Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние синтетического регуляторного пептида селанк на экспрессию генов в мозге и селезёнке

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние синтетического регуляторного пептида селанк на экспрессию генов в мозге и селезёнке"

' //« правах рукописи

КОЛОМ И н Тимур Александрович

ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО РЕГУЛЯТОРНОГО ПЕПТИДА СЕЛАНК НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ В МОЗГЕ И СЕЛЕЗЁНКЕ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

005016177

3 МАП Ш

Москва - 2012

005016177

Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Сломинский Пётр Андреевич

Официальные оппоненты:

Брага Элеонора Александровна

доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов», ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

«/и;

Шишкин Сергей Сергеевич

доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, заведующий лабораторией

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук

2012 г. в /Л"* часов на заседании

Защита состоится _ _ _ _

Диссертационного совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: ГСП-1, 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Автореферат разослан «

2012 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

/шынАнатшй Михайлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время в медицинской практике для профилактики и лечения различных заболеваний применяется множество лекарственных средств разной природы. Но, несмотря на огромное количество разработанных лекарственных препаратов, проблема лечения многих из ныне существующих заболеваний остаётся нерешённой. В связи с этим одной из важнейших задач молекулярной биологии является разработка и изучение механизма действия новых лекарственных препаратов, которые окажутся более эффективными по сравнению с существующими продуктами фармации. На данный момент одним из ведущих направлений разработки лекарственных препаратов является использование соединений на основе природных регуляторных пептидов, которые с одной стороны оказывают направленное воздействие на организм, а с другой - практически не имеют побочных эффектов. Синтетические регуляторные пептиды обладают широким спектром клинического действия, однако до настоящего времени точный механизм их действия на организм остаётся неясным. Поэтому изучение механизма действия синтетических регуляторных пептидов является одной из наиболее актуальных задач современной молекулярной биологии. В данном контексте большой интерес для изучения представляет изменение экспрессии генов, функционирующих в здоровом организме и реагирующих в ответ на различные физиологические воздействия.

К числу лекарственных препаратов на основе природных регуляторных пептидов относится разработанный в Институте молекулярной генетики РАН в сотрудничестве с НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН и недавно вошедший в клиническую практику в качестве анксиолитического и нооторопного средства пептидный препарат селанк. Селанк является синтетическим аналогом тафтцина - короткого фрагмента ТИг-Ыб-Рго-А^ тяжёлой цепи иммуноглобулина в человека, удлинённого с С-концевой части

молекулы трипептидом Pro-Gly-Pro для повышения метаболической стабильности и продолжительности действия пептида. В клинике было показано, что данный препарат эффективно купирует чувство тревоги и страха и наряду с этим обладает ноотропным действием, оказывая позитивное влияние на формирование памяти и процессы обучения. Благодаря наличию данных свойств, селанк приобрёл широкое применение в лечении и профилактике стрессовых и тревожных состояний, генерализованных тревожных расстройств и неврастении, а также в качестве стимулирующего средства при повышенных психоэмоциональных нагрузках. В исследованиях in vitro и in vivo было показано, что селанк также обладает выраженными противовирусными ^ свойствами в отношении вирусов гриппа А человека, вируса простого герпеса,

цитомегаловируса и др.

Ранее было установлено, что пептидные препараты способны изменять экспрессию генов. Так, семакс, синтетический аналог фрагмента АКТГ4-7, обладающий выраженным ноотропным и нейропротективным действием, способствует повышению экспрессии нейротрофинов как на уровне белка, так и на.уровне мРНК. В отношении селанка подобные исследования практически не проводились, и, несмотря на имеющиеся сведения о его способности оказывать действие на экспрессию мРНК гена Bdnf в мозге крысы, механизм действия пептида пока остаётся неясным. Кроме того, исследования деградации селанка в ллазме крови и мозге крысы, а также выявление самостоятельных эффектов его фрагментов, ставит вопрос о влиянии на экспрессию генов каждого из них в отдельности. ,

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы стало изучение влияния селанка на транскрипционный профиль клеток мозга и селезёнки крыс и мышей. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на изменение транскрипционного профиля клеток гиппокампа крысы с использованием технологии кДНК-микрочипоз.

2. Отбор генов с наиболее значительным изменением экспрессии мРНК в гиппокампе крысы после однократного" и курсового введения селанка и анализ экспрессии отобранных генов в лобной коре, мозжечке и селезёнке крысы.

3. Анализ экспрессии генов, вовлечённых в процессы воспаления, в селезёнке мыши через 6 и 24 часа после введения селанка и трёх его фрагментов - тафтцина, /\rg-Pro-Gly-Pro (А^РСР) и дипептида 01у-Рго (ОР) и отбор генов с наиболее значительным изменением экспрессии.

4. Анализ временной динамики экспрессии гена Вс1б, генов-мишеней и генов-корепрессоров белка ВСЬб в селезёнке мыши под действием селанка и его фрагментов.

Научная новизна и практическая значимость работы

Показано, что однократное и курсовое введение селанка приводит к широкомасштабному изменению транскрипционного профиля клеток гиппокампа крысы. Большинство генов, уровень мРНК которых изменился более чем в 2 раза, кодируют белки, ассоциированные с плазматической мембраной (в том числе трансмембраннные белки). Это позволяет говорить о наличии у селанка способности регулировать ионный гомеостаз клеток гиппокампа и, тем самым, модулировать на молекулярно-генетическом уровне различные ион-зависимые процессы, к которым относятся процессы обучения и формирования памяти.

Показано, что как однократное, так и курсовое введение селанка приводит к изменению в экспрессии генов Аст1, СхЗсг1, Fgf7, Р1ргп2 и Б1сба20 в гиппокампе крысы. Действие селанка на экспрессию данных генов носит тканеспецифичный характер, при этом наиболее близкий паттерн изменения экспрессии их мРНК наблюдается в лобной коре и мозжечке. Наиболее сильный ответ отобранных генов был отмечен в селезёнке после однократного введения селанка.

Показано, что селанк и его фрагменты (тафтцин, А^РвР и вР) изменяет экспрессию мРНК генов цитокинов, хемокинов, их рецепторов и некоторых

. других генов, вовлечённых в процессы воспаления, в селезёнке мыши. При этом наибольшее количество генов изменили экспрессию после введения дипептидаСР.

Показано, что селанк и его фрагменты оказывают сложное мультинаправленное действие на динамику экспрессии гена Вс1б, который играет ведущую роль в формировании и развитии иммунной системы, а также на динамику экспрессии генов-мишеней и генов-корепрессоров белка ВСЬб.

Полученные результаты позволяют расширить представления о механизме действия синтетического регулярного пептида селанк на уровне транскрипции генов и объяснись, некоторые, аспекты клинического действия этого пептида с молекулярно-генетической точки зрения. Быстрое и мощное действие .селанка и его фрагментов на экспрессию генов, вовлечённых в процессы воспаления, даёт основания предложить этот пептид в качестве иммуномодулирующего средства для профилактики и лечения вирусных и бактериальных инфекций разных типов.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 4 статьи и 5 сообщений в материалах тезисов научных конференций и

симпозиумов.

Апробация диссертации

Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих конференциях и конгрессах: конференции Европейского Общества Генетики Человека (Е8НС) в 2009 и 2010 гг., VI Съезд Российского общества медицинских генетиков (14-18 мая 2010 г., Ростов-на-Дону, Россия), Седьмой ■ Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (3-13 июня 2011 г.. Судак, Крым, Украина).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов исследования, заключение,

выводы и библиографический указатель. Список литературы состоит из 272 источников, среди которых 79 источников отечественной и 193 источников зарубежной литературы. Диссертация содержит 8 таблиц и 11 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

На первом этапе исследования проводили оценку влияния однократного и курсового введения селанка на экспрессию генов в мозге и селезёнке крысы. В эксперименте использовали самцов крыс линии Вистар со средней массой 260 г., содержавшихся в виварии со свободным доступом к воде и пище и 12-ти часовым циклом освещения. Все крысы (п=24) были разделены на 3 группы: контрольную (К) и группы однократного (ОВ) и курсового (KB) введения по 8 особей в каждой. В течение 5 суток животным из групп К и ОВ один раз в сутки интраназально вводили дистиллированную воду, животным из группы KB - водный раствор селанка (200 мкг/кг). На шестые сутки животным из группы ОВ вводили водный раствор селанка (200 мкг/кг). Спустя час животных всех групп декапитировали и выделяли ткани мозга (гиппокамп, лобная кора и мозжечок) и селезёнки. Суммарную РНК из полученных тканей выделяли с использованием набора Promega RNAgents® Total RNA Isolation System (Promega, США). На основе РНК, полученной из ткани гиппокампа, синтезировали меченную флуоресцентными красителями (СуЗ и Су5) кДНК, которая затем подвергалась гибридизации на микроматрице SBC-R-RC-100-13 Rat 12К expression cDNA array (V1.3) (Shanghai BioChip, Китай). В состав микроматрицы вошли 11060 последовательностей транскриптома крысы (известные гены, EST-последовательности). Массив генов, изменивших экспрессию в 2 или более раз после введения селанка, анализировали с использованием Интернет-ресурса Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) V6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.isp) с целью установления их структурно-функциональных связей.

Анализ относительной экспрессии генов Acini, CxicrL Fgf7, Ptprn2, Slc6a20 и гена сравнения Rpl3 проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием набора для синтеза первой цепи кДНК RevertAid™H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва), реактивов для ПЦР (Синтол, Россия) и коммерческих праймеров RT2 qPCR Primer Assay SYBR® Green

(SABioscience, США).

На втором этапе исследования проводили оценку влияния селанка и трёх его фрагментов (тафтцина, ArgPGP и GP) на экспрессию генов, вовлечённых в процессы воспаления, в селезёнке мыши через б и 24 ч после введения пептидов. В эксперименте использовали самцов белых мышей со средней массой 20 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Всех мышей (п=100) разделили на 4 группы - 2 контрольные (п,=10; п2=10) и 2 экспериментальные (п,=40; п2=40) для б- и 24-часовой временных точек. Каждая экспериментальная группа делилась на 4 подгруппы в соответствии с-вводимым пептидом по 10 особей в каждой. Животным из экспериментальных групп путём внутрибрюшинной инъекции однократно вводили раствор селанка или его фрагментов (100 мкг/кг), контрольным животным - эквивалентный объем физиологического раствора. Через 6 и 24 ч мышей декапитировали и выделяли ткань селезёнки. Суммарную РНК выделяли с использованием набора

RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Израиль).

Анализ относительной экспрессии генов, вовлечённых в процессы воспаления, проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени на панели RT2Profile PCR Array (SABiosciences, США), которая содержала праймеры для

84 генов. - - '

На третьем этапе исследования анализировали временную .динамику экспрессии гена Вс1б, генов-мишеней и генов-корепрессоров белка BCL6 в селезёнке мыши под действием селанка и его фрагментов. В эксперименте использовали самцов белых мышей со средней массой 20 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Всех мышей (п=150) разделили на 6 групп - 3 контрольные (п,= 10; п2=10; п,=10) и 3 экспериментальные (п,=40; п2=40; п3=40)

по числу временных точек (30 мин, 90 мин и 3 ч). Каждая экспериментальная группа делилась на 4 подгруппы в соответствии с вводимым пептидом по 10 особей в каждой. Животным из экспериментальных групп путём внутрибрюшинной инъекции однократно вводили раствор селанка или его фрагментов (100 мкг/кг), контрольным животным - эквивалентный объем физиологического раствора. Через 30 мин, 90 мин и 3 часа мышей декапитировали и выделяли ткань селезёнки. Суммарную РНК выделяли с использованием набора RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Израиль).

Анализ относительной экспрессии гена Вс16, генов-мишеней (Ccndl, Ccnd2, Cd44, Cd69, Stall) и генов-корепрессоров (Bcor, Ncorl и Ncor2) белка BCL6, а также генов сравнения (Gapdh, Hprtl и Hsp90abl) проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программного обеспечения Relative Expression Software Tool 384 (REST-384®) v.2 (Pfaffl et al., 2001, 2002, 2004).

Результаты исследования

Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на изменение транскриптома клеток гиппокампа крысы с использованием кДНК-микрочипов

Использование кДНК-микрочиповых технологий в экспрессионном анализе позволяет проводить быструю и широкомасштабную оценку изменения транскрипционного профиля клеток. Особенно часто данные технологии применяются при оценке влияния фармакологических препаратов разной природы на изменение экспрессии генов. В настоящей работе был проведён анализ влияния однократного и курсового введения селанка на экспрессию 11060 известных последовательностей транскриптома крысы в гиппокампе здоровых животных с использованием микроматриц SBC-R-RC-100-13 Rat 12К expression cDNA array. Было показано, что после однократного введения селанка более чем в 2 раза изменился уровень мРНК 36 генов (Рис. 1А), после курсового введения - 20 генов (Рис.1 Б).

Рисунок Î. Относительное изменение уровня мРНК генов в гиппокампе крысы после введения селанка (р<0,05).

А. Однократное введение мшв Б. Курсовое введение

Уровень мРНК генов в контрольной группе иииаыи принят за единицу.

С целью установления структурно-функциональных связей генов, изменивших экспрессию под действием селанка, и оценки их вовлеченности в реализацию различных биологических путей, был проведён анализ с использованием Интернет-ресурса DAVID. В результате было выделено три тесно взаимосвязанных структурно-функциональных кластера.

Первый, наиболее объёмный кластер, объединил 33 гена, которые кодируют белки, встроенные в плазматическую мембрану клетки или мембрану её органелл: Actnl, Arfgapl, Atp5al, Beam, Cacnalg, Clcnka, Cnksr2, Cx3crl, Cxcll2, Gldn, Gprl, Gpr85, Gria4, Grid2, Kcnj4, Lyn, Map2kl, Npr2, P2ry4, Pla2gl6, Ptprn2, ScampS, Scn3b, Selp, Slcla2, Slc5a7, Slc6a20, Slc8a3, Smad3, Tomm20, Trpcl, Ugtlaö и Uncl3c. При этом 24 гена кодируют исключительно трансмембранные белки (ионные каналы, переносчики ионов и биологических молекул, трансмембранные рецепторы, вовлечённые в процессы аккумуляции и передачи энергии) (р<0,01): Beam, Cacnalg, Clcnka, Cx3crl, Gldn, Gprl, Gpr85,

Gria4, Grid2, Kcnj4, Npr2, P2ry4, Pla2gl6, Ptprn2, Scamp5, Scn3b, Selp, Slcla2, Slc5a7, Slc6a20, Slc8a3, Tomm20, Trpcl, Ugtla6.

Во второй кластер вошли 9 генов, которые кодируют белки, сопряжённые с мембраной нервных клеток и их отростков (р<0,05): Actnl, Cacnalg, Gria4, Map2kl, Kcnj4, KIM24, Ptprn2, Sipalll, Slcla2.

Третий кластер включает 15 генов, кодирующих белки, вовлечённые в транспортную систему клетки (р<0,05): Arfgapl, Alp5al, Cacnalg, Clcnka, Gria4, Grid2, Kcnj4, Scamp5, Scn3b, Slcla2, Slc5a7, Slc6a20, Slc8a3, Trpcl, Tomm20, причём 10 из них участвуют исключительно в ионном транспорте и поддерживают ионный гомеостаз клетки (р<0,05): Atp5al, Cacnalg, Clcnka, Gria4, Grid2, Kcnj4, Scn3b, Slc5a7, Slc8a3, Trpcl.

Согласно литературным данным, селанк способен оказывать модулирующее действие на процессы, протекающие в ЦНС (в особенности связанные с обучением и формированием памяти), а также положительный терапевтический эффект при восстановлении нарушенных или утраченных в результате повреждения функций клеток мозга (Павлов и др., 2004; Семенова и др., 2007). Полученные данные позволяют предположить, что подобное действие может быть опосредовано влиянием селанка на экспрессию генов, вовлечённых в регуляцию ионного гомеостаза клетки, передачу нервного импульса, а также отвечающих за формирование синаптической пластичности.

Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на экспрессию генов Actnl, Cx3crl, Fgf7, Ptprn2 и Slc6a20 в мозге крысы

Среди генов, уровень мРНК которых в гиппокампе крысы изменился после однократного или курсового введения селанка, были отобраны 5 генов Actnl, СхЗсг], Fgf7, Ptprn2 и Slc6a20, которые изменили экспрессию при использовании обеих схем введения. Для более детальной оценки экспрессии данных генов в мозге крысы под действием селанка, были проанализированы изменения уровня их мРНК в лобной коре и мозжечке.

Было показано, что изменение уровня мРНК генов АсМ1, СхЗсг!, Р1ргп2 и 51с6а20 в лобной коре и мозжечке имеет схожий паттерн, который в большинстве случаев отличается от паттерна, наблюдаемого в гиппокампе (Рис. 2). Так при однократном введении селанка для генов Асш1, СхЗсгI и Р1ргп2 отмечено однонаправленное изменение уровня мРНК в лобной коре и мозжечке, но противоположное по направлению изменение уровня мРНК в гиппокампе. Уровень мРНК гена Асы1 достоверно снижается в гиппокампе как после однократного, так и после курсового введения селанка, а также в мозжечке после курсового введения пептида. В лобной коре наблюдается достоверный рост экспрессии данного гена после однократного введения селанка. Статистически значимым повышением уровня мРНК в три раза в гиппокампе крысы характеризовался ген Р1ргп2 как после однократного, так и после курсового введения селанка. При этом в лобной коре и мозжечке наблюдалась тенденция к снижению экспрессии данного гена. Уровень мРНК гена СхЗсг1 изменяется в гиппокампе, лобной коре и мозжечке как после однократного, так и после курсового введения селанка. Следует отметить, что при однократном введении экспрессия данного гена достоверно снижается более чем в 2 раза в гиппокампе и возрастает в 2 и 1,5 раза в лобной коре и мозжечке, соответственно. После курсового введения, напротив, наблюдается рост уровня мРНК данного гена в гиппокампе и лобной коре и снижение в мозжечке. После однократного введения селанка отмечено 4-х кратное повышение уровня мРНК гена Б1с6а20 в гиппокампе и лобной коре крысы, , после курсового введения - однонаправленное, изменение в трёх рассмотренных отделах мозга. Наибольшее повышение экспрессии гена БкбаЮ после курсового введения (в 3,1 раза) было отмечено в мозжечке.

Для гена наблюдается повышение уровня мРНК в рассмотренных

отделах мозга как при однократном, так и при курсовом введении селанка, однако, статистическая достоверность этих изменений отмечена только в гиппокампе.

Рисунок 2. Относительный уровень мРНК генов Аст1, СхЗсг1, Р1ргп2 и 51с6а20 в мозге крысы после

однократного и курсового введения селанка. Данные представлены в логарифмической шкале. Уровень мРНК генов в контрольной группе принят за единицу.

3 гиипокамп □ лобная кора ЕЭ мозжечок * - р<0,05 ** - р<0,01

Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на экспрессию генов АсЫ, СхЗсг1, ^«/7, Прт2 и Б1с6а20 в селезёнке крысы

Ранее было показано, что наряду с анксиолитическим и ноотропным действием, селанк обладает выраженной иммуномодулирующей активностью (Учакина и др., 2008; Андреева и др., 2010). Было установлено, что в мозге . крысы введение селанка приводит к изменению уровня мРНК гена СхЗсг!, который кодирует хемокиновый рецептор, вовлечённый в обеспечение иммунного ответа. Иммуномодулирующее действие селанка может быть обусловлено его способностью регулировать состояние иммунной системы на уровне транскриптома. В связи с этим, особый интерес представляет оценка экспрессии генов Аш1, С.хЗсг!, Г8/7, 1'1ргп2 и 81с6а20 в селезёнке - основном источнике циркулирующих иммунных клеток.

Было показано, что по сравнению с мозгом, в селезёнке крысы ответ генов Аст1, СхЗсг1, Ргрт2 и ¿7сба20 на введение селанка выражен

значительно сильнее. При этом отмечается повышение уровня мРНК всех отобранных генов, особенно значительное после однократного введения селанка. После курсового введения действие пептида на экспрессию данных было сопоставимо с таковым в гиппокампе (Рис. 3). При этом в большинстве . случаев направление изменения уровня мРНК отобранных генов в мозге и селезёнке не совпадает. Наибольшим повышением уровня мРНК характеризовались ген Р1рт2 (в 70 раз) и гены Лет! и СхЗсг1 (в 16 раз).

' Наличие сголь быстрых и значительных изменений уровня мРНК отобранных генов в селезёнке крысы в ответ на введение селанка позволяет предположить, что данный пептид способен оказывать аналогичное воздействие на экспрессию генов, вовлечённых в процессы воспаления и формирования иммунного ответа различных типов. В связи с этим большой интерес представляет более детальное изучение экспрессии генов, принимающих участие в регуляции функций иммунной системы организма под действием селанка.

OB KB 08 KB ОБ KB OB KB OS KB

Actnl СхЗсП fg/7 Ptprn2 Slc6a?.0

Гены

Рисунок 3. Относительный уровень мРНК генов Acini, СхЗсг!, Fg/7, Ptprnl и Slc6a20 в гиппокампе и селезёнке крысы после однократного и курсового введения селанка. Данные представлены в логарифмической шкале. Уровень мРНК генов в контрольной группе принят за единицу.

Ш гипгюкамп □ селезёнка * - р<0,05 ** - р<0.()1

Анализ влияния селанка и его фрагментов (тафтцина, А^РвР и вР) на экспрессию генов, вовлечённых в процессы воспаления, в селезёнке мыши через 6 и 24 часа после введения

Согласно литературным данным, отдельные фрагменты регуляторных пептидов обладают собственным специфическим физиологическим действием. В гибридных синтетических пептидах, к которым относится селанк, направленно сочетается разное физиологическое действие их отдельных фрагментов (Ашмарин и др., 2006; Андреева и др., 2010). Поэтому для анализа были отобраны 3 фрагмента селанка: тафтцин - природный иммунопептид с макрофагстимулирующей активностью, А^РОР, в отношении которого была показана наибольшая противовирусная активность и дипептид СР -наименьшая структурная единица селанка с противовирусной активностью.

Было показано, что в ответ на введения селанка и его фрагментов изменился уровень мРНК 35 генов ряда хемокинов, цитокинов и их рецепторов, а также некоторые другие гены, вовлечённые в процессы воспаления. При этом однократное внутрибрюшинное введение селанка привело к изменению уровня мРНК 16 генов, большинство из которых изменили экспрессию спустя сутки после введения. Введение Аг§РвР и тафтцина привело к изменению экспрессии 15 и 16 генов, соответственно. Изменение уровня мРНК наибольшего числа генов (22 генов) наблюдалось под действием СР, особенно через 6 ч после введения.

Среди изменивших экспрессию генов следует отметить 5 из них: СЗ, Са$р1, Вс1б, ¡12^ и Хсг1, уровень мРНК которых изменился после введения каждого из исследуемых пептидов. Спустя сутки после введения наблюдалось снижение уровня мРНК гена Хсг1. Уровень мРНК гена 112^ снизился через 6 ч после введения пептидов. Введение тафтцина, А^РвР и ОР привело к снижению уровня мРНК гена СЗ. Снижение уровня мРНК гена Сдар/ наблюдалось через 6 ч после введения каждого из пептидов, а спустя сутки после введения селанка и тафтцина, напротив, повышение уровня мРНК гена.

Среди отмеченных генов наиболее значительным изменением уровня мРНК после введения каждого из исследуемых пептидов отличался ген Вс1б (Рис. 4). Через 6 и 24 ч после введение селанка было отмечено снижение уровня мРНК данного гена в 4 и 8,5 раз, соответственно. Инъекция Аг§РСР и вР привела к снижению экспрессии гена Вс16 только спустя сутки после введения. Наиболее значительное падение уровня мРНК этого гена (в 25 раз) наблюдалось через б часов после введения тафтцина.

гО *

0,01

селанк тафтцин ArgPGP GP

Рисунок 4. Относительный уровень мРНК гена Вс1б в селезёнке мыши через 6 и 24 ч после введения селанка и его фрагментов. Данные представлены в логарифмической шкале. Уровень мРНК генов в контрольной группе принят за единицу. Я - б часов; □ - 24 часа; * - р<0,05 « - р<0,01.

Анализ временной динамики экспрессии гена Вс!6 под действием селанка и его фрагментов

Ген Вс16 кодирует ядерный транскрипционный репрессор, который регулирует развитие терминального центра, дифференциацию и выживание лимфоцитов и макрофагов, а также участвует в контроле клеточного цикла (Jardin и др., 2007).

В настоящем исследовании была проведена оценка временной динамики экспрессии гена Вс!6 под действием селанка и его фрагментов через 30 мин, 90 мин и 3 ч после введения пептидов (Рис. 5). Было показано, что изменение экспрессии гена Вс!6 наблюдается на всех временных интервалах после введения селанка. Причём, следует отметить, что через 30 и 90 мин после введения селанка наблюдается повышение уровня мРНК этого гена в 1,2 и 1,7 раза, соответственно, а спустя 3 ч, напротив, снижение уровня мРНК в 2 раза. После введения тафтцина достоверного изменения уровня мРНК гена Вс/б выявлено не было. После введения вР падение уровня мРНК отмечено на всех временных интервалах, и было наиболее выражено через 3 ч после введения пептида (в 2,5 раза). Сложное изменение уровня мРНК гена Вс16 после введения селанка и его фрагментов говорит о способности данных пептидов оказывать влияние на активацию экспрессии этого гена и, таким образом, принимать участие в поддержании баланса между ТЫ и ТЬ2-клетками. ю

^

X

О-

л

X

<и

ш

0

а

15

Ъ

1

Л

^

(и

и

0

1

о

Рисунок 5. Временная динамика экспрессии гена Вс16 в селезёнке мыши после введения селанка и его фрагментов. Данные представлены в логарифмической шкале. Уровень мРНК генов в контрольной группе принят за единицу. ■ - 30 мин; □ - 90 мин; 0 - 3 часа; * - р<0,05; ** - р<0,01

У/,

ш

** ** **

Ж

г//А

тафтцин

А^РвР

ОР

Анализ временной динамики экспрессии генов-мишеней белка ВСЬб под действием селанка и его фрагментов

Белок ВСЬб способен репрессировать экспрессию значительного числа генов-мишеней, вовлечённых в различные биологические процессы (№и, 2002). Для выявления репрессор-зависимого паттерна изменения уровня мРНК генов-мишеней белка ВСЬб под действием селанка и его фрагментов, была проведена оценка временной динамики экспрессии 5 генов-мишеней из 3 групп: гены, вовлечённые в регуляцию клеточного цикла (Селе/1 и СспсП), дифференциацию и активацию В-клеток (Сс144 и Сс169) и Т-клеток и макрофагов (БШ1) (Табл. 1).

Таблица 1. Временная динамика экспрессии генов-мишеней белка ВСЬб в селезёнке мыши после введения селанка и его фрагментов. Уровень мРНК генов в контрольной группе принят за единицу. * - р<0,05; ** - р<0,01.

„ 1 Временная Пептид Bel б Гены-мишенн

точка Catdl Ccnd2 Cd44 Cd69 Statl

селанк 30 мин 1,18* 1,25 1,13 0,93 1,47** 1,37**

90 мин 1,75** Т23 _1,60*f 1,33** 0,94 1,77**

3 ч 0,49** 1,07 2,16 0,77 1,00 0,86**

тафтцин 90 мин 1,08 ГП05 lJU05__ 1,03 0,62 1,36**

3 ч 4^82 0,82 2,97** 1ТЛ2 JJ29 0,71**

ArgPGP 30 мин ! 0,99 0,54**_ (Ц>4** 0,77 0,58** г~о7т1

~ I ?0\мин ~ 0,54** ,1,27 ! 1,33 1,22 0,77 1,22

з^ ПШ [0,78* 2,13** 1,22 1,19 1,04

GP 30 мин i 0,50** 0,81 liio 0,74** 0,35 0,74**

90 мин ! 0,68** 1,82** 1,40** 1,95** 1,19 1,51

3 ч i 0,39х* 0,69** 1,62** 0,88 0,6S** 0,68**

Установлено, что активация большинства генов наблюдается под действием дипептида GP, особенно через 90 мин после его введения, причём изменение уровня мРНК исследуемых генов на данном временном интервале имеет направление, противоположное изменению уровня мРНК гена Вс16. Интересный ответ гена Statl был отмечен после введения селанка, тафтцина и GP. Паттерн изменения уро^чя мРНК этого гена практически повторяет

паттерн изменения уровня мРНК гена Вс1б, особенно после введения селанка. Направление изменения уровня мРНК генов-мишеней не всегда коррелирует с направлением изменения уровня мРНК гена Вс!6, что может быть связано с включением ВСЬб-независимых путей регуляции их экспрессии, и/или с непосредственным действием пептидов на экспрессию данных генов.

Анализ временной динамики экспрессии генов-корепрессоров белка BCL6 под действием селанка и его фрагментов

Для реализации способности белка BCL6 репрессировать гены-мишени необходимо образование активного комплекса с участием различных белков-корепрессоров (Dhordain et al., 1998). В настоящем исследовании была проведена оценка временной динамики экспрессии генов Bcor, Ncorl, и Ncorl, кодирующих белки-корепрессоры, которые конкурентно связываются с ВТВ-POZ доменом BCL6 и необходимы для формирования репрессионного комплекса (Табл. 2).

Таблица 2. Временная динамика экспрессии генов-корепрессоров белка BCL6 в селезёнке мыши после введения селанка и его фрагментов. Уровень мРНК генов в контрольной группе принят за единицу. * - р<0,05; ** - р<0,01.

Пептид Временная Вс16 Гены- корепрессоры

точка Всог Ncorl Ncor2

30 мин 1,18* 0,09** 0,88* 7,20**

селанк 90 мин 1,75** 1,42** 2,25** 0,94

3 ч 0,49** 0,48** 0,50** 0,16**

тафтцин 90 мин 1,08 1,27** 1,59** 0,40**

3 ч 0,82 0,83 0,70** 1,08

30 мин 0,99 0,85 1,04 0,69*

ArgPGP 90 мин 0,54** 0,99 0,91 0,09**

3 ч 0,82 0,92 0,93 0,66**

30 мин 0,50** 0,75* 0,71** 0,35**

GP 90 мин 0,68** 1,15* 1,35** 0,30**

3 ч 0,39** 0,61** 0,43** 0,25**

Было показано, что практически на каждом временном интервале после введения селанка и вР наблюдается активация всех отобранных генов. При этом направление изменения уровня мРНК генов Всог и Мсог! соответствует таковому для гена Вс16 через 90 мин и 3 ч после введения селанка и через 30 мин и 3 ч после введения СР. Для гена Усог2 подобное соответствие наблюдается на всех временных интервалах после введения вР. Введение Аг§РСР вызвало статистически достоверное падение уровня мРНК гена Ысог2 на всех временных интервалах, наиболее сильное (в 11 раз) спустя 90 мин.

Изменение уровня мРНК генов-корепрессоров белка ВСЬб под действием селанка и его фрагментов в большинстве случаев совпадает по направлению с изменением уровня мРНК гена Вс16, что может быть связано с аналогичным влиянием пептидов на экспрессию данных генов. Таким образом, можно предположить, что селанк способен оказывать влияние на экспрессию генов-мишеней ВСЬб посредством изменения его репрессионной активности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синтетические пептидные препараты на основе природных регуляторных пептидов являются одними из наиболее перспективных продуктов современной фармации благодаря наличию у них способности оказывать селективное воздействие на различные процессы, протекающие в организме, а также практическому отсутствию негативных побочных эффектов. Одним из ярких представителей данного класса лекарственный препаратов является синтетический аналог тафтцина - селанк, разработанный в Институте молекулярной генетики РАН в сотрудничестве с НИИ фармакологии им. В.В. ЗакусоЕа РАМН и зарекомендовавший себя в качестве эффективного средства для лечения генерализованных тревожных расстройств и неврастении. Но, несмотря на имеющиеся сведения о наличии у селанка мощного анксиолитического и ноотропного эффекта, а также выраженного противовирусного действия, молекулярный механизм действия этого пептида пока остаётся неизвестным.

В настоящей работе было проанализировано влияние селанка на транскрипционный профиль клеток мозга и селезёнки лабораторных животных — крыс и мышей. Было показано, что в гиппокампе крысы однократное и курсовое введение селанка приводит к изменению уровня мРНК значительного числа генов, кодирующих белки, которые ассоциированы с плазматической мембраной клетки и играют ключевую роль в поддержании клеточного гомеостаза и регуляции ион-зависимых процессов, к которым можно отнести процессы формирования памяти и обучения.

В ходе анализа транскрипционного профиля клеток гиппокампа крысы были отобраны 5 генов (Аш1, СхЗсг/, Р1ргп2 и 5/с6а20), уровень мРНК которых изменился как при однократном, так и при курсовом введении селанка. Оценка экспрессии данных генов в лобной коре, мозжечке и селезёнке крысы показала, что по сравнению с гиппокампом наиболее схожий паттерн изменения уровня мРНК отобранных генов наблюдается в лобной коре и мозжечке. Кроме того, было показано, что однократное введение селанка приводит к значительному статистически достоверному повышению экспрессии всех отобранных генов в селезёнке крысы, наиболее сильному для гена Р(ргп2 (в 70. раз), который кодирует рецептороподобную протеин-тирозин-фосфатазу, играющую важную роль в сигнальной системе клетки.

Анализ экспрессии 84 генов, вовлечённых в процессы воспаления, в селезёнке мыши через 6 и 24 ч после введения селанка и трёх его фрагментов (тафтцина, Лг«РСР и СР), показал, что наибольшее количество генов (15 генов) изменили уровень мРНК спустя 6 ч после введения дипептида йР. Введение селанка привело к изменению уровня мРНК 8 генов через 6 ч и 11 генов через 24 ч после введения.

Также было показано, что для 5 генов (Вс!6, СЗ, Сюр!, 112и Хсг1) уровень мРНК изменяется после введения каждого из пептидов. Наиболее значительными изменениями уровня мРНК характеризуется ген Вс16. Анализ временной динамики экспрессии данного гена показал, что спустя 30 и 90 мин после однократного введения селанка наблюдается рост уровня его мРНК, а

спустя 3 ч после введения, напротив, отмечается падение уровня мРНК. Оценка временной динамики экспрессии генов-мишеней и генов-корепрессоров белка ВСЬб говорит о том, что уровень мРНК данных генов изменяется независимо, что может объясняться включением ВСЬб-независимых путей и/или непосредственным влиянием пептидов на экспрессию данных генов.

Полученные данные говорят о том, что селанк способен оказывать селективное влияние на экспрессию ряда генов и, тем самым, направленно модулировать различные процессы, в частности связанные с поддержанием ионного гомеостаза клетки, обучением и формированием памяти, а также с поддержанием ТЬ1/ТЬ2-баланса.

выводы

1. Синтетический регуляторный пептид селанк при однократном и курсовом введении вызывает широкомасштабные изменения транскрипционного профиля клеток гиппокампа крысы, причём в первую очередь меняется уровень мРНК генов, кодирующих белки, ассоциированные с плазматической мембраной.

2. Анализ уровня мРНК генов АсШк СхЗсг!, Р(ргп2 и БкбаК) в гиппокампе, лобной коре, мозжечке и селезёнке крысы показал тканеспецифичный характер действия селанка, причём наиболее выраженные изменения экспрессии исследуемых генов были обнаружены в селезёнке крысы после однократного введения селанка.

3. Селанк и его фрагменты (тафтцин, А^РвР и ОР) вызывают в селезёнке мыши изменения в экспрессии генов ряда хемокинов, цитокинов, их рецепторов и некоторых других генов, вовлечённых в процессы воспаления.

4. Наиболее значительное изменение экспрессии в селезёнке мыши было отмечено для гена Вс16, уровень мРНК которого снижался после введения каждого из исследуемых пептидов. Наиболее сложный характер изменения уровня мРНК данного гена наблюдается после введения селанка (рост через 30 и 90 мин и падение спустя 3 часа), тогда как дипептид ОР вызывает общее снижение уровня мРНК гена Вс1б на всех временных интервалах.

5. Анализ экспрессии генов-мишеней ВСЬб (СспсН, Ссп(12. С<144, Сс1б9 и БтИ) показал, что изменение уровня их мРНК не всегда коррелирует с изменением уровня мРНК гена-репрессора. Это может быть связано с включением ВСЬб-независимых путей регуляции их экспрессии, и/или с непосредственным действием пептидов на экспрессию данных генов.

6. Изменение уровня мРНК генов-корепрессоров ВСЬб (Ысог1, Ксог2 и Всог) под действием селанка и его фрагментов в большинстве случаев совпадает по направлению с изменением уровня мРНК гена Вс1б, что может быть связано с аналогичным влиянием пептидов на экспрессию данных генов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи

1. М. Shadrina, Т. Kolomin, Т. Agapova, Y. Agniullin, S. Shram, P. Slominsky, S. Limborska, N. Myasoedov, Comparison of the temporary dynamics of A'g/and Bdnf gene expression in rat hippocampus, frontal cortex, and retina under Semax action. Journal of Molecular Neuroscience (2010). Ns 41, p. 30-35.

2. T. Kolomin, M. Shadrina, L. Anareeva, P. Slominsky, S. Limborska, N. Myasoedov, Expression of inflammation-related genes in mouse spleen under tuftsin analog Selank, Regulatory Peptides (2011), № 170, p. 18-23.

3. T.A. Коломнн, М.И. Шадрина, Я.В. Агниуллин, С.И. Шрам, П.А. Сломинский, С.А. Лимборская, Н.Ф. Мясоедов, Транскриптомный ответ клеток гиппокампа и селезёнки крысы на однократное и курсовое введение пептида селанка. Доклады академии наук (2010), т. 430, №1, с. 127129.

4. Т.А. Коломнн, М.И. Шадрина, П.А. Сломинский, С.А. Лимборская, Н.Ф. Мясоедов, Изменение экспрессии генов хемокинов, цитокинов и их рецепторов под действием селанка и его фрагментов. Генетика (2011), т. 47, №5, с. 711-714.

Материалы конференций

.5. P. Slominsky, Т. Kolomin, Т. Agapova, М. Shadrina, Y. Agniullin, S. Shram, N. Myasoedov, New targets of Semax (N-terminal ACTH fragment analog) action on gene expression: temporal and spatial dynamics, European Journal of Human Genetics (2009), № 17, suppl. 2, European human genetics conference 2009, May 23-26. Vienna, Austria, p. 302.

6. T. Kolomin. M. Shadrina, Y. Agniullin, S. Shram, P. Slominsky, S. Limborska, N. Myasoedov, Gene expression analysis under the action of Selank and its fragments, European Journal of Human Genetics (2010), № 18, suppl. 1, European human genetics conference 2010, June 12-15, Gothenburg, Sweden, p. 277-278.

7. S. Limborska, Т. Kolomin, M. Shadrina, S. Shram, P. Slominsky, N. Myasoedov, Transcriptome alteration in hippocampus and spleen under the treatment of regulative peptide Selank and some of its fragments (2010), Cold Spring Harbor Laboratory, The biology of genomes, May 11-15, Cold Spring Harbor, New York, USA, p. 179.

8. T.A. Коломин, М.И. Шадрина, Я.В. Агниуллин, С.И. Шрам, С.А. Лимборская, Н.Ф. Мясоедов, Анализ экспрессии генов под действием регуляторного пептида селанка и его фрагментов, Материалы VJ Съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г., с. 87-88.

9. П.А. Сломинский, Т.А. Коломин, М.И. Шадрина, Н.Ф. Мясоедов, Транскриптомный ответ мозга и селезёнки мыши на пептид селанк и его фрагменты, Материалы VII Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Украина, 3-13 июня 2011 г., с. 393.

Подписано в печать: 28.03.2012 Тираж: 100 экз. Заказ №797 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.74, корп.1 (495) 790-47-77; vvww.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коломин, Тимур Александрович, Москва

61 12-3/925

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Влияние синтетического регуляторного пептида селанк на экспрессию генов в мозге и

селезёнке

03.01.03 - Молекулярная биология ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., проф. П.А. Сломинский

Москва-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений...........................................................................6

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................... 10

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................... 14

1.1. Природные регуляторные пептиды....................................... 14

1.1.1. Общая характеристика............................................... 14

1.1.2. Классификация регуляторных пептидов........................ 17

1.1.2.1. Нейропептиды................................................. 19

1.1.2.2. Пептиды желудочно-кишечного тракта................. 27

1.1.2.3. Регуляторные пептиды иммунной системы.............30

1.1.2.4. Атриопептиды.................................................32

1.2. Тафтцин.........................................................................33

1.2.1. Общая характеристика тафтцина..................................33

1.2.2. Действие тафтцина на иммунную систему..................... 35

1.2.3. Действие тафтцина на ЦНС........................................ 36

1.2.4. Противоопухолевое действие тафтцина......................... 38

1.3. Синтетический регуляторный селективный анксиолитик селанк.. 39

1.3.1. Синтетические регуляторные пептиды.......................... 39

1.3.2. Структура селанка....................................................43

1.3.3. Анксиолитическое действие селанка.............................43

1.3.4. Действие селанка на ЦНС.......................................... 48

1.3.5. Действие селанка на иммунную систему........................51

1.3.6. Другие свойства селанка............................................ 52

1.4. Подходы к изучению механизма действия регуляторных пептидов............................................................................. 54

1.4.1. Физиологические методы........................................... 54

1.4.1.1. Классификация экспериментальных моделей..........54

1.4.1.2. Физиологические методы оценки влияния

регуляторных пептидов на поведение животных............... 55

1.4.2. Биохимические методы.............................................. 58

1.4.2.1. Изучение биодеградации регуляторных пептидов .... 58

1.4.2.2. Поиск взаимодействий регуляторных пептидов с рецепторами.............................................................59

1.4.3. Молекулярно-биологические методы............................. 60

1.4.3.1. Анализ экспрессии генов на уровне мРНК............ 60

1.4.3.2. Анализ экспрессии генов на уровне белка.............. 63

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................65

2.1. Приготовление и хранение препаратов селанка....................... 65

2.2. Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на экспрессию генов в мозге и селезёнке крысы............................... 65

2.2.1. Характеристика экспериментальных групп животных.......65

2.2.2. Выделение тотальной РНК из тканей мозга и селезёнки крысы.......................................................................... 67

2.2.3. Оценка уровня экспрессии мРНК генов в гиппокампе крысы с использованием кДНК-микрочипов.......................... 68

2.2.4. Оценка уровня экспрессии мРНК генов АсШ1, СхЗсг!, Р1ргп1, 81с6а20 в гиппокампе, лобной коре, мозжечке и селезёнке крысы........................................................... 69

2.2.5. Статистическая оценка результатов..............................71

2.3. Анализ влияния селанка и его фрагментов на экспрессию генов, вовлеченных в процессы воспаления, в селезёнке мыши.................. 72

2.3.1. Характеристика экспериментальных групп животных.......72

2.3.2. Выделение тотальной РНК из тканей селезёнки мыши...... 73

2.3.3. Оценка уровня экспрессии мРНК генов, вовлеченных в процессы воспаления, в селезёнке мыши под действием селанка I

и его фрагментов с использованием ПЦР-чипов..................... 74

2.3.4. Статистическая оценка результатов..............................78

2.4. Временная динамика экспрессии мРНК гена Вс16, генов-мишеней и генов-корепрессоров белка ВСЬб в селезёнке мыши под действием селанка и его фрагментов......................................... 78

2.4.1. Характеристика экспериментальных групп животных.......78

2.4.2. Выделение тотальной РНК из тканей селезёнки мыши...... 79

2.4.3. Оценка уровня экспрессии мРНК гена Вс1б, генов-мишеней и генов-корепрессоров белка ВСЬб в селезёнке мыши под действием селанка и его фрагментов.................................... 79

2.4.4. Статистическая оценка результатов..............................80

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................... 81

3.1. Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на

изменение транскриптома клеток мозга и селезёнки крысы.......... 81

3.1.1. Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на изменение транскриптома клеток гиппокампа крысы с использованием кДНК-микрочипов................................... 81

3.1.2. Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на изменение экспрессии генов Ас1п1, СхЗсг1,

Ptprn2 и 81с6а20 в гиппокампе, лобной коре и мозжечке крысы .. 86

3.1.3. Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на изменение экспрессии генов Асы!, СхЗсг!,

Р1ргп2 и $1с6а20 в селезёнке крысы...................................... 91

3.2. Анализ влияния селанка и его фрагментов (тафтцина, АщРОР и ОР) на экспрессию генов, вовлеченных в процессы воспаления, в селезёнке мыши через 6 и 24 часа после введения..........................94

3.3. Временная динамика экспрессии гена Вс16, генов-мишеней и генов-корепрессоров белка ВСЬб в селезёнке мыши под действием селанка и его фрагментов........................................................ 98

3.3.1. Временная динамика экспрессии гена Вс16 под действием селанка и его фрагментов.................................................. 98

3.3.2. Временная динамика экспрессии генов-мишеней белка

ВСЬб под действием селанка и его фрагментов..................... 100

3.3.3. Временная динамика экспрессии генов-корепрессоров

белка ВСЬб под действием селанка и его фрагментов............... 101

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ............................................ 104

4.1. Влияние однократного и курсового введения селанка на изменение транскриптома клеток мозга и селезёнки крысы............. 104

4.1.1. Влияние однократного и курсового введения селанка на изменение транскриптома клеток гиппокампа крысы............... 104

4.1.2. Влияние однократного и курсового введения селанка на изменение экспрессии генов Асш1, СхЗсг!, Ргргп2 и 81с6а2С

в гиппокампе, лобной коре, мозжечке и селезёнке крысы.......... 113

4.2. Изменение экспрессии генов, вовлеченных в процессы воспаления, под действием селанка и его фрагментов в селезёнке мыши................................................................................ 116

4.3. Временная динамика экспрессии гена Вс16, генов-мишеней и генов-корепрессоров белка ВСЬб в селезёнке мыши под действием селанка и его фрагментов........................................................ 122

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................ 127

ВЫВОДЫ....................................................................................... 129

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................... 131

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ........................................... 159

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Abcfl (ATP-binding cassette, sub-family F, member 1) - транспортёр F-l АТФ-связывающей кассеты

Actb (actin, beta) - актин, бета

Actnl (actinin, alpha 1) - актинин, альфа-1

APUD (Amine Precursor Uptake and Decarboxylating system) - система поглащения и декарбоксилирования предшественников аминов

Arfgapl (ADP-ribosylation factor 1 GTPase activating protein) - АДФ рибозилирующий

фактор 1 белка активирующего ГТФазу

ArgPGP (Arg-Pro-Gly-Pro) - аргинил-пролил-глицил-пролин

АТР13А2 - АТФаза 13А2

Atp5al (ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, alpha subunit 1, cardiac

muscle) - альфа субъединица митохондриальной АТФ-синтаза

Beam (basal cell adhesion molecule) - основная молекула клеточной адгезии

Вс16 (B-cell leukemia/lymphoma 6) - транскрипционный репрессор BCL6

Bcor (BCL-6 corepressor) - корепрессор транскрипционного репрессора BCL6

Bdnf (brain-derived neurotrophic factor) - нейротрофический фактор мозга

СЗ (complement component 3) - компонент 3 комплемента

Cacnalg (calcium channel, voltage-dependent, T type, alpha 1G subunit) - 1 G-субъединица потенциалуправляемого кальциевого канала Т-типа Caspl (caspase 1) - каспаза 1

Cell 1 (chemokine (C-C motif) ligand 11) - СС-хемокиновый лиганд 11 Cell7 (chemokine (C-C motif) ligand 17) - СС-хемокиновый лиганд 17 Cell9 (chemokine (C-C motif) ligand 19) - СС-хемокиновый лиганд 19 Ccl20 (chemokine (C-C motif) ligand 20) - СС-хемокиновый лиганд 20 Ccl3 (chemokine (C-C motif) ligand 3) - СС-хемокиновый лиганд 3 Ccl5 (chemokine (C-C motif) ligand 5) - СС-хемокиновый лиганд 5 Ccl7 (chemokine (C-C motif) ligand 7) - СС-хемокиновый лиганд 7 Ccl9 (chemokine (C-C motif) ligand 9) - СС-хемокиновый лиганд 9 Ccndl (cyclin Dl) - циклин D1 Ccnd2 (cyclin D2) - циклин D2

Ccr2 (chemokine (C-C motif) receptor 2) - СС-хемокиновый рецептор 2 Ccr4 (chemokine (C-C motif) receptor 4) - СС-хемокиновый рецептор 4 Cd44 (cluster of differentiation 44) - кластер дифференциации 44 Cd69 (cluster of differentiation 69) - кластер дифференциации 69 Clcnka (chloride channel Ka) - хлоридный канал Ka семейства CLC

Cnksr2 (Connector enhancer of kinase suppressor of ras 2) - промежуточный белок,

усиливающий киназный сигнальный путь под действием Ras

Crp (C-reactive protein) - С-реактивный белок

Csnls2b (casein alpha s2-like В) - казеин-альфа

Ct - пороговый цикл

Ctss (cathepsin S) - цистеиновый катепсин S

Cx3crl (chemokine (C-X3-C motif) receptor 1) - рецептор фракталкина CxcllO (chemokine (C-X-C motif) ligand 10) - СХС-хемокиновый лиганд 10 Cxcll2 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12) - фактор роста стромальных клеток 1 Cxcr5 (chemokine (C-X-C motif) receptor 5) - рецептор 1 лимфомы Беркитта Схс115 (chemokine (C-X-C motif) ligand 15) - СХС-хемокиновый лиганд 15 Cyp2c22 (cytochrome P450 2c22) - цитохром P450 2C-2 DEPC (diethylpyrocarbonate) - диэтилпирокарбонат

Fc-фрагмент - концевая часть молекулы иммуноглобулина Fgf7 (fibroblast growth factor 7) - фактор роста кератиноцитов

Gapdh (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа

Gldn (gliomedin) - глиомедин Glp - пироглутаминовая кислота GP (Gly-Pro) - глицил-пролин

Gprl (G-protein copied receptor 1) - рецептор 1, ассоциированный с G-белком

Gpr85 (G protein-coupled receptor 85) - рецептор 85, ассоциированный с G-белком

Gria4 (glutamate receptor, ionotropic, 4) - ионотропный рецептор глутамата 4

Grid2 (glutamate receptor, ionotropic, delta 2) - ионотропный рецептор глутамата дельта-2

HcRt (hypocretin) - гипокретин, орексин

Hgn (hippyragranin) - гипперагранин

Hprtl (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase 1) - гипоксантин гуанин фосфорибозил трансфераза 1

Hsp90abl (heat shock protein 90 alpha, class В member 1) - белок теплового шока 90 альфа-B1

Ifng, IFN-y (interferon gamma) - интерферон гамма IgG (immunoglobulin G) - иммуноглобулин G 111 (interleukin 1) - интерлейкин 1 1110 (interleukin 10) - интерлейкин 10

I113ral (interleukin 13 receptor, alpha 1) - рецептор интерлейкина 13, альфа 1

1116 (interleukin 16) - интерлейкин 16

IIШ (interleukin 1 family, member 8) - интерлейкин 1-8

111г2 (interleukin 1 receptor, type II) - рецептор интерлейкина 1, тип 2

1120 (interleukin 20) - интерлейкин 20

I12rg (Interleukin 2 receptor, gamma chain) - рецептор интерлейкина 2, гамма-цепь 114 (interleukin 4) - интерлейкин 4

I15ra (interleukin 5 receptor, alpha) - рецептор интерлейкина 5, альфа

118 (interleukin 8) - интерлейкин 8

Itgam (integrin alpha M) - интегрин, альфа-М

Itgb2 (Integrin beta 2) - интегрин, бета-2

Kcnj4 (potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member 4) - калиевый канал внутреннего выпрямления J-4

Kif2c (kinesin family member 2C) - кинезин-подобный белок KIF2C К1Ы24 (Kelch-like protein 24) - Kelch-подобный белок 24 Kng 1 (kininogen 1) - кининоген 1

Lyn (Tyrosine-protein kinase Lyn) - протеин-тирозин киназа Lyn

Map2kl (mitogen activated protein kinase kinase 1) - митоген-активируемая протеинкиназа киназа 1

Mif (macrophage migration inhibitory factor) - фактор ингибирования миграции макрофагов NCBI (National Center for Biotechnology Information) - Национальный центр биотехнологической информации

Ncorl (nuclear receptor co-repressor 1) - ядерный рецептор корепрессор 1

Ncor2 (nuclear receptor co-repressor 2) - ядерный рецептор корепрессор 2

NF-kappaB (NFKB1, nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1) —

ядерный фактор энхансера гена лёгкой каппа-цепи В-лимфоцитов

Ngf (neuron groth factor) - фактор роста нервов

NK - естественные киллеры

Npr2 (natriuretic peptide receptor B/guanylate cyclase В (atrionatriuretic peptide receptor B) -рецептор В предсердного натрийуретического пептида

OPSI (Overwhelming post-splenectomy infection) - комплексное название инфекционных заболеваний, возникающих после спленэктомии

P2ry4 (pyrimidinergic receptor P2Y, G-protein coupled 4) - пиримидинэргический рецептор P2Y, ассоциированный с G-белком

Pdlim? (PDZ and LIM domain 7) - PDZ- и LIM-доменсодержащий белок 7 PGP (Pro-Gly-Pro) - пролил-глицил-пролин

Pla2gl6 (phospholipase A2, group XVI) - фосфолипаза A2, группа 16

Ppargclb (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 beta) - коактиватор 1-бета рецептора активатора пролиферации пероксисом

Psmc2 (proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, ATPase 2) - регулирующая субъединица 268-протеосомы

Ptprn2 (protein tyrosine phosphatase, receptor-type, N polypeptide 2) - рецептороподобная протеин тирозин фосфотаза, Ш-полипептид

Rnfll2 (ring finger protein 112) - белок 112, содержащий несколько доменов «цинковые пальцы»

Samsnl (SAM domain, SH3 domain and nuclear localisation signals, 1) Scamp5 (secretory carrier membrane protein 5) - секреторный мембранный переносчик 5 Scyel (aminoacyl tRNA synthetase complex-interacting multifunctional protein 1) - малый индуцибельный цитокин E-l

SDS (sodium dodecyl sulfate) - додецилсульфат натрия

Selp (selectin P) - селектин P

Sh3gll (SH3-domain GRB2-like 1) - эндофилин A2

Sipalll (signal-induced proliferation-associated 1 like 1) - белок, ассоциированный с индукцией пролиферации

Slcla2 (solute carrier family 1 (excitatory amino-acid transporter 2), member 2) - транспортёр глутамата

Slc5a7 (solute carrier family 5, member 7) - высокоафинный транспорёр холина

Slc6a20 (solute carrier family 6 (proline IMINO transporter), member 20) - Na+- и СГ-

зависимый транспортёр пролина

Slc8a3 (solute carrier family 8 (sodium/calcium exchanger), member 3) - натрий-кальциевый обменный транспортёр

Smad3 (SMAD family member 3) - представитель 3 SMAD-семейства

Ssx2ip (synovial sarcoma, X breakpoint 2 interacting protein) - афадин- и альфа-актинин-

связывающий белок

Statl (signal transducer and activators of transcription 1) - транскрипционный фактор семейства STAT

Suox (sulfite oxidase) - сульфитоксидаза xl/2 - время полужизни

Tgfbl (transforming growth factor, beta 1) - трансформирующий фактор роста, бета 1 TGF-a (transforming growth factor alpha) - трансформирующий фактор роста альфа TKPR (Thr-Lis-Pro-Arg) - трионил-лизил-пролил-аргинин (тафтцин) TKPRPGP (Thr-Lis-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro) - трионил-лизил-пролил-аргинил-пролил-глицил-пролин (селанк)

Tnf (Tumor necrosis factor) - фактор некроза опухоли

Tollip (Toll interacting protein) - белок, взаимодействующий сТоП-рецепторами

Tomm20 (translocase of outer mitochondrial membrane 20 homolog (yeast)) - гомолог

субъединицы TOM20 рецепторов митохондрий дрожжей

Trpcl (transient receptor potential channel 1) - неспецифический катионный канал

Ugtlaô (UDP glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide A6) - УДФ-

глюкуронозилтрансфераза 1-6

Uncl3c (une-13 homolog С) - белок une-13 гомолог С

Xcrl (Chemokine (С motif) receptor 1) - ХС-хемокиновый рецептор 1

а.о. - аминокислотный остаток

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АКТГ4.7 - адренокортикотропный гормон, фрагмент 4-7

АКТГ4-10 - адренокортикотропный гормон, фрагмент 4-10

ВИП - вазоактивный интестинальный (кишечный) пептид

ВНД - высшая нервная деятельность

ВПГ - вирус простого герпеса

ВТКИО - высокотемпературная реакция каталитического ионного обмена

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭМК - вирус энцефаломиокардита

ГАМК - гаммааминомасляная кислота

ГТР - генерализованное тревожное расстройство

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфат

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ИП - иммунопептид

кДа - кил о дальтон

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная РНК

МСГ - меланоцитстимулирующий гормон

НОР - нитроксидный радикал

НП - нейропептид

ОТ-ПЦР - обратнотранскрипционная полимеразная цепная реакция ПОМК - проопиомеланокортин ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени РНК - рибонуклеиновая кислота РП - регуляторный пептид СОР - супероксидный радикал УР - условный рефлекс

УРПИ - условно-рефлекторная реакция пассивного избегания

УРПР - условно-рефлекторная пищевая реакция

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЦНС - центральная нервная система

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В настоящее время в медицинской практике для профилактики и лечения различных заболеваний применяется множество лекарственных средств разной природы. Но, несмотря на огромное количество разработанных лекарственных препаратов, проблема лечения многих из ныне существующих заболеваний остаётся нерешённой. В связи с этим одной из важнейших задач молекулярной биологии является разработка и изучение механизма действия новых лекарственных препаратов, которые окажутся более эффективными по сравнению с существующими продуктами фармации. На данный момент одним из ведущих направлений разработки лекарственных препаратов является использование соединений на основе природных регуляторных пептидов, которые с одной стороны оказывают направленное воздействие на организм, а с другой - практически не имеют побочных эффектов. Синтетические регуляторные пептиды обладают широким спектром клинических эффектов, однако до настоящего времени точный механизм их действия на организм остаётся неясным. Поэтому изучение механизма действия синтетических регуляторных пептидов является одной из наиболее актуальных задач современной молеклярной биологии. В данном контексте большой интерес для изучения представляет изменение экспрессии генов, функционирующих в здоровом организме и реагирующих в ответ на различные физиологические воздействия.

К числу лекарственных препаратов на основе природных регуляторных

пептидов относится разработанный в Институте молекулярной генетики РАН

в сотрудничестве с НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН и недавно

вошедший в клиническую практику в качестве анксиолитического и

нооторопного средства пептидный препарат селанк. Селанк является

синтетическим аналогом тафтцина - короткого фрагмента ТЬг-Ыз-Рго-А^

10

тяжёлой цепи иммуноглобулина G человека, удлинённого с С-концевой части молекулы трипептидом Pro-Gly-Pro для повышения метаболической стабильности и продолжительности действия пептида. В клинике было показано, что данный препарат эффективно купирует чувство тревоги и страха и н�