Роль эпителиально-бактериальных взаимодействий в ассоциативном симбиозе репродуктивного тракта женщин

Кремлева, Елена Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль эпителиально-бактериальных взаимодействий в ассоциативном симбиозе репродуктивного тракта женщин
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль эпителиально-бактериальных взаимодействий в ассоциативном симбиозе репродуктивного тракта женщин"

На правах рукописи

тГ

КРЕМЛЕВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

РОЛЬ ЭПИТЕЛИАЛЬНО - БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В АССОЦИАТИВНОМ СИМБИОЗЕ РЕПРОДУКТИВНОГО ТРАКТА ЖЕНЩИН

03.02.03 — Микробиология

2 8 НОЯ 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

005539903

Оренбург-2013

005539903

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН

Научный консультант:

доктор медицинских наук

Черкасов

Сергей Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Оренбургская государственная медицинская академия Росздрава

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Ульяновский государственный университет

Чайникова Ирина Николаевна

Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна

доктор медицинских наук, ФГБУН Институт кле- Перунова

точного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН Наталья Борисовна

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Южно-Уральский государственный медицинский Росздрава

университет

Защита состоится 19 декабря в 12 часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03 ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Росздрава (Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6, тел.: (3532) 40-3562, факс: (3532) 77-24-59, e-mail: orgma_dsl@esoo.ru, зал заседаний диссертационного совета).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Росздрава.

Автореферат разослан _2013 г., автореферат и текст

объявления размещены на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, * ~ Немцева

профессор /^^¿^-/'¿/^^^ Наталия Вячеславовна

Актуальность проблемы

Интерес к изучению эпителиально-микробных взаимодействий, возросший в последние годы, определяется стратегически важным положением мукозальных эпителиоцитов - на границе внутренней и внешней сред, а также их способностью, реагируя на внешние стимулы, участвовать в развитии защитных реакций врожденного и адаптивного иммунитета, в формировании толерантности к комменсалам, а также в развитии патологических процессов.

Большинство исследований в этой области посвящены взаимодействию эпителиоцитов с патогенными микроорганизмами. Накоплены данные о бактериальных модулинах, эпителиальных TLR и NLR рецепторах (Yu L. et all, 2009), внутриклеточных сигнальных путях, изменении экспрессии цитокинов, антибактериальных пептидах (McCormick В.А, 2006), способных регулировать локальную иммунную реакцию, обеспечивая защиту от патогенных микроорганизмов.

Изучению эпителиально-микробного взаимодействия с нормоф-лорой уделяется значительно меньшее внимание, в основном на примере мукозального иммунитета кишечника. Однако, специфичность' функций репродуктивного тракта, требующая обеспечения эффективной защиты от потенциальных патогенов, при сохранении толерантности к генетически чужеродной сперме и плоду, не позволяет распространить на него данные, полученные в иных биотопах.

Имеющиеся данные об эпителиально-бактериальных взаимодействиях в женском репродуктивном тракте ограничиваются сведениями о роли эпителиального гликогена в поддержании популяции лак-тобактерий и синтезе эпителиальными клетками отдельных антибактериальных пептидов и цитокинов при взаимодействии с патогенами.

Комплексного изучения взаимодействия вагинальных эпителиоцитов с представителями доминантной и ассоциативной микрофлоры влагалища не проводилось, поэтому вопрос о роли эпителиально-бактериальных взаимодействий в формировании микробиоценозов и поддержании мукозального иммунитета репродуктивного тракта женщин остается открытым.

Поставленные вопросы лежат в области инфекционной симбио-логии, с опорой на концепцию ассоциативного симбиоза с его трех-

звеньевой структурой, включающей хозяина и микрофлору, как доминантную, так и ассоциативную (Бухарин О.В. с соавт., 2007). Если к этому добавить, что инфекция в настоящее время рассматривается как модельная система ассоциативного симбиоза (Бухарин О.В. с соавт., 2009), то становится очевидным, что решение задач по изучению эпителиально-бактериальных взаимодействий полностью укладывается в концепцию первых двух векторов хозяин-доминант и хозяин-ассоциант, что актуализирует постановку цели и задач нашей работы.

Цель и задачи исследования

Цель: Изучить механизмы эпителиально-бактериальных взаимодействий в вагинальном биотопе в условиях нормо- и патоценозов и оценить их роль в ассоциативном симбиозе репродуктивного тракта женщин.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1.Изучить влияние эпителиально-бактериальных взаимодействий на численность и функциональную активность представителей доминантной и ассоциативной микрофлоры влагалища.

2.0пределить изменение функциональной активности вагинальных эпителиоцитов (синтез бактерицидных и регуляторных веществ) в результате взаимодействия с различными вагинальными микросимбионтами.

З.Дать Сравнительную характеристику эпителиально-бактериальных взаимодействий в разных типах вагинальных микробиоценозов.

4.0ценить значение микроэкологического статуса вагинального биотопа для функционального состояния женской репродуктивной системы.

5.Охарактеризовать взаимосвязь мукозального иммунитета с характером микрофлоры влагалища и оценить возможность направленной модуляции параметров мукозального иммунитета пробиотиками.

б.На основе анализа исходов эпителиально-бактериальных взаимодействий обосновать подходы к оценке и коррекции микроэкологического состояния репродуктивного тракта женщин.

Научная повпзна

Установлено, что вагинальные эпителиоциты способны дифференцировано влиять на свойства микросимбионтов (Патент РФ№2458135), формируя определенный тип микробиоценоза. В условиях нормоценоза эпителиоциты оказывают преимущественно стимулирующее влияние на ростовые свойства и антагонизм нормофло-ры (лактобактерий и коринебактерий), одновременно подавляя ростовые свойства, способность к биопленкообразованию и антагонистическую активность ассоциативной микрофлоры (5. aureus и Е. coli).

Особенностями эпителиально-бактериальных взаимодействий при бактериальном вагинозе, по сравнению с нормоценозом являются: стимуляция способности к биопленкообразованию ассоциативных микросимбионтов, сопровождающаяся ослаблением подавляющего воздействия на их ростовые свойства, и резкое угнетение свойств "Н2О2+" биоваров лактобактерий.

Установлено стимулирующее влияние экзометаболитов вагинальных эпителиоцитов женщин на ростовые свойства пробиотиче-ского штамма как необходимое условие восстановления нормофлоры влагалища (Положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2012136487).

Выявлены механизмы регуляции эпителиально-бактериальных взаимодействий, основанные на цитокиновой реакции вагинальных эпителиоцитов при взаимодействии с микросимбионтами и дифференцированном дозозависимом влиянии провоспалительных цитоки-нов на свойства вагинальных микросимбионтов. Изучение экспрессии цитокинов вагинальными эпителиоцитами при контакте с микросимбионтами выявило выраженное усиление продукции провоспалительных цитокинов при взаимодействии с Е. coli и 5. aureus, тогда как лактобациллы и коринебактерии вызывали умеренную стимуляцию их продукции.

В условиях in vivo продемонстрирована значимость нормофлоры влагалища для состояния цитокинового профиля вагинального содержимого. Дефицит лактофлоры сопровождается повышением уровня провоспалительных цитокинов, сопоставимым с уровнем, наблюдаемым при И111111.

Выявлено дифференцированное дозозависимое влияние цитокинов провоспалительной направленности на ростовые свойства вагинальных микросимбионтов. В концентрациях, характерных для нормоценоза, происходит стимуляция свойств лактобацилл и корине-бактерий, и подавление роста S.aureus и E.coli. Цитокины в концентрациях, свойственных бактериальному вагинозу, напротив, угнетают ростовые свойства лактобацилл, стимулируя (в случае с IL-ip и IL-8) свойства S.aureus и E.coli.

Установлено, что результирующая эпителиально-бактериальных взаимодействий, выражающаяся в изменении функционального состояния эпителиоцитов и микросимбионтов, может быть использована в качестве критерия дифференциации автохтонной от аллохтонной микрофлоры в условиях женского репродуктивного тракта.

Установлен синергидный характер взаимодействий доминантной микрофлоры с мукозальными эпителиоцитами влагалища, проявляющийся в стимуляции ростовых свойств и антагонизма лактобактерий, и усилении синтеза эпителиоцитами веществ антимикробной направленности, что в совокупности служит основой поддержания колонизационной резистентности биотопа.

Выявлено, что нарушения микроэкологического состояния вагинального биотопа, проявляющиеся в дефиците доминантных микросимбионтов и повышении уровня провоспалительных цитокинов -одна из причин женской инфертнльности, что свидетельствует о роли микробного фактора в регуляции гомеостаза хозяина и функционировании репродуктивной системы.

Показана возможность модуляции параметров мукозального иммунитета влагалища пробиотиками. Интравагинальная пробиотиче-ская терапия оказывает влияние на состояние мукозального иммунитета нижних отделов женского репродуктивного тракта, выражающееся в противовоспалительном тренде баланса цитокинов.

Теоретическая и практическая значимость

В теоретическом плане получены новые данные о механизмах симбиотических взаимодействий макроорганизма с доминантной и ассоциативной микрофлорой вагинального биотопа, лежащих в основе формирования микробиоценоза и определяющих состояние муко-зального иммунитета.

Выявленная в ходе исследования связь микроэкологического состояния вагинального биотопа с фертильностью расширяет патогенетические представления о причинах женского бесплодия, обосновывая роль микробного фактора в качестве регулятора гомеостаза организма и функционирования репродуктивной системы.

Практическую значимость работы определяют:

- Новые критерии дифференциации автохтонной и аллохтонной вагинальной микрофлоры, позволяющие осуществлять' диагностику микроэкологических нарушений репродуктивного тракта женщин.

-Выявление связи состояния микробиоценоза с цитокиновым профилем вагинального биотопа позволило предложить определение уровня 1Ь-1р вагинальной жидкости в качестве маркера дисбиотиче-ских состояний женского репродуктивного тракта.

-Разработан способ оценки влияния вагинальных эпителиоцитов на биологические свойства бактерий, который по изменению свойств микроорганизмов позволяет оценивать влияние как эпителиальных экзометаболитов, так и непосредственного контакта с эпителиальными клетками (Патент РФ№2458135).

-Предложен новый способ индивидуального подбора пробиотика для эффективной интравагинальной пробиотической терапии, основанный на оценке результатов взаимодействия вагинальных эпителиоцитов пациентки с пробиотическими штаммами (Положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2012136487).

Основные положения, выносимые на защиту

Эпителиально-бактериальные взаимодействия - модельная система ассоциативного симбиоза, являющаяся основой поддержания микроэкологического гомеостаза биотопов женского репродуктивного тракта.

Результирующая бактериально-эпителиальных взаимодействий, выражающаяся в изменении функционального состояния эпителиоци-тов и микросимбионтов, - дифференциальный критерий отличия автохтонной и аллохтонной микрофлоры вагинального биотопа.

Эпителиально-бактериальные взаимодействия определяют колонизационную резистентность биотопов репродуктивного тракта, регулируя численность и функциональное состояние доминантной микрофлоры и напряженность факторов мукозального иммунитета.

Дефицит доминантных микросимбионтов и высокий уровень провоспалительных цитокинов, сопряженные с неудачными попытками ЭКО, характеризуют связь репродуктивной функции женского организма с микроэкологическим состоянием биотопов нижних отделов репродуктивного тракта.

Апробация работы

Основные положения работы доложены на У-УП Российских научных конференциях «Персистенция микроорганизмов», г. Оренбург, 2006, 2009, 2012; Российской научной конференции «Репродуктивное здоровье населения», г.Оренбург, 2005; 2 Международном конгрессе по пробиотикам «Санкт-Петербург-Пробиотики-2009»; IV Региональном научном форуме «Мать и Дитя».г. Екатеринбург, 2010; Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», г. Санкт-Петербург, 2010.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 11- в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, и 2 патента на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 267 страницах и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации

и указатель литературы, включающий 55 отечественных и 254 зару-

бежных источников. Иллюстрации представлены 21 таблицами и 23 рисунками.

Работа выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН в соответствии с планом научно-исследовательской работы: тема «Изучение симбиотических взаимоотношений в микробиоценозах тела человека», № гос. регистрации 01.2.00 104756; проект «Межбакгериальные взаимодействия и их роль в формировании микробных биоценозов тела человека» по программе Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине»; тема «Изучение механизмов взаимоотношений симбионтов и их регуляции в различных биологических системах», № гос. регистрации 0120.0 600145; программа инициативных фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 12-У-4-1023.

Материалы и методы исследования

Эпителиально-бактериальные взаимодействия были изучены у 326 женщин, из которых у 62 с нормобиоценозом определяли влияние эпителиально-бактериальных взаимодействий на свойства микрофлоры, у 22- экспрессию цитокинов эпителиоцитами при воздействии на них микросимбионтов, у 16 проводили оценку характера взаимодействий эпителиоцитов с ауто- и гетероштаммами лактобацилл; у 36 женщин, страдающих бактериальным вагинозом, определяли влияние эпителиально-бактериальных взаимодействий на свойства микрофлоры; у 24 - изменение экспрессии цитокинов эпителиоцитами при воздействии на них микросимбионтов; у 78 женщин, с первичным обращением по поводу бесплодия, изучали связь состояния микробиоценоза с цитокиновым профилем влагалища; у 52 пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием оценивали влияние микроэкологического состояния вагиначьного биотопа на исходы ЭКО; и у 36 женщин, с выраженным дефицитом лактофлоры, при проведении интраваги-нальной терапии пробиотиком исследовали состояние мукозального иммунитета и оценивали эффективность способа индивидуального подбора пробиотика.

Первичные вагинальные эпителиоциты получали с боковых стенок влагалища в первой фазе менструального цикла, элиминировали сопутствующую микрофлору, оценивали общее количество и процент

живых эпителиоцитов путем подсчета в камере Горяева после окрашивания флюорохрома диацетатом при люминесцентной микроскопии (Д.Клаус, 1990), после чего доводили взвесь до концентрации 10б кл/мл. Для оценки контактного бактериально-эпителиального взаимодействия эпителиоциты инактивировали 0,4% раствором формалина. Для изучения влияния внеклеточных секреторных продуктов, использовали фильтрат (мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм "Millipore", USA) 4 часовой культуральной жидкости эпителиоцитов, культивируемых в среде Хенкса.

В работе были использованы штаммы Corynebacterium spp., S.aureus, E.coli и различные по продукции Н2О2 Lactobacillus spp., выделенные из нижнего отдела репродуктивного тракта женщин. Клинические изоляты идентифицировали по совокупности морфологических, тинкгориальных и биохимических характеристик (Бержди, 1997). Способность лактобацилл продуцировать Н202 определяли способом О.В.Бухарина с соавт. (2012).

Лактобациллы культивировали в бульоне MRS (Sifin, Германия), S. aureus, Е. coli и коринебакгерии - в 2% мясопептонном бульоне (НПО "Питательные среды", Махачкала) в микроаэрофильных условиях при 37°С. Бактериальные супернатанты получали фильтрованием суточной культуральной жидкости (0,22 цм, Millipore). Термоинак-тивированные бактерии получали нагреванием взвеси суточной культуры бактерий до 75°С в течение 20 минут, с последующим контрольным высевом, после чего готовили взвесь 107 кл/мл.

Для определения влияния эпителиально-бактериальных взаимодействий на биологические свойства бактерий к взвеси изучаемых бактерий добавляли инактивированные эпителиоциты в соотношении 1/10, или эпителиальные супернатанты в объемном соотношении 1/7. При изучении влияния эпителиоцитов на антагонистическую активность микросимбионтов использовали методику А.В.Семенова с со-авт.(2007). Изменение антагонизма выражали в процентах угнетения прироста индикаторной культуры по сравнению с контролем. Изменение ростовых свойств бактерий определяли фотометрически (Х= 540 нм) и чашечным методом, путем подсчета КОЕ после высева на плотные питательные среды. Способность бактерий к образованию биопленок изучали по методике O'Toole с соавт. (1999).

Для определения влияния микросимбионтов на функциональную активность вагинальных эпителиоцитов к их взвеси добавляли гермоинактивированные лактобациллы или их супернатанты, соблюдая соотношение эпителиоцит/микроорганизм - 1/10, или микробный супернатант, при объемном соотношении микробный суперна-тант/взвесь эпителиоцитов - 1/7. Контролем служили эпителиоциты, подвергнутые воздействию среды культивирования лакгобацилл и/или 0,1 М ФСБ (рН 7,0-7,2).

Определение концентрации цитокинОв проводили в эпителиальных супернатантах и вагинальном содержимом, которое получали, омывая стенки влагалища 2 мл стерильного физиологического раствора. Ингибирование активности протеаз в полученных пробах осуществляли фенилметилсульфонилфлюоридом в конечной концентрации 5 мкМ/мл. Определение в вагинальном лаваже концентрации ци-токинов IL 1 Р, га IL1, IL4, INFy проводили иммуноферментным методом, используя наборы производства ООО «Цитокин», С-Петербург, секреторного Ig A (slg А) и лактоферрина, - ЗАО «Векгор-Бест», Новосибирск, TGF [И- BD Biosciences, США по протоколам, рекомендованным фирмами- производителями.

Для оценки влияния цитокинов на свойства бактерий к взвеси исследуемых микроорганизмов (ПМО=Ю5 КОЕ/мл) в соответствующей культуральной среде добавляли, соблюдая объемное соотношение 10/1, раствор цитокина, создавая конечные концентрации, характерные для нормо- или патоценоза. Влияние цитокинов на микроорганизмы оценивали по изменению их ростовых свойств и способности к образованию биопленок.

Диагностику инфекций, передаваемых половым путем, проводили методами полимеразной цепной реакции, прямой иммунофлюо-ресценции (уреаплазмоз и хламидиоз) и культуральным методом (трихомоноз). Воспалительную реакцию оценивали при микроскопии нативного мазка из влагалища и цервикального канала. Бактериальный вагиноз диагностировали по критериям R. Amsel с соавт. (1983).

Для проведения интравагинальной пробиотической терапии использовали пробиотический штамм Lactobacillus acidophilus вагинального происхождения (Экофемин, Pharma-vinci, Дания), который, согласно рекомендациям производителя, вводили интравагинально 2

раза в сутки в течение 6 суток. Эффективность пробиотической терапии определяли по восстановлению обсемененности слизистой влагалища лактобактериями (ПМО>Юб) через 7 дней после завершения лечения и первой половине (на 7-8 день) следующего менструального цикла.

Статистическую обработку полученных результатов, проверку нормальности распределения данных проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова, а для оценки достоверности различий между опытными и контрольными группами использовали критерий Манна-Уитни (С. Гланц,1998). Во всех процедурах статистического анализа уровень значимости р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе нашего исследования было изучено влияние бактериально-эпителиальных взаимодействий на биологические свойства вагинальных микросимбионггов в условиях нормо- и патоценозов, которое оценивали по изменению важнейших физиологических свойств, определяющих выживание бактериальной популяции (Перу-нова Н.Б., 2011) - способности к образованию биопленок, ростовых свойств и антагонистической активности.

Для этого был разработан способ, позволяющий оценивать влияние на бактерии как секреторных продуктов вагинальных эпите-лиоцитов, так и непосредственного контакта с ними (Патент РФ№2458135).

Было установлено, что вагинальные эпителиоциты, полученные при нормоценозе, способны дифференцированно изменять биологические свойства микрофлоры влагалища как контактно, так и посредством своих внеклеточных продуктов (рис. 1). Изучение влияния вагинальных эпйтелиоцитов, сформированных в условиях нормоценоза, в отношении S. aureus и E.coR выявило подавление ростовых характеристик, обусловленное в основном воздействием эпителиальных эк-зометаболитов (рис.1). В отношении ростовых свойств лактобактерий и коринёбактерий было выявлено как стимулирующее, так и подавляющее1 влияние вагинальных эпителиоцитов. При этом стимулирующее влияние превалировало как по выраженности, так и по распространенности. Влияние контактного взаимодействия и внеклеточ-

ных секреторных продуктов эпителиоцитов на ростовые свойства этих микроорганизмов было сходным.

E.coli:

секреторные продукты контактное взаимодействие S.aureus: секреторные продукты контактное взаимодействие Corynebacterium: секреторные продукты контактное, взаимодействие Lactobacillus: секреторные продукты контактное взаимодействие

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

□ стимуляция Ш индифферентно ■ подавление

Рис.1 Изменение ростовых свойств бактерий при контактных бактериально-эпителиальных взаимодействиях и под влиянием внеклеточных секреторных продуктов вагинальных эпителиоцитов (нормоценоз)

Таким образом, в условиях нормоценоза эпителиоциты оказывали преимущественно стимулирующее влияние на ростовые свойства лактобактерий и коринебактерий, и подавляющее - на S.aureus и E.coR.

При изучении влияния вагинапьных эпителиоцитов на антагонистическую активность представителей вагинальной микрофлоры было выявлено, что контактное сокультивирование бактерий с инак-тивированными вагинальными зпителиоцитами не оказывало статистически значимого влияния на антагонистическую активность изученных бактерий.

Воздействие же внекпеточных секреторных продуктов вагинальных эпителиоцитов на лактобакгерии и коринебактерии стимулировало их антагонистическую активность в отношении S.aureus и E.coR (рис.2). Влияние внеклеточных секреторных продуктов ваги-

нальных эпителиоцитов на взаимную антагонистическую активность Б.аигеиз и Е.соА было либо индифферентным, либо подавляющим.

50.0 45,0 40.0 35.0 30.0 25,0 20,0 15.0 10,0 5.0 0,0

Lactobacillus, spp.

Corynebacterium spp.

S.aureus.

E.coli.

в отношении s.aureus.

в отношении e.coli. e.coli.

в отношении s.aureus.

□ супернатант бактерий ■ эпителиальный супернатант

§ супернатант бактерий, обработанных секреторными продуктами эпителиоцитов Рис.2.Изменение антагонистической активности бактерий под влиянием внеклеточных секреторных продуктов вагинальных эпителиоцитов *-р<0,05 при сравнении с бактериями без предварительной обработки

Предварительный контакт эпителиоцита с микросимбионтом, на свойства которого впоследствии оказывалось влияние эпителиальными экзометаболитами, усиливал интенсивность воздействия, не меняя его направленности. Наибольшая стимуляция воздействия наблюдалась при взаимодействии с термоинактивированными бактериями. Воздействие бактериальных экзометаболитов было менее выраженным, что может быть связано с наличием в микробных супернатантах ферментных систем, способных снижать активность эпителиальных экзометаболитов (табл. 1). Усиление интенсивности воздействия в результате предварительного контакта с микросимбионтами подтверждает, что эпителиально-бактериальные взаимодействия динамический процесс, распознавание типа микросимбионта при котором ме-

няет характер реакции эпителиоцита на него.

Таблица 1.Изменение свойств бактерий под влиянием экзометаболи-тов эпителиоцитов, полученных при нормоценозе.

Изменение свойств бактерий (% по отношению к контролю) секреторные продукты эпителиоцитов

без предварительной стимуляции стимулированных микробным супернатантом стимулированных термоинакгивирован-ными бактериями

S. aureus ростовые свойства -(18,3±1,3) - (19,3±2,3) -(28,9±3,6)*

антагонизм к Е. coli -(28,5±5,73) -(31,3±3,8) -(33,6±2,6)

Е. coli ростовые свойства - (14,5±0,73) -(17,1±1,5) - (21,1±1,2) *

антагонизм к S. aureus -(11,2±2,6) -(15,1±3,1) -(19,6±3,9) *

Coryne-bacterium spp ростовые свойства +(20,1±3,5) +(30,2±4,1) * +(43,4±5,2) *

антагонизм к S. aureus +(371,4±13,7) +(379,5±5,8) +(398,6±16,2)

антагонизм к Е. coli +(313,2±13,2) +(321,1±14,1) +(349,5±15,8) *

Lactobacil lus spp ростовые свойства +(22,2±3,6) +(34,9±3,9) * +(48,6±5,3) *

антагонизм к S. aureus +(50,3±2,6) +(58,9±4,9) +(72,5±6,3) *

антагонизм к Е. coli +(35,7±4,1) +(42,3±5,1) +(55,8±6,3) *

«-»- подавление «+»-стимуляция

*- р<0,05 -достоверные различия при сравнении с влиянием секреторных продуктов эпителиоцитов без предварительной стимуляции

Суммируя полу ченные данные, следует отметить, что в условиях нормоценоза вагинальные эпителиоциты способны оказывать дифференцированное влияние на ростовые свойства и антагонистическую активность различных представителей микробиоценоза влагалища, вызывая в большинстве случаев подавление ростовых свойств 5. aureus и Е. coli и ослабление их антагонистической активности. В отношен™ же лактобактерий и коринебактерий преобладало стимулирующее воздействие как на ростовые свойства, так и на антагонистическую активность. Результирующей этого влияния является создание селективных преимуществ для конкретного доминантного и/или ас-

социативного микросимбионта путем стимуляции его ростовых свойств и антагонистической активности на фоне подавления свойств минорных симбионтов. Это позволяет рассматривать эпителиоциты как "первую линию обороны" макропартнера в вагинальном микробиоценозе, способную оказывать регуляторные воздействия на микросимбионтов с целью поддержания колонизационной резистентности, а эпителйально-бактериальные взаимодействия в качестве основы формирования и стабильного существования ассоциативного симбиоза влагалища.

Направленность и выраженность изменений ростовых свойств и антагонистической активности лактобактерий и коринебакгерий по сравнению с аналогичными показателями у S.aureus, E.coli, вероятно, являются отражением эволюционно сложившейся генетической и метаболической интеграции этих микроорганизмов с макропартнером. С этих позиций, результирующая бактериально-эпителиальных взаимодействий, вероятно, может рассматриваться в качестве дифференциального критерия отличия автохтонной от аллохтонной микрофлоры за счет создания селективных преимуществ для автохтонных микросимбионтов путем стимуляции их ростовых свойств и антагонистической активности на фоне подавления свойств аллохонных микроорганизмов.

Изучение особенностей эпителиально-бактериальных взаимодействий в условиях патоценоза было проведено на примере бактериального вагиноза - одного из наиболее распространенных вариантов дисбиоза репродуктивного тракта женщин, характеризующегося резким снижением количества лактобактерий и массивным ростом облигатных анаэробов, формирующих биопленки (Кира Е.Ф., 2001).

Влияние секреторных продуктов эпителиоцитов, полученных от женщин с БВ, на ростовые свойства ассоциантов было угнетающим, но Менее выраженным, чем влияние экзометаболитов эпителиоцитов, полученных при нормоцёнозе. Способность к биопленкообразованию под влиянием супернатантов эпителиоцитов, полученных из биотопов с нормо- и патоценозом, менялась диаметрально противоположно: если при нормоценозе наблюдалось угнетение способности к биопленкообразованию как S. aureus, так и E.coli, то в условиях бактериального вагиноза способность к образованию биоплёнок у этих микроорга-

низмов усиливалась. То есть, при воздействии эпителиоцитов, полученных при БВ, отмечено угнетение ростовых свойств ассоциантов, что, вероятно, способствовало поддержанию колонизационной резистентности, но при этом усиливалась их способность к биопленкооб-разованию, что приводило к формированию патомикробиоценозов.

Учитывая, что в патогенезе БВ ведущее место принадлежит снижению обсемененности влагалища доминантными микросимбионтами - лактобактериями, в особенности их "Н202+" биоварами, мы изучили взаимодействия эпителиоцитов с биоварами лактобактерий, различающимися по продукции перекиси водорода (рис. 3).

Lactobacillus spp Н202-нормоценоз

Lactobacillus spp Н202-бакгериальный вагиноз

Lactobacillus spp Н202+ | Lactobacillus spp H202+ нормоценоз j бактериальный вагиноз

H подавление О индифферентно □ стимуляция

Рис 3.Влияние секреторных продуктов эпителиоцитов, полученных из разных типов микробиоценозов на ростовые свойства лактобацилл

Результатом эпителиально-бактериальных взаимодействий в условиях БВ являлось преобладающее угнетение роста и способности к биопленкообразованию "Н202+" биоваров лактобактерий (рис. 3), и стимуляция этих свойств у "Н202-" биоваров лактобактерий, что, с одной стороны, объясняет устойчивость этого типа патоценоза, а с другой, снижение колонизационной резистентности нижних отделов женского репродуктивного тракта при нем.

Далее, оценивая по аналогии с нормоценозом, ответную реакцию эпителиоцитов на предварительный контакт с микросимбионтами,

зафиксировали повышение интенсивности воздействия эпителиальных экзометаболитов на свойства микроорганизмов, направленность влияния при этом не менялась. Воздействие на эпителиоциты оказывали как микробные секреторные продукты, так и термоинактивиро-ванные бактерии, однако воздействие последних было более эффективно (табл.2). Изменение функциональной активности эпителиоцитов, выражалось в повышении интенсивности угнетающего воздействия на прирост "Н202+"биоваров лактобактерий, стимулирующего воздействия на способность ассоциантов к биопленкообразованию и ростовые свойства "Н2О2-" биоваров лактобактерий.

Таблица 2. Изменение свойств бактерий под влиянием экзометаболитов вагинальных эпителиоцитов, полученных при бактериальном вагинозе

изменение свойств бактерий (% по отношению к контролю) секреторные продукты эпителиоцитов

без предварительной стимуляции стимулированных микробным супернатантом стимулированных гермоинакгивирван-ными бактериями

S. aureus ростовые свойства - (12,5±2,1) -(15,3±2,3) - (21,1±1,6) *

способность к образованию биопленок +(15,1±1,0) +(21,3±1,8) +(31,6±2,0) *

Е. coli ростовые свойства - (6,7±4,9) -(7,1±1,5) -(5,1±1,2)

способность к образованию биопленок +(17,8±3,6) +(20,3±2,6) +(35,1 ±3,8) *

Lactobacillus spp Н202"-" ростовые свойства ЦП,1±2,6) +(20,2±3,9) +(39,4±4,6) *

способность к образованию биопленок +(23,1±4,3) +(37,1±3,8) +(40,8±3,0) *

Lactobacillus spp Н202"+"' ростовые свойства -(3,3±1,9) -(2,9±0,9) -(11,6±2,4)*

способность ^образованию • бнОплепок -(6,4±1,6) -(9,6±2,9) -(12,7±2,5)

«-»-подавление, «^»-стимуляция

Особенностями эпителиально-бактериальных взаимодействий при бактериальном вагинозе, по сравнению с нормоценозом являются: стимуляция способности к биопленкообразовашпо ассоциативных микросимбионтов, сопровождающаяся ослаблением подавляющего воздействия на их ростовые свойства, и резкое угнетение "Н202+" биоваров лактобактерий, на фоне стимуляции ростовых свойств "Н2О2-" биоваров лактобактерий.

То есть, эпителиоциты, полученные от женщин с БВ, оказывали влияние на микроорганизмы, характерное для низкой колонизационной резистентности. Это происходило вследствие угнетения лактоба-терий, преимущественно их "Н202+" биоваров, играющих ведущую роль в поддержании колонизационной резистентности вагинального биотопа (Черкасов C.B., 2006), и ослабления угнетающее воздействия эпителиощггов на бактерии ассоцианты. С другой стороны, дифференцированное подавление роста "Н202+" биоваров доминантного микросимбионта, в совокупности со стимулирующим влиянием на способность к биопленкообразованию ассоциативных микросимбионтов способствует формированию и устойчивости таких патомикро-биоценозов. Описанные особенности отражают реальную клиническую ситуацию с БВ: снижение колонизационной резистентности соотносится с повышенным риском возникновения заболеваний, передаваемых половым путем, и высокой частотой воспалительных заболеваний женских половых органов, возникающих на фоне БВ; стимуляция биопленкообразования объясняет трудности антибатериаль-ной терапии как самого БВ, так и иных инфекций, возникающих на его фоне (Кира Е.Ф., 2001).

Таким образом, стимуляция биопленкообразования и угнетение роста лактобактерий, являющиеся результатом бактериально-эпителиальных взаимодействий при бактериальном вагинозе, раскрывают один из механизмов формирования и устойчивости пато-микробиоценоза и снижения колонизационной резистентности вагинального биотопа у женщин. Это подтверждает ключевую роль эпителиально-бактериальные взаимодействий в формирования вагинальных нормо- и патоценозов.

Следующий этап нашего исследования предусматривал оценку влияния эпителиально-бактериальных взаимодействий в вагинальном

биотопе на функциональное состояние мукозальных эпителиоцитов в условиях нормо- и патоценозов. Динамику функционального состояния оценивали по изменению экспрессии эпителиоцитами цитокинов, а также антибактериальной активности эпителиальных экзометаболи-тов. В качестве факторов воздействия выступали термоинактивиро-ванные вагинальные микросимбионты и фильтраты их суточных су-пернатантов.

При изучении влияния доминантных микросимбионтов на антибактериальную активность эпителиальных экзометаболитов было отмечено усиление их бактерицидного эффекта (рис.4), причем эффективность контактного взаимодействия с гермой накти вир ов анными лактобациллами была выше, чем воздействие их секреторных продуктов.

S.aureus E.coii

■ интактные эпителиоциты

S эпителиоциты, обработанные супернатами лакгобанилл О эпителиоциты, обработанные Ьинакгивированными лактобациллами

Рис.4 Изменение, антибактериальной активности эпителиальных экзометаболитов з результате взаимодействия эпителиоцитов с доминантными микросимбионтами *-р<0,05 при сравнении с интактными эпителиоцитами

Таким образом, доминантные микросимбионты стимулировали антимикробную активность вагинальных эпителиоцитов. Если учесть

описанную ранее способность мукозальных эпителиоцитов стимулировать антагонизм доминантных микросимбионтов, то можно констатировать синергвдное взаимодействие хозяина и доминанта, направленное на поддержание колонизационной резистентности вагинального биотопа.

Исследование влияния эпителиально-бактериальных взаимодействий на экспрессию цитокинов показало, что продукция вагинальными эпителиоцитами цитокинов изменялась как при взаимодействии с термоинактивированными бактериями (рис.5), так и секреторными продуктами микроорганизмов (рис.6), и имела отличия у эпителиоцитов, полученных при нормоценозе и бактериальном вагинозе.

5,0

0,0

Рис.5 Экспрессия цитокинов эпителиоцитами при контакте с термоинактивированными бактериями (кратность изменения по отношению к базовой секреции).

*р<0,05 - достоверные различия при сравнении с базовой секрецией цитокинов.

Изучая эпителиоциты, сформировавшиеся в условиях нормоце-ноза, мы обнаружили, что влияние термоинактивированной доминантной вагинальной микрофлоры - лактобактерий (рис.5) умеренно

усиливало продукцию эпителиоцитами 1Ь-6, 11_-1р и 1Ь-8 и подавляло

Lactobacillus. spp. Corynebacterium spp S.aureus

E.coli

□ IL-6 ■ IL-1ß ШИ-8 STNF

продукцию фактора некроза опухоли. Секреторные продукты лакто-бактерий (рис.6) не оказывали влияние на продукцию IL-ф и IL-8 и умеренно стимулировали секрецию вагинальными эпителиоцитами IL-6 и TNFa.

В качестве грамположительного представителя ассоциативных вагинальных микросимбионтов был выбран S.aureus. Контакт эпите-лиоцитов с термоинактивированными S.aureus не влиял на экспрессию цитокинов, за исключением подавления продукции TNFa (рис.5). Напротив, взаимодействие вагинальных эпителиоцитов с секреторными продуктами S.aureus (рис.6) приводило к выраженной стимуляции продукции IL-6 и IL-ip (в 5,8 и 7,5 раз соответственно) и практически не изменяло экспрессию IL-8 и TNF а.

10,0 о,о

Lactobacillus, spp. Corynebacterlum S.aureus E.coli

spp | □ IL-6 H !L-1 ft И IL-8 STNF I

Рис.6 Экспрессия цитокинов эпителиоцитами при взаимодействии с секреторными продуктами бактерий (кратность изменения по отношению к базовой секреции).

*р<0,05 - достоверные различия при сравнении с базовой секрецией цитокинов.

В качестве грамотрицательного представителя ассоциативных вагинальных микросимбионтов была выбрана E.coli. Влияние секреторных продуктов E.coli на продукцию цитокинов было аналогично

влиянию секреторных продуктов Б.аигеиз (рис.6). Напротив, результаты воздействия термоинативированных Е.соН и Б-аигет значительно различались - взаимодействие эпителиоцитов с Е.соН стимулировало экспрессию Т№а и 1Ь-1р и значительно подавляло экспрессию 1Ь-6 (рис.5).

Изменение экспрессии дитокинов при взаимодействии эпителиоцитов, полученных при нормоценозе, с коринебактериями было во многом аналогично результатам взаимодействия с лактобактерия-ми: умеренная стимуляция продукции 1Ь-8,1Ь-6, 1Ь-1р и подавление продукции Т№а, исключение составила лишь продукция 1Ь-6, которая выражено стимулировалась секреторными продуктами корине-бактерий (рис.6).

При сравнении влияния на продукцию цитокинов термоинакти-вированных бактерий и их экзометаболитов было выявлено, что инактивированные лактобактерии оказывают большее воздействие, чем экзометаболиты лактобактерий, для ассоциативных микросимбионтов прослеживалась обратная тенденция - воздействие экзометаболитов было более значимо, чем контакт с термоинакгивированными ассоциантами.

Таким образом, взаимодействие мукозальных эпителиоцитов с доминантными вагинальными микросимбионтами в условиях нормо-ценоза характеризуется умеренным усилением продукции цитокинов провоспалительной направленности, возникающим преимущественно в результате контакта эпителиальной и микробных клеток. Взаимодействие эпителиоцитов с ассоциативными микросимбионтами приводят к выраженному изменению экспрессии цитокинов, обусловленному в основном влиянием секреторных продуктов симбионтов.

Полученные результаты свидетельствуют о различном влиянии ассоциативной и доминантной микрофлоры на продукцию цитокинов эпителиоцитами. Явно заметны отличия в цитокиновой реакции эпи-телиоцита на взаимодействие с грамположительными и грамотрица-тельными термоинакгивированными бактериями (рис. 5,6). Выявленные отличия можно объяснить различием в строении клеточной стенки исследуемых микроорганизмов, тем более, что вагинальные эпите-

лиоциты имеют определенный дисбаланс ТЬЯ4/ТЬЯ2. Кроме того, отсутствие реакции эпителиоцитов на контакт с убитым Б.аигеиз возможно связано с особенностям!! строения его клеточной стенки, характеризующейся наличием протеина А, способного экранировать пепгидогликан (Дерябин Д.Г., 2000).

Умеренная цитокиновая реакция эгаггелиоцитов на доминантные микросимбионты по сравнению с ассоциативными микросимбионтами является естественной, и при постоянном взаимодействие эпителиальных клеток с лактобактериями не вызывает воспаления из-за иммунного ответа на нормофлору. Мукозальные эпителиоциты при этом не были, вопреки ожиданию, "ареактивны" по отношению к доминантному микросимбионту. Умеренное повышение уровня провос-палительных цитокинов в результате эпителиально-бактериальных взаимодействий с доминантным микросимбионтом вероятно способствует поддержанию врожденного иммунитета слизистых оболочек.

Характер цитокиновой реакции эпителиальных клеток на доминантные микросимбионты, а особенно на их экзометаболиты, может служить одним из критериев, позволяющих дифференцировать ассоциативные и доминантные микросимбионты. Так, однонаправленное влияние лактобактерий и коринебактерий на изменение экспрессии цитокинов вагинальными эпителиоцитами позволяет рассматривать коринебактерии в качестве представителя нормофлоры. Кроме того, эти данные могут быть использованы для индивидуального подбора пробиотических препаратов на основе оценки их влияния на продукцию цитокинов в репродуктивном тракте женщин.

Полученные результаты свидетельствуют, что при эпителиально-бактериальных взаимодействиях доминантные и ассоциативные микроорганизмы оказывают дифференцированное влияние на функциональное состояние мукозальных эпителиоцитов, что должно учитываться при регуляции мукозального иммунитета.

Изучение экспрессии цитокинов эпителиоцитами, полученными от пациенток, страдающих бактериальным вагинозом, выявило повышенный по сравнению с эпителиоцитами, полученными при нор-моценозе, уровень базовой экспрессии цитокинов (рис.7).

Нормоценаз стимул.

стимул. S.aureus lactobacillus.

spp

Рис.7 Экспрессия цитокинов эпителноцитами, сформировавшимися при нормоценозе и бактериальном вагинозе, при взаимодействии с секреторными продуктами бактерий.

Данный факт можно объяснить длительным влиянием патологического микроокружения, характерного для бактериального вагиноза. Измененной оказалась и реакция на стимуляцию секреторными продуктами вагинальных микросимбионтов. Так, взаимодействие с су-пернатантом лактобацилл вызывало умеренное усиление экспрессии цитокинов, которое значительно превосходило практически отсутствующую реакцию на секреторные продукты S.aureus. Эпителиоциты, полученные при нормоценозе, демонстрировали диаметрально противоположную реакцию - практически не реагировали на экзоме-таболиты лактобацилл, и бурно на S.aureus. Обнаруженные особенности отчасти объясняют снижение колонизационной резистентности при бактериальном вагинозе, где ключевая в мукозальном иммунитете влагалища клетка - эпителиоцит (Wira C.R. et all; 2005) утрачивает способность адекватно реагировать на угрозу.

Для подтверждения обнаруженной в условиях in vitro закономерности мы провели сравнительный анализ цитокинового профиля вагинальной жидкости у женщин с нормоценозом влагалища, дефицитом лактобакгерий и бактериальным вагинозом (табл. 3).

Повышеный уровнь IL-ip и IL-8 и пониженный TGF pi наблюдается у пациенток не только в группе с бактериальным вагинозом, но и при дефиците лакгофлоры, не сопровождающимся массивным ростом анаэробной микрофлоры, что подтверждает результаты, полученные ранее.

Таблица 3. Концентрация цитокинов вагинального содержимого в зависимости от состояния микробиоценоза влагалища.

состояние микробиоценоза IL-6 (pg/ml) TNFct (pg/ml) IL-8 (pg/ml) IL-lp (pg/ml) TGF pi (ng/ml)

нормоценоз (п=12) 21,3±5,1 2,7±0,9 366±69 32,9±10,1 8,7±0,6

дефицит лактобак-терий (п=9) 52,9±11,0* 1,7±0,6 792±114* 434±217* 4,6±0,3*

бактериальный ва-гиноз (п=16) 39,8±21,4 2,1±0,8 780±101* 480±274* 4,9±0,4*

Примечание: *р<0,05 - достоверные различия при сравнении с группой «нор-моценоз»

Суммируя данные по влиянию микросимбионтов на продукцию эпителиощггами цитокинов, следует отметить, что лактобактерии, составляющие подавляющее большинство микросимбионтов в условиях нормоценоза, поддерживают умеренную цитокиновую реакцию эпи-телиоцитов, а их утрата, или частичное замещение ассоциативными симбионтами вызывает резкое возбуждение клеток макроорганизма, проявляющееся в многократном усилении экспрессии цитокинов про-воспалительной направленности. Наиболее чувствительно на изменения в микробиоценозе влагалища реагирует уровень 1Ь-1р, что позволяет рассматривать его в качестве маркера дисбиотических состояний женского репродуктивного тракта. Эпителиоциты, сформировавшиеся в условиях патоценоза, демонстрируют повышенный уровень базовой секреции цитокинов провоспалительной направленности, при

этом они утрачивают способность значимо изменять продукцию ци-токинов, адекватно взаимодействуя с микросимбионтами.

Не исключено, что концентрация цитокинов в вагинальном биотопе, демонстрирующая динамичные высокоамплитудные изменения, может оказывать влияние на вагинальные микросимбионты, регулируя состояние микробиоценоза влагалища. В связи с этим, мы изучили влияние цитокинов в концентрациях, характерных для нормо- и патоценозов влагалища на ростовые свойства вагинальных микросимбионтов (рис.8).

Рис. 8 Влияние IL-1 (3 на ростовые свойства вагинальных микросимбионтов (в % по отношению к контролю)

*- р<0,05 - достоверные различия при сравнении с влиянием концентраций IL-lp, характерных для нормоценоза

Влияние IL-1 р на свойства вагинальных микросимбионтов было дифференцированным и дозозависимым. Умеренные концентрации IL-ip, характерные для нормоценоза, стимулировали ростовые свойства лактобацилл и коринебактерий (рис. 8) и угнетали у S.aureus и E.coli. Влияние IL-ip в концентрациях, фиксируемых при бактериальном вагинозе, было диаметрально противоположным. С возрастанием концентрации цитокина (рис. 8) стимуляция ростовых свойств

доминантного вагинального симбионта - лактобацилл становилась менее выраженной, а затем и вовсе сменилась дозозависимым угнетением. В отношении S.aureus и E.coli напротив подавление ростовых свойств сменялись стимуляцией.

Влияние IL-6 и IL-8 на вагинальные микросимбионты было аналогичным и выражалось для концентраций, характерных для нормо-ценоза, в стимуляции роста лакто- и коринебактерий и подавлении ростовых свойств и способности к биопленкообразованию S.aureus и E.coli. В концентрациях, характерных для патоценоза, подавляющее влияние, на свойства S. aureus и Е. coli усиливалось, но сопровождалось угнетением ростовых свойств лакто- и коринебактерий. Влияние TGF ßl на свойства доминантных и ассоциативных микросимбионтов было однонаправлено стимулирующим и не зависело от концентрации.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что провоспа-лительные цигокины способны оказывать дифференцированное дозо-зависимое влияние на ростовые свойства и биопленкообразование вагинальных микросимбионтов. В концентрациях, характерных для нормоценоза, их действие выражалось в стимуляции ростовых свойств лактобацилл и коринебактерий, и подавлении роста S.aureus и Ecoli как в планктонной, так и биопленочной культуре. Концентрации, свойственные вагинальному дисбиозу, напротив, приводили к подавлению роста лактобацилл, сопровождающемуся, в случае с IL-lß стимуляцией ростовых свойств и биопленкообразования S.aureus и E.coli.

Сведения о дифференцированном дозозависимом влиянии про-воспалительных цитокинов на свойства вагинальных микросимбионтов позволяют рассматривать изменение цитокинового профиля в качестве механизма формирования микробиоценоза влагалища в норме и при патологии.

Обобщая полученные данные, мы провели сравнительный анализ эпителиально-бактериальных взаимодействий в двух устойчивых типах вагинального биоценоза — нормоценозе и бактериальном ваги-нозе.

Таблица 4 Сравнительная характеристика эпителиально-бактериальных взаимодействий при нормоценозе и бактериальном вагинозе

Нормоценоз Бактериальный вагиноз

Взаимодействие вагинальных эпителиоцитов с доминантными микросимбион-— '--К" тами

Усиление ростовых свойств перехись проецирующих лактобацилл Угнетение ростовых свойств перикись продуцирующих лактобацилл

Усиление антагонистической активности лактобацилл Не оказывает значимого влияния на антагонизм лактобацилл

Взаимодействие вагинальных эпителиоцитов с ассоциативными микросимбион- : ... ';,■: . тами

Угнетение ростовых свойств ассоциан-тов Умеренное угнетение ростовых свойств ассоциантов

Снижение способности ассоциантов к образованию биопленок Повышение способности ассоциантов к образованию биопленок

Снижение антагонистической активности ассоциантов Отсутствие значимого влияния на антагонизм ассоциантов

Исходное состояние знителиоцита . ■

Умеренная базовая экспрессия цито-кинов провоспалительной направленности Повышенный уровень базовой экспрессии провоспалительных цитокинов

Изменение функционального состояния эпнгелиоцитов в результате взаимодействия с' доминантными микросимбионтами

Умеренная стимуляция экспрессии ци-токинов Выраженная стимуляция экспрессии цитокинов

Изменение функционального состояния эпителиоцитов в результате взаймодей-, ствия с ассоциативными микросимбионтами

Значительное усиление синтеза цито-кинов эпителиоцитами Продукция эпителиоцитами цитокинов значимо не изменяется

Концентрация провосп£шител£.ных цитокинов в вагинальной жидкости

Умеренная Высокая

Влияние присущей типу биоценоза концентрации цитокинов на ростовьге свойства доминантных микросимбионтов

Стимуляция ростовых свойств Подавление ростовых свойств

Влияние присущей типу биоценоза концентрации цитокинов на ростовые свойства ассоциативных микросимбиоптов

Подавление ростовых свойств Стимуляция ростовых свойств

Если попытаться суммировать все вышеизложенное, то эпителиально-бактериальные взаимодействия в условиях нормоценоза влагалища представляются следующим образом. Вагинальный эпителио-цит, сформировавшийся в условиях благоприятного микроокружения (подавляющее преобладание лактофлоры) дифференцированно влияет на свойства микросимбионтов, стимулируя ростовые свойства и антагонизм доминантов и подавляя указанные свойства у ассоциантов. Создаваемые селективные преимущества определяют высокую удельную долю лактобацилл в вагинальном биоценозе, что оказывается выгодно для функционального состояния эпителиоцита. Ввиду высокой удельной доли доминантов, суммарная продукция цитокинов эпителиальными клетками остается умеренной (рис.9), что позволяет эпителиоцитам сохранять функциональный резерв, реализуемый при встрече с патогенами, когда запуск воспалительной реакции абсолютно оправдан.

Рис. 9. Схема эпителиально-бактериальных взаимодействий в условиях нормоценоза влагалища

Создаваемая умеренная концентрация цитокинов (рис. 9) оказывает стимулирующее влияние на ростовые свойства доминантных, микросимбионтов и подавляющее - на ростовые свойства и способ-

ность к биопленкообразованию ассоциативных, что также способствует доминированию в вагинальном биотопе лакгобацилл.

По иному складываются эпителиально-бактериальные взаимодействия в условиях бактериального вагиноза. Эпителиоциты, сформировавшиеся в патологическом микроокружении, подавляют рост "Н2О2+" биоваров лактобактерий, тормозят рост ассоциантов, стимулируя при этом их способность к биопленкообразованию. Удельная доля в вагинальном биотопе лакгобацилл резко падает. Эпителиальные клетки остаются в окружении ассоциантов, взаимодействие с которыми вызывает многократное усиление экспрессии эпителиоцитами провоспалительных цитокинов. Высокий уровень цитокинов оказывается дополнительным прессингом для лактофлоры, и стимулятором для патогенной и условно-патогенной микрофлоры. В результате чего патологическое микроокружение сохраняется и продолжает влиять на формирование эпителиоцитов с извращенным типом реакции на микросимбионтов. Возникает порочный круг, определяющий устойчивость этого типа патоценоза. Приведенные данные свидетельствуют о ключевой роли эпителиально-бактериальных взаимодействий в формировании или поддержании вагинального микробиоценоза.

В дальнейшем мы попытались найти ответ на вопрос: существует ли связь состояния микробиоценоза репродуктивного тракта с функцией репродуктивной системы в целом? Для этого был проведен сравнительный анализ микроэкологического состояния биотопов репродуктивного тракта у женщин с оппозитными результатами экстракорпорального оплодотворения. ЭКО было выбрано в качестве модели для изучения влияния на возможность реализации репродуктивной функции, в связи с гарантированным исключением при нем других причин инфертильности.

Результаты микробиологического исследования, выполненного в цикле, предшествующем стимуляции суперовуляции, показали, что состояние пациенток обеих групп соответствовало требованиям, предъявляемым к участникам программ вспомогательных репродуктивных технологий, подразумевающим отсутствие инфекций, передаваемых половым путем, и неспецифических воспалительных заболеваний репродуктивного тракта. Сравнительный анализ микрофлоры влагалища в группах с оппозитными исходами ЭКО выявил, что со-

стояние микрофлоры влагалища женщин, попытка ЭКО которых завершилась неудачей, характеризовалось относительным дефицитом лактофлоры 4.1±0.2 ^ КОЕ/мл против 5.4±0.2 ^ КОЕ/мл в подгруппе женщин с благоприятным исходом ЭКО (р=0.03), при этом достоверных отличий в обсемененности условно патогенными микроорганизмами или их видовой характеристики не наблюдалось.

При ретроспективном анализе содержания цитокинов в вагинальном содержимом женщин, оппозитных по исходам ЭКО, установлено, что отсутствие беременности сопряжено с более высоким уровнем 1Ь-8, 1Ь-1р и ЮТа (табл. 5), что отражает общую провоспа-лительную настроенность.

Таблица 5. Концентрация цитокинов в вагинальном содержимом

Результат ЭКО позитивный (п= 26) Результат ЭКО негативный (п=28)

1Ь -6 (р^ш1) 43,0±12,0 47,3±9,4

ТОРа (ри/т1) 1,0±0,3 4,5±1,0 *

1Ь-8 (р^т1) 557,0±89,7 854,6±84,1*

П.-1Р (р§/т1) 41,3±10,3 321,1±118,2*

Примечание: *р<0,05 - достоверная разница между группами.

Наступление в результате ЭКО беременности имело прямую связь с показателем микробной обсемененности влагалища лактобак-териями (г=0.50, р<0.05) и обратную связь с концентрацией в вагинальном содержимом 1Ь-1Р (г=-0.52, р<0.05), 1Ь-8 (г=-0.36, р<0.05), Т№чх (г =-0.41, р<0.05).

Полученные результаты позволяют связать неблагоприятный исход ЭКО со следующими факторами, отражающими микроэкологическое состояние нижних отделов репродуктивного тракта:

-снижением микробной обсемененности влагалища лактобакте-риями;

- повышенным уровнем ТИРа, 1Ь -1р и 1Ь -8 в вагинальном содержимом.

Связь исходов ЭКО с микробной обсемененностью влагалища доминантным микросимбионтом - лактобактериями свидетельствует о значимости микробиоты репродуктивного тракта женщин для реализации фертильной функции макросимбионта, что с позиции биоло-

гической целесообразности понятно и оправдано, так как возможность развития и рождения плода в условиях нормобиоценоза обеспечивает становление нормальной микрофлоры новорожденного (Orrhage К, Nord С.Е., 1999), и препятствует возникновению осложнений беременности и родов.

Выявленные отличия уровня цитокинов вагинальной жидкости женщин, оппозитных по фертильности в программе ЭКО, свидетельствуют либо о влиянии цитокинов нижних отделов репродуктивного тракта на процесс имплантации, либо о том, что изменения, происходящие в цитокиновом профиле вагинального содержимого, являются отражением процессов, происходящих в цитокиновой системе всего репродуктивного тракта. Но совершенно очевидно, что уровень цитокинов вагинальной жидкости может служить прогностическим критерием готовности макроорганизма к возникновению беременности.

С другой стороны, связь неудачных исходов ЭКО с повышенным уровнем цитокинов вагинальной жидкости указывает на значимость нормального уровня цитокинов нижних отделов репродуктивного тракта для возникновения беременности, и открывает перспективы поиска терапевтических воздействий, способных прямо или косвенно снижать уровень провоспалительных цитокинов в вагинальном биотопе, нормализуя микроэкологическое состояние репродуктивного тракта.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о влиянии состояния микробиоценоза и цитокинового профиля вагинального биотопа на фертильность, и обуславливают необходимость изучения факторов, определяющих микроэкологическое состояние репродуктивного тракта женщин.

Учитывая вышеизложенное, мы предприняли попытку выявить микробные факторы, определяющие цитокиновый профиль нижних отделов репродуктивного тракта женщин. Для этого было проведено сопоставление уровня TNFa, IL-ip, IL-6 и IL-8 вагинального содержимого с состоянием микрофлоры влагалища и цервикального канала, а также наличием инфекций, передаваемых половым путем.

Повышенный уровень цитокинов был отмечен как при наличии патогенов, передаваемых половым путем, что было вполне ожидаемым, так и при дисбалансе нормальной микрофлоры влагалища. При-

чем дефицит доминантного вагинального микросимбионта - лактоба-цилл оказался фактором, более значимым для повышения уровня 1Ь-1Р, чем наличие И111111 (табл. 6). Корреляционный анализ позволил выявить обратную связь между показателем микробной обсеменен-ности влагалища лакгобактериями и концентрацией в вагинальном лаваже (г = -0.69, р<0.05), 1Ь-8 (г = -0.48, р<0.05), прямую зависимость уровня 1Ь-1р (г=0.64,р<0.05) от микробной обсемененности влагалища условно-патогенными микроорганизмами.

Таблица б.Концентрация цитокинов вагинального содержимого в зависимости от состояния микробиоценоза влагалища и цервикального канала.

состояние микробиоценоза 1Ь-6 (Р8/т1) тага (РЯЛШ) 1Ь-8 (Р8/т1) 1Ь-1Р

нормоценоз(п= 12) 21,3±5,1 2,7±0,9 366,0±69,1 32,9±10,1

дефицит лактобактерий (п=9) 52,9±11,0* 1,7±0,б 792,6±114,6* 434,8±217,2*

бактериальный вагиноз(п=16) 39,8±21,4 2,1±0,8 780,3±101,8* 480,6±274,7*

трихомониаз (п=6) 56,5±15,6* 6,7±3,2 1244,6±12,7* 237,9±102,6*

хламидиоз (п=8) 69,4±12,9* б,9±1,7* 1090,6±113,8* 55,0±11,3

хламидиоз в сочетании с дефицитом лактобактерий (п=10) 126,9±37,7* 8,1±1,8* 986,9+97,5* 325,4±131,6*

уреаплазмоз (п=б) 16,8±0,8 0,4±0,1 949,7±9,1* 37,8±1,5

уреаплазмоз в сочетании с дефицитом лактобактерий (п=8) 15,6±1,2 2,5±1,7 981,1±189,3* 87,6±21,1*

трихомониаз в сочетании с хламидиозом и дефицитом лактобактерий (п=6) 83,4±12,7* 13,6±2,6* 1204,5±72,7* 392,3±115,1*

уреаплазмоз в сочетании с хламидиозом и дефицитом лактобактерий (п=7) 178,4±91,1* 12,0±3,6* 1027,6±219,0* 625,4±284,7*

Примечание: *р<0,05 - достоверные различия при сравнении с группой «нор-моценоз»

Сравнительный анализ цитокинового профиля вагинальной жидкости среди пациенток с наличием ИППП также продемонстрировал роль доминантной микрофлоры в сдерживании бурной цитокиновой реакции. Так сочетание ИППП с дефицитом лактофлоры приводило (табл.6) к достоверному повышению уровня IL-ip с 55,0±11,3 пг/мл при изолированном хламидиозе до 325,4±131,6 пг/мл при сочетании хламидиоза с дефицитом лактобакгерий, и с 37,8±1,5 пг/мл при уреа-плазмозе до 87,6±21,1 пг/мл при уреаплазмозе, протекающем на фоне дефицита лактобакгерий. Это свидетельствует о том, что дефицит лактобакгерий, выступающих в роли доминантного вагинального микросимбионта, является фактором, оказывающим значительное влияние на повышение уровня провоспалительных цитокинов в нижних отделах репродуктивного тракта женщин.

Таким образом, на этом этапе исследования нам удалось выяснить

что:

— Факторами, способствующими повышению уровня провоспалительных цитокинов в вагинальном содержимом являются наравне с инфекциями, передаваемыми половым путем, дисбиотические состояния нижних отделов репродуктивного тракта.

— Сочетание ИППП с дисбиотическими состояниями нижних отделов женского репродуктивного тракта приводит к дополнительному повышению уровня провоспалительных цитокинов в вагинальной жидкости.

— Дефицит доминантного вагинального микросимбионта - лактобакгерий сопровождается многократным повышением концентрации IL-lp в вагинальном содержимом.

На следующем этапе нашего исследования мы рассмотрели с позиции эпителиально-бактериальных взаимодействий интравагиналь-ную терапию пробиотическими штаммами лакгобацилл, применяемую для восстановления нормальной микрофлоры женского репродуктивного тракта. При этом мы преследовали две цели: получить данные, подтверждающие ключевую роль в формировании микробиоценоза эпителиально-бактериальных взаимодействий; и, используя ранее полученные сведения, разработать подходы к повышению эффективности пробиотической терапии.

Для этого мы изучили характер взаимодействия вагинальных эпителиоцитов и штаммов лактобактерий, полученных из того же биотопа (аутоштаммы) при нормоценозе. Оказалось, что внеклеточные секреторные продукты эпителиоцитов, полученных из того же биотопа, в 100% случаев стимулировали прирост аутоштамма. Гете-роштаммы лактобактерий реагировали на аналогичное воздействие, как усилением, так и торможением скорости прироста.

Попытка выявить зависимость направленности влияния секреторных продуктов эпителиоцитов на ростовые свойства штаммов лактобактерий от их видовой принадлежности или наличия и выраженности способности продуцировать перекись водорода, считающиеся с антропоцентристских позиций наиболее экологически привлекательными, показала, что характер влияния эпителиоцитов на ростовые свойства лактобактерий не связан с этими параметрами..

Таким образом, было выявлено, что стимуляция роста аутоштам-мов доминантной микрофлоры, является характерной особенностью эпителиально-бактериальных взаимодействий в реально существующих нормоценозах.

Ориентируясь на это, мы попытались оценить зависимость "приживления" пробиотика от результата влияния вагинальных эпителиоцитов пациентки на ростовые свойства пробиотического штамма. Для этого у пациенток с выраженным дефицитом лактофлоры до проведения стандартной интравагинальной пробиотической терапии получали вагинальные эпителиоциты и изучали их влияние на ростовые свойства пробиотического штамма. Затем сравнивали эффективность терапии в группах, сформированных в соответствии с характером влияния эпителиоцитов на рост пробиотического штамма.

При сравнении эффективности пробиотической терапии через неделю после завершения лечения было выявлено, что у пациенток, вагинальные эпителиоциты которых стимулировали ростовые свойства пробиотического штамма лактобактерий, в 85,7% случаев происходило восстановление обсемененности влагалища лактофлорой (рис. 10), у оставшихся (14,3%) также наблюдалось увеличение показателя микробной обсемененности влагалища лактобактериями, но не превышающее 105 КОЕ/мл. В случае если эпителиоциты влияли на рост пробиотического штамма индифферентно, восстановление лакгофло-

ры наблюдалось только в 16,7% случаев, и не происходило вовсе в случае подавляющего влияния эпителиоцитов на рост пробиотика.

Я ПМО лактобактерий 231д КОЕ/мл Ш ПМО лактобактерий - 4 !д КОЕ/мл В ПМО лактобактерий - 51д КОЕ/мл □ ПМО лактобактерий > 61д КОЕ/мл Рис 10. Обсемененность влагалища лактобактериями на 7 сутки после завершения прсбиотической терапии.

Микрофлора половых путей женщины находится под воздействием циклически изменяющихся параметров существования и способность адаптироваться к этим постоянным изменениям является обязательным условием для сохранения нормофлоры влагалища. В связи с этим, мы оценили обсемененность влагалища лактофлорой вторично - в первой фазе следующего за пробиотической терапией менструального цикла. По прошествии одного менструального цикла ситуация несколько ухудшилась при сохранении прежней тенденции: нормальное количество лактобактерий было зафиксировано лишь в группе пациенток, вагинальные эпителиоциты которых стимулировали ростовые свойства пробиотического штамма лактобактерий, хотя, доля таких пациенток снизилась с 85,7% до 64,3%. Это происходило за счет увеличения количества женщин с умеренным дефицитом лак-тофлоры. Выраженного дефицита нормофлоры не было зафиксировано ни у одной женщины в этой группе. Напротив, у лиц третьей

группы в течение одного менструального цикла эффект пробиотиче-ской терапии был полностью нивелирован и количество лактобакте-рий вернулось к прежнему уровню.

Из представленных данных следует, что эффективность пробио-тической терапии зависит от характера эпителиально-бактериальных взаимодействий вагинальных эпителиоцитов с пробиотическим штаммом, что в условиях in vivo подтверждает возможность использования результирующей эпителиально-бактериальных взаимодействий в качестве критерия автохтонности, и свидетельствует о необходимости предварительного определения индивидуальной совместимости пробиотического штамма и клеток макроорганизма.

Параллельно, с целью подтверждения в условиях in vivo значимости эпителиально-бактериальных взаимодействий для модуляции параметров мукозального иммунитета, в процессе интравагинальной пробиотической терапии было изучено исходное состояние и динамика показателей мукозального иммунитета влагалища.

При сравнительном анализе исходного состояния мукозального иммунитета вагинального биотопа в группах пациенток с оппозитной эффективностью пробиотической терапии были выявлены следующие различия. Для исходного состояния мукозального иммунитета пациенток с успешным результатом пробиотической терапии были характерны достоверно более высокие концентрации slg А и лактоферрина и более низкие концентрации провоспалительного цитокина ILip (табл.7). Показатель отношения ralLl/ILip, характеризующий вероятность блокирования провоспалительного потенциала IL1[3, был выше, а коэффициенты IL1(3/IL4, INFy/IL4, ILlp/TGFpi, характеризующие соотношение цитокинов провоспалительной и противовоспалительной направленности, были достоверно ниже в этой группе. Перечисленные различия свидетельствуют о том, что в группе пациенток с успешным восстановлением лактофлоры, исходное состояние мукозального иммунитета влагалища имело меньший провоспалительный тренд, при этом обладая высоким уровнем факторов защиты (slgA, лактоферрин), то есть характеризовалось меньшей глубиной микроэкологических нарушений.

Таблица 7. Характеристика исходного состояния мукозапьного иммунитета влагалища у пациенток с оппозитным результатом пробио-тической терапии.

Концентрация в вагинальном лаваже: Пробиотическая терапия

эффективна не достаточно эффективна не эффективна

1Ь 1 р р£/т1 564,0±44,0 617,7±63,2 902,1±144,0*

га 11Л pg/mI 9283,8±2S6,9 6955,8±235,2 9858,0±338,0

ЮТу pg/ml 40,6±0,6 42,2±0,3 44,2±1,0

ТвБ 31 пй/Ш1 4,9±0,1 5,1±0,2 5,5±0,4

1Ь 4 pg/ml 2,2±1,2 1,3±0,4 1,0±0,2

Лакгоферрин пд/т! 5712,4±35,4 3650,9±87,3* 866,4±139,4*

А mkg/ml 19,3±0,2 12,6±0,7* 10,1±1,7*

га 1ЫЛЬ 1Р 17 11,1* 11*

1Ь 1Р / 1Ь 4 256 464* 902*

ЮТу/ 1Ь 4 18 31,6* 44*

11Лр/ТОРр1 116 120 163*

Примечание: *р<0,05 — достоверная разница при сравнении с 1 группой.

Оценка связи успешности пробиотической терапии с исходным состоянием мукозального иммунитета выявила достоверные положительные корреляции с уровнем лактоферрина (г=0,935; р=0,001), э^А (г=0,612; р=0,045), отрицательные с 11Лр (г=-0,575; р=0,051), 1ЫрЛ£4 (г=-0,799; р=0,016), ЮТу/1Ь4 (г=-0,698; р=0,031), 1ЫрЯОРр1 (г=-0,597; р=0,049). Данные о том, что высокий уровень провоспалитель-ных цитокинов препятствует восстановлению нормоценоза, могут быть объяснены способностью лакгобактерий изменять ростовые свойства под влиянием провоспалительных цитокинов, в частности 1Ыр, при этом низкие концентрации цитокина оказывают стимулирующее воздействие, а высокие - подавляющее. Поэтому у пациенток с высоким уровнем 1Ыр лактобациллы не могли нарастить биомассу и успешно колонизировать вагинальный биотоп и оказывались в роли транзиторных микроорганизмов.

Изучение динамики показателей мукозального иммунитета влагалища в группах с оппозитным результатом интравагинальной про-

биотической терапии выявило различия, как по интенсивности, так и по направленности изменений изучаемых показателей (табл. 8).

Таблица 8. Характеристика состояния мукозального иммунитета влагалища в группах пациенток с оппозитным результатом пробиотиче-ской терапии.

Концентрация в вагинальном лаваже: Пробиотическая терапия

эффективна не эффективна

до после до после

1Ь 1 Р РЙ/Ш1 564,0±44,0 233,4±65,4** 902,1±144,0 * 572,3±92,3**

га11Л р^т1 9283,8±286,9 7259,2±199,6 9858,0±338,0 8546,1±265,8

ЮТу р^т! 40,6±0,6 19,2±0,6** 44,2±1,0 42,3±0,8

ТСБ Р1 п^т! 4,9±0,1 8,68±0,6** 5,5±0,4 4,6±0,3

1Ь 4 Рй/т1 2,2±1,2 1,2±0,4 1,0±0,2 1,1±0,3

Лактоферрин пй/т! 5712,4±35,4 1087,4±132,2** 866,4±139,4* 4664,6±98,6**

Б А ткд/т! 19,3±0,2 4,5±0,4** 10,1±1,7* 16,5±1,1**

гаИЛЛЬ 1Р 17 31** 11* 15

ИЛР/1Ь4 256 201** 902* 506**

ЮТу/1Ь4 18 16 44* 37

1ЫР/ТОРР1 116 27** 163* 124

Примечание: *р<0,05 - достоверная разница при сравнении с 1 группой.

**р<0,05 - достоверная разница при сравнении по сравнению с исходными данными.

В группе эффективной пробиотикотерапии динамику параметров мукозального иммунитета характеризовало снижение концентрации цитокинов провоспалительной направленности- 1ЫР и ШБу на фоне повышения уровня ТСР01, обладающего противовоспалительным эффектом. При этом наблюдалось закономерное увеличение отношения гаИЛЛЫР, и снижение коэффициентов 11ЛРЛЬ4, 1Ыр/ТОРр1, что свидетельствует о противовоспалительном тренде в состоянии мукозального иммунитета влагалища. Это сопровождалось достоверным снижением уровня секреторного иммуноглобулина А и лактоферрина (табл.8). Явный противовоспалительный тренд, наблюдаемый при восстановлении нормоценоза, объясняется особенностями эпителиально-бактериальных взаимодействий в вагинальном био-

топе. В результате пробиотической терапии на смену "резко раздражающему" влиянию условно-патогенных микроорганизмов пришло преобладание "мягко стимулирующего" влияния лактобактерий. Снижение уровня в^А и лактоферрина, наблюдаемое у обследованных в этой группе, вероятно можно оценить, как ответ на восстановление бактериальной составляющей колонизационной резистентности влагалища, что позволяет макроорганизму снизить компенсаторно-повышенный уровень продукции этих защитных факторов.

В результате пробиотической терапии, не увенчавшейся восстановлением лактофлоры, также наблюдались изменения мукозального иммунитета. Аналогично первой группе происходило снижение концентрации 1Ыр (табл.8), при этом она достигла уровня, равного исходному в первой группе, однако при этом снижалась и концентрация ТвБр 1, что в совокупности не позволило значимо изменить соотношение про/противовоспалительных цитокинов. Тенденция изменения уровня э^А и лактоферрина была противоположна первой группе -уровень этих факторов возрастал, приближаясь к исходным показателям группы, пробиотическая терапия в которой была успешной. Таким образом, в группе пациенток, пробиотическая терапия у которых не достигла эффекта, наблюдалось повышение уровня факторов колонизационной резистентности, снижение концентрации про- и противовоспалительных цитокинов при сохранении их соотношения, что в совокупности свидетельствовало о снижении степени микроэкологических нарушений. Несмотря на отсутствие внешнего эффекта (восстановление нормоценоза) в этой группе произошли значимые изменения, повышающие защиту полового тракта от инфекции. Тот факт, что в результате проведенной терапии состояние мукозального иммунитета приблизилось к исходному уровню группы успешной пробиотической терапии, позволяет рассчитывать, что желаемый эффект у пациенток с выраженными микроэкологическими нарушениями может быть достигнут при пролонгации курса интравагинальной терапии пробиотиками.

Полученные данные свидетельствуют о том, что пробиотические штаммы лактобацилл оказывают влияние противовоспалительной направленности на состояние мукозального иммунитета нижних отделов женского репродуктивного тракта; выраженные микроэкологиче-

ские нарушения, проявляющиеся в высоком уровне провоспалитель-ных цитокинов и низких значениях slgA и лактоферрина препятствуют колонизации лактобацилл.

Таким образом, на этом этапе исследования в условиях in vivo было получено доказательство ключевой роли эпителиально-бактериальных взаимодействий в формировании микробиоценозов, подтверждена возможность использования результирующей эпителиально-бактериальных взаимодействий в качестве критерия автохтон-ности микрофлоры, показана возможность направленной модуляции параметров мукозального иммунитета пробиотиками и разработан способ индивидуального подбора пробиотического штамма для эффективной пробиотической терапии, основанный на оценке эпителиально-бактериальных взаимодействий (Положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2012136487).

В заключение, обобщая полученный материал, следует выделить три основных момента:

- бактериально-эпителиальные взаимодействия - рехуляторная основа ассоциативного симбиоза женского репродуктивного тракта, определяющая его колонизационную резистентность при инфекции;

- микробный фактор вкупе с цитокиновым "зеркалом" вагинальных эпителиоцитов важнейший инфектологический механизм функционирования женской репродуктивной системы;

- бактериально-эпителиальные взаимодействия - методический ключ распознавания автохтонной и аллохтонной микрофлоры, позволяющий индивидуализировать подбор пробиотика для купирования вагинального дисбиоза.

Выводы

1. Мукозальные эпителиоциты влагалища в условиях нормобиоце-ноза оказывают дифференцированное воздействие на ростовые свойства, биопленкообразование и антагонистическую активность вагинальных микросимбионтов, определяя селективные преимущества для микрофлоры вагинального биотопа.

2. Бактериально-эпителиальные взаимодействия при бактериальном вагинозе направлены на угнетение роста лактобактерий (преимущественно биоваров, продуцирующих перекись водорода) и стимуляцию способности к биопленкообразованию ассоциативных микроорганизмов, определяя формирование и устойчивость патомикробиоценоза при бактериальном вагинозе.

3. Доминантные вагинальные микросимбионты синергидно взаимодействуют с мукозальными эпителиоцитами влагалища, формируя колонизационную резистентность биотопа.

4. Стимулирующее влияние экзометаболитов вагинальных эпиге-лиоцитов женщин на ростовые свойства пробиотического штамма способствует успешному восстановлению нормофлоры влагалища.

5. Экспериментально установлено изменение продукции цитокинов вагинальными эпителиоцитами при взаимодействии с микрофлорой: Е coli и S. aureus приводят к их выраженной экспрессии провоспали-тельных цитокинов, тогда как лактобациллы и коринебалктерии вызывают умеренную стимуляцию продукции цитокинов.

6.Цитокины провоспалительной направленности, экспрессируемые эпителиоцитами, способны оказывать дифференцированное дозозави-симое влияние на ростовые свойства вагинальных микросимбионтов. В концентрациях, характерных для нормоценоза, происходит стимуляция свойств лактобацилл и коринебактерий, и подавление роста S.aureus и E.coli. Цитокины в концентрациях, свойственных бактериальному вагинозу, напротив, угнетают ростовые свойства лактобацилл, стимулируя (в случае с IL-lß и IL-8) S.aureus и E.coli.

7. При определении связи состояния микробиоценоза с цитокино-вым профилем вагинального биотопа, выявлена корреляция высокого

уровня 1Ь-1р с дефицитом лактофлоры, что позволяет рассматривать 1Ь-1р в качестве маркера дисбиотических состояний.

8. Выявлена связь микроэкологического состояния вагинального биотопа с фертильностью женского организма (на примере экстракорпорального оплодотворения). Неудачи ЭКО коррелировали с дефицитом лактобацилл и высоким уровнем провоспалительных цито-кинов.

9. Интравагинальная терапия пробиотическими штаммами лактобак-терий оказывает влияние на состояние мукозального иммунитета нижних отделов женского репродуктивного тракта, выражающееся в противовоспалительном тренде баланса цитокинов.

10. Эффективность восстановления нормофлоры в результате ин-травагинальной пробиотической терапии зависит от тяжести исходных изменений местного иммунитета, она прямо пропорциональна уровню факторов защиты (э^А, лактоферрин) и обратно пропорциональна степени провоспалительного тренда.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в журналах,рекомендованных ВАК

1. Кремлева Е.А., Константинова О.Д., Черкасов C.B. Микроэкологическое состояние вагинального биотопа пациенток, оппозитных по фертильности в программе ЭКО // Медицинский альманах, 2010, №4 (13), С. 95-97. ^1 : ; 1 '

2. Кремлева Е.А., Черкасов Ç.B., Бухарин О.В. Влияние микробно-эпителиальных взаимодействий на биологические характеристики вагинальной микрофлоры // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии, 2011, №2, С.53-57.

3. Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Черкасов C.B. Особенности эпители-ально-бакгериальных взаимодействий при бактериальном вагинозе. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии, 2012, №

3. С.3-8.

4. Кремлева Е.А., Черкасов C.B., Константинова О.Д. Характеристика уровня цитокинов и состояния микробиоценоза репродуктивного тракта женщин с бесплодием // Российский вестник акушера-гинеколога, 2012, Т 12, № 3, С.11-15.

5. Кремлева Е.А., Черкасов C.B. Продукция цитокинов вагинальными эпителиоцитами в процессе взаимодействия с доминантными и ассоциативными микросимбионтами // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии, 2012, № 4, С. 114-118.

6. Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Сгибнев A.B. Роль ассоциативных микросимбионтов в функционировании ассоциативного симбиоза // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии, 2012, №

6. С.89-95.

7. Кремлева Е.А., Черкасов C.B., Бухарин О.В. Эпителиально-бактериальные взаимодействия как основа формирования микробиоценоза // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии, 2012, №6, С. 95-99.

8. Кремлева Е.А., Константинова О.Д. Индивидуальный подбор про-биотика для эффективной интравагинальной пробиотической терапии // Лечение и профилактика, 2013,2 (6), С.32-35.

9. Кремлева Е.А., Бухарин О.В. Влияние IL-lp на ростовые свойства вагинальных микросимбионтов // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии, 2013, №4, С.65-69.

10. Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Сгибнев А.В., Черкасов C.B. Участие доминантной микрофлоры в механизмах защиты вагинального биотопа женщин // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии, 2013, № 6, С.100-104.

11. Кремлева Е. А., Константинова О.Д. Состояние мукозального иммунитета влагалища при интравагинальной пробиотической терапии // Медицинский альманах, 2013, № 6(30), С.93-96.

Публикации в других изданиях:

12. Кремлева E.À., Черкасов C.B. Влияние вагинальных эпителиоци-тов на микроорганизмы, выделенные из влагалища // Материалы 2 Международного конгресса по пробиотикам «Санкт-Петербург - Про-биотики -2009», 2009 г., С. М20.

13. Кремлева Е.А., Черкасов C.B. Изменение ростовых свойств бактерий при контакте с вагинальными эпителиоцитами // Материалы международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», Санкт-Петербург, 2010, С. 121.

Патенты:

14. Кремлева Е.А., Черкасов C.B., Бухарин О.В. Способ определения влияния вагинальных эпителиоцитов на биологические свойства бактерий (варианты). Патент на изобретение №2458135 опубликован 10.08.20i2 Бюл. № 22

15. Кремлева Е.А., Черкасов C.B., Бухарин О.В. Способ индивидуального подбора препаратов, содержащих пробиотические штаммы лактобактерий, для эффективной интравагинальной терапии Положительное решение о выдаче патента по заявке на изобретение №2012136487. Дата публикации заявки: 20.03.2013 Бюл.№ 8.

Список сокращений

БВ бактериальный вагиноз

ИППП инфекции, передающиеся половым путем

ПМО показатель микробной обсемененности

ФСБ фосфатно-солевой буфер

ЭКО экстракорпоральное оплодотворение

1Ь4 интерлейкин 4

1Ь-6 интерлейкин 6

1Ь-8 интерлейкин 8

1Ь-ф интерлейкин 1 р

ЮТу интерферон гамма

н2о2+ перикисьпродуцирующие биовары

МЛ Ыо(1-подобные рецепторы

А секреторного иммуноглобулина А

га 1Ы рецепторный антагонист интерлейкина 1Р

ТОБ Р1 трансформирующий ростовой фактор Р1

тья толл-подобные рецепторы

ТОТа. фактор некроза опухолей

КРЕМЛЕВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

РОЛЬ ЭПИТЕЛИАЛЬНО-БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В АССОЦИАТИВНОМ СИМБИОЗЕ РЕПРОДУКТИВНОГО ТРАКТА ЖЕНЩИН

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Подписано в печать 19.09.2013 г. Формат А 5. Печать оперативная. Усл. печ. листов -2,0. Зак № 276, Тираж 100 экз. Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии ИП Емельянова И.В. ОВИЛТ «Самарская типография». ИНН 564203296722, 10.10.2013, с. Сакмара, тел: 8 (35331) 22354.

Оригинал изготовлен с помощью текстового редактора Microsoft Word 2003 for Windows.

Гарнитура Times.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора медицинских наук, Кремлева, Елена Александровна, Оренбург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

КРЕМЛЕВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

РОЛЬ ЭПИТЕЛИАЛЬНО-БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В АССОЦИАТИВНОМ СИМБИОЗЕ РЕПРОДУКТИВНОГО

ТРАКТА ЖЕНЩИН

03.02.03 - Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант доктор медицинских наук ЧЕРКАСОВ Сергей Викторович

Оренбург - 2013 г.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ....................................................................... 6

ГЛАВА 1. Микроэкология нижних отделов женского репродуктивного тракта (Обзор литературы).................................... 14

1.1. Микробиоценоз репродуктивного тракта женщин с позиции кон- 14 цепции ассоциативного симбиоза.....................................

1.1.1. Микросимбиоценоз женского репродуктивного тракта......... 14

1.1.2. Доминантные вагинальные микросимбионты..................... 16

1.1.3. Ассоциативные вагинальные микросимбионты........................ 32

1.1.4. Макропартнер в ассоциативном симбиозе женского репродук- 39 тивного тракта.......................................................................

1.2. Факторы, оказывающие влияние на состояние микроэкологии нижних отделов репродуктивного тракта женщин.................. 53

1.3. Микроэкологические нарушения и инфекционные состояния ре- 57 продуктивного тракта женщин.............................................

1.4. Способы коррекции микроэкологического состояния женского репродуктивного тракта................................................... 60

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования............................. 67

2.1. Общие данные..................................................................... 67

2.2. Характеристика штаммов микроорганизмов, методы выделения, 68 идентификации и культивирования......................................

2.3. Методы диагностики инфекций, передаваемых половым путем 71

2.4. Характеристика состояния микросимбиоценоза репродуктивного 73 тракта женщин.............................................................................

2.5. Методы изучения свойств микросимбионтов......................... 74

2.5.1. Метод определения продукции лактобациллами перекиси 74 водорода.......................................................................

2.5.2. Метод определения ростовых свойств микроорганизмов...... 75

2.5.3. Метод определения антагонистической активности микроор 76 ганизмов.....................................................................

2.5.4 Метод изучения способности бактерий образовывать биопленки 78

2.5.5. Методы изучения влияния вагинальных эпителиоцитов на 79 функциональную активность микросимбионтов...................

2.6. Методы изучения вагинальных эпителиоцитов.................. 81

2.6.1. Методы получения вагинальных эпителиоцитов..................... 81

2.6.2. Методы оценки количества и жизнеспособности первичных ва- 82 гинальных эпителиоцитов..................................................

2.6.3. Методы получения эпителиальных экзометаболитов и инакти-вированных эпителиоцитов............................................... 83

2.6.4. Изучение функциональной активности вагинальных эпителио- 83 цитов...........................................................................

2.6.5. Методы изучения влияния микросимбионтов на функциональную активность вагинальных эпителиоцитов..................... 84

2.7. Методы количественного определения цитокинов, рецепторного 85 антагониста интерлейкина 1 и трансформирующего ростового фактора Р1, Э^А, СЗ компонента комплемента и лактоферрина.

2.8. Способ изучения влияния цитокинов на свойства бактерий...... 87

2.9. Методика изучения связи состояния микробиоценоза с цитокино- 87

вым профилем влагалища................................................

2.10. Методика изучения связи исходов экстрокорпорального оплодо- 89 творения с микроэкологическим состоянием биотопов репродуктивного тракта женщин................................................

2.11. Методика изучения взаимодействия мукозальных эпителиоцитов 90 влагалища с ауто- и гетероштаммами лактобацилл..................

2.12. Методика изучения интравагинальной пробиотической терапии. 91

2.13. Методы статистической обработки полученных результатов... ... 93

ГЛАВА 3. Характеристика эпителиально-бактериальных взаимодействий в вагинальном биотопе в норме и при патологии............. 95

3.1. Влияние эпителиально-бактериальных взаимодействий на свойства вагинальных микросимбионтов................................. 96

3.1.1 .Способ определения влияния вагинальных эпителиоцитов на 97 биологические свойства бактерий.....................................

3.1.2. Влияние эпителиально-бактериальных взаимодействий на свой- 100 ства вагинальных микросимбионтов (в условиях нормоценоза)

3.1.3. Влияние эпителиально-бактериальных взаимодействий на свой- 110 ства вагинальных микросимбионтов (в условиях бактериального вагиноза).....................................................................

3.2. Влияние эпителиально-бактериальных взаимодействий на функциональную активность вагинальных эпителиоцитов.............. 120

3.2.1. Влияние эпителиально-бактериальных взаимодействий на 121 функциональную активность вагинальных эпителиоцитов, сформировавшихся в условиях нормоценоза.................................

3.2.2. Влияние эпителиально-бактериальных взаимодействий на 128 функциональную активность вагинальных эпителиоцитов, сформировавшихся в условиях бактериального вагиноза...............

3.3. Влияние цитокинов на свойства вагинальных микросимбион- 134 тов...........................................................................

3.4. Исход эпителиально-бактериальных взаимодействий - как критерий дифференциации автохтонной и аллохтонной микрофлоры 144

3.5. Сравнительная характеристика эпителиально-бактериальных 152 взаимодействий в разных типах вагинального микробиоценоза

ГЛАВА 4. Влияние микроэкологического состояния нижних отделов репродуктивного тракта на функцию женской репродуктивной системы........................................................................................... 158

4.1. Характеристика микроэкологического состояния биотопов репро- 158 дуктивного тракта женщин с оппозитными исходами экстракорпорального оплодотворения.............................................................

4.2. Микроэкологические подходы к прогнозированию успешности 166 реализации репродуктивной функции.........................................

4.3. Связь состояния микробиоценоза и цитокинового статуса нижних 176 отделов женского репродуктивного тракта..................................

ГЛАВА 5. Интравагинальная пробиотическая терапия с позиции эпи-

телиально-бактериальных взаимодействий.................................... 187

5.1. Эпителиально-бактериальные взаимодействия как основа для индивидуального подбора пробиотика................................. 187

5.2. Состояние параметров мукозального иммунитета влагалища при интравагинальной пробиотической терапии................................202

7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................ 213

8. ВЫВОДЫ..................................................................... 234

9. ЛИТЕРАТУРА............................................................... 236

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Интерес к изучению эпителиально-микробных взаимодействий, возросший в последние годы, определяется стратегически важным положением мукозальных эпителиоцитов - на границе внутренней и внешней сред, а также их способностью реагируя на внешние стимулы, участвовать в развитии защитных реакций врожденного и адаптивного иммунитета, в формировании толерантности к комменсалам, а также в развитии патологических процессов.

Большинство исследований в этой области посвящены взаимодействию эпителиоцитов с патогенными микроорганизмами. Накоплены данные о бактериальных модулинах, эпителиальных TLR и NLR рецепторах (Yu L et all, 2009), внутриклеточных сигнальных путях, изменении экспрессии цитокинов, антибактериальных пептидах (McCormick В.А, 2006), способных регулировать локальную иммунную реакцию, обеспечивая защиту от патогенных микроорганизмов.

Изучению эпителиально-микробного взаимодействия с нормофло-рой уделяется значительно меньшее внимание, в основном на примере мукозального иммунитета кишечника. Однако специфичность функций репродуктивного тракта, требующая обеспечения эффективной защиты от потенциальных патогенов, при сохранении толерантности к генетически чужеродной сперме и плоду, не позволяет распространить на него данные, полученные в иных биотопах.

Имеющиеся данные об эпителиально-бактериальных взаимодействиях в женском репродуктивном тракте ограничиваются сведениями о роли эпителиального гликогена в поддержании популяции лактобакте-рий и синтезе эпителиальными клетками отдельных антибактериальных пептидов и цитокинов при взаимодействии с патогенами.

Комплексного изучения взаимодействия вагинальных эпителиоци-тов с представителями доминантной и ассоциативной микрофлоры влагалища не проводилось, поэтому вопрос о роли эпителиально-бактериальных взаимодействий в формировании микробиоценозов и поддержании мукозального иммунитета репродуктивного тракта женщин остается открытым.

Поставленные вопросы лежат в области инфекционной симбиоло-гии, с опорой на концепцию ассоциативного симбиоза с его трехзвенье-вой структурой, включающей хозяина и микрофлору, как доминантную, так и ассоциативную (Бухарин О.В. с соавт., 2007). Если к этому добавить, что инфекция в настоящее время рассматривается как модельная система ассоциативного симбиоза (Бухарин О.В. с соавт., 2009), то становится очевидным, что решение задач по изучению микробно-эпителиальных взаимодействий полностью укладывается в концепцию первых двух векторов хозяин-доминант и хозяин-ассоциант, что актуализирует постановку цели и задач нашей работы.

Цель и задачи исследования

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1.Изучить влияние микробно-эпителиальных взаимодействий на численность и функциональную активность представителей доминантной и ассоциативной микрофлоры влагалища.

2. Определить изменение функциональной активности вагинальных эпителиоцитов (синтез бактерицидных и регуляторных веществ) в ре-

зультате взаимодействия с различными вагинальными микросимбионтами.

3.Дать сравнительную характеристику эпителиально-бактериаль-ных взаимодействий в разных типах вагинальных микробиоценозов.

4. Оценить значение микроэкологического статуса вагинального биотопа для функционального состояния женской репродуктивной системы.

5. Охарактеризовать взаимосвязь мукозального иммунитета с характером микрофлоры влагалища и оценить возможность направленной модуляции параметров мукозального иммунитета пробиотиками.

6.На основе анализа исходов эпителиально-бактериальных взаимодействий обосновать подходы к оценке и коррекции микроэкологического состояния репродуктивного тракта женщин.

Научная новизна

Эпителиально-бактериальные взаимодействия в женском репродуктивном тракте - модельная система ассоциативного симбиоза, являющаяся основой поддержания микроэкологического гомеостаза, механизмы регуляции в которой строятся на закономерностях цитокиновой реакции вагинальных эпителиоцитов на взаимодействие с вагинальной микрофлорой, а также дифференцированном дозозависимом влиянии цитокинов провоспалительной направленности на свойства вагинальных микросимбионтов.

Установлено, что вагинальные эпителиоциты способны дифференцировано влиять на свойства микросимбионтов, формируя определенный тип микробиоценоза. В условиях нормоценоза эпителиоциты оказывают преимущественно стимулирующее влияние на ростовые свойства и антагонизм нормофлоры (лактобактерий и коринебактерий), одновременно подавляя прирост биомассы, способность к биопленкооб-

разованию и антагонистическую активность ассоциативной микрофлоры (S. aureus и Е. coli).

Особенностями эпителиально-бактериальных взаимодействий при бактериальном вагинозе, по сравнению с нормоценозом являются: стимуляция способности к биопленкообразованию ассоциативных микросимбионтов, сопровождающаяся ослаблением подавляющего воздействия на их ростовые свойства, и резкое угнетение прироста биомассы "Н202+" биоваров лактобактерий.

Изучение экспрессии цитокинов вагинальными эпителиоцитами при контакте с вагинальными микросимбионтами выявило выраженное усиление экспрессии провоспалительных цитокинов при взаимодействии с Е. coli и S. aureus, тогда как лактобациллы и коринебактерии вызывали умеренную стимуляцию их продукции.

Выявлено дифференцированное дозозависимое влиянии цитокинов провоспалительной направленности на ростовые свойства вагинальных микросимбионтов. В концентрациях, характерных для нормоценоза, происходит стимуляция свойств лактобацилл и коринебактерий, и подавлении роста S.aureus и E.coli. Концентрации, свойственные БВ, напротив, угнетают прирост биомассы лактобацилл, стимулируя (в случае с IL-lß и IL-8) свойства S.aureus и E.coli.

Установлено, что результирующая эпителиально-бактериаль-ных взаимодействий, выражающаяся в изменении функционального состояния эпителиоцитов и микросимбионтов, может быть использована в качестве критерия дифференциации автохтонной от аллохтонной микрофлоры в условиях женского репродуктивного тракта.

Установлен синергидный характер взаимодействий доминантной микрофлоры с мукозальными эпителиоцитами влагалища, проявляющийся в стимуляции прироста биомассы и антагонизма лактобактерий, и усилении синтеза эпителиоцитами веществ антимикробной направлен-

ности, что в совокупности служит основой поддержания колонизационной резистентности биотопа.

Выявлено, что нарушения микроэкологического состояния вагинального биотопа, проявляющиеся в дефиците доминантных микросимбионтов и повышении уровня провоспалительных цитокинов - одна из причин женской инфертильности, что свидетельствует о роли микробного фактора в регуляции гомеостаза хозяина и функционировании репродуктивной системы

В условиях in vivo продемонстрирована значимость нормофлоры влагалища для состояния цитокинового профиля вагинального содержимого. Дефицит лактофлоры сопровождается повышением уровня провоспалительных цитокинов, сопоставимым, а в отношении IL-1(3 даже превышающем уровень, наблюдаемый при И111111.

Показана возможность модуляции параметров мукозального иммунитета влагалища пробиотиками. Интравагинальная пробиотическая терапия оказывает влияние на состояние мукозального иммунитета нижних отделов женского репродуктивного тракта, выражающееся в противовоспалительном тренде баланса цитокинов.

Установлено стимулирующее влияние экзометаболитов вагинальных эпителиоцитов женщин на ростовые свойства пробиотического штамма как необходимое условие восстановления нормофлоры влагалища, что положено в основу разработки способа индивидуального подбора пробиотика для эффективной интравагинальной терапии (Положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2012136487).

Теоретическая и практическая значимость

формирования микробиоценоза и определяющие состояние мукозально-го иммунитета.

Выявленная в ходе исследования связь микроэкологического состояния вагинального биотопа с фертильностью, расширяет патогенетические представления о причинах женского бесплодия, обосновывая роль микробного фактора в качестве регулятора гомеостаза организма и функционирования репродуктивной системы.

Практическую значимость работы определяют:

- Новые критерии дифференциации автохтонной и аллохтонной вагинальной микрофлоры, позволяющие осуществлять диагностику микроэкологических нарушений репродуктивного тракта женщин.

-Выявление связи состояния микробиоценоза с цитокиновым профилем вагинального биотопа позволило предложить определение уровня 1Ь-1|3 вагинальной жидкости в качестве маркера дисбиотических состояний женского репродуктивного тракта.

-Разработан способ оценки влияния вагинальных эпителиоцитов на биологические свойства бактерий, который по изменению свойств микроорганизмов позволяет оценивать влияние как эпителиальных эк-зометаболитов, так и непосредственного контакта с эпителиальными клетками (Патент РФ№2458135).

Основные положения, выносимые на защиту

Результирующая бактериально-эпителиальных взаимодействий, выражающаяся в изменении функционального состояния эпителиоцитов и микросимбионтов, - дифференциальный критерий отличия автохтонной и аллохтонной микрофлоры вагинального биотопа.

Эпителиально-бактер�

Информация о работе

Кремлева, Елена Александровна
доктора медицинских наук
Оренбург, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Роль эпителиально-бактериальных взаимодействий в ассоциативном симбиозе репродуктивного тракта женщин - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы