко О.В., Савкова Г.А. Кооперация и специализация клеток в бактериальных колониях // Острые кишечные инфекции. Л.: Изд-во ЛНИИЭМ, 1990. - С. 54-62.

29. Тец В.В. Биомембраны микробных сообществ // Ученые записки С.-Петерб. гос. мед. ун-та им. Павлова. 1997. - №4. - С. 27-30.

30. Тец В.В. Бактериальные сообщества. В кн. Клеточные сообщества под ред. В.В.Теца. СПб., 1998 С.15-73.

31. Тец В.В., Заславская Н.В. Выживаемость бактерий, растущих диффузно и образующих газон, в присутствии гента-мицина и ионов металлов // Труды РАЕН. 2000. - С. 77-82.

32. Тец В.В., Артеменко К.Л., Кнорринг Г.Ю., Заславская Н.В. Влияние экзогенных ферментов на бактерии. // Узловые вопросы борьбы с инфекцией: Рос. науч.-практ. конф. — СПб., 2004. С.4-5.

33. Тец В.В., Артеменко K.JL, Кнорринг Г.Ю., Заславская Н.В. Оценка влияния ферментов и антибактериальных препаратов на бактерии. // Узловые вопросы борьбы с инфекцией: Рос. науч.-практ. конф. СПб., 2004. - С. 3-4.

34. Тец В.В., Иванов С.Д., Тец Г.В. и др. Влияние условий культивирования на содержание ДНК бактерий и проницаемость их мембран // Вестн. РАМН 2005.- №7.- с.15-17.

35. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987. - 573 с.

36. Aas F. E., Wolfgang M., Frye S., Dunham S., Lovold C., Koomey M. Competence for natural transformation in Neisseria gonorrhoeae: components of DNA binding and uptake linked to type IV pilus expression // Mol. Microbiol.-2002.-№ 46.-P.749-760.

37. Ahmer B.M. Cell-to-cell signalling in Escherichia coli and Salmonella enterica II Molec. Microbiol. 2004. - Vol 52, № 4.- P. 933-941.

38. Al-Fattani M. A., Douglas L. J. Penetration of Candida Biofilms by Antifungal Agents // Antimicrob. Agents Chemother.-2004.-№ 48.-P. 3291-3297.

39. Amano A., Nakagawa I., Hamada S. Studying initial phase of biofilm formation: molecular interaction of host proteins and bacterial surface components // Methods Enzymol.-1999.-№ 310.-P.501-513.

40. Anderl J. N., Franklin M. S., Stewart P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resis-tance to ampicillin and ciprofloxacin // Antimicrob. Agents Chemother.-2000.-№ 44.-P.1818-1824.

41. Anker P., Stroun M. Circulating Nucleic Acids in Plasma or Serum //Ann NY Acad. Sci.- 2000.-Vol. 906.-P.188.

42. Anker P., Zajac V., Lyautey J., Lederrey C., Dunand C., Lefort F., Mulcahy H., Heinemann J., Stroun M. Transcession of DNA from bacteria to human cells in culture: a possible role in oncogenesis // Ann. NY Acad. Sci. 2004.-№1022.-P. 195-201.

43. Balestrino D., Haagensen J. A., Rich C., Forestier C. Characterization of Type 2 Quorum Sensing in Klebsiella pneumoniae and Relationship with Biofilm Formation // J. Bacteriol.-2005.-№ 187.-P. 2870-2880.

44. Baur В., Hanselmann K., Schlimme W., Jenni B. Genetic transformation in freshwater: Escherichia coli is able to develop na-turalcompetence // Appl. Environ. Microbiol. 1996.- Vol. 62, № 10.-P. 3673-3678.

45. Bayer M.E., Easterbrook K. Tubular spinae are long distance connectors between bacteria.// J.Gen.Microbiol.-1991.-Vol.137.-P.1081-1086.

46. Beaber J., Hochhut В., Waldor M. Genomic and Functional Analyses of SXT, an Integrating Antibiotic Resistance Gene Transfer Element Derived from Vibrio cholerae II J. Bacter.- 2002. Vol. 184, № 15.- P. 4259-4269.

47. Bergey D. H., Holt J.G., Krieg N. R. Bergey's manual of determinative bacteriology-9th ed.- Williams&Wilkins.-1994.-1246 p.

48. Berenike M., Joachim R. DNA on fluid membranes : A model polymer in two dimensions // Macromolecules.- 2000.- Vol. 33, №19.-P. 7185-7194.

49. Bergsmedh A., Szeles A., Henriksson M., Bratt A., Holmgren L. Horizontal transfer of oncogenes by uptake of apoptotic bo-dies // PNAS .- 2002.- Vol. 98, №11.- P. 6407-6411.

50. Beveridge T.J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles // J. Bacterid.-1999.- № 181.-P. 4725 -4733.

51. Bicknell G. R., Cohen G. M. Cleavage of DNA to Large Kilobase Pair Fragments Occurs in Some Forms of Necrosis as Well as Apop-tosis II Bioch. Biophys. Res. Commun. 1995 Vol. 6, № 1.-P.40-47.

52. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. - Vol. 37. -P. 911917.

53. Bockelmann U., Janke A., Kuhn R., Neu T.R., Wecke J., Lawrence J.R. Szewzyk U. Bacterial extracellular DNA forming a defined network-like structure // FEMS Microbiology Letters .- 2006.-Vol 262, № l.-P. 31-39.

54. Brooun A., Liu S., Lewis K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms // Antimicrob. Agents Chemother.-2000.-№ 44.-P. 640-646.

55. Campanac C., Pineau L., Payard A., Baziard-Mouysset G., Roques C. Interactions between Biocide Cationic Agents and Bacterial Biofilms // Antimicrob. Agents Chemother.- 2002.-№ 46.-P. 146974.

56. Catlin B.W. Transformation of Neisseria meningitidis by deoxyri-bonucleates from cells and from culture slime // Department of Microbiology and Immunology, School of Medi-cine, Marquette University, Milwaukee, Wisconsin.-1959.-№79.-P. 579-590.

57. Chambless J.D., Hunt S.M., Stewart P.S. A Three-Dimensional Computer Model of Four Hypothetical Mechanisms Protecting Biofilms from Antimicrobials // Appl. and Env. Microbiol. 2006. - Vol 72, №3. - P. 2005-2013

58. Chen I., Dubnau D. DNA uptake during bacterial trans-formation // Nat. Rev. Microbiol. 2004.- Vol. 2.- P. 241-249.

59. Chen W., Honma K., Sharma A., Kuramitsu H.K. A universal stress protein of Porphyromonas gingivalis is involved in stress responses and biofilm formation // FEMS Microbiol. Lett. 2006. -Vol.264, №12. - P.15-21.

60. Christensen В.В., Sternberg С., Andersen J.В., Eberl L., Moller S., Givskov M., Molin S. Establishment of new genetic traits in a microbial biofilm community // Appl. Environ. Microbiol.-1998.-Vol. 64, № 6.-P.2247-55.

61. Chugani S., Whiteley M., Lee K., D'Argenio D., Manoil C., Greenberg E. QscR, a modulator of quorum-sensing signal synthesis and virulence in Pseudomonas aeruginosa II PNAS.- 2001.-Vol. 98, № 5.-P. 2752-2757.

62. Ciofu O., Beveridge T. J., Kadurugamuwa J. L., Walther-Rasmussen J., Hoiby N. Chromosomal P-lactamase is packaged into membrane vesicles secreted from Pseudomonas aeruginosa II J. An-timicrob. Chemother. 2000. - № 45.-P. 9-13.

63. Cogan N. G., Cortez R., Fauci L. Modeling physiological resistance in bacterial biofilms // Bull. Math. Biol.-2005.-№ 67.-P.831-853.

64. Costerton J.W. The bacterial glycocalyx in nature and diseases // Rev. Microbiol. 1981. - Vol.35, № 3.- P.299-324.

65. Costerton J.W., Cheng K. J., Geesey G.G., Nickel L.T., Dasgupta M., Marrie J.T. Bacterial biofilms in nature disease // Ann. Rev. Microbiol. 1987. - Vol.41, № 5. - P.435-464.

66. Costerton J. W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., Lappin-Scott M. Microbial biofilms // Annu. Rev. Microbiol. — 1995 Vol. 49 - P.711-745.

67. Costerton J. W. 1999. Introduction to biofilm // Int. J. Antimic-rob. Agents .- 1999.-№ 11.-P.217-221.

68. Costerton J. W., Stewart P. S., Greenberg E. P. Bacterial bio-films: a common cause of persistent infections // Science.- 1999.- Vol. 284.-P. 1318-1322.

69. Could L.M. Determinants of response to antibiotic therapy // J. Chemother. 1998. - Vol. 10, № 5. - P. 347-353.

70. Cowan S.E., Gilbert E., Liepmann D., Keasling J.D. Commen-sal Interactions in a Dual-Species Biofilm Exposed to Mixed Organic Compounds // Appl. Env. Micr.- 2000.-Vol 66, № 10.-P. 44814485.

71. Danese P.N., Pratt L.A., Kolter R. Exopolysaccharide produc-tion is required for development of Escherichia coli K-12 bio-film architecture // J. Bacteriol. 2000.- №. 182.- P.3593-3596.

72. D'Argenio D.A., Calfee M.W., Rainey P.B., Pesci E.C. Auto-lysis and autoaggregation in Pseudomonas aeruginosa colony morphology mutants // J. Bacteriol.-2002.-№ 184.-P. 6481-6489.

73. Das J. R., Bhakoo M., Jones M. V., Gilbert P. Changes in the bio-cide susceptibility of Staphylococcus epidermidis and Escherichia coli cells associated with rapid attachment to plastic surfaces // J. Appl. Microbiol.-1998.-№ 84.-P 858.

74. Davey M.E., O' Toole G.A., Microbial biofilms: from ecology to Molecular ganetics // Microbiol. Mol.Genet.- 2000.-Vol. 64.- P.847-867.

75. Davies D. G., Parsek M. R., Pearson J. P., Iglewski В. H., Coster-ton J. W., Greenberg E. P. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm // Science. 1998. - №. 280. - P. - 295-298.

76. Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents // Nat. Rev. Drug Discov. 2003.-№ 2.-P.114-122.

77. Davison J. Genetic exchange between bacteria in the environ-ment // Plasmid. 1999.- № 42.-P. 73-91.

78. Deich R. A., Hoyer L.C. Generation and release of DNA-bin-ding vesicles by Haemophilus influenzae during induction and loss of competence // J. Bacterid.-1982.-№ 152.- P.855-864.

79. De Lancy Pulcini E. Bacterial Biofilms: A Review of Current Research // Nephrologie.-2001. Vol.22, № 8.-P.439-441.

80. Dell'Anno A., Bompadre S., Danovaro R. Quantification, base composition, and fate of extracellular DNA in marine sediments // Limnol. Oceanogr. 2002.- Vol. 47.-P.899-905.

81. Denamur E., Bonacorsi S., Giraud A. High frequency of mutator strains among human uropathogenic Escherichia coli isolates // Journ. of Bacteriol.-2002.-№ 184.-P. 605-609.

82. Dillard J.P., Seifert H.S. A variable genetic island specific for Neisseria gonorrhoeae is involved in providing DNA for natural transformation and is found more often in disseminated infection isolates // Mol. Microbiol. 2001.-Vol. 41, №1 .-P.263-277.

83. Dong Y., Wang L., Xu J. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase // Nature.2001.-№ 411.-P.813-817.

84. Donlan R.M., Costerton W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms // Clinical Microbiol.Rev.2002.-№15.-P.167-193.

85. Doolittle W.F. Phylogenetic Classification and the Universal Tree // Science.-1999.- Vol. 284, №5423.-P. 2124 2128.

86. Dorward D., Garon C. & Judd R. Export and Intracellular Transfer of DNA via Membrane blebs of Neisseria gonorrhoeae II J. Bact.-1989.-№ 171.-P. 2499-2505.

87. Draghi J., Turner P. DNA secretion and gene-level secretion in bacteria // Microbiol.-2006.-№ 152.-P. 2683-2688.

88. Drenkard E. Antimicrobial resistance of P. aeruginosa biofilms // Microbes Infect.- Vol. 5, №13. P.l213-1219.

89. Dubnau D. DNA uptake in bacteria // Annu. Rev. Microbiol.-1999.-№ 53.-P.217-244.

90. Dunny G.M., Leonard B.A. Cell-cell communication in Gram-positive bacteria // Annu Rev Microbiol.-1997.-№ 51 .-P.527-564.

91. Echtfeld C.J.A., de Kruijff В., de Gier J. Differential muscibility properties of various phosphatidylcholine / lysophos-phatidylcholine mixtures // Biochim. Biophys. Acta. 1980. - Vol. 595. - P. 71-81.

92. Erin J., Schaik V., Giltner C.A., Audette G.F., Keizer D.W., Bautista D.L., Slupsky C.M., Sykes B.D., Irvin R.T. DNA Binding: a Novel Function of Pseudomonas aeruginosa Type IV Pili // J. of Bacteriology.- 2005. Vol. 187, № 4.-P. 1455-1464.

93. Federle M.J., Bassler B.L. Interspecies communication in bac-teria // J. Clin. Invest.-2003.- Vol. 112.-P.1291-1299.

94. Finkel S.E., Kolter R. DNA as a Nutrient: Novel Role for Bacterial Competence Gene Homologs // Jour, of Bact.- 2001. Vol. 183, № 21. P. 6288-6293.

95. Fredrickson A. G. Behavior of Mixed Cultures of Microorganisms // Annual Review of Microbiology.-1977. Vol. 31.-P. 63-88.

96. Frias J., Olle E., Alsina M. Periodontal pathogens produce quorum sensing signal molecules // Infect. Immun.- 2001.-№ 69.-P. 3431-3434.

97. Frost L.S. Bacterial conjugation: everybody's doin' it // Can. J. Microbiol. 1992. - Vol. 38, № 1 l.-P.1091-1096.

98. Frostegard A., Courtois S., Ramisse V., Clerc S., Bernillon D., Le Gall F., Jeannin P., Nesme X., Simonet P. Quantification ofbias related to the extraction of DNA directly from soils // Appl. Environ. Microbiol.-1999. Vol. 65.- P.5409-5420.

99. Fuqua C., Parsek M. R., Greenberg E. P. Regulation of gene expression by cell-to -cell communication: Acyl-Homoserine Lactone Quorum Sensing // Annual. Rev. Genet.- 2001.-№ 35.-P. 439-468.

100. Futai M. Orientation of membrane vesicles from Escherichia coli prepared by different procedures // J. of Membr. Biol.-1974.-Vol.15, № l.-P. 15-28.

101. Fux C.A., Costerton J.W., Stewart P.S., Stoodley P. Survival strategies of infectious biofilms // Trends Microbiol.- 2005.-Vol.13, № l.-P.34-40.

102. Ghannoum M., O'Toole G.A. Microbial biofilms. Washington D.C.: ASM Press. - 2004. - P.478.

103. Gilbert P., Das J., Foley I. Biofilm susceptibility to antimicrobials //Adv. Dent. Res.-1997.-№ 11.-P.160-167.

104. Gankema H., Wensink J., Guinee P.A.M., Jansen W.H., Witholt B. Some characteristics of the outer membrane material released by growing enterotoxigenic Escherichia coli. //Infect.Immun.-1980.-№ 29.-P. 704-713.

105. Gladue R. P., Snider M.E. Intracellular accumulation of azithromycin by cultured human fibroblasts // Antimicrob. Agents Chemother. 1990.- Vol. 34, № 6.- P. 1056-1060.

106. Goodell E.W., Schwarz U. Release of cell wall peptides into culture medium by exponentially growing Escherichia coli II J.Bacterid.- 1985.-Vol.l62:P.391-397.

107. Goodgal S.H. DNA uptake in Haemophilus transformation // Ann. Rev. Genet. 1982.-№ 16.-P.169-192.

108. Gray К. M., Garey J. R. The evolution of bacterial Luxl and LuxR quorum sensing regulators. Microbiology.-2001 .-№ 147.-P. 2379-2387.

109. Greenberg E. P. Bacterial communication: tiny teamwork // Nature.-2003.-Vol. 424.-P. 134.

110. Habash M., Reid G. Microbial biofilms: their development and significance for medical device-related infections // J. Clin. Pharmacol. 1999.- Vol. 39, № 9.-P.887-898.

111. Hall-Stoodley L., Costerton J. W., Stoodley P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases // Nat. Rev. Microbiol.-2004.-№ 2.-P. 95-108.

112. Hamilton, H.L., Dominguez, N.M., Schwartz, K.J., Hackett, K.T. & Dillard, J.D. Neisseria gonorrhoeae secretes chromo-somal DNA via a novel type IV secretion system. Molecular Microbiology.-2005.-№ 55.-P. 1704-1721.

113. Нага Т., Aumayr A., Ueda S. Genetic transfor-mation of Pseu-domonas aeruginosa with extracellular DNA // J. Gen. Appl. Microbiol.- 1981.-№ 27.- P. 109-114.

114. Нага Т., Ueda S. A study on the mechanism of DNA excretion from P. aeruginosa KYU-1 effect of myto-mycin С on extracellular DNA production // Agric. Biol. Chem.-1981.-№ 45.-P. 2457-2461.

115. Harris К.A., Hartley J.С. Development of broad-range 16S rDNA PCR for use in the routine diagnostic clinical micro-biology service // J. Med. Microbiol. 2003.-№ 52.-P. 685-691.

116. Harrison J.J., Ceri H., Roper N.J., Badry E.A., Sproule K.M., Turner R.J. Persister cells mediate tolerance to metal oxyanions in Escherichia coli II Microbiology.- 2005.-№ 151.-P. 3181-3195.

117. Harshey R.M. Bees aren't the only ones: swarming in Gram-negative bacteria // Mol. Micr.- 1994.- Vol.13, № 3.- P. 389.

118. Hausner M,, Wuertz S. High Rates of Conjugation in Bacterial Biofilms as Determined by Quantitative In Situ Analysis // Appl. Env. Microbiol.-1999.-Vol.65,№8.-P.3710-3713.

119. Holmgren L. Szeles A., Rajnavolgyi E., Folkman J., Klein G., Ernberg I., Falk K. Horizontal Transfer of DNA by the Uptake of Apoptotic Bodies // Blood.-1999.- Vol. 93, № 11.- P. 3956-3963.

120. Hochman A. Programmed cell death in prokaryotes // Crit. Rev. Microbiol.-1997.- №23.- P.207-214.

121. Horstman A.L., Kuehn M.J. Enterotoxigenic Escherichia coli Secretes Active Heat-labile Enterotoxin via Outer Membrane Vesicles // J. Biol. Chem.-2000.-Vol. 275, № 17.-P. 12489-12496.

122. Huber В., Riedel K., Hentzer M., Heydorn A., Gotschlich A., Givskov, M., Molin, S., Eberl, L. The сер quorum-sensing sys-tem of Burkholderia cepacia Hill controls biofilm formation and swarming motility // Microbiology.-2001.-№ 147.-P. 2517-2528.

123. Hughes F.M., Cidlowski J.A. Utilization of an in vitro assay to evaluate chromatin degradation by candidate apoptotic nuc-leases // Cell Detah and Diff. 1997.-Vol. 4, № 3.-P. 200-208.

124. Hunt S. M., Hamilton M. A., Stewart P. S. 2005. A 3D model of antimicrobial action on biofilms // Water Sci. Technol.-2005.-№ 52.-P.143-148.

125. Imran M., Jones D., Smith H. Biofilms and the plasmid maintenance question // Math. Biosci.- 2005.-Vol. 193, № 2.-P. 183-204.

126. Inglefield P., Lindblom K.A., Gottlieb A.M. Water binding and mobility in the phosphatidilcholine / cholesterol / water lamellar phase // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - Vol. 419. - P. 196-205.

127. Inglis T.J., Millar M.R., Jones J.G. Robinson D.A. Tracheal tube biofilm as a source of bacterial colonization of the lung // J. Clin. Microbiol.-1989.-Vol. 27, № 9.-P. 2014-2018.

128. Inoue K., Kitagawa T. Effect of exogeneaus lysolecithin on liposomal membranes in relation to membrane fluidity // Biochim. Biophys. Acta. 1974. - Vol. 363. - P. 361-372.

129. Ishida H., Ishida Y., Kurosaka Y., Otani Т., Sato K., Kobayashi H. In vitro and in vivo activities of levofloxacin against biofilm-producing Pseudomonas aeruginosa II Antimicrob. Agents. Chemother. 1998. - Vol.42, №7. - P. 1641-1645.

130. Jabra-Rizk M.A., Meiller T.F., James C.E., Shirtliff M.E. Effect of farnesol on Staphylococcus aureus biofilm formation and antimicrobial susceptibility // Antimicrob Agents Chemother. 2006. -Vol.50, №4. - P.1463-1469.

131. Jain R., Rivera M., Lake J. Horizontal gene transfer among genomes: The complexity hypothesis // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1999.-№ 96.-P. 3801-3806.

132. Jayarao B.M., Dore J.E., Oliver S.P. Restriction fragment length polymorphism analysis of 16S ribosomal DNA of Streptococcus and Enterococcus species of bovine origin // Journal of Clinical Micro-biology.-1992.-Vol. 30.-P. 2235-2240.

133. Jefferson К. K., Goldmann D. A., Pier G. B. Use of Confocal Microscopy to Analyze the Rate of Vancomycin Penetration through

134. Staphylococcus aureus Biofllms. Antimicrob // Agents Chemother.-2005.-№ 49.-P. 2467-2473.

135. Jorgensen A., Molin S., Tolker-Nielsen T. Biofllm formation by Pseudomonas aeruginosa wild-type, flagella, and type IV pili mutants // Mol. Microbiol.-2003.-№ 48.-P. 1511-1524.

136. Julien В., Kaiser A.D., Garza A. Spatial control of cell differentiation in Myxococcus xanthus II PNAS .- 2000.- Vol. 97, № 16.-P. 9098-9103.

137. Kadurugamuwa J. L., Beveridge T. J. Natural release of virulence factors in membrane vesicles by Pseudomonas aeruginosa and the effect of aminoglycoside antibiotics on their release // J. Antim-icr. Chemother.-1997.-№ 40.-P. 615-621.

138. Kadurugamuwa J. L., Beveridge T. J. Membrane vesicles derived from Pseudomonas aeruginosa and Shigella flexneri can be integrated into the surfaces of other Gram-negative bacteria // Microbiology.-1999.-№ 145.-P. 2051-2060.

139. Kane T.D., Wesley J.A., Johannigman J.A. The detection of microbial DNA in the blood // Annals of Sugery.- 1998.- Vol. 227.-P.l-9.

140. Kariyama R. Increas of cardiolipin content in S.aureus by the use of antibiotics affecting the cell wall // J. of Antibiotics. 1982. -Vol. 35. - P. 1700-1704.

141. Keren I., Kaldalu N., Spoering A., Wang Y., Lewis K. Persister cells and tolerance to antimicrobials // FEMS Microbiol Lett.-2004.-Vol. 230.-P.13-18.

142. Keren I., Shah D., Spoering A, Kaldalu N., Lewis K. Specialized persister cells and the mechanism of multidrug tolerance in Escherichia coli И J. Bacteriol.-2004.-Vol. 186.-P.8172-8180.

143. Kesty N.C., Mason K.M., Reedy M., Miller S.E., Kuehn M.J. Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells // The EMBO J.- 2004.-№ 23.- P. 4538-4549.

144. Ketyi I. Biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa and by Staphylococcus aureus on model medical devices // Acta. Microbiol. Immunol. Hung. 1995. - Vol. 42, №2. - P.221-7.

145. Kierek-Pearson K., Karatan E. Biofilm development in bacteria // Adv. Appl. Microbiol. 2005.-№ 57. - P.79-111.

146. Klausen M., Heydorn A., Ragas P., Lambertsen L., Aaes-Jorgensen A., Molin S., Tolker-Nielsen T. Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa wildtype, flagella, and type IV pili mutants // Mol. Microbiol. 2003.-Vol. 48.- P. 1511-1524.

147. Klotz M.G., Loewen P.C. The molecular evolution of catalatic hydroperoxidases; evidence for multiple lateral transfer of genes between prokaryota and from bacteria into eukaryota // Mol.Biol. Evol.- 2003 .-№ 20.-1098-1112.

148. Knox K.W., Vesk M., Work E. Relation Between Excreted Lipopolysaccharide Complexes and Surface Structures of a Lysine1.mited Culture of Escherichia coli II J. BacterioL-1966.-Vol 92, № 4.-P. 1206-1217.

149. Kolling G.L., Matthews K.R. Export of Virulence Genes and Shiga Toxin by Membrane Vesicles of Escherichia coli 0157:H7 // Appl. and Env. Micr. 1999.- Vol. 65, № 5.-P. 1843-1848.

150. Kondo E., Knai K. Mechanism of bactericidal activity of ly-solecithin and its biological implication // Japan. J. Med. Sci. Biol. -1985. Vol. 38. - P. 181-194.

151. Koseoglu H., Asian G., Esen N., Sen B.H., Coban II. Ultrastruc-tural stages of biofilm development of Escherichia coli on urethral catheters and effects of antibiotics on biofilm formation // Urology. 2006. - Vol. 68, №5.- P.942-946.

152. Kunisada Т., Yamada K., Oda S., Нага O. Investigation on the efficacy of povidoneiodine against antiseptic-resistant species // Dermatology.- 1997.-Vol. 195, № 2.- P.14-18.

153. LaFleur M.D., Kumamoto C.A., Lewis K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells // Antimicrob. Agents. Chemother. 2006. - Vol.50, №11. - P.3839-3846.

154. Lasa I., Del Pozo J.L., Penades J.R., Leiva J. Bacterial biofilms and infection // An. Sist. Sanit. Navar. 2005. - Vol.28, №2. -P.163-175.

155. Lasa I. Towards the identification of the common features of bacterial biofilm development // Int. Microbiol.- 2006.- Vol. 9, №1.-P.21-18.

156. Lanzafame A., Bonfiglio G., Santini L., Mattina R. In vitro Activity of Levofloxacin against Recent Gram-Negative Nosocomial Pathogens//Chemotherapy.- 2005.-№ 51.-P.44-50.

157. Leadbetter J., Greenberg E. Metabolism of aeylhomoserine lactone quorum-sensing signals by Variovorax paradoxus // J. Bacte-riol. 2000.-№ 182.-P.6921-6926.

158. Lewis K. Programmed death in bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. - Vol. 64.-P.503-514.

159. Lewis K. Riddle of biofilm resistance // Antimicrob. Agents Chemother.-2001 .-Vol. 45.-P.999-1007.

160. Lewis K. Persister cells and the riddle of biofilm survival // Bio-chemistry.-2005. № 70.-P. 267-274.

161. Li Z., Clarke A.J., Beveridge T.J. A major autolysin of Pseudo-monas aeruginosa: subcellular distribution potential role in cell growth and division, and secretion in surfacen membrane vesicles. //J.Bacteri 1996.-Vol.l78:P.2479-2488.

162. Li Y. H., Lau P. C., Lee J. H., Ellen R. P. Cvitkovitch D. G. Natural genetic transformation of Streptococcus mutans growing in biofilms// J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183.- P. 897-908.

163. LI C., Hsu H., Wu Т., Tsao K., Sun C., Wu J. Cell-free DNA is released from tumor cells upon cell death: A study of tissue cultures of tumor cell lines // J. of Clin. Lab. Analys. 2003.-Vol. 17, № 4.-P. 103-107.

164. Lorenz M.G., Gerjets D., Wackernagel W. Release of transforming plasmid and chromosomal DNA from two cultured soil bacteria //Arch. Microbiol.-1991.-№ 156.-P. 319-326.

165. Lorenz M.J., Wackernagel W. Bacterial Gene Transfer by Natural Genetic Transformation in the Environment // Micr. Rev. 1994.-Vol.58,№3.-P. 563-602.

166. Lynch M. J., Swift S., Kirke D. F., Keevil C. W., Dodd С. E., Williams P. The regulation of biofilm development by quorum sensing in Aeromonas hydrophila // Environ. Microbiol. 2002.- Vol. 4.-P. 18-28.

167. Maeda S., Ito M., Ando Т., Ishimoto Y., Fujisawa Y., Takahashi H., Matsuda. A, Sawamura A., Kato S. Horizontal transfer of non-conjugative plasmids in a colony biofilm of Escherichia coli II FEMS Microbiol Lett. -2006.-Vol.255,№ 1.-P. 115-120.

168. Mavrodi D. V., Bonsall R. F., Delaney S. M., Soule M. J., Phillips G., Thomashow L. S. Functional Analysis of Genes for Biosynthesis of Pyocyanin and Phenazine-l-Carboxamide from Pseu-domonas aeruginosa PAOl // J. Bacteriol.-2001.-№ 183.-P. 64546465.

169. Mah T. F., O'Toole G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents // Trends Microbiol. 2001. - Vol. 9. - P.3439.

170. Mandersloof J.G., Reman F.C., van Deenen L.L.M., de Gier J. Barrier properties of lecithin / lysolecithin mixtures // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - Vol. 382. - P. 22-26.

171. Martinez J. L., Baquero F. Mutation frequencies and antibiotic resistance // Antimicrob. Agents and Chemother.-2000.-№ 44. P. 1771-1777.

172. Mayrand D., Grenier D. Biological activities of outer membrane vesicles// Can.J.Microbiol.-1989.-Vol. 35:P.607-613.

173. Merritt J., Qi F., Goodman S. D., Anderson M. H., Shi W. Mutation of luxS Affects Biofilm Formation in Streptococcus mutans II Infect. Immun.-2003.-№ 71. P. 1972-1979.

174. Miller M., Bassler B. Quorum sensing in bacteria // Annu Rev Microbiol. 2001 .-№ 55.-P. 165-199.

175. Molin S, Tolker-Nielsen T. Gene transfer occurs with enhanced efficiency in biofilms and induces enhanced stabilisation of the biofilm structure// Curr. Opin. Biotechnol.- 2003.-Vol.14, № 3.-P.255-261.

176. Moscoso M., Garcia E., Lopez R. Biofilm Formation by Streptococcus /wewmoniae: Role of Choline, Extracellular DNA, and Capsular Polysaccharide in Microbial Accretion // J. of Bacteriol. -2006.-Vol 188, № 22.- P. 7785-7795.

177. Muto Y., Goto S. Transformation by extracellular DNA produced by Pseudomonas aeruginosa II Microbiol: Immunol.-1986.-№ 30.-P. 621-628.

178. Nadkarni M. A., Martin F. E., Jacques N. A., Hunter N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set // Microbiology.-2002.-№ 148.-P. 257-266.

179. Nandi S., Maurer J.J., Hofacre C., Summers F.J. Gram-positive bacteria are a major reservoir of Class 1 antibiotic resistance inte-grons in poultry litter // PNAS.- 2004.-Vol. 101, № 18.-P. 71187122.

180. Niemeyer J., Gessler F. Determination of free DNA in soils // J. Plant Nutr. Soil Sci.-2002. Vol. 165.-P.121-124.

181. O'Connell H.A., Kottkamp G.S. Influences of biofilm structure and antibiotics resistance mechanisms on indirect pathogenicity in a model polymicrobial biofilm // Appl. Environ. Microbiol. 2006. -Vol.72, №7. - P.5013-5019.

182. Olson M. E., Ceri H., Morck D. W., Buret A. G.,Read R. R. Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics // Can. J. Vet. Res. 2002.-№ 66.-P. 86-92.

183. O'Toole G., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development // Annu. Rev. Microbiol.-2000.-№ 54.-P.49-79.

184. Palchevskiy V., Finkel S. Escherichia coli Competence Gene Homologs Are Essential for Competitive Fitness and the Use of DNA as a Nutrient // Journ. of Bacteriol. 2006. - Vol. 188, № 11. - P. 3902-3910.

185. Parsek M.R., Greenberg E.P. Acyl-homoserine lactone quorum sensing in Gram-negative bacteria: A signaling mechanism involvedin associations with higher organisms // Proc. Nat. Acad. Sci.-2000.-Vol.97, №16.-P.8789-8793.

186. Pearson J.P., Van Delden C., Iglewski B.H. Active Efflux and Diffusion Are Involved in Transport of Pseudomonas aeruginosa Cell-to-Cell Signals // J. Bact. 1999.- Vol. 181, № 4.- P. 12031210.

187. Petersen F.C., Pecharki D., Scheie A., Biofilm Mode of Growth of Streptococcus intermedins Favored by a Competence-Stimulating Signaling Peptide // J. Bact. 2004.- Vol 186, № 18.- P. 6327-6331.

188. Petersen F.C., Tao L., Scheie A.A. DNA Binding-Uptake System: a Link between Cell-to-Cell Communication and Biofilm Formation //J. of Bact. 2005.-Vol.187, №13. - P. 4392-4400.

189. Renelli M., Matias V, Lo R., Beveridge T. DNA-containing membrane vesicles of Pseudomonas aeruginosa PAOl and their genetic transformation potential // Microbiology.-2004.-№150.-P. 2161-2169.

190. Rakita R.M., Jacques-Palaz K., Murray B.E. Intracellular activity of azithromycin against bacterial enteric pathogens. // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. -Vol. 38, № 9. - P.1915-1921.

191. Ramage G., Martinez J.P., Lopez-Ribot J.L. Candida biofilms on implanted biomaterials: a clinically significant problem // FEMS Yeast Res. 2006. - Vol.6, №7. - P.979-86.

192. Rasmussen T.B., Quorum M.G. Quorum sensing inhibitors: a bargain of effects // Microbiology.- 2006.- № 152.- P. 895-904.

193. Reisner A., Haagensen J.A., Schembri M.A., Zechner E.L., Molin

194. Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms // Mol. Microbiol.- 2003.-Vol. 48.-№ 4.-P.933-46.

195. Revenchon S., Bouillant M., Salmond G., Nasser W. Integration of the quorum-sensing system in the regulatory networks controlling virulence factor synthesis in Erwinia chrysanthemii II Mol Micro-biol.- 1998.-№ 29.-P.1407-1418.

196. Sat В., Hazan R., Fisher Т., Khaner H., Glaser G., Engelberg-Kulka H. Programmed Cell Death in Escherichia coli: Some Antibiotics Can Trigger mazEF Lethality // J. of Bact. -2001.-Vol 183, №6.-P. 2041-2045.

197. Shah D., Zhang Z., Khodursky A., Kaldalu N., Kurg K., Lewis K., Persisters: a distinct physiological state of E. coli II BMC Microbiology." 2006.-Vol.53, №6.-P. 1-9.

198. Shapiro J.A. The significances of bacterial colony patterns. //BioEssays.- 1995.-Vol.17, N7.-P.597-607.

199. Schauder S., Bassler B. L. The languages of bacteria // Genes & Dev.-2001 .-№ 15.-P. 1468-1480

200. Scheie A.A., Petersen F.C. The biofilm concept: consequences for future prophylaxis of oral diseases? // Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 2004.- Vol. 15, №1.- P. 4-12.

201. Stone B. J., Kwaik Y.A. Natural competence for DNA transformation by Legionella pneumophila and its association with expression of type IV pili. //J. Bacteriol.-1999.-№ 181.-P.1395-1402.

202. Van Schaik E., Giltner C.L., Audette G.F., Keizer D.W., Bautista D.L., Slupsky C.M., Sykes B.D., Irvin R.T. DNA Binding: a Novel Function of Pseudomonas aeruginosa Type IV Pili // J. Bact.- 2005.-Vol. 187, № 4. P. 1455-1464.

203. Schooling S.R. Beveridge T.J. Membrane Vesicles: an Overlooked Component of the Matrices of Biofilms // J. Bacteriol.-2006.-Vol.188, № 16.-P. 5945-5957.

204. Siegrist H.H., Nepa M.C., Jacquet A. Susceptibility to levoflox-acin of clinical isolates of bacteria from intensive care and haema-tology/oncology patients in Switzerland: a multicentre study // J Antimicrob Chemother.- 1999.- Vol. 43, № l.-P. 51-44.

205. Skarstad K., Steen H.D., Boye E. Cell cycle parameters of slowly growing Escherichia coli B/r studied by flow cytometry // J. Bact.-1983.-Vol. 154, №2.-P. 656-662.

206. Smil V. Phosphorous in the environment: Natural Flows and Human Interferences. 2000.-Vol. 25.-P. 53-88.

207. Sorensen S.J., Bailey M., Hansen L.H., Kroer N., Wuertz S. Studying plasmid horizontal transfer in situ: a critical review // Nat. Rev. Microbiol.- 2005.-Vol. 3, № 9.-P.700-710.

208. Spoering A.L., Gilmore M.S. Quorum sensing and DNA release in bacterial biofilms // Current Opinion in Microbiology.- 2006.-№ 9.-133-137.

209. Sponza D. Т. Investigation of extracellular polymer substances (EPS) and physiochemical properties of different activated sludge floes under steady state conditions // Enzyme Microb. Technol.-2003. Vol.-32.-P.375-385.

210. Stanley N. R., Lazazzera B. A. Environmental signals and regulatory pathways that influence biofilm formation // Mol. Microbiol. 2004. -№ 52.- 917-924.

211. Steinberger R. E., Holden P.A. Extracellular DNA in Single-and Multiple-Species Unsaturated Biofilms // Applied and Environmental Microbiology.- 2005.- Vol. P. 5404-5410.

212. Steinmoen H., Teigen A., Havarstein L. Competence-Induced Cells of Streptococcus pneumoniae Lyse Competence-Deficient Cells of the Same Strain during Cocultivation // Journal of Bacteriology.- 2003.- Vol. 185, №24.-P. 7176-7183.

213. Stewart P. S. Theoretical aspects of antibiotic diffusion into microbial biofilms // Antimicrob. Agents Chemother.-1996.- № 40.-P.2517-2522.

214. Stewart P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms // Biotechnol. Bioeng.- 1998.- Vol. 59.-P.261-271.

215. Stewart P. S., Costerton J. W. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms // Lancet.-2001. № 358.-P.135-138.

216. Stewart P.S. Mechanisms of antibiotic resistance in bacterial biofilms // Int. J. Med. Microbiol. 2002.;-Vol. 292.-P. 107-113.

217. Stickler D., Dolman J., Rolfe S., Chawla J. Activity of some antiseptics against urinary tract pathogens growing as biofilms on silicone surfaces // Eur. J. of Clin. Micr. & Inf. Dis. 1991.- Vol. 10, № 5.-P. 410-415.

218. Sticker D.J. Polymicrobial bacteriuria: Biofilm formation on foreign bodies and colonization of the urinary tract. In: Colonization of Mucosal Surfaces ed Nataro J.P., Cohen P.S., Mobley H.T., Weiser J.N., ASM Press, Washington DC.-2005.-P. 409-429.

219. Stoodley P., Debeer D., Lewandowski Z. Liquid Flow in Biofilm Systems // Appl. Environ. Microbiol. -1994.- Vol. 60, № 8.-P.2711-2716.

220. Stoodley P., Sauer K., Davies D.G., Costerton J.W. Biofilms as complex differentiated communities // Annu. Rev. Microbiol.-2002.-№ 56.-P.187-209.

221. Suci P.A., Mittelman M.W., Yu F.P., Geesey G.G. Investigation of ciprofloxacin penetration into Pseudomonas aeruginosa biofilms // Antimicrob. Agents. Chemother. 1994. - Vol.38, №9. - P.2125-2133.

222. Surdeau N., Laurent-Maquin D., Bouthors S., Gelle MP. Sensitivity of bacterial biofilms and planktonic cells to a new antimicrobial agent, Oxsil 320N // J. Hosp. Infect. 2006. - Vol.62, №4. -P.487-493.

223. Ta-Hsiu L., Salnikow J., Moores S., Stein W. Bovine Pancreatic Deoxyribonuclease A // J. of Biolog. Chem. 1972.- Vol. 248, №. 4.-P.1489-1495.

224. Tanabe K., Kondo Т., Onodera Y. A conspicuous adaptability to antibiotics in the Escherichia coli mutator strain, dnaQ49 // FEMS Microbiology Letters.-1999.-№ 176.-P. 191-196.

225. Thomas C.M., Nielsen K.M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria // Nature Rev.-2005.-№3.-P.711-721.

226. Trotha R., Hanck Т., Konig W., Konig B. Rapid ribosequencing -an effective diagnostic tool for detecting microbial infection // Infection. 2001. -№ 29.-P. 12-16.

227. Tetz V.V. Colony-like communities of bacteria // Microbios. -1994. Vol.80, № 322. - P.63-65.

228. Tetz V.V. The effect of antimicrobial agents and mutagen on bacterial cells in colonies // Med. Microbiol. Lett. 1996. - №5. -P.426-436.

229. Tetz V.V. Mixed bacterial communities and antibiotics// Clin. Microbiol. Infect. 1997. - Suppl. 3. - P. 299.

230. Tetz V.V., Rybalchenko O.V., Savkova G.A. Surface films of Escherichia coli colonies // FEMS. Microbial. Lett. 1993. -Vol.107, № 2-3. - P.23 1-240.

231. Tetz V.V., Rybalchenko O.V., Savkova G.A. Ultrastructural features of microbial colony organization //J. Basic Microbiol. 1990. -№30.- P.597—607.

232. Tetz V.V., Rybalchenko O.V., Savkova G.A. Ultrastructure of surface film of bacterial colonies // J. Gen.Microbiol. 1993. -Vol.139, № 4. - P.855-858.

233. Tetz V.V., Rybalchenko O.V., Savkova G.A. Morpho-physiologic characteristics of Escherichia coli and Shigella flexneri 2a carrying the htpR 15 gene // J. Basic Microbiol.- 1993,- № 33.-P. 131-139.

234. Tetz V.V. The Pangenome concept: a unifying view on genetic information // Med. Sci. Monit.-2005.-Vol.l 1, №7.-P.24-29.

235. Tomlin, K. L., Malott, R. J., Ramage, G., Storey, D. G., Sokol, P. A., Ceri, H. Quorum-Sensing Mutations Affect Attachment and Stability of Burkholderia cenocepacia Biofilms // Appl. Environ. Microbiol.-2005.-№ 71.-P. 5208-5218.

236. Van Schaik E.J., Giltner C.L., Audette G.F., Keizer D.W., Bautista D.L., Slupsky C.M. DNA binding: a novel function of Pseudomonas aeruginosa type IV pili // J. Bacterid.- 2005.- № 187.-P. 1455-1464.

237. Vorachit M. Lam K., Jayanetra ., Costerton J. Resistance of Pseudomonas pseudomallei Growing as a Biofilm on Silastic Discs to Ceftazidime and Co-Trimoxazole // Antimic. Agents and Chemother. 1993. - Vol.37, № 9.-P. 2000-2002.

238. Yamasaki Y., Akiyama H., Toi Y., Arata J. A combination of roxithromycin and imipenem as an antimicrobial strategy against biofilms formed by Staphylococcus aureus // J. Antimicr. Chemo-ther.-2001.-№ 48.-P. 573-577.

239. Yaron S., Kolling L., Simon L., Matthews K. Vesicle-Mediated Transfer of Virulence Genes from Escherichia coli 0157:H7 to Other Enteric Bacteria // Appl. and Env. Microbiol.-2000.-№ 66.-P. 4414-4420.

240. Yarmolinsky M. B. Programmed cell death in bacterial populations//Science.-1995.-№ 267.-P. 836-837.

241. Uhlinger D.J., White D.C. Relationship Between Physiological Status and Formation of Extracellular Polysaccharide Glycocalyx in

242. Pseudomonas atlantica // Appl. Environ. Microbiol. 1983. - Vol. 45, № 1.-P. 64-70.

243. Wang Y., Goodman S., Redfield R., Chen C. Natural Transformation and DNA Uptake Signal Sequences in Actinobacillus actin-omycetemcomitans II J. Bacteriol.-2002.-Vol 184, № 13. P.3442-3449.

244. Wang B.Y., Chi В., Kuramitsu H.K. Genetic exchange between Treponema denticola and Streptococcus gordonii in biofilms //Oral Microbiol. Immunol.- 2002. Vol.17, № 2.-P. 108-112.

245. Wang Y., Liang S. Autoinducter -2 (AI-2) mediated quorum sensing in Escherichia coli //Dissertation.-2004.

246. Waters C.M., Bassler B.L. Quorum Sensing: Cell-to-Cell Communication in Bacteria // Ann. Rev. of Cell and Dev. Biol. 2005.-Vol. 21.- P. 319-346.

247. Watnic P., Kotler R. Biofilm, city of microbes // J. Bacter.2002.-№182.-P.2675-2679.

248. Whitehead N.A., Barnard A.M., Slater H., Simpson N.J., Salmond G.P. Quorum-sensing in Gram-negative bacteria // FEMS Microbiol Rev. -2001. Vol. 25, № 4.-P.365-404.

249. Webb J. S., Givskov M., Kjelleberg S. Bacterial biofilms: pro-karyotic adventures in multicellularity // Curr. Opin. Microbiol.2003.-№ 6. P. 578-585.

250. Webb J.S., Thompson L.S., James S., Charlton Т., Tolker-Nielsen T, Koch В., Givskov M., Kjelleberg S. Cell Death in

251. Pseudomonas aeruginosa Biofilm Development // J. of Bacter.-2003.- Vol. 185, № 15.-P. 4585-4592.

252. Wuertz S., Okabe S., Hausner M. Microbial communities and their interactions in biofilm systems: an overview // Water Sci. Technol. 2004.-Vol. 49, № 11 .-P.327-336.

253. Whitchurch C.B., Tolker-Nielsen Т., Regas P.C., Mattick J.S. Extracellular DNA required for bacterial biofilm formation // Science.-2002.-№ 295.-P.1487.

254. Woese C.R. Bacterial evolution // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1987.-Vol. 51, №2.-P. 221-271.

255. Xu K. D., McFeters G.A., Stewart P.S. Biofilm resistance to antimicrobial agents // Microbiology.-2000.-№ 146.-P.547-549.

256. Zhao X., Drlica K. Restricting the selection, of antibiotic-resistant mutants: a general strategy derived from fluoroquinolone studies // Clinic. Infec. Dis. 2001. - Vol. 33, №.-P. 147-156.

257. Zheng Z., Stewart P.S. Penetration of Rifampin through Staphylococcus epidermidis Biofilms Antimicrob. Agents and Chemother. 2002.-Vol 46, №3.-P. 900-903.

258. Zhou L., Srisatjaluk R., Justus D.E., Doyle R.J. On the origin of membrane vesicles in Gram-negative bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 199 8.-Vol. 163№2.-P.223-22 8.

Информация о работе

Тец, Георгий Викторович
кандидата биологических наук
, 0
ВАК 03.00.07

Диссертация

Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биопленок с антибиотиками - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы