Действие стрессовых факторов на бактериальные биопленки с дефектом структуры внеклеточного полимерного матрикса

Стрелкова, Екатерина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Действие стрессовых факторов на бактериальные биопленки с дефектом структуры внеклеточного полимерного матрикса
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Действие стрессовых факторов на бактериальные биопленки с дефектом структуры внеклеточного полимерного матрикса"

На правах рукописи

СТРЕЛКОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ДЕЙСТВИЕ СТРЕССОВЫХ ФАКТОРОВ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЕ БИОПЛЕНКИ С ДЕФЕКТОМ СТРУКТУРЫ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ПОЛИМЕРНОГО МАТРИКСА

Специальность 03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

00554188Ь

5 ДЕК 2013

Москва-2013

005541886

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН)

Научный руководитель: Плакунов Владимир Константинович,

доктор биологических наук профессор

Официальные оппоненты: Романова Юлия Михайловна,

доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Ивановский Руслан Николаевич,

доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник кафедры микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация: факультет почвоведения Московского

государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 23 декабря 2013 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 при ИНМИ РАН по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН Автореферат разослан « » ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.В. Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Известно, что микробные популяции в биопленках существенно отличаются по физиолого-биохимическим свойствам от суспензионных культур [James et al., 1995]. Реализация специфического биопленочного фенотипа определяет повышенную устойчивость биопленок к стрессовым факторам, антибиотикам и другим биоцидам. Изучению механизмов устойчивости биопленок посвящено большое количество работ. Среди возможных причин повышенной устойчивости к антимикробным препаратам исследователи называют индукцию систем, обуславливающих экскрецию антибиотиков из клеток [Nikaido, 2009], низкую скорость диффузии антибиотиков через внеклеточный полимерный матрикс [Lewis, 2001], возникновение клеток-персистеров [Levin and Rozen 2006], сниженную скорость метаболизма бактерий в биопленках [Costerton et al., 1999]. Описан интересный механизм протокооперативных взаимоотношений в условиях бинарной биопленки: галотолерантный нефтеокислитель не только выживает, но и размножается при концентрации NaCl, которая является летальной для чистой планктонной культуры этого гапотолеранта, за счет накопления в биопленке гапофильным спутником осмопротекторного вещества (эктоина) [Плакунов с соавт., 2008]. В случае устойчивости биопленок к неблагоприятным физико-химическим факторам среды (таким, как pH и температура) некоторые авторы предполагают важную роль матрикса биопленок [Scher et al., 2005]. Однако экспериментальные доказательства механизма этого явления отсутствуют.

Поэтому механизмы устойчивости биопленок к антимикробным веществам и стрессовым факторам среды, а также роль в этих процессах внеклеточного полимерного матрикса заслуживают более детального изучения. Следует отметить, что из-за различий в применяемых методиках и в экспериментальных подходах в процессе получения биопленок, появилось множество разнообразных и, иногда, альтернативных взглядов на механизмы этой устойчивости. Кроме того, большинство подобных исследований ограничено клиническими штаммами микроорганизмов. Связано это с тем, что многие патогенные микроорганизмы образуют биопленки в инфицированном ими макроорганизме или на поверхности медицинского оборудования (катетеры, глазные линзы и др.), что приводит к возникновению трудно излечиваемых рецидивов заболеваний. Между тем, изучение механизмов устойчивости биопленок сапротрофных микроорганизмов - не менее важная задача. В частности, необходимо знать, есть ли прямая связь повышенной устойчивости биопленок с патогенностью входящих в них микроорганизмов (например, с образованием факторов патогенности). Понимание механизмов устойчивости сапротрофных микроорганизмов - это важный шаг на пути разработки методов борьбы с нежелательным биопленкообразованием (в процессах биокоррозии и биообрастания технологического оборудования). С другой стороны, знания механизмов устойчивости могут быть ценным инструментом для стимуляции биопленкообразования в случае использования активности биопленок в процессах очистки природных сред от загрязнений (например, в системах водоподготовки). Эти знания также могут быть полезны для понимания процессов формирования и функционирования микробных сообществ в природных экотопах.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение динамики формирования биопленок сапротрофными микроорганизмами, изолированными из пластовых вод нефтяных месторождений, а также их модельными аналогами и выявление вклада внеклеточното полимерного матрикса в устойчивости этих биопленок к антимикробным веществам и экстремальным условиям среды.

Для достижения данной цели были поставлены задачи:

1. Определить сравнительную чувствительность планктонных культур и биопленок нефтеокисляющих микроорганизмов, изолированных из пластовых вод нефтяных месторождений, а также модельных микроорганизмов к антибиотикам с различным механизмом действия (в качестве биохимических инструментов).

2. Разработать метод, позволяющий изучать динамику формирования биопленок (возникновение «биопленочного» фенотипа).

3. Разработать способы визуализации матрикса биопленок различными микроскопическими методами.

4. Изучить сравнительную чувствительность планктонных культур изученных микроорганизмов и их биопленок к экстремальным факторам среды (тепловому, осмотическому и кислотному шоку).

Научная новизна работы

Разработан метод изучения динамики формирования биопленок. Для культур Kocuria sp., Dietzia sp., P.chlororaphis 66 установлено время перехода от планктонного способа существования к биопленочному, которое составляет 2-6 часов.

Установлено, что биопленки сапротрофных штаммов (Dietzia sp., Kocuria sp., Pseudomonas sp., Chromobäcterium sp.) значительно более устойчивы к действию антимикробных препаратов, чем их планктонные культуры. Показано, что биопленки сапротрофных бактерий по этому свойству не отличаются от изученных другими исследователями биопленок патогенных штаммов бактерий.

Впервые для сапротрофных микроорганизмов обнаружено явление стимуляции биопленкообразования под действием суббактериостатических концентраций антибиотиков (азитромицина, рифампицина), которое было описано ранее лишь для патогенных микроорганизмов.

Впервые обнаружена повышенная устойчивость биопленок некоторых нефтеокисляющих грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (изолированных из пластовых вод нефтяных месторождений, а также коллекционных культур) к неблагоприятным физико-химическим условиям среды: температуре, pH среды и к повышенной концентрации NaCl.

Практическая значимость работы

Показано, что внеклеточный полимерный матрикс играет важнейшую роль в обеспечении устойчивости биопленок к неблагоприятным физико-химическим факторам среды. Это во многом объясняет закономерности существования и выживания сообществ микроорганизмов в природных экотопах (в почве, водоемах и нефтяных месторождениях), где экстремальные факторы среды периодически возникают или существуют постоянно.

Воздействие на внеклеточный полимерный матрикс в качестве мишени, поиск путей его эффективного разрушения может быть одним из успешных методов борьбы с биопленками.

В тех случаях, когда необходимо использовать полезные свойства биопленок (интенсификация процессов биодеградации субстратов, повышение нефтеизвлечения) стимуляцию биопленкообразования можно проводить путем создания благоприятных условий для формирования матрикса.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на III Всероссийском конгрессе с международным участием «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний-Новгород, 2010), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010), на XXIII Международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011), а также на Молодежной школе конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» в 2010, 2011,2012, 2013 году.

Публикации

Материалы диссертации опубликованы в 5 экспериментальных статьях, 1 обзоре литературы и 10 тезисах конференций.

Место проведения работы и благодарности

Работа выполнена в лаборатории нефтяной микробиологии в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН). Микроскопические исследования были выполнены на кафедре биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н. Плакунову В.К., а также своим соавторам д.б.н. проф. Беляеву С.С., к.б.н. Журиной М.В. за практическую помощь, ценные советы на всех этапах выполнения работы.

Объём и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 118 страницах машинописного текста и включают 30 рисунков и 3 таблицы. Список литературы» содержит 160 источников, в том числе 26 отечественных и 134 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования послужили чистые культуры бактерий, главным образом, нефтеокисляющих, относящиеся к родам Dietzia (штамм 2610-1), Kocuria (штамм 4А-2Ж), изолированных через промежуточное формирование биопленок [Плакунов с соавт. 2008] из пластовых вод Ромашкинского нефтяного месторождения, а также неспособный к окислению нефти галофильный спутник Chromohalobacter sp. (штамм 21684-1К). Кроме того, были использованы

нефтеокисляющие бактерии рода Pseudomonas из коллекции лаборатории нефтяной микробиологии. Для сравнения взяты модельные бактерии: Chromobacterium violaceum WT (типовой штамм АТСС 31532) и его мутант CV026, а также Р. chlororaphis 66 и Р. aeruginosa PAOI, предоставленные проф. И.А.Хмель (Институт молекулярной генетики РАН).

Микроорганизмы сохраняли на среде LB в столбиках под вазелиновым маслом (для галофила Chromohalobacter sp. добавляли 10% NaCl) при 4-6°С кроме культур Chromobacterium, которые хранили при комнатной температуре (мутант CV026 в присутствии 100 мкг/мл канамицина). Для приготовления инокулята бактерии выращивали на среде LB при 29°С на качалке (150 об/мин) в течение 20-24 ч. Эти культуры использовали в опытах с биопленками.

Для сравнения чувствительности планктонных культур и биопленок к антибактериальным веществам и физико-химическим факторам среды использовали предложенный нами метод с использованием тефлоновых блочков [Стрелкова с соавт., 2012]. В этом случае для формирования биопленок в пробирку с 4 мл среды LB вносили 2 г тефлоновых блочков (размер 2x2x2 мм) и 50 мкл инокулята. На тефлоновых блочках происходило формирование биопленок, планктонные (суспензионные) культуры развивались в той же пробирке в жидкой среде. После завершения инкубации планктонную культуру отделяли, и ее рост измеряли по величине условной оптической плотности (светопоглощение+светорассеяние) при 540 нм. Блочки отмывали от планктонных клеток 1% раствором NaCl, и биопленки фиксировали 96% этанолом. После удаления спирта окрашивание биопленок производили 0.1% водным раствором красителя кристаллического фиолетового (КФ). В параллельных опытах для окрашивания матрикса биопленок использовали красители альциановый синий или 1,9-диметилметиленовый синий (1,9-dimethylmethylene blue, DMMB) по стандартной методике [Peeters et al., 2008]. После экстракции красителей 96% этанолом (а в случае DMMB специальным декомплексирующим раствором) оптическую плотность растворов измеряли при 590 нм (в случае кристаллического фиолетового) или при 540 нм (в случае альцианового синего) и 620 нм (для DMMB). В отдельных опытах параллельно с окрашиванием и экстракцией красителей определяли количество углерода биопленок методом мокрого сжигания.

Чувствительность Планктонной культуры к антибиотикам характеризовали концентрацией антибиотика, подавляющей на 50% скорость роста культуры (ИД5о) (через 24 ч инкубации при 28°С) в пробирках на качалке (150 об/мин).

В экспериментах По измерению зависимости роста от температуры культивирования использовали биопленки, предформированные при оптимальной температуре в течение 6 ч, когда заканчивается период реализации «биопленочного фенотипа» (см. раздел 2.2.). После завершения этого процесса культуры переносили в термостаты с исследуемыми температурами.

В опытах с азитромицином предформирование биопленок культуры P. acephalitica осуществляли в присутствии 0.5 мкг/мл этого антибиотика.

В случае измерения зависимости роста от концентрации соли и pH использовали биопленки в стадии формирования без прединкубации. Состав и количество осмопротекторов в бинарных биопленках (из культур нефтеокисляющего галотолеранта Dietzia sp. и его спутника галофила Chromohalobacter sp.) определяли

по'ранее описанной методике [Журина с соавт. 2008] после выращивания биопленок на целлофановых фильтрах в чашках Петри на среде LB в присутствии 10% NaCl. Сравнение проводили с монокультурами галофила, выращенными в тех же условиях. Количество экстракта, наносимого на хроматограмму, нормировали путем пересчета на единицу биомассы галофила. Для этого культуры с фильтров смывали 96% этанолом и после экстракции эктоина определяли общую сухую биомассу. В случае бинарных биопленок осадок после экстракции эктоина обрабатывали 10 мл дистиллированной воды при pH 8.5 с добавлением 1-2 мг ДНКазы и 5 мг MgS04x7H20. При этом наступал полный лизис клеток галофила. Остаток после центрифугирования и повторного промывания высушивали для определения сухой биомассы галотолеранта - нефтеокислителя. Биомассу галофила-спутника вычисляли как разность между общей биомассой и биомассой нефтеокислителя. Полноту удаления клеток галофила проверяли в модельных опытах.

Для исследований методами фазово-контрастной (ФКМ) и эпифлуоресцентной (ЭпиФМ) (микроскоп Axio Imager. Dl Carl Zeiss объектив х40), лазерной интерференционной (ЛИМ) и атомной силовой микроскопии (АСМ), биопленки формировали на покровных стеклах. С этой целью стекла стерилизовали в чашках Петри сухим жаром, затем в чашки стерильно заливали по 10 мл среды LB (в случае мутанта CV026 добавляли 100 мкг/мл канамицина) и вносили инокулят: 50 мкл 24-часовой бактериальной культуры. Инкубировали в стационарных условиях при 28-29°С в течение 48 ч. Планктонную культуру сливали, стекла осторожно подсушивали фильтровальной бумагой, и биопленки фиксировали слабым нагреванием в пламени горелки. Для ФКМ окрашивание проводили по стандартной методике красителем DMMB. Для ЭпиФМ - красителем DAPI. Для ЛИМ и АСМ использовали неокрашенные препараты.

Для измерений методом ЛИМ использовали микроскоп МИА-1, (ВНИИОФИ, Россия). Принцип метода и схема прибора подробно изложены в работах [Юсипович с соавт., 2011].

АСМ-изображения были получены с использованием комплекса NTEGRA SPECTRA (NT-MDT, Зеленоград, Россия) и программы NOVA (NT-MDT). Измерения проводили в полуконтактном режиме при помощи зонда NSG 10-А, средний модуль упругости 11.8 Н/м, средний радиус кривизны 10 нм. Область сканирования составляла 40x40 мкм (256x256 точек), частота сканирования составляла 1 Гц.

Обработку АСМ и ЛИМ изображений проводили с использование программы SPIP 6.0 (Image Metrology A/S, Harsholm, Denmark). Для определения латеральных размеров объектов в фазовых изображениях использовался Фурье-анализ усредненных профилей изображения, где размеры частиц определялись по наличию частот в Фурье спектре. Параметр шероховатости (S) для АСМ и ЛИМ изображений рассчитывали по формуле:

1 М-1 N-1

2>(w,)|, (i)

MN t=0 о

где MN — номер точки по координатам х и у, соответственно, к, I — индекс точки, z — амплитуда в точке хь y¡.

Диапазон высот (S¡) для АСМ изображений рассчитывали как разность высот между самой низкой и самой высокой точкой изображения.

Sz zmax - zmin (2)

Фрактальную размерность (Sß) для ACM изображений рассчитывали по алгоритму, указанному в программе SPIP 6.0.

При помощи ЛИМ получают фазовые изображения распределения величины оптической разности хода лучей (ОРХ) в каждой точке объекта. Особенности использования ЛИМ для различных микробиологических объектов приведены в работе [Юсипович с соавт., 2011]. Измеряемая при помощи ОРХ величина в каждой точке плоскости объекта представляет из себя сумму произведений показателя преломления на толщину различных оптических сред в этой точке (среды, клеток и.т.д.) [Yusipovich et al.. 201 la]:

ОРХ = Oh Z, + Н2г2+...+ n„ Z„ ) - 1lmZ (3)

z и n- толщина и показатель преломления оптической среды, соответственно.

Электронномикроскопические исследования проводили на электронном микроскопе (JEM-100C, «Jeol», Япония) стандартными методами негативного контрастирования и ультратонких срезов. Препараты биопленок переносили на медные сеточки, покрытые формваровой пленкой (Serva, Heidelberg, Germany), и окрашивали 2% фосфорновольфрамовой кислотой (pH 3.5). Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-3R и окрашивали 3% водным раствором уранилацетата. Препараты просматривали в микроскопе при увеличении 7-20 тыс.

Статистическая достоверность результатов основана на выборе типичного эксперимента непараметрическим методом сравнения парных данных с учетом «критерия знаков» [Paulson, 2008]. Графические данные обрабатывали в программе Origin 8.6 с помощью функции ß-spline. В отдельных случаях (указанных в таблицах) применяли стандартную процедуру определения доверительного интервала по Стъюденту-Фишеру. Каждый эксперимент проводили в четырех повторностях.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Чувствительность к антибиотикам

Для изучения этапов формирования биопленок непатогенными бактериями мы предложили использовать антибиотики с разным механизмом действия в качестве молекулярных инструментов для выявления ключевых процессов метаболизма, приводящих к «биопленочному» фенотипу.

Измерение сравнительной чувствительности планктонных культур и биопленок изучаемых бактерий, в том числе модельных грамотрицательных микроорганизмов Р. chlororaphis 66 и С. violaceum, к трем антибиотикам (оксациллину, рифампицину и азитромицину) показало, что рост биопленок значительно (в десятки и сотни раз) менее чувствителен к изучаемым антибиотикам (за исключением биопленки С. violaceum CV026), чем рост планктонных культур, особенно в случае предформированных (в течение 6 ч) биопленок.

2.2. Динамика формирования биопленок

На основе предыдущих результатов нами предложен простой метод определения временнбй динамики формирования биопленки, т.е. момента проявления

«биопленочного» фенотипа, выражающегося в повышении устойчивости к антибиотику азитромицину.

Для этого антибиотик вносили в ячейки планшета или в пробирки с тефлоновыми блочками в разные моменты времени: 0 (вместе с инокулятом) и через 2, 4, 6 и 14 ч. Прирост биопленки по сравнению с контролем без антибиотика регистрировали через 24 ч (рис. 1).

В случае БмШа ер. антибиотики вносили через 0, 2, 4, 6, и 24 ч. Результаты, которые в этом случае оценивали через 48 ч (в связи с меньшей скоростью формирования биопленки данным микроорганизмом), представлены на рис. 2. Аналогичные данные получены для оксациллина и рифампицина (не показано).

% от контроля без антибиотика

100 г

90 80

70 60 50 40

0 2 4 6 8 10 12 Время внесения азитромицина, ч % от контроля без антибиотика 90

14 16

Рис. 1. Динамика роста планктонной культуры и формирования биопленки Косина ер. в зависимости от времени внесения

азитромицина (для

планктонной культуры — 0.05 мкг/мл, для биопленки - 1 мкг/мл:

1 — планктонная культура (ОП54о в % от контроля без антибиотика);

2 - суммарная биопленка (по окрашиванию КФ);

3 - матрикс биопленки (по окрашиванию альциановым синим).

Рис. 2. Динамика роста планктонной культуры и формирования биопленки эр. в зависимости от времени внесения

азитромицина (для

планктонной культуры — 0.5 мкг/мл, для биопленки - 5 мкг/мл:

1 — планктонная культура (ОП540 в % от контроля без антибиотика);

2 - суммарная биопленка (по окрашиванию КФ);

3 - матрикс биопленки (по окрашиванию альциановым синим).

0 2 4 6 20

Время внесения азитромицина, ч

В опытах с биопленочными культурами Косипа ер. существенное понижение чувствительности к азитромицину наблюдается в период между 2 и 4 ч (рис. 1, кривые 2 и 3), а для культуры й1еШа эр. - после несколько более длительной инкубации (между 4 и 6 ч) (рис. 2, кривые 2 и 3). Параллельное измерение чувствительности планктонных культур показало отсутствие заметного увеличения устойчивости при добавлении азитромицина в первые (2-14) часы инкубации (рис. 1 и 2, кривые 1). Этот факт исключает возможность влияния плотности микробной популяции или разложения антибиотика в процессе инкубации на величину чувствительности к нему бактерий.

Можно полагать, что именно в указанный период времени (между 2 и 6 ч) в биопленочной культуре происходит переход от обратимой стадии адгезии клеток к необратимой стадии и началу формирования внеклеточного матрикса биопленки.

Для уточнения этого вывода параллельно и независимо от окрашивания биопленок кристаллическим фиолетовым производили их окрашивание альциановым синим. Резкое возрастание окрашивания матрикса в этом случае наблюдалось параллельно с увеличением устойчивости к антибиотикам (рис. 1 и 2, кривые 3), что подтверждает выказанное предположение.

Аналогичные данные получены для модельной грамотрицательной бактерии Р.сЫогогарЫз 66, у которой время проявления «биопленочного» фенотипа составило 2-4 ч. (рис. 3).

% от контроля без антибиотика

Рис. 3. чувствительности

Зависимость Р.

1ПП4-

3 2

сМогогарЫз 66 к азитромицину от времени внесения антибиотика: 1- планктонная культура; 2- биопленка по

окрашиванию

кристаллическим фиолетовым; 3 - биопленка по окрашиванию альциановым синим.

Пунктиром показана величина контроля, принятого за 100%.

40-

30-

20-

0 2 4 6

10 12 14 16

Время внесения азитромицина (25 мкг/мл), ч

2.3. Стимуляция антибиотиками формирования биопленок

Ранее [Стрелкова с соавт., 2011] мы обнаружили, что низкие, суббактериостатические концентрации некоторых антибиотиков стимулируют образование биопленок. В настоящей работе это явление было исследовано подробнее. Антибиотики в широком диапазоне концентраций вносили одновременно с инокулятом микроорганизма или после предварительной инкубации биопленочной культуры в течение 4-6 ч. Далее методом окрашивания кристаллическим фиолетовым и альциановым синим прослеживали рост культуры и формирование матрикса в течение последующих 24 ч инкубации. Результаты для азитромицина представлены на рисунках 4 и 5. Можно видеть, что антибиотик в низких концентрациях (которые не оказывают влияния на рост планктонных культур изучаемых микроорганизмов или слабо подавляют его) вызывает заметную стимуляцию биопленкообразования. При этом скорость роста матрикса (по окрашиванию альциановым синим) (рис. 4 и 5, кривая 2) несколько превышает скорость размножения микробных клеток (по окрашиванию кристаллическим фиолетовым) (рис. 4 и 5, кривая 1).

Аналогичный эффект получен для Р. aeruginosa РА01 [данные приведены в рукописи].

% от контроля без антибиотика

I 1 I

0,00 0,02 0.04 0,06 0,08 0.10

12 3 4 Концентрация азитромицина, мкг/мл

Рис. 4. Стимуляция формирования биопленки Косипа эр. суббактериостатическими концентрациями азитромицина:

1 - биопленка по окрашиванию КФ;

2 - биопленка по окрашиванию альциановым синим

3 - планктонная культура. Пунктиром показана величина контроля, принятого за 100%.

% от контроля без антибиотика

350 300 250 200 150

Рис. 5. Стимуляция формирования биопленки Огек^а эр. суббактериостатическими концентрациями азитромицина:

1 - биопленка по окрашиванию КФ;

2 — биопленка по окрашиванию алъциановым синим.

3 - планктонная культура. Пунктиром показана величина контроля, принятого за 100%.

Концентрация азитромицина, мкг/мл

Сходное стимулирующее действие на формирование биопленок изученных бактерий оказывает рифампицин, тогда как для оксациллина это явление не обнаружено. Добавление азитромицина и рифампицина после завершения этапа обратимой адгезии (через 4-6 ч) приводило к снижению или отсутствию эффекта стимуляции биопленкообразования (не показано).

Мы полагаем, что антибиотики, непосредственно или опосредовано влияющие на процесс транскрипции и трансляции белка, имитируют действие стрессовых факторов, запускающих процессы формирования «биопленочного» фенотипа.

2.4. Визуализация внеклеточного полимерного матрикса с помощью различных микроскопических методов

Для изучения функционального вклада матрикса биопленок в их устойчивость к различным воздействиям необходимо иметь микроорганизмы с разным уровнем формирования матрикса, а также удобный метод визуализации и количественной характеристики некоторых особенностей его структуры (толщина, шероховатость). Одним из подходов является применение специфических красителей, избирательно взаимодействующих с компонентами матрикса.

Для визуализации матрикса биопленок ранее предлагались красители конго красный (окрашивает только целлюлозу и целлюлозоподобные гликаны) и альциановый синий (окрашивает кислые полисахариды), который мы использовали в предыдущих экспериментах [Стрелкова с соавт., 2012]. Однако, как по результатам цитируемой работы [Peeters et al., 2008], так и по нашим данным (см. далее), DMMB обладает

наибольшей избирательностью к компонентам матрикса и практически не окрашивает свободные от матрикса клетки бактерий.

Мы изучили возможность использования ряда микроскопических методов для визуализации матрикса биопленок и выявления различий в его формировании у модельных штаммов С. violaceum: у штамма С. violaceum WT, обладающего нормальной способностью к синтезу АГЛ - компонентов регуляторной системы quorum sensing и к формированию матрикса биопленки, а также у мутанта С. violaceum CV026 с нарушением синтеза N-ацилгомосеринлактонов (АГЛ) и предположительно сниженной способностью к формированию матрикса.

2.4.1. Световая микроскопия

На рис. 6 представлены типичные фотографии биопленок штамма С. violaceum WT и его мутанта CV026 , полученные методом ФКМ после окрашивания DMMB.

ПО мкм

Рис. 6. Фазово-контрастная микроскопия биопленок (выращенных на покровных стеклах) после окрашивания ОММВ:

С. ую1асеит \¥Т (а), мутант СУ026 при отсутствии в среде 1Ч-ацилгомосеринлактонов (б).

Анализ полученных изображений показал, что в соответствии с ранее высказанным предположением, биопленка мутанта характеризуется гораздо меньшим содержанием компонентов матрикса и преобладанием «оголенных», непогруженных в матрикс клеток и микроколоний (рис. 66). Можно полагать, что отдельные овальные включения матрикса обусловлены локальной спонтанной реверсией мутанта к дикому типу с восстановлением синтеза матрикса (частота около 10"7). Однако это предположение требует дальнейших исследований.

По сравнению со стандартной ФКМ метод ЛИМ обладает возможностью количественной оценки величины оптической разности хода объекта (ОРХ), что позволяет значительно расширить и автоматизировать анализ получаемых изображений.

Полученные при помощи ЛИМ фазовые изображения пленок можно интерпретировать как двумерную проекцию трехмерной структуры биопленки, а неровности объектов будут обусловлены либо геометрией пленки (неровности

рельефа) и/или (что более вероятно) различием в структуре (напр., более высоким значением показателя преломления клеток или наличием пустот).

Типичные фазовые изображения биопленок штаммов \¥Т и СУ026 приведены на рис. 7.

Таблица 1. Сравнение степени шероховатости биопленок, образуемых штаммами С. ую1асеит.

нм

Рис. 7. Фазовые изображения биопленок С. уЫасеит WT (а) и мутанта С. у'ю!асеит СУ026 (б), полученные методом ЛИМ.

Перепад величины ОРХ для штамма У/Т в среднем более чем в 9 раз превышает аналогичную величину для штамма СУ026, что, по-видимому, определяется различиями в толщине исследуемых биопленок.

Латеральные размеры объектов, определенные при помощи ЛИМ, составляют 10-15 мкм, что значительно больше размеров одной бактерии, однако такой размер, соответствует размеру микроколоний этих бактерий. Таким образом, внутренние структуры, оцениваемые ЛИМ, по-видимому, являются микроколониями клеток, представляющими из себя компактные скопления клеток и матрикса.

Штаммы Характерные латеральные размеры объектов, мкм сред±ст.откл. Средняя толщина (ОРХ), нм сред±ст.откл. Шероховатость, нм сред±ст.откл.

19.7±2.0 284.5±63.6 288.7±62.2

СУ026 14.7±1.5 30.1±8.5" 40.6±18.2'

Примечание: данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего (п = 10). * - р<0.05, критерий Сгьюдента для независимых выборок.

Шероховатость (изменение высоты от среднего) у СУ026 и \УТ различается, но, по-видимому, это, главным образом, связано с различной исходной толщиной пленки (чем больше толщина, тем больше шероховатость). Соответственно, большее

значение шероховатости и средней толщины образцов в случае штамма \УТ, обусловлено большим количеством матрикса внутри биопленки этого штамма.

Существенные различия в строении биопленок и содержании в них матрикса подтверждены применением метода эпифлуоресцентной микроскопии. Результаты представлены на рис. 8.

Рис. 8. Эпифлуоресцентная микроскопия препаратов биопленок, окрашенных ОАР1.

Биопленка С. ую1асеит \УТ (а); биопленка мутанта С. ую1асеит СУ026 (б).

Для выявления матрикса в этом случае использовали высокую концентрацию ОАР1 (100 мкг/мл) и более продолжительное время окрашивания (до 30 мин), как это рекомендовано в работе [Агеуес1о е1 а1., 2006]. В этих условиях ОАР1 накапливается в матриксе и визуализирует его за счет собственной флуоресценции красителя. Флуоресценция клеток, погруженных в матрикс, при этом экранируется.

В случае биопленки мутанта можно наблюдать отдельные клетки (рис. 86), в то время как в биопленке дикого штамма (рис. 8а) отдельные клетки различить невозможно, а наблюдается собственная флуоресценция красителя в толще матрикса.

2.4.2. Электронная микроскопия

В процессе подготовки проб к просвечивающей электронной микроскопии компоненты матрикса обезвоживаются, поэтому на типичных электронограммах ультратонких срезов обнаружить достоверные различия изучаемых штаммов не удается. Однако использование метода контрастирования (фосфорно-вольфрамовой кислотой) позволяет сохранить некоторые компоненты матрикса, а именно, мембранные везикулы (МВ), тесно ассоциированные с микробными клетками, которые являются обычными компонентами многих микробных биопленок [Уопегаша е1 а!., 2009]. Эти структуры в значительных количествах присутствуют в биопленках штамма дикого типа С. violaceum \УТ и практически не обнаруживаются в препаратах мутанта СУ026 [изображения приведены в рукописи].

2.4.3.Атомно-силовая микроскопия.

С использованием метода АСМ исследована поверхностная структура биопленок штаммов С. violaceum WT и мутанта С. violaceum CV026. Результаты представлены на рис. 9.

В Г

Рис. 9. АСМ-изображения биопленок штаммов С. ую1асеит \УТ (А, В) и мутанта С. уЫасеит СУ026 (Б,Г)- Изображения, полученные методом рассогласования (А, Б) и квазитрехмерного распределения высот (В, Г).

Можно видеть, что биопленка С. уЫасеит WT имеет развитый матрикс, в толще которого лежат отдельные клетки (рис. 9 А, В), в то время как в препарате мутантного штамма С. ую1асеит СУ026 матрикс практически отсутствует, и клетки лежат непосредственно на подложке (рис. 9 Б, Г).

Поверхность биопленки С. ую1асеит имеет достоверно большую

шероховатость и разброс высот, а также характеризуется большим значением фрактальной размерности. Эти отличия отражают присутствие большого количества

неравномерно распределенных компонентов матрикса в биопленке С. violaceum WT [данные приведены в рукописи].

Таким образом, окрашивание матрикса биопленки специфическими красителями позволяет выявить различия в его накоплении с помощью относительно простых методов ФКМ и ЭпиФМ. Применение методов ЛИМ и АСМ, используемых для характеристики поверхности объектов, дает возможность не только визуализировать матрикс биопленки, но и количественно охарактеризовать некоторые особенности его структуры.

2.5. Вклад внеклеточного полимерного матрикса в устойчивость биопленок к экстремальным факторам среды

2.5.1. Зависимость от температуры

Как мы уже упоминали, есть сведения, что биопленки могут обнаруживать повышенную устойчивость не только к антибактериальным агентам, но и к неблагоприятным физико-химическим условиям среды (тепловому, осмотическому и кислотному шоку), однако механизмы такой устойчивости остаются неизвестными.

Поэтому представлялось необходимым детально исследовать влияние физико-химических факторов на формирование биопленок изучаемыми микроорганизмами. В случае зависимости от температуры мы сравнивали планктонные культуры и предформированные биопленки.

Нами было показано, что биопленки Dietzia sp., Kocuria sp, и P. chlororaphis 66 no сравнению с планктонными культурами характеризуются лучшим ростом (в 1.5-2.0 раза) в области суб- и, особенно, супраоптимальных температур при сохранении величины температуры, оптимальной для роста.

Одно из возможных объяснений состоит в том, что механизм защиты биопленок при суб- и при супраоптимальных температурах связан с наличием внеклеточного полимерного матрикса, поскольку устойчивость к тепловому воздействию проявляется в наибольшей степени у предформированных биопленок. Можно предложить следующую рабочую гипотезу. При субоптимальных температурах изменяется барьерная функция клеточной мембраны, что повышает утечку (диффузионным путем) в окружающую среду некоторых важных метаболитов. В результате скорость роста клеток снижается. Матрикс биопленок снижает количество пассивно теряемых веществ клетки в окружающую среду и облегчает обратное поглощение этих метаболитов. Такая роль матрикса, обеспечивающая повышение скорости роста при неоптимальной температуре, по нашему мнению, вполне может быть названа «защитной».

При супраоптимальных температурах (43-45°С для мезофильных бактерий) в планктонной культуре наступает денатурация многих ключевых ферментов, и, если инкубацию продолжать более 24 ч, рост обычно подавляется полностью и наступает лизис клеток. Матрикс способствует аккумуляции термопротекторов, образуемых микроорганизмами в биопленке, тогда как в планктонных культурах такие осмопротекторы диффундируют в окружающую среду, а не накапливаются в клетках. В результате в таких денатурирующих условиях скорость роста у биопленок в 1.5-2 раза выше, чем у планктонных культур. Это имеет принципиальное

экофизиологическое значение, т.к. позволяет сохранять жизнеспособность и метаболическую активность микроорганизмов в экстремальных условиях.

С целью проверки этого предположения мы предложили использовать два подхода. Во-первых, проводили детальное сравнительное изучение чувствительности к физико-химическим факторам среды и антибиотикам биопленок исходных штаммов бактерий и их мутантов с дефектом структуры внеклеточного полимерного матрикса. Во-вторых, в аналогичных сравнительных экспериментах использовали бактерии, у которых процесс формирования биопленок был подавлен в присутствии некоторых антибиотиков в связи с аномально высокой чувствительностью к ним процесса формирования матрикса.

В первой серии экспериментов по изучению зависимости роста планктонных культур и биопленок от температуры мы использовали штамм С. violaceum WT и его мутант CV026 с нарушенным функционированием регуляторной системы quorum-sensing. У этого мутанта в результате инсерции транспозона мини-Тп5 инактивирован ген evil, кодирующий синтетазу N-гексаноил-гомосеринлактона (С6-АГЛ) [McClean et al„ 1997].

В серии экспериментов, описанных в предыдущей главе, с помощью разных методов микроскопии мы показали, что у мутанта CV026 нарушено формирование внеклеточного полимерного матрикса. Поэтому большой интерес представляет изучение зависимости роста планктонных культур и биопленок дикого штамма и мутанта С. violaceum от температуры (результаты представлены на рис. 10). В этих экспериментах биопленки окрашивали DMMB для выявления различий в формировании матрикса.

% от оптимальной

Рис. 10. Зависимость роста планктонных культур и биопленок С. У1о1асеит \УТ и его мутанта СУ026 от температуры:

100 г 3

80 1 4

1, 2- планктонные культуры штамма WT и мутанта CV026

соответственно;

3, 4 - биопленки штамма WT и мутанта CV026 соответственно (по окрашиванию

DMMB).

Пунктиром показана величина контроля, принятого за 100%.

30 35

Температура, °С

Эти результаты показывают, что зависимость роста планктонных культур обоих штаммов от температуры существенно не различается (рис. 10, кривые 1 и 2). Тогда как формирование биопленки, образуемой мутантом (рис. 10, кривая 4), заметно чувствительнее к воздействию супраоптимльных температур, чем биопленка дикого штамма С. Violaceum (рис. 10, кривая 3).

Как продемонстрировано в предыдущем разделе 2.4, комплекс микроскопических методов позволил установить, что у мутанта CV026 существует дефект структуры внеклеточного полимерного матрикса.

Мы видим, что этот мутант оказался весьма чувствительным к тепловому (а также, как это показано в разделе 2.5.2, и к кислотному шоку). Причиной такой чувствительности, по нашему мнению, является именно дефект матрикса, играющего барьерную роль и препятствующего утечке необходимых метаболитов в окружающую среду. Хотя нельзя полностью исключить непосредственного воздействия дефекта системы QS у мутанта CV026 на чувствительность к тепловому шоку (минуя участие матрикса), анализ литературы не позволил обнаружить экспериментальные данные, которые подтверждали бы возможность такого воздействия.

Во второй серии экспериментов мы использовали макролидный антибиотик азитромицин (сумамед), который, по данным ряда авторов, в низких, суббактериостатических концентрациях подавляет формирование биопленок и биосинтез биопленочного матрикса у некоторых штаммов Haemophilus influenzae [Starner et al., 2008] и P. aeruginosa [Hoffmann et al., 2007].

Скрининг, проведенный нами среди коллекционных и изолированных из пластовых вод нефтяных месторождений бактерий рода Pseudomonas, позволил обнаружить штамм P. acephalitica, у которого формирование биопленок оказалось более чувствительным к действию азитромицина, чем рост планктонной культуры (рис. 11).

% от контроля без антибиотика

Рис. 11. Влияние азитромицина на рост

Р. асерИа/Шса:

1 - планктонная культура;

2 — биопленка(по окрашиванию КФ): 3 - биопленка(по окрашиванию ОММВ). Пунктиром показана величина контроля, принятого за 100%.

I 1 г 1 | ■ | 1 ........—I ' I ' I |* I—'■) 3

0,0 0,1 0.2 0,3 0,4 0.5 0,6 2 4 6 8 10

Концентрация азитромицина, мкг/мл

Как следует из данных, приведенных на рис. 11, при концентрации азитромицина 0.5 мкг/мл рост планктонной культуры практически не подавляется, тогда как формирование матрикса биопленки (измеряемое по окрашиванию ОММВ) составляет не более 30% от контроля без антибиотика. Поэтому мы провели сравнительное изучение роста планктонных культур и биопленок Р. асерИаНИса при разных температурах как в присутствии 0.5 мкг/мл азитромицина, так и без добавления этого

Рис. 12. Зависимость роста планктонных культур и биопленок Р. асерЪа!Шса от

температуры: I планктонная культура; 2 — планктонная культура + 0.5 мкг/мл азитромицина; 3 -биопленка (по

окрашиванию ОММВ); 4 - биопленка + 0.5 мкг/мл азитромицина (по окрашиванию ОММВ). Пунктиром показана величина роста при оптимальной температуре 29°С.

Можно видеть, что при температурах выше 30°С добавление азитромицина резко (в 1.3-2.0 раза) снижает устойчивость биопленки к тепловому воздействию, в результате чего она становится практически такой же чувствительной, как и планктонная культура. Снижение окрашивания ОММВ подтверждает тот факт, что в присутствии антибиотика подавляется формирование матрикса.

Как и в предыдущем варианте (с системой С>8) может возникнуть предположение, что действие антибиотика на термоустойчивость бактерии осуществляется не через посредство нарушения структуры матрикса, а является следствием ингибирования синтеза белка. Однако в данном случае существуют убедительные свидетельства против подобной возможности.

Во-первых, как можно видеть на рис. И, при концентрации азитромицина 0.5 мкг/мл сколько-нибудь заметного подавления роста планктонной культуры не происходит, следовательно ингибирующее действие азитромицина на синтез белка у данного микроорганизма не проявляется (кривая 1).

Во-вторых, что не менее важно, существуют многочисленные данных о прямом подавлении суббактериостатическими концентрациями азитромицина синтеза полисахаридных компонентов матрикса [Науге-Вогиё й. а1., 2003].

антибиотика. Результаты представлены на рис. 12. % от оптимальной

Температура, "С

Таким образом, наше предположение о том, что барьерные функции матрикса способствуют повышению устойчивости биопленок к тепловому (и холодовому) шоку, получило экспериментальные подтверждения.

2.5.2. Зависимость от рН

Результаты, отражающие влияние рН на рост планктонных культур и биопленок изучаемых бактерий, представлены на рис. 13.

% от оптимального

5.0 6.0 7.0 8.0 9.0

рН

Рис. 13. Зависимость роста планктонных культур и биопленок изучаемых бактерий от рН: 1 - планктонная культура О/'егг¡а эр.; 2 - биопленка ер. (по окрашиванию КФ); 3 -

планктонная культура С. V¡о/асеит \\Т; 4 - биопленка С. ую!асеит \\Т (по окрашиванию ЭММВ); 5 - планктонная культура мутанта С. \iolaceum СУ026; 6 - биопленка мутанта С. ую1асеит СУ026 (по окрашиванию ОММВ).

Оптимум рН существенно не различается у планктонных культур и биопленок, однако при неблагоприятных значениях рН (особенно ниже оптимального) в биопленках Л'еггг'о ер. и дикого штамма С. \iolaceum \¥Т (но не мутанта СУ026) накапливается больше биомассы, чем в планктонных культурах.

Данный факт можно объяснить тем, что кислые компоненты экзополимерного матрикса биопленки служат барьером, ограничивающим протонную проницаемость и

защищающим биопленку от воздействия неблагоприятных рН. В пользу этого предположения говорит сниженная устойчивость к кислотному шоку биопленок мутанта С. \ю1асеит СУ026, у которого, как мы показали в предыдущем разделе, нарушен процесс формирования матрикса.

2.5.3. Влияние концентрации N80

Ранее мы показали, что в реконструированных бинарных биопленках галофильный спутник СИготока1оЬас1ег зр. защищает нефтеокисляющую бактерию О/'ейга ер. от гиперосмотического шока. Высказано предположение, что обнаруженная повышенная устойчивость негалофильного микроорганизма в бинарной биопленке к гиперосмотическому воздействию может быть связана с образованием галофилом осмопротектора (эктоина), утечка которого в окружающую среду затруднена благодаря барьерной функции матрикса [Плакунов с соавт., 2008].

Для проверки этого предположения мы использовали бинарные биопленки, реконструированные из чистых культур .Оге/гг'а ер. и ее спутника ОгготокЫоЬаМег зр., для которых были продемонстрированы вышеописанные протокооперативные взаимоотношения.

Сравнительный хроматографический анализ экстрактов биопленок, сформированных из одного спутника-галофила (Скгото1ш1оЬас1ег ер.) и из смеси спутника с галотолерантом (Д/е^/а хр.) на среде ЬВ содержащей 10% ЫаС1, показал, что в бинарной биопленке содержание эктоина увеличивается в 1.3-1.6 раза (рис. 14).

Рис. 14. Накопление эктоина (денситометрические кривые) в биопленке, сформированной одним галофилом

СИготоИа/оЬаМег эр (1), и в бинарной биопленке, реконструированной из галотолеранта (£)/е/гга эр.) и его спутника-галофила (СИготоИа1оЬас1ег эр.) (2).

Яркость

3000 т

Механизм этого эффекта, как мы полагаем, связан с тем, что часть эктоина, образуемого галофилом СИготокаЬЬаМег ер., поглощается гапотолерантным нефтеокислителем Ше121а зр., что приводит к снижению внеклеточного уровня эктоина в биопленке и дерепрессирует систему его биосинтеза.

Повышение уровня эктоина в биопленке происходит до тех пор, пока в клетках галотолеранта не накопится такое его количество, которого достаточно для осуществления осмопротекции. После «насыщения» клеток нефтеокислителя эктоином, внеклеточный уровень последнего достигает порога, при котором избыточный биосинтез эктоина вновь блокируется включением регуляторного механизма. Ранее нами было показано, что экзогенный эктоин, действительно, защищает галотолеранта Dietzia sp. от гиперосмотического шока [Плакунов с соавт., 2008].

3. Обсуждение результатов

Впервые для сапротрофных микроорганизмов, изолированных из пластовых вод нефтяных месторождений и их модельных аналогов, показана повышенная (по сравнению с планктонными культурами) устойчивость к тепловому и кислотному шоку.

Установлено, что биопленки изученных микроорганизмов по сравнению с планктонными культурами значительно более устойчивы к действию антибиотиков. Оказалось даже, что антибиотики в низких (суббактериостатических) концентрациях могут вызывать стимуляцию формирования биопленок.

Механизм стимулирующего действия антибиотиков на формирование биопленок остается неизвестным. Высказано предположение, что антибиотики-аминогликозиды могут действовать на уровень циклодигуанозинмонофосфата (c-di-GMP), который является фактором, влияющим на биопленкообразование [Lopez et al., 2010]. Другая возможность - стимуляция синтеза адгезинов в связи с «рибосомным стрессом» [Peeters et al., 2008]. Сходное объяснение предложено и другими авторами [Boehm et al., 2009].

Антибиотики в данном случае выступают как имитаторы стрессового воздействия. Несомненный интерес представляет установленный нами факт, что биопленки сапротрофных бактерий, изолированных из нефтяных месторождений, подобно биопленкам патогенных бактерий, обладают повышенной устойчивостью к действию антибиотиков.

Существенную роль в устойчивости биопленок играют внеклеточные полимерные вещества, составляющие структуру матрикса, поскольку при подавлении образования матрикса под воздействием суббактериостатических концентраций антибиотика азитромицина (в случае P. acephalitica), а также в результате мутации гена evil, кодирующего синтетазу N-гексаноилгомосеринлактона (в случае С. violaceum CV026) чувствительность биопленок к экстремальным факторам среды снижается практически до уровня планктонных культур.

Вклад матрикса в устойчивости биопленок был подтвержден нами и с применением комплекса микроскопических исследований. Биопленка мутанта С. violaceum CV026, не способного к синтезу компонентов системы quorum sensing, обладает менее развитым матриксом по сравнению со штаммом дикого типа, и при этом повышенной чувствительностью к физико-химическим факторам среды и к антибактериальному антибиотику азитромицину, что соответствует представлениям о барьерной роли полностью сформированного («зрелого») матрикса биопленок в отношении таких биоцидов. Результаты микроскопических исследований полностью подтверждают сделанный нами предварительный вывод о том, что дефект регуляторной системы

quorum sensing у мутанта С. violaceum CV026 проявляется, в частности, в особенностях формирования матрикса биопленки.

Полученные нами результаты, с одной стороны, свидетельствуют о существенном вкладе внеклеточных полимерных веществ, формирующих матрикс биопленок, в обеспечение устойчивости этих структурированных сообществ к экстремальным факторам среды, которые периодически возникают или постоянно присутствуют в природных экотопах, в том числе в почве, водоемах и нефтяных месторождениях. С другой стороны, матрикс биопленок представляется перспективной мишенью при разработке методов борьбы с нежелательным образованием биопленок (в медицине и технологических процессах).

ВЫВОДЫ

1. Рост биопленок сапротрофных штаммов изученных микроорганизмов, относящихся к родам Dietzia, Kocuria, Pseudomonas, Chromobacterium, значительно (в десятки и сотни раз) более устойчив к антибиотикам (азитромицину, рифампицину и оксациллину), чем рост планктонных культур, особенно в случае предформированных биопленок.

2. Впервые предложен метод изучения динамики формирования биопленок т.е. времени, необходимого для перехода клеток от планктонного способа существования к биопленочному (при наличии поверхности раздела фаз), основанный на снижении чувствительности к антибиотикам при их добавлении через различные промежутки времени. Для изученных микроорганизмов это время составляет 2-6 ч.

3. Впервые обнаружено явление стимуляции процесса формирования биопленок у изученных сапротрофных микроорганизмов низкими концентрациями антибиотиков, влияющих на процессы транскрипции и трансляции (азитромицина и рифампицина). При этом скорость роста матрикса превышает скорость размножения микробных клеток, что подтверждает реализацию в этих условиях «биопленочного» фенотипа.

4. Впервые показано, что окрашивание матрикса биопленки С. violaceum специфическим красителем 1,9-диметилметиленовым синим (DMMB) позволяет выявить снижение содержания полисахаридных компонентов у мутанта с нарушением системы quorum sensing. Применение методов лазерной интерференционной и атомной силовой микроскопии, дает возможность не только визуализировать матрикс биопленки, но и количественно охарактеризовать некоторые особенности его структуры (толщину и шероховатость).

5. Показано, что биопленки ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий (изолированных из пластовых вод Ромашкинского нефтяного месторождения) обладают повышенной по сравнению с планктонными культурами устойчивостью к экстремальным физико-химическим условиям среды (неблагоприятной температуре, pH и концентрации соли). Биопленки по сравнению с планктонными культурами характеризуются лучшим ростом (в 1.5-2.0 раза) в области суб- и, особенно, супраоптимальных температур, а также при неблагоприятных значениях pH.

Список работ по теме диссертации

Экспериментальные статьи и обзоры

1. Журина М. В., Стрелкова Е. А., Плакунов В. К., Беляев С. С.. Влияние состава реконструированных биопленок на активность парафинокисляющих бактерий // Микробиология. 2008. Т. 77. № 5. С. 701-703.

2. Стрелкова Е. А., Журина М. В., Плакунов В. К. . Использование реконструированных биопленок для ускорения деградации углеводородов нефти // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2008. Т. 3. № 4. С. 28-30.

3. Стрелкова Е. А., Журина М. В., Плакунов В. К., Беляев С. С.. Стимуляция антибиотиками процесса формирования бактериальных биоплемок // Микробиология. 2012. Т. 81. №.2. С. 282285.

4. Стрелкова Е.А., Позднякова Н.В., Журина М.В., Плакунов В.К., Беляев С.С. Роль внеклеточного полимерного матрикса в устойчивости бактериальных биопленок к экстремальным факторам среды // Микробиология. 2013. Т. 82. №2. С. 131-138.

5. Журина М.В., Кострикина H.A., Паршина Е.Ю., Стрелкова Е.А., Юсипович А.И., Максимов Г.В., Плакунов В.К.. Визуализация внеклеточного полимерного матрикса биопленок Chromobacterium violaceum с помощью микроскопических методов // Микробиология. 2013. Т. 82. № 4. С. 502-509.

Обзор

Стрелкова Е.А., Журина М.В., Плакунов В.К. Персистенция и адаптивный мутагенез в биопленках// Микробиология. 2010. Т. 79. № 4. С. 447-458.

Тезисы конференций

1. Плакунов В.К., Журина М.В., Безрукова Е.А., Лебедева И.В. Взаимоотношения микроорганизмов нефтяных месторождений в реконструированных биопленках/ЛУ Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективыразвития». Россия. Москва. 2007. Тезисы докладов, секция 7. С. 343-344.

2. Журина М.В., Воронина H.A., Безрукова Е.А., Лебедева И.В., Плакунов В.К. Зависимость способности микроорганизмов к окислению парафинов от состава реконструированных биопленок. Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера». Россия. Москва. 2007. Тезисы докладов. С. 46.

3. Журина М.В., Стрелкова Е.А., Плакунов В.К.. Механизмы взаимодействия нефтеокисляющих микроорганизмов и их спутников в реконструированных биопленках//1У Молодежная школа-конференция с международным участием: Актуальные вопросы современной микробиологии. Россия. Москва. 2008. Тезисы докладов С. 87-88.

4. Стрелкова Е.А., Журина М.В., Плакунов В.К.. Взамодействие нефтеокислителя Dietzia sp.c галофильными спутниками в составе бинарных биопленок// V Молодежная школа-конференция с международным участием: «Актуальные вопросы современной микробиологии». Россия. Москва. 2009. Тезисы докладов. С. 135-137.

5. Стрелкова Е.А., Журина М.В., Плакунов В.К., Сидоров A.C. Микробные взаимодействия в составе бинарных биопленок // III Всероссийский конгресс с международным участием «Симбиоз-Россия 2010». Тезисы докладов. 2010. Нижний Новгород. С. 74-75.

6. Стрелкова Е.А., Кондакова Т.В., Суворова Е.В., Журина М.В.. Влияние стрессовых факторов и антибиотиков на формирующиеся и зрелые биопленки// VI Молодежнаяшкола- конференция с международным участием: «Актуальные вопросы современной микробиологии». Россия. Москва. 2010. Тезисы докладов. С. 75-76.

7. Стрелкова Е.А., Журина М.В., Кондакова Т.В., Суворова Е.В. Стимуляция биопленкообразования при воздействии стрессовых факторов и антибиотиков // Всероссийский симпозиум с международным участием «Автотрофные Микроорганизмы». Россия. Москва. 2010. Тезисы докладов. 99.

Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Россия. Москва. 2011. Тезисы докладов. 30.

9. Позднякова Н.В., Стрелкова Е.А., Журина М.В., Плакунов В.К. Закономерности формирования микробных биопленок и способы борьбы с ними // VIII Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Россия. Москва. 2012 г. Тезисы докладов. С. 147-149.

10. Журина М.В., Стрелкова Е.А., Ганнесен A.B., Мартьянов C.B., Плакунов В.К. Значение матрикса биопленок для их устойчивости к антибактериальным агентам и физико-химическим факторам среды. IX Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Россия. Москва. 2013. Тезисы докладов. С. 76-78.

Подписано в печать: 19.11.13 Тираж: 100 экз. Заказ № 1054 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Стрелкова, Екатерина Александровна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук

СТРЕЛКОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ДЕЙСТВИЕ СТРЕССОВЫХ ФАКТОРОВ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЕ БИОПЛЕНКИ С ДЕФЕКТОМ СТРУКТУРЫ ВНЕКЛЕТОЧНОГО

ПОЛИМЕРНОГО МАТРИКСА

Специальность 03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Плакунов В.К.

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................12

1 Особенности структуры и состава биопленок.........................................12

1.1 Вступление..............................................................................................12

1.2 Строение биопленок...............................................................................15

1.3 Основные этапы формирования биопленок..........................................18

1.4 Факторы, влияющие на процесс формирования биопленок.................21

1.5 Участие регуляторной системы quorum sensing в биопленко-образовании......................................................................................................24

2 Типы и механизмы взаимоотношений микроорганизмов, входящих в состав биопленок....................................................................................................26

3 Влияние условий внешней среды и биоцидов на функционирование биопленок...............................................................................................................31

3.1 Действие антибиотиков..........................................................................32

3.1.1 Ингибиторное действие.......................................................................32

3.1.2 Стимулирующее действие...................................................................34

3.1.3 Механизмы устойчивости к антибиотикам........................................36

3.1.4 Устойчивость к стрессовым факторам...............................................41

4 Персистентность и адаптивный мутагенез в биопленках........................42

4.1 Понятие о персистентности....................................................................42

4.2 Механизмы персистентности: системы токсин-антитоксин................43

4.3 Адаптивный мутагенез...........................................................................49

5 Использование биопленок в биотехнологии............................................52

6 Способы борьбы с формированием биопленок и клеток-персистеров... 54

7 Заключение.................................................................................................56

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..................................................................59

Глава 1 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................59

1.1 Объекты исследования..............................................................................59

1.2 Культивирование и хранение микроорганизмов......................................59

1.3 Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и физико-химическим факторам среды...................................................................59

1.4 Микроскопические методы.......................................................................61

Глава 2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.........................................................63

2.1 Чувствительность к антибиотикам...........................................................63

2.2 Динамика формирования биопленок........................................................65

2.3 Стимуляция антибиотиками формирования биопленок..........................70

2.4 Визуализация внеклеточного полимерного матрикса с помощью микроскопических методов...................................................................................74

2.4.1 Световая микроскопия............................................................................75

2.4.2 Электронная микроскопия......................................................................80

2.4.3 Атомно-силовая микроскопия................................................................82

2.5 Вклад внеклеточного полимерного матрикса в устойчивость биопленок к экстремальным факторам среды.........................................................................85

2.5.1 Зависимость от температуры..................................................................85

2.5.2 Зависимость от рН...................................................................................93

2.5.3 Влияние концентрации №С1..................................................................95

Обсуждение результатов.......................................................................................97

ВЫВОДЫ................................................................................................................99

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...............................................................................101

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................102

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность

Известно, что микробные популяции в биопленках существенно отличаются по физиолого-биохимическим свойствам от суспензионных культур [James et al., 1995]. Реализация специфического биопленочного фенотипа определяет повышенную устойчивость биопленок к стрессовым факторам, антибиотикам и другим биоцидам. Изучению механизмов устойчивости биопленок посвящено большое количество работ. Среди возможных причин повышенной устойчивости к антимикробным препаратам исследователи называют индукцию систем, обуславливающих экскрецию антибиотиков из клеток [Nikaido, 2009], низкую скорость диффузии антибиотиков через внеклеточный полимерный матрикс [Lewis, 2001], возникновение клеток-персистеров [Levin and Rozen 2006], сниженную скорость метаболизма бактерий в биопленках [Costerton et al., 1999]. Описан интересный механизм протокооперативных взаимоотношений в условиях бинарной биопленки: галотолерантный нефтеокислитель не только выживает, но и размножается при концентрации NaCl, которая является летальной для чистой планктонной культуры этого галотолеранта, за счет накопления в биопленке галофильным спутником осмопротекторного вещества (эктоина) [Плакунов с соавт., 2008]. В случае устойчивости биопленок к неблагоприятным физико-химическим факторам среды (таким, как pH и температура) некоторые авторы предполагают важную роль матрикса биопленок [Scher et al., 2005]. Однако экспериментальные доказательства механизма этого явления отсутствуют.

Поэтому механизмы устойчивости биопленок к антимикробным веществам

и стрессовым факторам среды, а также роль в этих процессах внеклеточного

полимерного матрикса заслуживают более детального изучения. Следует

отметить, что из-за различий в применяемых методиках и в экспериментальных

подходах в процессе получения биопленок, появилось множество

разнообразных и, иногда, альтернативных взглядов на механизмы этой

устойчивости. Кроме того, большинство подобных исследований ограничено клиническими штаммами микроорганизмов. Связано это с тем, что многие патогенные микроорганизмы образуют биопленки в инфицированном ими макроорганизме или на поверхности медицинского оборудования (катетеры, глазные линзы и др.), что приводит к возникновению трудно излечиваемых рецидивов заболеваний. Между тем, изучение механизмов устойчивости биопленок сапротрофных микроорганизмов - не менее важная задача. В частности, необходимо знать, есть ли прямая связь повышенной устойчивости биопленок с патогенностью входящих в них микроорганизмов (например, с образованием факторов патогенности). Понимание механизмов устойчивости сапротрофных микроорганизмов — это важный шаг на пути разработки методов борьбы с нежелательным биопленкообразованием (в процессах биокоррозии и биообрастания технологического оборудования). С другой стороны, знания механизмов устойчивости могут быть ценным инструментом для стимуляции биопленкообразования в случае использования активности биопленок в процессах очистки природных сред от загрязнений (например, в системах водоподготовки). Эти знания также могут быть полезны для понимания процессов формирования и функционирования микробных сообществ в природных экотопах.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение динамики формирования биопленок сапротрофными микроорганизмами, изолированными из пластовых вод нефтяных месторождений, а также их модельными аналогами и выявление вклада внеклеточного полимерного матрикса в устойчивости этих биопленок к антимикробным веществам и экстремальным условиям среды.

Для достижения данной цели были поставлены задачи:

антибиотикам с различным механизмом действия (в качестве биохимических инструментов).

3. Разработать способы визуализации матрикса биопленок различными микроскопическими методами.

Научная новизна работы

Установлено, что биопленки сапротрофных штаммов {Dietzia sp., Kocuria sp., Pseudomonas sp., Chromobacterium sp.) значительно более устойчивы к действию антимикробных препаратов, чем их планктонные культуры. Показано, что биопленки сапротрофных бактерий по этому свойству не отличаются от изученных другими исследователями биопленок патогенных штаммов бактерий.

Практическая значимость работы

Апробация работы

Публикации

Место проведения работы и благодарности

Объём и структура диссертации

Список работ, опубликованных по теме диссертации Экспериментальные статьи и обзоры

3. Стрелкова Е. А., Журина М. В., Плакунов В. К., Беляев С. С.. Стимуляция антибиотиками процесса формирования бактериальных биопленок // Микробиология. 2012. Т. 81. №.2. С. 282-285.

Обзор

Тезисы конференций

3. Журина М.В., Стрелкова Е.А., Плакунов В.К.. Механизмы взаимодействия нефтеокисляющих микроорганизмов и их спутников в реконструированных биопленках/ЛУ Молодежная школа-конференция с международным участием: Актуальные вопросы современной микробиологии. Россия. Москва. 2008. Тезисы докладов С. 87-88.

4. Стрелкова Е.А., Журина М.В., Плакунов В.К.. Взамодействие нефтеокислителя Dietzia sp.c галофильнымн спутниками в составе бинарных биопленок// V Молодежная школа- конференция с международным участием: «Актуальные вопросы современной микробиологии». Россия. Москва. 2009. Тезисы докладов. С. 135-137.

8. Стрелкова Е.А., Журина М.., Кондакова Т.В., Суворова Е.В. Стрессовые факторы и антибиотики как инструменты изучения молекулярных механизмов формирования биопленок. XXIII Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Россия. Москва. 2011. Тезисы докладов. 30.

10. Журина М.В., Стрелкова Е.А. , Ганнесен А.В., Мартьянов C.B., Плакунов В.К. Значение матрикса биопленок для их устойчивости к антибактериальным агентам и физико-химическим факторам среды. IX Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Россия. Москва. 2013. Тезисы докладов. С. 76-78.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Особенности структуры и состава биопленок 1.1 Вступление

Биопленки (ЬюШгш) представляют собой наиболее распространенную в природе форму существования микроорганизмов. В научной литературе можно найти большое количество определений этого понятия, отражающих ту или иную особенность данных сообществ. Мы воспользуемся определением, приведенным в недавнем обзоре, в котором подчеркиваются самые характерные свойства подобных ассоциаций: «биопленки - это пространственно и метаболически структурированные сообщества микроорганизмов, заключенные во внеклеточный полимерный матрикс и расположенны

Информация о работе

Стрелкова, Екатерина Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Действие стрессовых факторов на бактериальные биопленки с дефектом структуры внеклеточного полимерного матрикса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы