Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микроэкологические особенности компонентов биопленки репродуктивного тракта женщин

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Микроэкологические особенности компонентов биопленки репродуктивного тракта женщин"

На правах рукописи

ДАНЫИИНА АНАСТАСИЯ ВЛАДИМИРОВНА

МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КОМПОНЕНТОВ БИОПЛЕНКИ РЕПРОДУКТИВНОГО ТРАКТА ЖЕНЩИН

03.02.08 — экология (биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005016075

3 МАЙ 2012

Ульяновск-2012

005016075

Работа выполнена на кафедре общей и клинической фармакологии с курсом микробиологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна

доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой биологии, ветеринарной генетики, паразитологии и экологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Романова Елена Михайловна

доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой экологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего

профессионального образования «Саратовский государственный технический университет» Тихомирова Елена Ивановна

Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»)

Защита диссертации состоится «18» мая 2012 года в /О часов на заседании диссертационного совета Д 212.278.07 при Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет» по адресу: г. Ульяновск, Набережная реки Свияги, 106, корп. 1, ауд. 703.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, с авторефератом — на сайте ВУЗа - www.uni.ulsu.ru и на сайте Высшей аттестационной комиссии Министерства образования и науки Российской Федерации -http://vak.ed.gov.ru.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432000, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42, Ульяновский государственный университет, управление научных исследований.

Автореферат разослан « /б » ОМ^МЛ- 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

С.В. Пантелеев

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема взаимоотношений микробной популяции и человека продолжает оставаться одной из важнейших на современном этапе существования человеческого общества. Особую значимость приобретает вопрос о влиянии микроорганизмов на макроорганизм в условиях экологической системы (Акопова, 2010).

Представление о способах взаимодействия паразита и хозяина в последние годы претерпело значительные изменения. Показано, что бактерии для своего выживания широко используют преимущества, которые дает коллективное поведение (Lewis К., 2005). Одним из основных открытий в этой области следует считать установление факта существования бактерий в составе сообществ, получивших название «биопленка» (Тец, 2007). Биопленки образуются в естественных условиях существования бактерий, в том числе, в организме человека на поверхности кожи и слизистых (Белова и соавт., 2004).

Образование биопленок является одной из основных стратегий, повышающих выживание бактерий в организме хозяина благодаря благоприятной среде в пределах покрывающей их пленки. Способность бактерий существовать в составе биопленок значительно повышает устойчивость бактерий к воздействию неблагоприятных факторов по сравнению с планктонными формами микроорганизмов (Ильина, 2004).

Известно, что биопленки - это полимикробные фиксированные сообщества, окруженные защитным полимерным матриксом, где формируется своеобразная экологическая система, способствующая сохранению жизнеспособности микробных популяций (Семенов, 2009). В настоящее время природа и свойства матрикса установлены, в то время как микробный компонент биопленки репродуктивного тракта женщин остается мало изучен.

Целью исследования явилась экологическая оценка структуры биопленки репродуктивного тракта женщин и выявление изменений биоэкологических характеристик ее компонентов в условиях дисбактериоза данного биотопа.

Для достижения цели были сформулированы следующие задачи:

1. Определить видовую структуру биопленки вагинального и цервикального биотопов здоровых женщин, а также при дисбактериозе репродуктивного тракта.

2. Дать экологическую характеристику компонентов микробоценоза изученных биотопов.

3. Выявить изменения биоэкологических свойств патогенных и условно патогенных бактерий-ассоциантов на примере представителей рода Staphylococcus.

Научная новизна работы. Впервые дана экологическая характеристика структуры биопленки вагинального и цервикального биотопов здоровых женщин, а также при дисбактериозе репродуктивной системы. Показаны глубокие изменения микробоценоза репродуктого тракта на уровне экосистемы, сопровождающиеся сменой ценотипа и иерархии микробных таксонов биопленки при нарушении микроэкологии репродуктивного тракта.

Анализ видового состава микробных ассоциаций изученных биотопов при дисбактериозе, по сравнению со здоровыми женщинами, выявил значительные нарушения биоценотических связей в биопленке, проявлявшиеся снижением доминирования основных симбионтов на фоне роста представителей добавочной и транзиторной микробиоты.

На примере представителей рода Staphylococcus показано, что выявленные нарушения структуры биопленки сопровождаются изменением биоэкологических свойств микробов-ассоциантов, проявлявшихся в повышении их патогенного потенциала. Показана значительная активизация продуцирования ферментов агрессии этими микроорганизмами и усиление летального эффекта в опытах in vivo.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе данные дают представление о различиях структуры биопленки репродуктивного тракта здоровых женщин и при дисбактериозе данного биотопа. Анализ экологических показателей видового состава биопленки расширяют представление о характере межмикробных взаимодействий, определяющих формирование ■ и поддержание микробоценоза репродуктивной системы женщин.

Выявленные изменения экологических характеристик биопленки способствуют реализации вирулентного потенциала ее компонентов, в результате чего усиливается их способность оказывать патологическое действие на макроорганизм. Учитывая широкую распространенность дисбактериоза органов репродуктивного тракта женщин, необходимо учитывать изменения патогенных свойств компонентов биопленки данного биотопа и возможность возникновения эндогенной инфекции в результате трансформации нормоценоза. В связи с этим для оптимизации диагностики предлагается внедрение в работу бактериологических лабораторий определение биоэкологических свойств компонентов биопленки репродуктивных органов.

По материалам диссертационной работы опубликованы практические рекомендации «Экологическая характеристика микробоценоза вагинального и цервикального биотопов репродуктивной системы женщин» (2012).

Метод определения экологических параметров микробоценоза при дисбактериозе репродуктивного тракта внедрен в работу лаборатории ГУЗ ОКБ г. Ульяновска.

Полученные данные используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» по курсу микробиологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Структурная перестройка биопленки при дисбактериозе репродуктивного тракта женщин проявляется глубокими изменениями пространственной организации и сменой иерархии экологических групп микроорганизмов.

2. Дисбактериоз сопровождается сменой абсолютных доминант, увеличением показателей частоты встречаемости и видового разнообразия добавочной и транзиторной микробиоты биотопа репродуктивного тракта.

3. Изменение структуры биопленки вагинального и цервикального биотопов репродуктивной систем женщин сопровождается изменением биоэкологических свойств патогенных и условно патогенных эндосимбионтов на примере представителей рода Staphylococcus.

Личный вклад автора. В основу данной работы положены материалы собранные автором за период 2009-2011 гг. Автор принимал непосредственное участие в разработке темы, составление плана исследования, сборе материала, обобщения и интерпретации полученных данных.

Апробация работы.

Результаты исследований доложены на научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Санкт-Петербург, 2009); «Всероссийской научно-методической конференции: инновации и традиции науки образования» (Сыктывкар, 2010); III Всероссийской научно-практической (заочной) конференции «Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований» (Москва, 2010); III Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ, 5 из которых в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,

5

описания материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Список литературы содержит 219 наименований, в том числе 59 зарубежных. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 31 рисунком.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 содержит обзор отечественной и зарубежной литературы по данной проблеме.

Раздел 1.1. посвящен рассмотрению биопленки как формы существования микроорганизмов. Изучены основные работы, посвященные способности бактерий образовывать биопленки и изменять свои свойства при образовании последних.

Раздел 1.2. посвящен проблеме экологического преимущества биопленок. Рассматриваются вопросы о более выгодном росте бактерий в сообществе, чем в виде планктонных форм.

В разделе 1.3. рассматривается структура биопленки репродуктивного тракта женщин. В данном разделе указана морфология микробоценоза здоровых женщин и при состояниях, связанных с дисбактериозом данного биотопа. Показаны также основные причины, приводящие к развитию нарушений состава микробиоты репродуктивного тракта.

Раздел 1.4. Рассматриваются теоретические аспекты исследований стафилококков. В данном разделе дан анализ многогранного проявления патогенного потенциала данных бактерий и их влияние на изменение состава микробоценозов организма.

Глава 2. посвящена материалам и методам исследований. Изучены культуры микроорганизмов, выделенных из репродуктивного тракта 256 женщин (1 группа) в возрасте от 18 до 45 лет с дисбактериозом влагалища. Группу сравнения (2 группа) составили 53 здоровых женщины, репрезентативных по возрасту.

Исследование морфологии биопленки репродуктивного тракта женщин проводили согласно приказа МЗ СССР № 535 от 22.04.85. («Об унификации микробиологических методов исследования, применяющихся в клинико-диагностических лабораториях на базе лечебно-профилактических учреждениях»). Исследование позволило определить как качественный, так и количественный состав бактериальной микрофлоры.

Работа выполнена на базах:

1. Бактериологической лаборатории городской больницы № 1

г. Ульяновска (зав. лабораторией — Т.И. Волгина).

2. Клинической лаборатории Областной клинической больницы

г. Ульяновска (зав. лабораторией - Р.Ф. Бурганова).

3. Кафедры общей и клинической фармакологии с курсом

микробиологии ИМЭиФК УлГУ.

4. Центра коллективного пользования УлГУ.

Посевы осуществляли на дифференциально-диагностические и элективные среды, такие как ЖСА, МПА, МПБ, Staphylococcus agar (Becton Diskinson), 5% -кровяной агар, Сабуро, Блаурокка, МРС-4, Эндо и др.

Культуры, выросшие на питательных средах, подвергали групповой (анаэробные, неспорообразующие бактерии), родовой (бифидобактерии) и видовой идентификации (лактобакгерии, стафилококки, эшерихии, стрептококки, энтерококки, дрожжеподобные грибы рода Candida). Видовую иентификацию микроорганизмов проводили с использованием определителя Берджи (1997). Морфологические и тинкториальные свойства выделенных культур изучали в мазках, окрашенных по Граму.

Атомно-силовой микроскопии подвергали биопленки, полученные в пластиковых 96-ти луночных планшетах (Sarstedt, Германия). В лунки вносили бульонные культуры бактерий, выращивали в течении 24-48 часов при t=37° С в соответствии с условиями культивирования. Затем готовили препараты для сканирующей микроскопии по методике, предложенной Мальником В.В. (2010).

Экологическую оценку микробоценоза репродуктивного тракта проводили путем определения индекса контагиозности (Уиттекер, 1980), индекса флористической значимости видов (Наткевичайте-Иванускене, 1985), видового разнообразия сообщества микроорганизмов (1980) и показателя постоянства (Домбровский, 1986).

С целью повышения эффективности выявления компонентов биопленки наряду со стандартным методами клинико-лабораторного обследования использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием тест-системы «Фемофлор» (ООО «НПО ДНК-Технология»).

Адгезивную, гемолитическую активность стафилококков определяли in vitro, вирулентность in vivo (Лабинская А.С., 2010).

Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием t критерия по Стьюденту. Результаты считались достоверными при р<0,05. Для обработки данных использовали пакет прикладных программ Microsoft Office 2003.

Глава 3 состоит из 4 разделов и включает в себя изложение собственных результатов, полученных в ходе исследования.

В разделе 3.1. представлена общая характеристика компонентов биопленки репродуктивной системы здоровых женщин и пациенток с дисбактериозом.

Проведенные исследования выявили существенные отличия интенсивности роста микробиоты репродуктивного тракта пациенток первой и второй групп. У 80,6% женщин 2 группы выявлен скудный рост микробиоты, обильного роста ни в одном случае обнаружено не было. Напротив, 64,3% обследованных 1 группы имело обильную микробиоту.

В разделе 3.2. описан морфологический состав биопленки репродуктивного тракта.

Результаты исследования показали, что в микробоценозе влагалища практически всех здоровых обследуемых (98,6%) превалировали Lactobacillus spp. в относительно высокой концентрации (6,9±0,2 lg КОЕ/мл), их встречаемость в цервикальном канале составила 50,6%. Bifidobacterium spp. во влагалищном биотопе были выявлены у 46% и в цервикальном канале у 16,7% здоровых женщин. Плотность колонизации данных бактерий составила 4,3±0,1 lg КОЕ/мл. Частота высеваемости остальных представителей микробоценоза в цервикальном и вагинальном биотопах варьировала, однако патогенных видов ни в одном случае выявлено не было .

Представленные данные свидетельствуют о доминировании в биотопе влагалища и цервикального канала здоровых женщин нормальной микробиоты, представленной, в основном, лактобациллами. Они, проявляя высокую степень колонизационной резистентности, являются одним из основных факторов поддержания межвидового баланса микроорганизмов данного биотопа. Обсемененность микросимбионтами влагалища, превышала уровень ПМО в цервикальном биотопе. Показатели частоты встречаемости и плотности колонизации в обоих биотопах условно патогенных микроорганизмов не превышало уровня нормоценоза.

В разделе 3.3. изложены данные о микробоценозе влагалища и цервикального канала при дисбактериозе.

Проведенные исследования микробиоты влагалища женщин 1 группы, выявили значительные изменения соотношения видов, составляющих микробоценоз данного биотопа. Так, при дисбактериозе репродуктивного тракта обследованных женщин выявлены изменения видового состава биопленки по сравнению со здоровыми. Это проявлялось снижением частоты встречаемости представителей рода Lactobacillus и Bifidobacterium в вагинальном биотопе в 2 раза (рис. 1).

Lactobacillus spp. Bifidobacterium spp.

И 1 группа ЕЭ 2 группа

Рис. 1. Частота встречаемости Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. во влагалищном биотопе (%)

В цервикальном биотопе у обследованных 1 группы представители нормальной микробиоты не высевались, тогда как у женщин 2 группы частота встречаемости бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium составляла 51,9% и 16,7% соответственно. На фоне дефицита, а в ряде случаев, отсутствия микробов-эубионтов, отмечалось увеличение численности, частоты встречаемости и видового разнообразия условно патогенных микроорганизмов (рис. 2).

При дисбактериозе органов репродуктивного тракта отмечалось увеличение частоты встречаемости представителей добавочной микрофлоры, таких как стафилококки - более чем в 2 раза, грибы рода кандида - в 1,7, энтерококки и коринебактерии - в 1,4 раза, а также появление клостридий, бактероидов и гарднерелл.

% 60

1 группа

□ Staphylococcus spp. H Candida spp.

® Enterococcus spp. 33 Escherichia coli

El Clostridium spp. £2 Bacteroides spp.

Рис.2. Частота встречаемости репродуктивного тракта женщин (%)

2 группа

И Streptococcus spp. @ Corynebacterium spp. И Gardnerella spp.

добавочной микробиоты

встречаемости (58,6%) и

Наибольшие показатели частоты интенсивности колонизации (9,6±1,2 lg КОЕ/мл (р<0,05) были отмечены у представителей рода Staphylococcus. Наряду с коагулазоотрицательными, и из влагалища, и цервикального канала были изолированы коагулазоположительные стафилококки.

Из коагулазоотрицательных чаще выделяли S. epidermidis (55,8% всего общего количества выделенных штаммов) в концентрации 10-10 КОЕ/мл. У 12,1% обследованных 2 группы, в отличие от здоровых женщин, был обнаружен абсолютный патоген S. aureus, показатель микробной обсемененности которого составил 7,5±1,49 lg КОЕ/мл (рис. 3). Все исследуемые штаммы данного вида отличались выраженными признаками патогенности — гемолитической активностью, наличием лецитиназы, плазмокоагулазы, ферментацией маннита.

50

40

30

20

10

0

S. epidermidis S. haemolyticus S. aureus S. capitis S. wameri

fS 1 группа 2 группа

Рис. 3. Видовой состав стафилококков биотопов репродуктивного тракта

Таким образом, при дисбактериозе репродуктивной системы происходило снижение частоты встречаемости нормальной микробиоты на фоне увеличения количественных показателей и расширения видового спектра условно-патогенных и появления патогенных микроорганизмов (S. aureus, Sir. pyogenes). Доминирующим таксоном при дисбиотических нарушениях микробоценоза являлись Staphylococcus spp.

В разделе 3.4. описаны особенности микробных компонентов биопленки при дисбактериозе, связанном с воспалительными процессами в отдельных органах репродуктивного тракта женщин.

При воспалительном процессе в шейке матки, придатках матки и влагалище выявлено снижение частоты встречаемости представителей облигатной микробиоты (Lactobacillus spp.) и отсутствие бактерий рода Bifidobacterium на фоне повышения частоты выделения условно патогенной биоты во влагалищном и цервикальном биотопах. Наиболее значительное повышение было выявлено у S epidermidis (35,3%) и Candida spp. (36,9%). Показатели плотности колонизации были также увеличены по сравнению со здоровыми женщинами -у S. epidermidis до 8,5±0,7 lg КОЕ/мл, у грибов рода Candida до 8±1,3 lg КОЕ/мл.

Таким образом, изучение микробных компонентов биопленки при воспалительном процессе в органах репродуктивной системы - шейке матки, придатках матки и влагалище, выявило снижение показателей частоты встречаемости и плотности колонизации индигенных симбионтов -Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp. во влагалищном и цервикальном биотопах, по сравнению со здоровыми, на фоне повышения уровня выделения условно патогенной биоты.

Наиболее значительное повышение показателей частоты встречаемости и плотности колонизации было выявлено у Staphylococcus epidermidis (35,3% и 8,5±0,7 lg КОЕ/мл соответственно). В составе биопленки был также выявлен абсолютный патоген - S. aureus, который характеризовался высоким титром колонизации влагалищного биотопа.

Глава 4. При изучении ассоциативных взаимоотношений компонентов биопленки производили определение показателей, характеризующих ее экологическую стабильность.

Определение индекса контагиозности, демонстрирующего равномерность распределения видов в пространстве, показало, что у женщин при дисбактериозе наблюдается достоверное уменьшение данного показателя у представителей облигатной микробиоты. Это приводит к освобождению экологических ниш и замещение их факультативной флорой, что свидетельствует о неравномерности участия в горизонтальной структуре микропейзажа репродуктивного тракта основных участников биоценоза и представителей транзиторной биоты.

Максимальное снижение данного показателя отмечалось у представителей облигатной биоты - лактобактерий и бифидобактерий, выделенных у женщин 1 группы. У видов, входящих в группу транзиторной микробиоты, было отмечено увеличение показателя индекса контагиозности — у стафилококков почти в 4 раза, грибов рода кандида - в 2,6, кишечных палочек в 2,3 раза (табл. 1).

В цервикальном канале также отмечали повышение показателя кантогиозности по сравнению с контролем: у стафилококков в 4 раза, дрожжеподобных грибов рода Candida в 2,7, энтерококков в 2 раза. Появились представители родов, не выявленные во 2 группе, такие как коринебактерии и клостридии.

Полученные данные свидетельствовали о диспропорции участия в горизонтальной структуре микропейзажа основных симбионтов и представителей условно-патогенной биоты биопленки.

Таблица 1

Показатели индекса контагиозности микробных компонентов биопленки

Микроорганизмы Обследованные

1 группа (биотопы) 2 группа(биотопы)

влагалища цервикаль-ного канала влагалища цервикаль-ного канала

Lactobacillus spp. 0,41 ±0,1* 0,34±0,02 0,9±0,3 0,82±0,1

Bifidobacterium spp. 0,36±0,02* 0,27±0,01 0,63±0,07 0,57±0,03

Escherichia coli 0,56±0,25 0,35±0,15 0,24±0,01 0,19±0,01

Streptococcus spp. 0,58±0,03 0,4±0,02 0,41±0,17 0,33±0,01

Staphylococcus spp. 0,98±0,1* 0,6±0,02* 0,27±0,03 0,15±0,01

Enterococcus spp. 0,63±0,02 0,48±0,1 0,46±0,07 0,32±0,04

Corynebacterium spp. 0,47±0,16 0,41 ±0,03 0,28±0,13 -

Clostridium spp. 0,31±0,1 0,3±0,01 - -

Candida spp. 0,75±0,03* 0,54±0,1* 0,28±0,13 0,2±0,01

Примечание: * - достоверность различия показателя по сравнению с женщинами 2-й группы

Для характеристики компонентов биопленки как экологической системы, раскрытия её ценотической структуры применяли метод учёта количественных соотношений встречаемости определенных типологических групп микроорганизмов.

Для этого определяли индекс флористической значимости. Результаты исследований выявили уменьшение данного показателя для Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp. у женщин с дисбактериозом в 1,5 раза по сравнению с обследованными 2 группы.

Условно-патогенные бактерии демонстрировали стойкий рост индекса флористической значимости при дисбактериозе репродуктивного тракта и во влагалищном, и в цервикальном биотопах (табл. 2).

Таблица 2

Показатели индекса флористической значимости видов экосистемы

влагалища

Микроорганизмы Индекс флористической значимости (%)

1 группа 2 группа

Влагалище Цервикаль ный канал Влагалище Цервикаль ный канал

Lactobacillus spp. 8,3 6,7 12,1 11,7

Bifidobacterium spp. 6,4 4,1 8,8 7,8

Escherichia coli 5,94 5,1 3,2 2,9

Streptococcus spp. 4,31 4 3,0 2,2

Staphylococcus spp. 10,6* 10,1 2,9 2,1

Enterococcus spp. 4,65 3,9 4,1 2,7

Corynebacterium spp. 3,73 3,4 3,5 -

Clostridium spp. 3,4 2,6 - -

Candida spp. 8,35* 7,4 2,3 1,6

Примечание * - достоверность различия показателя по сравнению с женщинами 2-й группы

Для определения доли участия разных видов в структуре биоценоза определяли показатель постоянства, позволяющий установить типологию доминант биоценоза (табл.3).

Установлено, что в составе' биопленки репродуктивного тракта у здоровых женщин доминирующая группа была представлена лактобактериями, бифидобактерии относились к добавочным видам. Обращает на себя внимание отсутствие в добавочных видах условно-патогенной микробиоты.

Анализ микробных компонентов биопленки репродуктивной системы у женщин 1 группы показал, что изменения имеют последовательный характер и проявляются на уровне экосистемы, выражаясь в отсутствии доминантных видов. Представители нормальной микробиоты, такие как лакто- и бифидобактерии перешли в транзиторную группу, а абсолютно доминирующими видами стали патогенные и условно-патогенные стафилококки. Микробоценоз характеризовался появлением широкого спектра добавочных и транзиторных видов.

14

Таблица 3

Показатель постоянства компонентов биопленки репродуктивной системы и у здоровых женщин

№ п/п Микроорганизмы Показатель постоянства, %

1 группа 2 группа

Доминирующие виды

1 Lactobacillus spp. - 100

2 Staphylococcus spp. 60,5 -

Добавочные виды

3 Bifidobacterium spp. - 27,2

4 Candida spp. 48,6 -

5 Streptococcus spp. 30 -

6 Enterococcus spp. 30,6 -

Транзиторные виды

7 Gardnerella spp. 17,2 14

8 Clostridium spp. - 16

9 Corynebacterium spp. 3,4 -

10 Escherichia coli 17,2 -

Установлен выраженный дисбаланс микробиоты, проявляющийся в данной группе за счет увеличения частоты встречаемости представителей условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Увеличение значимости транзиторной микробиоты и снижение облигатной свидетельствует об уравнивании значимости членов сообщества.

Существенной характеристикой микробного сообщества является видовое разнообразие, позволяющее дополнить картину количественных характеристик экосистемы. Определение коэффициента видового разнообразия репродуктивного тракта выявило достоверное увеличение количества видов у обследованных 1-й группы, как во влагалищном биотопе, так и в цервикалыюм (рис. 4).

о —--

влагалище

цервикальный канал

□ 1 группа ¡1 2 группа

Рис.4. Видовое разнообразие биопленки влагалищного и цервикального биотопов обследуемых

Показатель видового разнообразия микробных ассоциаций во влагалищном биотопе увеличивался по сравнению со здоровыми в 1,8 раза, в цервикальном канале - в 1,6 раза. Следовательно, контаминация условно-патогенными штаммами микроорганизмов значительно легче происходила у исследуемых 1-ой группы при дисбактериозе микробоценоза данного биотопа.

Таким образом, проведенные исследования показали, что у женщин с дисбактериозом репродуктивного тракта происходят качественные и количественные изменения биопленки данного биотопа. Это проявляется в увеличении показателей общей бактериальной плотности, а также частоты встречаемости условно-патогенной микробиоты на фоне снижения доминирования основных ассоциантов. Доминантные представители микробоценоза при дисбактериозе отсутствуют, тогда как в контрольной группе основными видами являлись лактобациллы и бифидобакгерии. Кроме того, при нарушении микробоценоза в группе добавочных видов появились бактерии Staphylococcus spp. и Candida spp., которые в нормоценозе изучаемого биотопа отсутствовали. Следовательно, выявлены значительные изменения видового разнообразия биотопа урогенитального тракта.

В главе 5 представлена характеристика биоэкологических свойств бактерий рода Staphylococcus.

В разделе 5.1. описаны биологические свойства выделенных представителей рода Staphylococcus.

Показано, что у обследованных 1 группы доминирующим компонентом биопленки являлись стафилококки. По сравнению со 2 группой показатели частоты встречаемости у них увеличились в 2,3 раза, а интенсивности колонизации в 4 раза. Их видовой спектр был шире, чем у здоровых женщин и появился безусловный патоген - S. aureus.

Выделенные культуры стафилококков обладали типичными морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами.

По морфологическим свойствам в препаратах, окрашенных по Граму, Staphylococcus spp. представляли собой кокки (диаметром 0,6-1,5 мкм), располагавшиеся беспорядочными скоплениями, по форме чаще напоминающими гроздья винограда, реже попарно или тетрадами, неподвижные, спор и капсул не образовывали, хорошо окрашивались анилиновыми красителями, грамположительные.

При выполнении атомно-силовой сканирующей микроскопии были получены АСМ-изображения стафилококков, выделенных из биопленки репродуктивного тракта женщин.

В разделе 5.2. приведено сравнительное изучение вирулентности стафилококков, входящих в состав биопленки репродуктивного тракта женщин 1 и 2 групп, in vitro. Показано, что культуры, выделенные при дисбактериозе, в отличие от контроля, обладали способностью расщеплять маннит и вызывать агглютинацию эритроцитов, а также более выраженной гемолитической активностью (рис. 5).

Штаммы стафилококков, выделенные в 1 группе, обладали также, в отличие от 2 группы, коагулазной и фосфатазной активностью.

Для выявления значения стафилококков в развитии дисбактериоза репродуктивной системы изучали их вирулентность in vivo. Проведенные исследования показали, что 83,1% штаммов 1 группы давали положительную внутрибрюшинную пробу, тогда как во 2 группе этот показатель был значительно ниже (р<0,05).

Уровень вирулентности (1ЛЭ50)стафилококков варьировал, что позволило разделить все изученные штаммы на группы: слабо-вирулентные, у которых LD50 составила 2,1; умеренно-вирулентные — 3,2; высоковирулентные - 6,2 и невирулентные. В 1й группе преобладали умеренно- и высоко-вирулентные штаммы, во 2й группе — невирулентные (58%) (рис. 6).

17

гемолитическая расщепление адгезивная

активность маннита способность

□ 1 группа Ш 2 группа

Рис.5. Вирулентные свойства стафилококков

невирулентные

высоковирулентные

умеренно вирулентные

слабовирулентные

■ 1 группа □ 2 группа

Рис.6. Уровень вирулентности стафилококков, входящих в состав биопленки репродуктивного тракта

В разделе 5.3. описана чувствительность стафилококков, выделенных у больных из биотопов влагалища (83 изолята) и цервикального канала (67штаммов) к химиопрепаратам: эритромицину, гентамицину и ампициллину.

Установлено, что множественной антибиотикорезистентностью обладали 25,4% штаммов, в том числе выделенные из биопленки влагалищного биотопа (19,7%) и цервикального канала (5,7%).

Из всех видов стафилококков наиболее высокой антибиотикорезистентностью обладали штаммы S. aureus, особенно выделенные из биопленки вагинального биотопа - 83%. Изоляты, выделенные из цервикального канала, не обладали множественной резистентностью к антимикробным препаратам. Доля умеренно-чувствительных и чувствительных была одинаковой в каждой группе - 8 ,5%.

Из S. epidermidis 63% штаммов были устойчивы к антимикробным препаратам, 15% изолятов проявили умеренную чувствительность, 22% штамма были чувствительны.

У вида S. saprophyticus количество антибиотикоустойчивых штаммов составило 35,2%. Остальная доля изолятов проявила умеренную чувствительность.

С целью более полной характеристики чувствительности клинических изолятов к антимикробным препаратам использовали определение минимальной подавляющей концентрации к отдельным антимикробным препаратам (эритромицин, ампициллин, гентамицин). Для эритромицина и ампициллина она составила 10"3мг/мл, а к гентамицину стафилококки были чувствительны даже при разведении 10~4мг/мл.

Результаты исследования показали, все выделенные клинические изоляты стафилококков обладали разной чувствительностью к антимикробным препаратам. Наибольшее количество изолятов было чувствительно к гентамицину (63,4%) и эритромицину (48,2%), менее выражено данное свойство было по отношению к ампициллину (15%). Полученные результаты подтвердились при определении минимальной ингибирующей концентрации.

Таким образом, показано, что патогенные и условно-патогенные стафилококки, входящие в состав биопленки репродуктивного тракта, обладают значительным набором ферментативных свойств и полирезистентностыо к широкому спектру антибиотиков.

выводы

1. В структуру биопленки здоровых женщин входили представители 16 родов микроорганизмов, из которых Lactobacillus spp. составляли доминантную группу, Bifidobacterium spp. - добавочную, к группе транзиторных микроорганизмов относились 14 условно-патогенных видов.

2. Структура биопленки вагинального и цервикального биотопов при дисбактериозе репродуктивной системы характеризовалась снижением частоты встречаемости облигатных компонентов (Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp.) на фоне увеличения количественных показателей и расширения видового спектра условно-патогенных, а также появления патогенных микроорганизмов (S. aureus, S. pyogenes).

3. Перестройка ценотипа и смена абсолютных доминант экосистемы биопленки при дисбактериозе репродуктивной системы сопровождалась снижением доминирования и флористической значимости основных симбионтов (Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp.) на фоне увеличения видового разнообразия и частоты встречаемости транзиторной микробиоты (Staphylococcus spp., Candida spp.). Понижение показателей контагиозное™ представителей нормальной микробиоты приводило к освобождению экологических ниш, занимаемых транзиторной биотой.

4. Дисбаланс микробной экосистемы биопленки влагалища и цервикального канала при дисбактериозе репродуктивной системы сопровождался расширением спектра биоэкологических свойств представителей рода Staphylococcus, обеспечивающих подавление симбионтов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в журналах из списка ВАК:

1. Мясникова (Даньшина) А.В. Мониторинг микробиоценоза урогенитального тракта женщин при микоплазменных инфекциях / М.А. Орлина, И.С. Немова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, А.В. Мясникова // Вестник новых медицинских технологий. Тула, - 2010. - № 5. - С. 97100.

2. Мясникова (Даньшина) А.В. Морфологический состав биопленки биотопа влагалища при воспалительных заболеваниях репродуктивного тракта женщин / А.В. Мясникова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, Ю.С. Нашрнов // Вестник новых медицинских технологий. -Тула, 2011. - № 4. - С. 21-24.

3. Мясникова (Даньшина) A.B. Изменение микрофлоры влагалища при воспалительных заболеваниях урогенитальнош тракта у женщин с метаболическим синдромом / Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, Н.И. Кан, О.И. Ивандеева, A.B. Мясникова, A.C. Нестеров, Ю.С. Нагорнов // Естественные и технические науки -Москва, 2011,-№6.-С. 108-110.

4. Даньшина A.B. Особенности вагинального микробиоценоза при воспалениях репродуктивного тракта женщин / A.B. Даньшина, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, Е.П. Тарабрина, A.C. Нестеров // Естественные и технические науки - Москва, 2012. - № 2. — С. 106-109.

5. Даньшина A.B. Экологическая характеристика микробоценоза репродуктивного тракта женщин [Электронный ресурс] / A.B. Даньшина, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова // Современные проблемы науки и образования - Москва, 2012. - №2. - Электронный журнал — Режим доступа: http://www.science-education.ru/102

Публикации в прочих изданиях:

6. Мясникова (Даньшина) A.B. Особенности состава вагинальной микробиоты при урогенитальных инфекциях / И.С. Немова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, М.А. Орлина, A.B. Мясникова // Материалы научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии — 2009» - Санкт-Петербург, 2009.

7. Мясникова (Даньшина) A.B. Видовой состав вагинальной микробиоты при урогенитальных патологиях / И.С. Немова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.А. Кузнецова, A.B. Мясникова // Материалы III Всероссийской конференции с международным участием: Медико-физиологические проблемы экологии человека (22-25 сентября 2009 г). -Ульяновск. - 2009. - С. 222-223

8. Мясникова (Даньшина) A.B. Антибиотикорезистентность возбудителя урогенитального уреаллазмоза / М.А. Орлина, И.С. Немова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, A.B. Мясникова // Современные наукоемкие технологии. - Москва, 2010. - № 8: - С. 139.

9. Мясникова (Даньшина) A.B. Традиционный метод экологической оценки микробиоценоза при кольпите / A.B. Мясникова, Н.И, Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова // Материалы Всероссийской научно-методической конференции «Инновации и традиции науки образования» - Сыктывкар, 2010. - С. 12-14.

10. Мясникова (Данынина) A.B. Характеристика микробиоты влагалища при воспалительных заболеваниях внутренних половых органов / A.B. Мясникова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, Т.И. Волгина // Успехи современного естествознания. - Москва, 2010. - № 5. - С. 66.

11. Мясникова (Данынина) A.B. Роль микроорганизмов в структуре воспалительных заболеваний урогенитального тракта у женщин / A.B. Мясникова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова // Материалы III Всероссийской научно-практической (заочной) конференции «Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований» - Москва, 2010. — С. 84-86.

12. Мясникова (Данынина) A.B. Микрофлора влагалища как индикатор репродуктивного здоровья женщин I A.B. Мясникова, И.С. Немова, М.А. Орлина // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Высшее сестринское образование в системе российского здравоохранения» - Ульяновск, 15-16 декабря 2010. — С. 121122.

13. Мясникова (Данынина) A.B. Микробный пейзаж влагалища при кольпите /A.B. Мясникова, И.С. Немова, К.С. Кузнецова // Медицинский академический журнал - Москва, 2010. - Т. 10, № 5. - С. 88.

14. Мясникова (Данынина) A.B. Антибиотикорезистентность микрофлоры влагалища при вульвовагините / A.B. Мясникова, К.В. Мясников // Вестник Российского государственного медицинского университета. — Москва, 2011. - Специальный выпуск№ 1.-С. 184-185.

15. Мясникова (Данынина) A.B. Дисбактериоз влагалища у больных вульвовагинитом / A.B. Мясникова, К.В. Мясников, К.С. Кузнецова // Вестник Российского государственного медицинского университета. -Москва, 2011. - Специальный выпуск № 1. - С. 185.

16. Мясникова (Данынина) A.B. Микробоценоз влагалища при аднексите / A.B. Мясникова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова // Международный журнал экспериментального образования. — Москва, 2011,-№7.-С. 42.

17. Мясникова (Данынина) A.B. Микробиоценоз репродуктивного тракта женщин при воспалительных заболеваниях / М.А. Орлина, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, A.B. Мясникова // Практические рекомендации. - Ульяновск, 2011. - 22 с.

18. Данынина A.B. Экологическая характеристика микробоценоза вагинального и цервикального биотопов репродуктивной системы женщин / A.B. Даньшина, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова // Практические рекомендации. - Ульяновск, 2012. - 16 с.

22

Подписано в печать 11.04.2012. Формат 60 х 84/16. Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 58 !Ш

Отпечатано с оригинал-макета в Издательском центре Ульяновского государственного университета 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Даньшина, Анастасия Владимировна, Ульяновск

61 12-3/1135

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «УЛЬЯНОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

Даныдина Анастасия Владимировна

МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КОМПОНЕНТОВ БИОПЛЕНКИ РЕПРОДУКТИВНОГО ТРАКТА ЖЕНЩИН

03.02.08 - экология (биология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Н.И. Потатуркина-Нестерова

Ульяновск-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................8

1.1. Биопленка как форма существования симбионтов...........8

1.2. Экологические преимущества биопленок......................13

1.3. Структура биопленки репродуктивного тракта женщин.....15

1.4. Значение Staphylococcus spp. в патологии репродуктивного тракта....................................................24

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.....................33

2.1. Материалы исследования..........................................33

2.2. Методы исследования..............................................37

2.3. Методы статистического анализа данных......................47

ГЛАВА 3. СТРУКТУРА МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА БИОПЛЕНКИ

РЕПРОДУКТИВНОГО ТРАКТА ЖЕНЩИН.........................50

3.1. Общая характеристика микробиоты влагалища здоровых женщин и пациенток с дисбактериозом репродуктивной системы..............................................50

3.2. Морфология биопленки здоровых женщин...................54

3 3 Микробоценоз влагалища и цервикального канала

при дисбактериозе...................................................61

3.4 Микробоценоз репродуктивного тракта женщин

при воспалении отдельных органов репродуктивной

системы.................................................................66

ГЛАВА 4. ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ КОМПОНЕНТОВ

БИОПЛЕНКИ..................................................................73

4.1. Изменение индекса контагиозности микроорганизмов.......73

4.2. Изменения индекса флористической значимости............77

4.3. Динамика показателя постоянства микроорганизмов......81

4.4 Динамика показателя видового разнообразия................84

ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЭКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

БАКТЕРИЙ РОДА STAPHYLOCOCCUS...............................86

5.1. Биологические свойства выделенных представителей рода Staphylococcus....................................................86

5.2. Вирулентность выделенных штаммов...........................93

5.3. Чувствительность Staphylococcus spp. к антибиотикам.....103

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.......................................110

ВЫВОДЫ.....................................................................................129

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................130

УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

БВ - бактериальный вагиноз

ГЭ - геном-эквивалент

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ЖСА - желточно-солевой агар

КА - кровяной агар

КОЕ - колониеобразующая единица

МПА - мясо-пептонный агар

МПБ - мясо-пептонный бульон

ОБМ - общая бактериальная масса

ПМО - показатель микробной обсемененности

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

УПМ - условно патогенные микроорганизмы

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Проблема взаимоотношений микробной популяции и человека продолжает оставаться одной из важнейших на современном этапе существования человеческого общества. Особую значимость приобретает вопрос о влиянии микроорганизмов на макроорганизм в условиях экологической системы (Акопова, 2010).

Представление о способах взаимодействия паразита и хозяина в последние годы претерпело значительные изменения. Показано, что бактерии для своего выживания широко используют преимущество, которое дает коллективное поведение (Lewis К., 2005). Одним из основных открытий в этой области следует считать установление факта существования бактерий в составе сообществ, получивших название «биопленка» (Тец, 2007). Биопленки образуются в естественных условиях существования бактерий, в том числе, в организме человека на поверхности кожи и слизистых (Белова и соавт., 2004).

Образование биопленок является одной из основных стратегий, повышающих выживание бактерий в организме хозяина, благодаря благоприятной среде в пределах покрывающей их пленки. Способность бактерий существовать в составе биопленок значительно повышает устойчивость бактерий к воздействию неблагоприятных факторов по сравнению с планктонными формами микроорганизмов (Ильина, 2004).

Известно, что биопленки - это полимикробные фиксированные сообщества, окруженные защитным полимерным матриксом, где формируется своеобразная экологическая система, способствующая сохранению жизнеспособности микробных популяций (Семенов, 2009). В настоящее время природа и свойства матрикса установлены, в то время как микробный компонент биопленки репродуктивного тракта женщин остается мало изучен.

Цель и задачи исследования:

Провести экологическую оценку структуры биопленки репродуктивного тракта женщин и выявить изменение биоэкологических характеристик ее компонентов в условиях дисбактериоза данного биотопа.

Задачи исследования:

1. Определить видовую структуру биопленки вагинального и цервикального биотопов здоровых женщин, а также при дисбактериозе репродуктивного тракта.

2. Дать экологическую характеристику компонентов микробоценоза изученных биотопов.

3. Выявить изменения биоэкологических свойств патогенных и условно патогенных бактерий-ассоциантов на примере представителей рода Staphylococcus.

Научная новизна работы. Впервые дана экологическая характеристика структуры биопленки вагинального и цервикального биотопов здоровых женщин, а также при дисбактериозе репродуктивной системы. Показаны глубокие изменения микробоценоза репродуктого тракта на уровне экосистемы, сопровождающиеся сменой ценотипа и иерархии микробных таксонов биопленки при нарушении микроэкологии репродуктивного тракта.

Анализ видового состава микробных ассоциаций изученных биотопов при дисбактериозе, по сравнению со здоровыми женщинами, выявил значительные нарушения биоценотических связей в биопленке, проявлявшиеся снижением доминирования основных симбионтов на фоне роста представителей добавочной и транзиторной микробиоты.

На примере представителей рода Staphylococcus показано, что выявленные нарушения структуры биопленки сопровождаются изменением биоэкологических свойств микробов-ассоциантов, проявлявшихся в повышении их патогенного потенциала. Показана значительная активизация

продуцирования ферментов агрессии этими микроорганизмами и усиление летального эффекта в опытах in vivo.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе данные дают представление о различиях структуры биопленки репродуктивного тракта здоровых женщин и при дисбактериозе данного биотопа. Анализ экологических показателей видового состава биопленки расширяют представление о характере межмикробных взаимодействий, определяющих формирование и поддержание микробоценоза репродуктивной системы женщин.

Выявленные изменения экологических характеристик биопленки способствуют реализации вирулентного потенциала ее компонентов, в результате чего усиливается их способность оказывать патологическое действие на макроорганизм. Принимая во внимание широкую распространенность дисбактериоза органов репродуктивного тракта женщин, необходимо учитывать изменения патогенных свойств компонентов биопленки данного биотопа и возможность возникновения эндогенной инфекции в результате трансформации нормоценоза. В связи с этим для оптимизации диагностики предлагается внедрение в работу бактериологических лабораторий определение биоэкологических свойств компонентов биопленки репродуктивных органов.

По материалам диссертационной работы опубликованы практические рекомендации «Экологическая характеристика микробоценоза вагинального и цервикального биотопов репродуктивной системы женщин» (2012).

Метод определения экологических параметров микробоценоза при дисбактериозе репродуктивного тракта внедрен в работу лаборатории ГУЗ ОКБ г. Ульяновска.

Полученные данные используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» по курсу микробиологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Структурная перестройка биопленки при дисбактериозе репродуктивного тракта женщин проявляется глубокими изменениями пространственной организации и сменой иерархии экологических групп микроорганизмов.

2. Дисбактериоз сопровождается сменой абсолютных доминант, увеличением показателей частоты встречаемости и видового разнообразия добавочной и транзиторной микробиоты биотопа репродуктивного тракта.

3. Изменение структуры биопленки вагинального и цервикального биотопов репродуктивной системы женщин сопровождается изменением биоэкологических свойств патогенных и условно патогенных эндосимбионтов на примере представителей рода Staphylococcus.

Апробация работы.

Диссертация выполнена в соответствии с учебным планом научной работы Ульяновского государственного университета (ГК № 1456/01-04-01 от 22.04.2010).

Результаты исследований доложены на научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Санкт-Петербург, 2009); «Всероссийской научно-методической конференции: инновации и традиции науки образования» (Сыктывкар, 2010); III Всероссийской научно-практической (заочной) конференции «Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований» (Москва, 2010); III Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ, пять из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3

глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка используемой литературы. Список литературы содержит 219 наименований, в том числе 59 зарубежных. Работа иллюстрирована 21 таблицей, 30 рисунками.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Биопленка как форма существования симбионтов

Достижения в микробиологии последних двух десятилетий показали, что бактерии для своего выживания, так же как и люди, широко используют преимущества, которые дает коллективное поведение. Представление о способах взаимодействия паразита и хозяина, а также действии на микроорганизмы антибиотиков в последние годы претерпело значительные изменения (Lewis, 2005). Одним из основных открытий в этой области следует считать установление факта существования бактерий в составе различных сообществ, получивших общее название - биопленки (Тец, 2007).

Биопленки образуются в естественных условиях существования бактерий, в том числе в организме человека на поверхности кожи и слизистых (Costi, 2008). Свободно живущие популяции микроорганизмов с интенсивным клеточным делением и развитыми системами активной и пассивной подвижности быстро распространяющиеся в среде, относятся к планктонным формам. «Оседлые», сессильные формы имеют выраженные механизмы специфической адгезии, они характеризуются медленной скоростью роста популяций и способностью агрегироваться в клеточные консорциумы (Costerton, 2007). Популяции сессильных клеток и формируют биопленки - живые, постоянно обновляющиеся сообщества одного или нескольких видов бактерий, которые закрепились на биогенном или абиогенном субстрате и окружены полимерным материалом (матриксом), предохраняющим их от вредных воздействий окружающей среды, демонстрируют изменения фенотипа, выражающиеся в изменении параметров роста и экспрессии специфичных генов (Маянский, 2011). Биопленочные бактерии общаются между собой секреторными медиаторами (аутоиндукторами), которые служат основной их социального поведения или quorum sensing - QS (Гинцбург, 2003; Davies, 2004).

Роль биопленок в инфекционной патологии была оценена практически сразу же после их обнаружения, когда было установлено, что сессильные формы бактерий малочувствительны к факторам неспецифического и специфического иммунитета (Darouiche, 2001). Формирование биопленки в очаге воспаления ведет к хронизации инфекционного процесса и сопровождается неудовлетворительными результатами антибиотикотерапии (Blango, 2010; Kirov, 2007). Проблема подавления образования бактериальной пленки до сих пор остается актуальной задачей, так как классические приемы этиотропной терапии гнойно-воспалительных инфекционных процессов в ряде случаев малоэффективны из-за высокой лекарственной устойчивости внутрибиопленочных форм возбудителя (Бехало, 2010).

Непатогенные бактерии, комменсалы человека, существуют также в виде сложных мультивидовых сообществах, образуя микроценозы кожи, кишечника, слизистых (Hall-Stoodley, 2009).

Благодаря наличию в биопленке сложной и разветвленной системы кооперации между многочисленными и разнообразными микробными популяциями, попадающими в организм естественным путем, исходный субстрат в результате микробной трансформации превращается через каскад реакций в промежуточный, либо в конечный продукт с той или иной биологической или фармакологической активностью. Фактически совокупность всех микробоценозов человека следует рассматривать как своеобразный экстракорпоральный орган, количество клеток в котором в десятки - сотни раз превышает общее число эукариотических клеток всех тканей и органов. Микробиота, постоянно или временно присутствующая в организме, вносит значительный вклад в анатомию и физиологию человека (Шендеров, 2005).

Для каждого вида существуют свои особенности роста и развития, в то время как формирование бактериальных биопленок подчинено некоторым общим закономерностям (О' Toole, 2000). В результате исследования

установлено, что ключевым моментом, без которого невозможно образование микробной биопленки является процесс адгезии микроорганизма к доступной для дальнейшей колонизации поверхности (Белобородов, 2008; Гостев, 2010).

По мнению ряда авторов (Вознесенский, 2008; Денисов, 2007), процесс адгезии бактерий может быть разделен на две стадии: первичная стадия или стадия стыковки, и вторичная - или стадия прикрепления.

Первичная адгезия обратима и зависит от множества физических и химических переменных, которые определяют характер взаимодействия между бактериальной клеткой и поверхностью (Kreft, 2008). Прежде всего микроорганизм должен попасть в непосредственную близость к поверхности, либо случайно, либо направлено, например, путем хемотаксиса (Keren, 2004; Видяева, 2009). Прикрепление бактерий к нативному материалу основано на гидрофобных, электростатических контактах с поддерживающим субстратом, засчет сил Ван дер Вальса, неспецифической адгезии (Mohamed, 2007).

Вторая стадия адгезии - собственно прикрепление, когда микроорганизм синтезирует и использует собственные молекулы (Bjarnsholt, 2010). Адгезия к биологическим поверхностям (к клеткам тканей, стенкам сосудов) обусловливается специфическим взаимодействием белков-адгезинов или лектинов фимбрий экзоплазматического компартамента бактериальной клетки с рецепторами или определенными доменами поверхности мембран хозяйских клеток (Götz, 2002; Гостев, 2010).

В работах показано, что после завершения второй стадии, адгезия при отсутствии физического или химического вмешательства становится необратимой, и микроорганизм оказывается прочно прикрепленным к колонизируемой поверхности. У некоторых микроорганизмов для адгезии может использоваться несколько различных адгезинов в зависимости от условий окружающей среды (Simmons, 2007; Чеботарь, 2010).

В течение второй стадии адгезии взвешенные микророганизмы одного вида могут также коррегировать друг с другом или с микрорганизмами других видов, формируя сообщество (Зайцева, 2006; Коробов, 2011). Если биопленка состоит из нескольких видов, экзометаболиты одного микроорганизма могут использоваться для поддержания роста и развития другого. При этом адгезия одного вида может обеспечить лиганды, способствующие прикрепление других. М.Е. Davey (2000) установлено, что как только бактерии прикрепляются к поверхности, начинается процесс созревания биопленки.

Данные лазерной конфокальной микроскопии во многих работах (Lee, 2003; Зайцева, 2006) позволили установить, что биопленки имеют сложную трехмерную структурную организацию. После необратимой адгезии популяции микроорганизма начинает интенсивно пролиферировать с образованием многоклеточных слоев и обильно синтезировать компоненты экзополимерного матрикса, это один из ключевых моментов образования биопленки (Manos, 2008). Потенциал роста любой бактериальной биопленки ограничен количеством питательных веществ в окружающей среде, доступности их для клеток, находящихся внутри биопленки и возможностью удаления продуктов метаболизма. (Сидоренко, 2004).

В химическом отношении матрикс неоднороден и разл